Dissertations / Theses on the topic 'DDX17'

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a small retrovirus that highly depends on the host cell machinery to replicate by completing its lifecycle and producing new infectious viral particles. The complexity of HIV-1 life cycle regulation only reflects the diversity of the virus-host interactions. Cellular helicases are enzymes involved in every step of nucleic acid metabolism, through rearranging ribonucleoprotein complexes. The understanding and the importance of helicases in HIV-1 replication started to emerge a decade ago. Since then, many studies reported the promoting or inhibiting effect of this protein family on HIV-1. My thesis project was to investigate the role of helicases in HIV-1 replication and comprises two parts. First, we performed a shRNA screen in SupT1 cells to knockdown 130 helicases and monitor their effect on the production of HIV-1 particles. This work allowed us to identify cellular pathways that are important for HIV-1 replication, as well as 35 potential helicases that dramatically affect virus production. Second, we chose to further investigate the role of DDX17 in HIV-1 replication. In addition to showing for the first time that a helicase is required for HIV-1 frameshift, we found that DDX17 promotes viral RNA packaging. Considering the role of DDX17 as a cofactor of the zinc antiviral protein (ZAP) in exosome-mediated HIV-1 mRNA degradation, this emphasizes the fact that helicases are multifunctional proteins. Finally, this work identifies helicases that potentially strongly modulate HIV-1 production. Individual investigation for each candidate will be needed to unravel the mechanisms underlying their effect on HIV-1 replication.
Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un petit rétrovirus qui dépend fortement de la machinerie cellulaire afin de compléter son cycle de réplication et produire de nouvelles particules virales infectieuses. La complexité de la régulation du cycle de réplication du VIH-1 reflète la diversité des interactions hôte-virus. Les hélicases sont des enzymes impliquées dans toutes les étapes du métabolisme des acides nucléiques, en réarrangeant les complexes ribonucléprotéiques. La compréhension de l'importance des hélicases dans la réplication du VIH-1 a commencé il y a une dizaine d'années. Depuis, plusieurs études ont rapporté les effets stimulateurs ou inhibiteurs de cette famille de protéines sur le VIH-1. Mon projet de thèse était d'investiguer le rôle des hélicases dans la réplication du VIH-1 ; il comprenait deux parties. Premièrement, nous avons supprimé l'expression de 130 hélicases au moyen de shRNAs dans les cellules SupT1. Ce travail nous a permis d'identifier les voies cellulaires majoritairement impliquées dans la réplication du VIH-1, ainsi que 35 hélicases affectant de manière drastique la production virale. Dans un second temps, nous avons choisi de nous intéresser plus en détails au rôle de la protéine DDX17 dans la réplication du VIH-1. En plus d'identifier pour la première fois une hélicase étant requise pour le décalage du cadre de lecture (-1), nous montrons que DDX17 favorise l'encapsidation de l'ARN viral. Considérant que DDX17 agit également en tant que co-facteur de ZAP (protéine antivirale zinc) dans la dégradation des ARNs du VIH-1 par l'exosome, cela souligne le fait que les hélicases sont multifonctionnelles. Finallement, au cours de ce travail nous avons identifié un certain nombre d'hélicase ayant le potentiel de fortement moduler la production du VIH-1. Des études individuelles seront nécessaires afin de mettre à jour les mécanismes responsables de l'effet de chacun des candidats sur la réplication du VIH-1.

La progression tumorale, qui conduit à la formation de métastases, est le résultat de profondes modifications des différents niveaux de régulation de l'expression des gènes comme la transcription ou l'épissage alternatif. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de DDX5 et DDX17, deux ARN hélicases qui, au cours de la progression tumorale, sont impliquées dans la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif et la biogénèse des microARNs. Pour cela, j'ai utilisé deux modèles de progression tumorale : le modèle murin 4T1, composé de cellules cancéreuses qui présentent des propriétés métastatiques différentes, et les cellules humaines MCF10A qui, après traitement au TGF-beta, sont capables de réaliser la transition épithélio-mésenchymateuse, un processus de trans-différenciation qui contribue à la formation des métastases. Dans le modèle 4T1, j'ai montré que Ddx17 et Ddx5 contribuent à l'invasivité des cellules tumorales en contrôlant des programmes transcriptionnels et d'épissage alternatif. Plus précisément, j'ai démontré que Ddx5 et Ddx17 favorisent l'agressivité des cellules cancéreuses en régulant l'épissage des variants de l'histone macroH2A1 qui, à leur tour, contrôlent l'expression de gènes impliqués dans la progression tumorale. Dans le modèle MCF10A où la transition épithélio-mésenchymateuse peut être induite sous TGF-beta, j'ai montré que DDX5 et DDX17 orchestrent dynamiquement des programmes transcriptionnels et d'épissage. Le travail effectué pendant ma thèse met en évidence l'importance des ARN hélicases DDX5 et DDX17 comme régulateurs clés de la progression tumorale, et souligne le rôle de l'épissage alternatif lors de la progression tumorale. De plus, ce travail met l'accent sur l'importance d'intégrer les différents niveaux de régulation de l'expression des gènes (transcription, épissage, microARN) pour une compréhension globale de la progression tumorale
Tumor progression leading to the formation of metastases result from deep modifications of gene expression programs at several levels, including transcription and splicing. During my PhD, I investigated the role in tumor progression of DDX5 and DDX17, two highly related multifunctional DEAD box RNA helicases that are involved in transcription and splicing as well as in microRNA biogenesis. For this purpose, I used two breast cancer models of tumor progression : the 4T1 mouse model composed of cancer cells that exhibit different metastatic properties and MCF10a human cells that undergo epithelial-to-mesenchymal transition upon Tgf-beta treatment, a trans-differentiation process contributes to metastasis formation. In the 4T1 mouse model, I showed that Ddx17 and Ddx5 contribute to tumor-cell invasiveness by controlling both transcriptional and splicing programs. More specifically, I demonstrated that Ddx5 and Ddx17 promote cancer cells aggressiveness by regulating the splicing of the macroH2A1 histone which in turn impacts on the expression of genes implicated in tumor cell invasiveness. In the Tgf-beta induced epithelial-to-mesenchymal trans-differentiation model, I showed that DDX5 and DDX17 dynamically orchestrate transcription, microRNA and splicing programs. The work performed during my PhD highlights the importance of DDX5 and DDX17 RNA helicases as key regulators of tumor progression in breast cancer, and also underlines the role of alternative splicing during tumor progression. Furthermore, this work emphasizes the importance of integrating the different layers of the gene expression process (transcription, splicing, microRNA) for a comprehensive understanding of tumor progression

Rôle des hélicases DDX5 et DDX17 dans la régulation transcriptionnelle et la maturation des ARN du Virus de l'hépatite B. La chronicité du virus de l'hépatite B (VHB) repose sur la persistance de l'ADN circulaire et clos de manière covalente (ADNccc) dans le noyau des hépatocytes infectés. Le génome viral présente une structure chromatinisée sujette à des régulations épigénétiques impactant son activité biologique à différents niveaux. Une meilleure connaissance des facteurs cellulaires orchestrant la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle de l'ADNccc est fondamentale dans la compréhension des mécanismes à l'origine de la persistance du VHB. Afin d'identifier les acteurs cellulaires impliqués dans la biologie de l'ADNccc, un ambitieux projet de protéomique de l'ADNccc (ChROP) a été initié par le Dr. Barbara Testoni. Parmi les candidats identifiés, les hélicases à ARN DDX5 et DDX17 ont particulièrement attiré notre attention. DDX5 et DDX17 jouent un rôle crucial dans la régulation de la transcription et le métabolisme des ARN. Nous avons donc évalué leur rôle dans la régulation transcriptionnelle de l'ADNccc et le métabolisme des ARN viraux. Afin d'étudier de manière précise les différents transcrits du VHB, une technique de 5' RACE a été mise au point au laboratoire par le Dr. Bernd Stadelmayer, et a fait l'objet d'une publication. Cette technique a permis l'étude des ARN du VHB dans un contexte de déplétion des hélicases DDX5 et DDX17. Par ailleurs, DDX5/17 appartiennent au complexe insulateur de CCCTC-binding protein (CTCF). Nous avons donc en parallèle étudié le rôle de CTCF dans la biologie de l'ADNccc et le métabolisme des ARN viraux. Dans des cellules HepG2-NTCP et des hépatocytes primaires humains infectés par le VHB, la répression de DDX5/17 entraine un raccourcissement de tous les ARN viraux. Des séquençages de dernière et troisième génération ont permis l'identification de variants d’épissage alternatif ainsi qu’une utilisation différentielle du site de polyadénylation lors de la transcription des transcrits viraux. Des expériences d'immunoprécipitation de l'ARN ont montré que DDX5 et DDX17 s'associent directement aux ARN viraux et recrutent CPSF6 et NUDT21, deux facteurs impliqués dans le choix du site de polyadénylation. Par ailleurs, nous avons identifié des sites de liaison de CTCF sur le génome du VHB et par mutagénèse dirigé, nous avons mis en évidence que la mutation de ces sites impacte le recrutement de CTCF et de DDX5/17 sur l’ADNccc et affecte métabolisme des ARN viraux. L'ensemble de ces données met donc en lumière un rôle essentiel de DDX5 et DDX17 dans la maturation des ARN viraux, en complexe avec la protéine insulatrice CTCF et des facteurs de temrination, à l'interface entre l'ADNccc et les transcripts du VHB
Role of the DEAD-box helicases DDX5 and DDX17 in HBV transcriptional regulation and RNA processingChronicity of hepatitis B virus (HBV) infection hinges on the persistence of covalently-closed-circular DNA (cccDNA) in the nucleus of infected hepatocytes. The viral genome associates with histones and non-histone proteins to build a chromatin structure that is subjected to epigenetic regulation translating into different levels of biological activity. A better understanding of the host factors orchestrating HBV minichromosome transcriptional regulation and RNA processing is fundamental for deciphering the mechanisms at the basis of HBV persistence and reactivation. In order to identify the cellular factors regulating cccDNA biology, an ambitious project of cccDNA proteomics (ChroP) has been initiated by Dr. Barbara Testoni. Among the identified cccDNA-associated proteins, the DEAD-box RNA helicases DDX5 and DDX17 particularly interested us for their driving role in mammalian transcriptional regulation and RNA metabolism. Thus, we investigated their role in cccDNA transcriptional activity regulation and HBV RNA processing. Precise characterization of HBV transcripts was performed with a 5' RACE approach set up and published in our lab by Dr. Bernd Stadelmayer. This technique was applied to study viral transcript in a context of DDX5/17 depletion. Furthermore, DDX5/17 belong to the insulator complex CCCTC-binding protein (CTCF). We therefore investigated the role of CTCF in cccDNA biology and viral RNA metabolism. In HBV infected HepG2-NTCP and Primary Human Hepatocytes, siRNA knockdown of DDX5/17 led to a shortening of all the viral transcripts, together with an increase in viral transcript levels and viral particles accumulation in the cytoplasm, without affecting the global level of cccDNA. Next and third generation sequencing allowed the identification of alternative splicing of pgRNA-derived spliced variants and differential usage of polyadenylation site during HBV RNA transcription. Moreover, RNA immunoprecipitation of DDX5 and DDX17 revealed that both of these proteins are directly associated to the viral transcripts and recruit two factors, CPSF6 and NUDT21, involved in alternative polyadenylation site choice. Moreover, we identified CTCF binding sites on HBV genome and by site directed mutagenesis we showed that mutations in CTCF binding sites affect CTCF and DDX5/17 recruitment to cccDNA and subsequently impact HBV RNA processing. Altogether, our data highlight an essential role of DDX5 and DDX17 in the fine tuning of HBV RNA processing, in complex with the insulator protein CTCF and termination factors at the interface between cccDNA and HBV transcripts

L'épissage alternatif est le mécanisme permettant la production de plusieurs isoformes d'ARNs messagers à partir du même gène. La majorité des gènes humains sont concernés par ce processus. Epissage et transcription étant simultanés, les deux processus sont co-régulés. Plusieurs études récentes ont proposé que l'organisation tridimensionnelle du génome, qui régule la transcription, pourrait également moduler l'épissage. DDX5 et DDX17 sont deux hélicases à ARN impliquées dans plusieurs étapes de la biogenèse et de la maturation des ARNs, y compris la transcription et l'épissage. Des travaux de notre équipe ont montré que leur expression est réprimée lors de la différenciation cellulaire, ce qui contribue à établir des programmes d'épissage spécifiques. DDX5 et DDX17 interagissent avec CTCF et le complexe Cohésine, deux régulateurs de l’organisation 3D de la chromatine, suggérant un rôle des hélicases dans la topologie du génome, et potentiellement dans la connexion éventuelle entre organisation 3D et épissage. Nous avons dans un premier temps évalué l’impact à large échelle de DDX5/17 sur l’épissage par RNA-Seq, et montré que la co-déplétion de CTCF et de Cohésine avec les hélicases augmente leur effet sur l'inclusion de certains exons. De plus, nos résultats indiquent que la déplétion de DDX5/17 impacte la terminaison de la transcription de centaines de gènes. Enfin, nous avons sélectionné deux exons régulés par DDX5/17 et CTCF pour étudier l'organisation tridimensionnelle de leurs gènes par des expériences de 3C (Chromosome Conformation Capture). Le premier candidat est un exon interne du gène NCS1 et le second un exon situé just en aval du promoteurdu gène PRMT2. Nos résultats de 3C indiquent la présence d'une boucle entre le promoteur du gène NCS1 et l'exon alternatif interne. De plus, nous montrons pour les 2 gènes testés la proximité physique entre leur promoteur et leur région terminatrice, et une déstabilisation de cette boucle en absence de DDX5/17, ce qui pourrait expliquer les défauts observés de terminaison. . Enfin, une stabilisation contrainte de la boucle promoteur-terminateur du gène PRMT2 altère l'inclusion de l'exon promoteur proximal de ce gène. Ainsi, nos résultats appuient l'hypothèse d'un lien mécanistique entre l'organisation 3D des gènes et la régulation de l'épissage alternatif et plus généralement de la fidélité de leur transcription
Alternative splicing is the mechanism that allows the production of several mRNA isoforms from the same gene, and that concerns the majority of human genes. As it occurs during transcription, both processes are co-regulated. Several recent studies have proposed that the three-dimensional organization of the genome, which regulates transcription, could also have an impact on splicing. DDX5 and DDX17 are two RNA helicases involved in several steps of RNA biogenesis and processing, including transcription and splicing. Notably, previous studies from our lab have shown they are downregulated during cellular differentiation, which contributes to establish specific splicing programs. Moreover, DDX5/17 interact with CTCF and Cohesin that are key regulators of chromatin topology and looping. This suggests a role for DDX5/17 in genome topology, and could suggest their involvement in the cross-talk between 3D organization and splicing. In order to address this question, we first assessed the impact of DDX5/17 on splicing by RNA-Seq and tested the contribution of CTCF and Cohesin on DDX5/17-dependant exon inclusion. We observed that the co-depletion of CTCF and Cohesin with DDX5/17 increases the effect of the helicases on the inclusion of some exons. Moreover, our results indicate for the first time that depletion of DDX5/17 deregulates transcriptional termination of many genes. Finally, we selected two exons regulated by both DDX5/17 and CTCF and investigated the three-dimensional organization of their associated genes by Chromosome Conformation Capture (3C) assays. The first exon is located within the NCS1 gene while the second exon has a promoter-proximal position in the PRMT2 gene. Our 3C experiments indicate the presence of a chromatin loop between the NCS1 promoter and its internal DDX5/17- and CTCF-regulated exon. Moreover, our results reveal a physical proximity between the promoter and the terminator region of both genes, and a deregulation of this specific configuration upon DDX5/17 depletion, which could possibly lead to transcriptional readthrough. Finally, stabilizing the promoter-terminator loop using a dCas9-based approach altered the inclusion of the PRMT2 promoter-proximal exon. Altogether, our results support the hypothesis of a mechanistical link between the 3D organization of genes and the regulation of alternative splicing and transcription fidelity

Les ARN hélicases DDX5 et DDX17 sont des protéines " multi-tâches ", elles sont impliquées dans de nombreuses étapes de la régulation du métabolisme des ARNs dont la transcription, l'épissage et la dégradation des ARNs. Lors de processus biologiques complexes tels que la myogénèse, les programmes d'expression génique sont profondément modifiés. Durant mon travail de thèse, j'ai contribué à montrer que DDX5 et DDX17 sont des protéines orchestratrices de la différenciation en coordonnant de manière directe et dynamique plusieurs niveaux de régulation génique. DDX5 et DDX17 contrôlent l'activité du facteur de transcription MyoD, régulateur majeur de la myogénèse ainsi que des microARNs spécifiques du muscle miR-1 et miR-206. Ceux-ci ciblent et régulent en retour l'expression de DDX5 et DDX17 mettant en place une boucle de rétro-contrôle négative induisant la diminution d'expression de ces deux protéines au cours de la différenciation. Enfin, cette diminution d'expression permet la mise en place d'un programme d'épissage participant à l'acquisition de phénotypes morphologiques des cellules différenciées. D'un point de vue mécanistique, il apparaît qu'un sous-groupe des événements d'épissage régulés durant la différenciation est contrôlé par la coopération de DDX5 et DDX17 avec le facteur d'épissage hnRNP H/F. D'autre part, DDX5 a aussi été impliqué dans un contexte pathologique du muscle. Cette hélicase interagit avec la mutation responsable de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Durant ma thèse, j'ai produit des résultats préliminaires suggérant un rôle de DDX5 dans la mise en place des défauts d'épissage observés dans cette pathologie

La voie de signalisation NF-kB (nuclear factor kB) régule la transcription de gènes impliqués dans la réponse immune et l’inflammation. L’activation chronique de cette voie est fréquemment retrouvée associée à des désordres inflammatoires et des cancers. Les impacts fonctionnels de l’activation de la voie NF-kB ont été jusqu’à présent étudiés à l’échelle des promoteurs. Néanmoins, les études récentes de la distribution chromatinienne de NF-kB indiquent que la sous-unité NF-kB RelA se localise majoritairement dans les régions intragéniques, incluant des exons et des introns, où ses fonctions restent inconnues. Mes travaux ont consisté à adresser cette question dans le contexte de l’infection par le virus HTLV-1, un activateur chronique de la voie NF-kB, responsable de la leucémie T de l’adulte. Mes données montrent que l’activation de la voie NF-kB par l’oncogène viral Tax de HTLV-1 s’accompagne de modifications de l’épissage alternatif d’exons riches en GC qui coïncident avec le recrutement chromatinien de RelA à proximité de ces exons régulés. Les analyses intégratives des profils d’épissage et du remodelage de la chromatine, combinées à des essais de ciblage expérimental de la chromatine (TALE), démontrent que la fixation intragénique de RelA permet de recruter le régulateur d'épissage DDX17 pour moduler l’épissage alternatif de l’exon via son activité hélicase. Ces données révèlent que, outre ses fonctions transcriptionnelles, le facteur NF-kB RelA agit comme une ancre chromatinienne pour le facteur d’épissage DDX17 et fournit une spécificité de régulation d’épissage alternatif. Ces données revisitent nos connaissances des mécanismes physiopathologiques des maladies associées à HTLV-1 ainsi que d'autres désordres reliés à l’activation chronique de la voie NF-kB
The NF-kB (nuclear factor kB) signaling pathway regulates gene transcription of genes involved in immune response and inflammation. Chronic activation of NF-kB frequently associated with inflammatory disorders and cancer. The functional impacts of NF-kB have long been studied at the promoter level. Nevertheless, recent studies of the chromatin distribution of RelA indicate that this NF-kB subunit is predominantly localized in intragenic regions, including exons and introns, where its functions remain unknown. My work has addressed this question in the context of HTLV-1 infection, which is a constitutive activator of NF-kB, and the causative agent of the Adult T-cell Leukemia. The results show that the activation of NF-kB by the viral oncoprotein Tax results in changes in alternative splicing regulations of GC-rich exons that coincide with the chromatin recruitment of RelA in the vicinity of these exons. Integrative analysis of RNA splicing and chromatin occupancy, combined with experimental chromatin tethering assays (TALE) demonstrate that the intragenic binding of RelA leads to the recruitment of the splicing regulator DDX17, which modulates the inclusion rate of exon thanks to its helicase activity. Altogether, these data reveal that, besides its transcriptional role, NF-kB RelA acts as a chromatin anchor for the splicing factor DDX17 and provides alternative splicing specificity. These data revisit our knowledge of the physiopathologic mechanisms of HTLV-1 associated diseases , as well as other disorders related to the chronic activation of the NF-kB pathway

Les ARN hélicases ddx5 (p68) et ddx17 (p72) sont deux protéines multifonctionnelles très similaires connues pour jouer un rôle dans la transcription comme co-régulateurs de divers facteurs de transcription, dans la maturation des miARNs et des mARNs, en particulier dans l'épissage. Il a été également montré que ces deux hélicases sont impliquées dans le développement et dans différents types de cancers. Afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels ddx5 et ddx17 contrôlent l'expression génique, j'ai dans un premier temps examiné le rôle de ddx5 dans la régulation de c-fos, un gène cible du récepteur aux estrogènes (ER), dont ddx5 est un coactivateur. Les données démontrent que cette hélicase est nécessaire pour l'activité transcriptionnelle induite par l'estradiol du gène c-fos dans une lignée cellulaire de cancer du sein. De plus, ddx5 est nécessaire pour l'épissage co-transcriptionnel de c-fos, facilitant son export. Ainsi, ddx5 est présent dans la « mRNP » (pour messenger RiboNucleoprotein Particle) de c-fos en association avec les facteurs d'export Aly et TAP. Enfin, les résultats obtenus mettent l'accent sur la capacité de ddx5 de suivre un transcrit tout au long de sa voie d'expression génique, de la transcription à son passage dans le cytoplasme, révélant pour la première fois une fonction de cette hélicase dans l'export d'ARNm. J'ai également travaillé sur le rôle de ddx5 et ddxl7 dans la régulation de l'épissage alternatif. Après avoir utilisé une approche à large échelle, je me suis concentrée sur les différents mécanismes moléculaires utilisés pour l'inclusion ou l'exclusion d'exons dépendants de la présence de ddx5/ddx17. J'ai ainsi étudié de quelle manière leur activité d'ARN hélicases est nécessaire pour l'inclusion des exons définis par des sites 5' faibles, présents dans des régions riches en GC. De plus, la déplétion de ddx5/ddx17 entraîne l'inclusion d'exons localisés au sein de régions riches en AT et flanquées par de sites 5' et 3' faibles. Comme résultat, j'ai pu montrer la capacité de ces deux protéines à contrôler le taux d'inclusion des exons par différents mécanismes. Ces résultats sont importants car cela étend les fonctions connues de ddx5 et ddx17 dans la régulation de l'expression génique et aide à mieux comprendre comment elles contrôlent des programmes d'expression génique et donc des programmes cellulaires modifiés dans la progression tumorale
The RNA helicases ddx5 (p68) and ddx17 (p72) are two highly related multi-functional proteins known to play a role in transcription as co-regulators of various transcription factors, in processing of miRNAs and mRNAs, in particular in splicing. It has been moreover shown that these two helicases are involved in development and in different types of cancer. To better understand the mechanisms by which ddx5 and ddx17 control gene expression, I first investigated the role of ddx5 in the regulation of c-fos, a target gene of estrogen receptor (ER), which ddx5 is a co-activator of. The data demonstrated that this helicase is necessary for estradiol induced-transcriptional activity of the c-fos gene in a breast cancer cell line. Moreover, ddx5 is needed for c-fos co-transcriptional splicing, facilitating its export. Thus, ddx5 is present in c-fos mRNP together with the export factors Aly and TAP. Finally, the results obtained emphasised the ability of ddx5 to follow a transcript ail along its gene expression pathway, from transcription to its passage to the cytoplasm, revealing for the first time a function of this helicase in mRNA export. I worked as well on the role of ddx5 and ddx17 in alternative splicing regulation. After having used a large-scale approach, I focused on the different molecular mechanisms behind exon inclusion or exclusion, in a ddx5/ddx17 dependent fashion, detailing how their RNA helicase activity is required for the inclusion of exons defined by weak 5' splicing sites located in GC-rich regions. Moreover, ddx5/ddx17 depletion results in the inclusion of exons located within AT-rich regions and flanked by both weak 5' and 3' splicing sites likely by inhibiting splicing kinetics. Indeed, I showed the ability of these two proteins in controlling the exon inclusion rate by different mechanisms. These results are important because they expand the known functions of ddx5 and ddxl7 in gene expression regulation and help to better understand how they control gene expression programs and therefore cellular programs altered in tumor progression

Das Neuroblastom ist der häufigste extrakraniell gelegene solide Tumor der pädiatrischen Onkologie. Der Verlauf der Erkrankung geht von spontaner Regression oder Differenzierung bis hin zu tödlich verlaufenden Erkrankungen. Die Mortalität von Patienten mit Tumoren in fortgeschrittenen Stadien ist immer noch sehr hoch. Die aggressivsten Tumoren sind die, die eine Amplifikation des Protoonkogens MYCN aufweisen. Eine Untergruppe dieser MYCN amplifizierten Tumoren weist eine Coamplifikation von DDX1 auf. Die Prognose dieser Patienten ist besser als die mit allein MYCN amplifizierten Tumoren, wenn auch immer noch schlechter als die von Patienten ohne MYCN Amplifikation. Das DDX1-Protein ist eine putative RNA-Helikase. Über seine genaue Funktion ist noch nicht viel bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, potentielle Ziel-mRNAs von DDX1 zu identifizieren, um einen besseren Einblick in die Funktionen von DDX1 und mögliche Wege der Beeinflussung von Tumorverhalten und Prognose zu erhalten. Hierzu wurden eine DDX1 amplifizierte und eine nicht amplifizierte Zelllinie in Kultur genommen und eine Immunopräzipitation mit Zelllysaten der beiden Zelllinien durchgeführt – jeweils mit einem spezifischen Antikörper gegen DDX1 und einem unspezifischen Kontrollantikörper. Die Identifizierung der an DDX1 gebundenen mRNAs erfolgte mittels Microarray. Validiert wurden einige der im Microarray identifizierten RNAs mittels RT-PCR. CDK1, ATM und p18 ließen sich als spezifische Ziel-mRNAs von DDX1 identifizieren.

Les cellules sont constamment exposées à des agents endommageant de l'ADN d'origine exogène, notamment les rayons ultraviolets, les irradiations γ, et l'exposition aux agents chimiques génotoxiques, mais également d'origine endogène générés par le métabolisme cellulaire. De plus en plus d'évidences montrent que la transcription est un processus biologique qui peut mettre en péril l'intégrité du génome. Un mécanisme actuellement très étudié qui lie la transcription à l'instabilité génomique est la formation des boucles R (R-loops), des structures hybrides ARN:ADN qui exposent un ADN simple brin déplacé. Ces structures aberrantes se présentent en tant que sous-produits de la transcription et/ou lors de l'interférence entre la réplication et la transcription, et plus récemment ils ont été montrées s'accumuler lorsque la biogénèse de l'ARNm est perturbée. La persistance des boucles R est une source importante d'instabilité génomique car elle peut générer des cassures double brin de l'ADN et favoriser la recombinaison. Pour faire face aux conséquences néfastes des endommagements de l'ADN, les cellules activent une cascade élaborée de voies de signalisation qui permet de coordonner la prolifération cellulaire avec la réparation de l'ADN. L'ensemble de ces acteurs moléculaires constitue un réseau de réponse aux dommages de l'ADN qui est indispensable pour la stabilité génomique. Récemment chez la levure, l'activation transitoire de ce réseau a été également proposée être important dans la coordination de la transcription et de la réplication, afin d'éviter d'une part des contraintes topologiques et d'autre part la formation de structures aberrantes générées lors de conflits entre ces deux processus cellulaires essentiels. Dans la perspective d'identifier des nouveaux gènes impliqués dans ce réseau de signalisation, un crible fonctionnel in vitro précédemment établi au laboratoire a conduit à l'identification de Ddx19, une hélicase à motif DEAD-box, en tant que nouvel élément répondant à l'endommagement de l'ADN. Ddx19 interagit avec le pore nucléaire via CAN/Nup214, et il est impliqué dans l'export des ARNm grâce à son activité hélicase et ATPase, stimulé par les facteurs IP6 et Gle1. Le présent travail de thèse dévoile une nouvelle fonction de Ddx19 distincte de son rôle connu dans l'export de l'ARNm. Je pu montrer que, lors de l'induction des dommages à l'ADN par les rayons UV, Ddx19 se relocalise transitoirement de la face cytoplasmique du nucléopore vers le noyau de façon dépendant d'ATR. L'inactivation de Ddx19 entraîne des endommagements spontanées dépendant de la prolifération, démontré par l'activation de la voie de signalisation d'ATM-Chk2 et la formation de foyers nucléaires de γH2AX et 53BP1. Ces phénotypes sont concomitants avec le ralentissement des fourches de réplication qui ne peuvent plus redémarrer après leur blocage par la camptothécine. En outre, les cellules déplétées de Ddx19 présentent une forte accumulation des boucles R nucléaires, enrichi dans le compartiment nucléolaire, et aussi autour de la périphérie nucléaire. Par ailleurs, ces cellules présentent une viabilité réduite et une létalité synthétique lorsque la déplétion de Ddx19 est combinée avec l'inhibition de l'expression de la topoisomérase I. Je propose Ddx19 comme deuxième hélicase nécessaire pour la résolution des boucles R, et qui fonctionne à côté mais de façon indépendante de la Senataxin, l'hélicase précédemment connue pour résoudre ces structures in vivo chez les cellules de mammifères. Je démontre que cette nouvelle fonction de Ddx19 ne dépend pas de son interaction avec le pore nucléaire, mais plutôt de son activité hélicase et d'un résidu de sérine phosphorylée par Chk1 qui stimule sa relocalisation vers le noyau. Ces données proposent Ddx19 en tant que nouvelle ARN hélicase qui facilite la coordination de la réplication et la transcription, médiée par ATR à travers de la résolution des boucles R, préservant ainsi l'intégrité du génome
Cells are continuously challenged by DNA damage resulting from external cues as UV light, γ-irradiation and exposure to genotoxic chemicals, as well as from endogenous stress caused by cellular metabolism. Growing evidence points to transcription as a biological process that could adversely affect genome integrity. One currently highly investigated mechanism by which transcription can induce genome instability is through the formation of R-loops, RNA:DNA hybrid structures exposing a displaced single-stranded DNA tract. These aberrant structures occur as byproducts of transcription and/or upon interference between replication and transcription, and more recently were also shown to accumulate upon disruption of mRNA biogenesis and processing. Persistent unresolved R-loops are a potent source of genomic instability as they ultimately generate double strand breaks and promote recombination events. To deal with the deleterious consequences of DNA damage, cells activate elaborate DNA damage response (DDR) pathways to delay cell division and stimulate repair of lesions, thus preserving genome stability. Recently in yeast transient DDR activation has also been proposed to be important in the coordination of transcription and replication, in order to avoid topological constraints and the formation of aberrant structures generated upon collision of their machineries. By means of an in vitro screen aimed at identifying new DDR genes, we isolated Ddx19, a DEAD-Box helicase known to be involved in mRNA export, as a novel DNA damage responsive gene. Ddx19 interacts with the nucleopore complex via nucleoporin CAN/Nup214, and is involved in mRNA remodelling and export through its ATPase and helicase activities, stimulated by IP6 and the Gle1 factor. My present thesis work unravels a novel function of Ddx19 in preserving genome stability in mammalian cells, distinct from its known role in mRNA export. I show that upon UV-induced damage, Ddx19 transiently relocalizes from the cytoplasmic face of the nucleopore to the nucleus in an ATR-dependent manner. Downregulation of Ddx19 gives rise to spontaneous, proliferation-dependent DNA damage, as determined by the specific activation of the ATM-Chk2 pathway and formation of γH2AX and 53BP1 nuclear foci. This is concomitant with the slowing down of replication forks that are unable to restart after being stalled with camptothecin. In addition, cells depleted of Ddx19 display strong accumulation of nuclear R-loops, enriched in the nucleolar compartment, and around the nuclear periphery. Moreover, these cells show low viability and exhibited synthetic lethality when combined with inhibition of topoisomerase I expression. I propose Ddx19 as a second helicase required for R-loops resolution, functioning alongside but independently of Senataxin, the first known RNA helicase to resolve these structures in vivo in mammalian cells. I provide evidence that this new function of Ddx19 does not depend on its interaction with the nuclear pore, but rather on its helicase activity and on a serine residue phosphorylated by Chk1 which promotes its relocalization into the nucleus upon damage. These data put forward Ddx19 as a novel RNA helicase that facilitates ATR-dependent coordination of DNA replication and transcription through R-loops resolution, thus preserving genome integrity

O neuroblastoma é o tumor sólido extra-cranial mais comum e mortal da infância, sendo o tempo de sobrevida nos casos mais agressivos ainda muito curto. Uma das esperanças nesses casos é que os estudos moleculares possam fornecer informações sobre os genes ou as vias moleculares que governam a patogênese dos neuroblastomas. Pois, há poucos genes como o MYCN, que foi descrito por estar diretamente ligado ao neuroblastoma. A amplificação deste oncogene ocorre em pouco mais de 25% dos neuroblastomas e é considerada como o mais importante marcador de prognóstico nestes tumores, sendo fortemente relacionada aos estádios avançados da doença e falha no tratamento. Outros genes do amplicon do MYCN, incluindo o DDX1 \"DEAD box polypeptide 1 gene\" e o NAG \"neuroblastoma-amplified gene\", estão sendo observados por se apresentarem co-amplificados com o MYCN. Entretanto, a importância deste fenômeno no prognóstico ainda é desconhecida. Os objetivos deste trabalho foram determinar qual o melhor método para estudar a amplificação dos genes MYCN, DDX1 e NAG, além de esclarecer a importância da coamplificação dos genes DDX1 e NAG no prognóstico. Procedimento: O número de cópias dos genes MYCN, DDX1 e NAG foi determinado por PCR em Tempo Real e PCR convencional em 100 neuroblastomas primários. Os dados da PCR em Tempo Real foram analisados por quantificação absoluta e relativa. Os resultados da PCR convencional foram analisados por eletroforese em gel de agarose, medindo a intensidade das bandas formadas no gel no sistema Kodak. A relevância da amplificação gênica como marcador de prognóstico foi avaliada em 74 pacientes, dos quais nós obtivemos o acompanhamento clínico. Resultados: Nos 74 casos estudados, ambos os métodos demonstraram que a amplificação do MYCN estava associada com os estádios mais avançados da doença. A análise das curvas de sobrevida livre de progressão confirmou que pacientes com ausência de amplificação do MYCN apresentavam maior tempo de sobrevida. Nós também analisamos a amplificação do DDX1 nas mesmas amostras incluindo aquelas com ausência de amplificação de MYCN. Não foi encontrada nenhuma relação entre a co-amplificação com idade ao diagnóstico ou tempo de sobrevida. Conclusões: Os métodos aplicados para calcular o número de cópias dos genes na PCR em Tempo Real mostraram-se equivalentes. A PCR em Tempo Real apresentou maior acurácia nos resultados quando comparada à PCR convencional. A análise da sobrevida não demonstrou relação entre a amplificação dos genes DDX1 e/ou NAG com piora no prognóstico.
Neuroblastoma is the most common and deadly extra-cranial solid childhood tumor. Survival rates for aggressive neuroblastomas are still disappointingly low. One of the hopes is that molecular studies will provide insights into the genes and molecular pathways that govern neuroblastoma pathogenesis. However, at present only a few genes as MYCN have been directly linked to neuroblastoma. MYCN oncogene amplification, occurring in up to 25% of neuroblastomas, has been considered the most important prognostic factor, strongly correlating to advanced stage disease and treatment failure. Another genes in the MYCN amplicon, including the DEAD box polypeptide 1 (DDX1) gene, and neuroblastoma-amplified gene (NAG gene), have been found to be frequently co-amplified with MYCN in NB. But the prognostic significance of the coamplification remains unclear. The aims of this study were to evaluate which is the best method to study the gene amplification of those three genes MYCN, DDX1 and NAG, as well as clarify the prognostic significance of the co-amplification or DDX1 and NAG with MYCN. Procedure: The gene copy numbers of MYCN, DDX1, and NAG were determined by the real-time quantitative polymerase chain reaction and conventional polymerase chain reaction in 100 primary NBs. Real-Time data were analyzed by absolute and relative quantification. For conventional PCR, samples were electrophoresed on a 2% agarose gel and the intensity of each band evaluated by Kodak image software. To evaluate of the prognostic significance of the gene amplification we had only 74 cases in witch we could analyze the follow-up. Results: In all 74 cases, both methods demonstrated that MYCN amplification was associated mainly with advanced cancer stages, and the analysis of overall survival confirmed that patients without MYCN amplification had a cumulative survival significantly higher than patients with oncogene amplification. We also studied DDX1 and NAG amplification for all NB samples even that without MYCN amplification. No relationship between any gene co-amplification status and disease stage, age at diagnosis, or overall survival was found. Conclusions: The two methods used to calculate gene copy number for Real Time PCR assay shown to be equivalent. Real Time PCR assay shown to be more accurate to study gene amplification than conventional PCR assay. Survival analysis pointed out that DDX1 and/or NAG amplification has no additional adverse effect on prognosis.

Das Neuroblastom ist der häufigste extrakraniell gelegene solide Tumor der pädiatrischen Onkologie. Der Verlauf der Erkrankung geht von spontaner Regression oder Differenzierung bis hin zu tödlich verlaufenden Erkrankungen. Die Mortalität von Patienten mit Tumoren in fortgeschrittenen Stadien ist immer noch sehr hoch. Die aggressivsten Tumoren sind die, die eine Amplifikation des Protoonkogens MYCN aufweisen. Eine Untergruppe dieser MYCN amplifizierten Tumoren weist eine Coamplifikation von DDX1 auf. Die Prognose dieser Patienten ist besser als die mit allein MYCN amplifizierten Tumoren, wenn auch immer noch schlechter als die von Patienten ohne MYCN Amplifikation. Das DDX1-Protein ist eine putative RNA-Helikase. Über seine genaue Funktion ist noch nicht viel bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, potentielle Ziel-mRNAs von DDX1 zu identifizieren, um einen besseren Einblick in die Funktionen von DDX1 und mögliche Wege der Beeinflussung von Tumorverhalten und Prognose zu erhalten. Hierzu wurden eine DDX1 amplifizierte und eine nicht amplifizierte Zelllinie in Kultur genommen und eine Immunopräzipitation mit Zelllysaten der beiden Zelllinien durchgeführt – jeweils mit einem spezifischen Antikörper gegen DDX1 und einem unspezifischen Kontrollantikörper. Die Identifizierung der an DDX1 gebundenen mRNAs erfolgte mittels Microarray. Validiert wurden einige der im Microarray identifizierten RNAs mittels RT-PCR. CDK1, ATM und p18 ließen sich als spezifische Ziel-mRNAs von DDX1 identifizieren.

Cardiomyopathies are the most common form of genetic disorders featuring primary abnormalities in the structure and function of the heart. Over the past few decades, tremendous progress has been made in elucidating the genetic basis of cardiac disorders. However, the development of specific and effective therapies remains largely limited due to the lack of suitable therapeutic targets. Nucleoli are polyfunctional subnuclear domains that are heavily involved in ribosomal RNA production. Recent studies have identified nucleolar structure perturbations and functional defects associated with different types of cardiomyopathies. Additionally, several mutations have been identified in several ribosomal genes that are linked to cardiomyopathy in human patients. We previously identified a nucleolar DEAD-box RNA helicase, DDX27, as a critical regulator of myogenesis. This study aimed to investigate the role of ddx27 deficiency in cardiac muscle and expand the understanding of DDX27 mediated pathways that are involved in myopathies. In this study, we used zebrafish models to investigate ddx27 deficiency in cardiac muscle. Phenotype characterization, cardiac function testing, transmission electron microscopy and histological analysis of ddx27 mutants revealed corresponding dilated cardiomyopathy and skeletal muscle hypotrophy. Furthermore, knockdown of DDX27 ortholog, Rs1, in cardiac muscle was fatal for Drosophila larvae. However, other tissues (i.e., neural or gastrointestinal) were unaffected suggesting that abnormalities caused by Ddx27 deficiency are specific to cardiac and skeletal muscle. Immunofluorescence, northern blotting and polysomal profiling of ddx27 zebrafish myofibers revealed that DDX27 is necessary for preserving nucleolar architecture and ribosome biogenesis. Here we have shown that DDX27 is essential for normal function of cardiac and skeletal myogenic processes due to its critical role in ribosomal regulation. Additionally, we provide novel evidence for DdX27 deficiency contributing to dilated cardiomyopathy. Overall, the findings of this study provide further evidence for the role of RNA helicases, specifically DDX27, in cardiac and skeletal muscle pathogenesis as well as provide novel insight into the molecular pathways of therapeutic benefit for afflicted patients of these diseases.
2022-06-04T00:00:00Z

碩士
國立臺灣大學
分子醫學研究所
89
hnRNP K is a multifunctional protein known to be involved in regulation of transcription, translation, nuclear transport and signal transduction. Some hnRNP K- associated proteins have been isolated. In the thesis, I defined a new member of hnRNP K interacting protein, DDX1. DDX1 is a member of the DEAD box protein family, members of the DEAD-box family contain eight conserved motifs with demonstrated ATPase activity. In addition to the reported DDX1, a longer form (DDX1(#4)) with an extra 121 nucleotides fragment located between nucleotides 241 and 242 of DDX1(#3) was isolated. Both forms of DDX1s can interact with hnRNP K in in vitro and in vivo assays. The region spanning from amino acid 1-276 of hnRNP K is apparently responsible for its physical interaction with DDX1. The ATPase activity of the purified recombinant DDX1(#3) protein was stimulated by some single-stranded RNAs, including poly(A), poly(U) and poly(C), and yeast and HeLa cell total RNA, but not by DNAs. In the presence of hnRNP K, the ATPase activity of DDX1(#3) with poly(C) was partially (~25%) inhibited.

碩士
國立中興大學
生物化學研究所
102
The study contains two parts: the first part is determing the structure of protein XccFhrR, which regulates causative hrp genes, in Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). FhrR transcription factor belongs to the TetR family, and regulates the expression of genes that encode flagella, Hrp and ribosomal proteins. We have obtained the native crystals of XccFhrR that diffracted to a resolution of 2.9 A. We tried to get the phase by the molecular replacement approach using the most similar protein Sco0520, but were not able to successfully extract the phase information. To solve the problem, we have prepared the Se-Met labeled protein. We have obtained preliminary Se-Met labeled crystals, but they are too small for X-ray diffrection. More efforts are required to grow bigger crystals. The second part is to study the complex structure of the dsRNA receptor protein DDX1 and DDX21 in the mammalian innate immune system. The full-lenth DDX1 and DDX21 are very difficult to obtain in soluble form, and we finally found the DDX11-440 and DDX211-571 fragements are very soluble. We have tried to obtain their co-crystal by using a variety of crystallization conditions, yet no crystal could be obtained so far.

La déficience intellectuelle (DI) définit un groupe de conditions génétiquement hétérogènes caractérisées par l’apparition de troubles cognitifs précoces chez l’enfant. Elle affecte 1-3% de la population dans les pays industrialisés. La prévalence de la DI est beaucoup plus élevée ailleurs dans le monde, en raison de facteurs sociodémographiques comme le manque de ressources dans le système de santé, la pauvreté et la consanguinité. Des facteurs non-génétiques sont mis en cause dans l’étiologie de la DI ; on estime qu’environ 25% des cas de DI sont d’origine génétique. Traditionnellement, les bases moléculaires de la DI ont été investiguées par des analyses cytogénétiques, les approches de cartographie génétique et le séquençage de gènes candidats ; ces techniques de génétiques classiques sont encore mises à rude épreuve dans l’analyse de maladies complexes comme la DI. La DI liée à l’X a été particulièrement étudiée, avec plus d’une centaine de gènes identifiés uniquement sur le chromosome X. Des mutations hétérozygotes composites sont mises en évidence dans la DI autosomique, dans le contexte d’unions non-consanguines. L’occurrence de ce type de mutations est rare, chez des individus non-apparentés, de sorte que les mutations dominantes de novo sont plus courantes. Des mutations homozygotes sont attendues dans les populations consanguines ou marquées par un effet fondateur. En fait, les bases moléculaires de la DI autosomique ont été presqu’exclusivement étudiées dans le contexte de populations avec des forts taux de consanguinité. L’origine de la DI demeure encore inconnue dans environ 60 % des cas diagnostiqués. En l’absence de facteurs environnementaux associés à la DI chez ces individus, il est possible d’envisager que des facteurs génétiques non identifiés entrent en jeu dans ces cas de DI inexpliqués. Dans ce projet de recherche, nous voulions explorer l’origine génétique de la DI, dans vingt familles, où une transmission de la maladie selon un mode autosomique récessif est suspectée. Nous avons mis de l’avant les techniques de séquençage de nouvelle génération, afin de mettre en évidence les déterminants génétiques de la DI, à l’échelle du génome humain. En fait, nous avons priorisé la capture et le séquençage de l’exome; soient la totalité des régions codantes du génome humain et leurs sites d’épissage flanquants. Dans nos analyses, nous avons ciblé les variants qui ne sont pas rapportés trop fréquemment dans différentes bases de données d’individus contrôles, ces mutations rares cadrent mieux avec une condition comme la DI. Nous avons porté une attention particulière aux mutations autosomiques récessives (homozygotes et hétérozygotes composites) ; nous avons confirmé que ces mutations ségréguent avec une transmission récessive dans la famille à l’étude. Nous avons identifié des mutations dans des gènes pouvant être à l’origine de la DI, dans certaines des familles analysées ; nous avons validé biologiquement l'impact fonctionnel des mutations dans ces gènes candidats, afin de confirmer leur implication dans la pathophysiologie de la DI. Nous avons élucidé les bases moléculaires de la DI dans huit des familles analysées. Nous avons identifié le second cas de patients avec syndrome de cassure chromosomique de Varsovie, caractérisé par des dysfonctions de l’ARN hélicase DDX11. Nous avons montré qu’une perte de l’activité de TBC1D7, une des sous-unités régulatrice du complexe TSC1-TSC2, est à l’origine de la pathologie dans une famille avec DI et mégalencéphalie. Nous avons mis en évidence des mutations pathogéniques dans le gène ASNS, codant pour l’Asparagine synthétase, chez des patients présentant une microcéphalie congénitale et une forme progressive d’encéphalopathie. Nous avons montré que des dysfonctions dans la protéine mitochondriale MAGMAS sont mises en cause dans une condition caractérisée par un retard prononcé dans le développement associé à une forme sévère de dysplasie squelettique. Nous avons identifié une mutation tronquant dans SPTBN2, codant pour la protéine spinocerebellar ataxia 5, dans une famille avec DI et ataxie cérébelleuse. Nous avons également mis en évidence une mutation dans PIGN, un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des ancres de glycosylphosphatidylinositol , pouvant être à l’origine de la maladie chez des individus avec épilepsie et hypotonie. Par ailleurs, nous avons identifié une mutation - perte de fonction dans CLPB, codant pour une protéine chaperonne mitochondriale, dans une famille avec encéphalopathie néonatale, hyperekplexie et acidurie 3-méthylglutaconique. Le potentiel diagnostic des techniques de séquençage de nouvelle génération est indéniable ; ces technologies vont révolutionner l’univers de la génétique moléculaire, en permettant d’explorer les bases génétiques des maladies complexes comme la DI.
Intellectual disability (ID) regroups greatly heterogeneous conditions that are characterized by early-onset cognitive impairment. ID affects about 1-3% of Western populations; but its prevalence is much higher in deprived regions of the world where socio-demographic factors like poor healthcare, lack of resources and parental consanguinity prevail. Non-genetic factors are involved in the etiology of ID; approximately 25% of ID cases are of genetic origin. Traditionally, the molecular basis of ID have been assessed through cytogenetic analyses, genetic mapping and candidate gene approaches. These classical genetic tools are still put to the test in the study of complex diseases like ID. Until recently, X-linked ID cases were the main focus of studies on ID with more than hundred ID genes identified only on the X chromosome. Compound heterozygous mutations are identified in autosomal forms of ID, in the context of non-consanguineous unions. However, the occurrence of such mutations is rare in outbred populations, so that dominant de novo mutations are most common in unrelated individuals. Homozygous mutations are expected in consanguineous unions or in populations marked by a founder effect. In fact, the molecular bases of autosomic recessive ID have been almost exclusively studied in populations with high consanguinity rates. ID remains unsolved in more than 60% of patients. In the absence of environmental factors associated with ID in these individuals, it is possible to consider that unidentified genetic factors are involved in these unexplained ID cases. In this research project, we used next generation sequencing technologies to highlight the genetic causes of ID in twenty families were an autosomal recessive mode of inheritance is expected. We prioritized the use of whole-exome sequencing, namely all coding exons in the genome of this individual. In our analyses, we filtered out variants that were too common in control individuals to describe a rare condition like ID. We focussed our attention on rare autosomic recessive varaiants (homozygous and compound heterozygous), these mutations were confirmed by Sanger re-sequencing to segregate with an autosomal recessive mode of inheritance in the family. We identified mutations in candidate genes for ID in some of the family analysed, we validated the functional impact of the mutations in these genes to confirm their involvement in the pathophysiology of ID in the family studied. We explained the molecular basis of ID in eight of the families studied. We identified the second case of Warsaw-Breakage-Syndrome, a rare genetic disorder characterised by dysfunction of the RNA helicase DDX11. We showed that disruption in TBC1D7, a functional subunit of the TSC1-TSC2 protein complex, cause ID and megalencephaly. We demonstrated that ASNS, the Asparagine Synthetase gene, is defective in patients with congenital microcephaly and progressive encephalopathy. We showed that the gene coding for the mitochondrial protein MAGMAS is involved in the pathophysiology of a condition characterised by developmental delay and severe skeletal dysplasia. We identified a truncating mutation in SPTBN2, encoding for the spinocerebellar ataxia 5 proteins, in a family with ID and spinocerellar ataxia. We also identified a mutation in a gene involved in the biosynthetic pathway of glycosylphosphatidylinositol anchors; the mutation in PIGN may cause the epilepsy and hypotonia features observed in the affected individuals of that family. Finally, we identified a loss of function mutation in CLPB, coding for a mitochondrial chaperone, in individuals with severe encephalopathy, hypereklexia and 3-methylglutaconic aciduria. The diagnostic potential of next generation sequencing technologies is undeniable. These technologies will revolutionize the world of molecular genetics; they will help deciphering the molecular basis of complex diseases like ID.