Dissertations / Theses on the topic 'Enfermedad de Huntington'

La actual investigación en el campo de las células madre está ofreciendo nuevas posibilidades de terapia para enfermedades incurables del sistema nervioso, como es el caso de la corea de Huntington. Esta es una enfermedad hereditaria caracterizada por una degeneración selectiva de las neuronas GABAérgicas del Núcleo Estriado. Para poder desarrollar terapias de reemplazo celular basadas en los transplantes de células madre es necesario controlar el proceso de diferenciación de las células madre hacia el fenotipo neuronal GABAérgico.
En la presente tesis hemos estudiado los mecanismos de supervivencia de las células madre en cultivo y los factores implicados en la diferenciación selectiva hacia el fenotipo GABAérgico. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación in vitro basado en la adición secuencial de ácido retinoico (RA) y cloruro potásico (KCl). El RA promueve la supervivencia celular e induce un fenotipo neuronal. El tratamiento con KCl induce selectivamente el fenotipo GABAérgico. Mediante este procedimiento se generan un elevado número de neuronas GABAérgicas maduras, post-mitóticas y funcionales, de forma eficaz y homogénea, a partir de una línea de células madre en cultivo.
El transplante de estas células pre-diferenciadas in vitro en el cerebro adulto de rata y en un modelo excitotóxico de la enfermedad de Huntington demuestran un buen grado de diferenciación, supervivencia e integración funcional. Las células muestran una supervivencia a largo plazo, conservan el fenotipo neuronal GABAérgico y elaboran procesos neuríticos asociados a posibles contactos pre- y post-sinápticos.
Estos resultados apoyan la posibilidad de desarrollar terapias celulares basadas en la diferenciación de células madre para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
"CELL THERAPY IN MODELS OF HUNTINGTON'S DISEASE"

The implementation of cell replacement therapies for Huntington's disease using multipotent neural stem cells requires the specific differentiation into gamma-aminobutyric acid (GABA) neuronal subtype prior to transplantation. In the present thesis we present an efficient culture procedure that induces stable GABAergic neurons from the immortalized striatal neural stem cell line ST14A. This process requires sequential retinoic acid treatment and KCl depolarization. Initial addition of retinoic acid increased cell survival and promoted neuronal differentiation. Subsequent stimulation with KCl induced specific differentiation into GABAergic neurons, yielding 74% of total cultured cells. KCl-evoked Ca2+ influx reduced cell proliferation and nestin expression, and induced neurite outgrowth and GABAergic markers as well as GABA contents, release and uptake.
Characterization of the integration, survival and phenotype of these pre differentiated GABAergic neurons following transplantation into the adult brain in a model of Huntington's disease revealed long-term survival in quinolinate-lesioned striata. Under these conditions, cells maintained their GABAergic phenotype and elaborated neurite processes with synaptic contacts with endogenous neurons.
We present an in vitro procedure that generates a homogeneous population of functional GABAergic neurons from a neural stem cell line, which survive and maintain their acquired fate in vivo. This data may lend support to the possibility of cell replacement therapies for Huntington's disease using neural stem cells.

En la enfermedad de Huntington (HD), muchos síntomas están asociados con alteraciones en las funciones reguladas por la dopamina y el glutamato; una intervención directa sobre los receptores de dopamina D1 (D1R) pueden provocar numerosos efectos secundarios dada la amplia distribución en el sistema nervioso central. En nuestro grupo de investigación se demostró que el heterómero que forman los D1R con los receptores H3 de histamina (D1R- H3R), y que posee nuevas propiedades bioquímicas y farmacológicas, podría actuar como una posible diana terapéutica para regular la sobreactivación del D1R mediante una modulación por parte del H3R en etapas tempranas de HD. En células Wt y modelo de HD demostramos ahora, mediante ensayos de ligación por proximidad (PLA), la presencia de los heterómeros A1R-D1R, A2AR-D2R, D1R-D3R D1R-NMDAR y H3R-NMDAR que podrían considerarse nuevas dianas para HD. D1R-NMDAR y H3R-NMDAR señalizan a través de la vía de fosforilación de ERKs; sin embargo, en el modelo HD no se modificó dicha señalización. En la vía del AMPc, H3R-NMDAR presentó un cross-talk positivo de NMDAR sobre H3R para las células Wt y negativo para las células HD. Mediante ensayos de unión de radioligandos, los ligandos del H3R: imetit y RAMH (agonistas), A331440, carcinina, conessina y VUF 4904 (antagonistas) modulan alostéricamente la unión de la dopamina al D1R, específicamente al segundo protómero del homómero D1R-D1R. Además, mediante estudios de BRET, se confirmó que estos receptores forman un complejo heterotetrámero D1R-D1R-H3R-H3R que puede activar diferencialmente los distintos subtipos Gαs y Gαi, éste último a altas concentraciones de agonistas de D1R. Concretamente, entre los subtipos de proteína Gαi, el heterómero D1R-H3R tiene preferencia por los subtipos Gαi1 y Gαo2. Al determinar la afinidad de ligandos de H3R al unirse a su receptor en presencia o no de D1R, se determinó que los antagonistas A331440, ROS, conessina y JNJ10181457 mostraron mejor afinidad por el heterómero D1R-H3R que sobre el homómero H3R-H3R, lo que indica la existencia de una modulación alostérica de D1R sobre el centro ortostérico de H3R que favorece la unión de estos ligandos a H3R dentro del heterómero. El JNJ10181457, presentó una mejor afinidad de unión al heterómero y también una mayor potencia de bloqueo de la señal del AMPc inducida por la activación del H3R en el heterómero. Esto significa que el D1R ejerce de modulador alostérico positivo tanto de la unión como del efecto antagónico de la vía del AMPc del JNJ10181457. Estos resultados hacen de este antagonista un candidato ideal como lead compound en la búsqueda de ligandos de H3R selectivos del heterómero D1R-H3R. Mediante ensayos de BRET de proteína G, CODA-RET y de determinación de AMPc, se ha determinado que los complejos H3R-H3R y D1R-H3R pueden activar a la proteína Gαi al ser tratados con agonistas selectivos de H3R. Al evaluar la preferencia diferencial de estos complejos por las subunidades de Gαi/Gαo, se detectó que ambos complejos pueden activar a las subunidades Gαo1, Gαo2, Gαi1, Gαi2 y Gαi3; sin embargo, podemos decir que RAMH para la subunidad Gαo1, proxyfam para la Gαi1, SAMH para Gαi2 e imetit para Gαi1 y Gαi3 tienen preferencia por el heterómero. Al analizar la vía de activación de las ERKs, cuando el H3R del heterómero D1R-H3R se activó con immepip, se alcanzó un nivel de señalización similar al del SKF 81297. Se encontraron resultados opuestos al analizar la vía de las ERKs y la del AMPc con los ligandos RAMH, immethridina, histamina y SAMH que podrían sugerir un biased agonism que deberá confirmarse con curvas completas de activación de ERKs que permitan calcular las respectivas EC50. Todo ello valida nuestro interés por encontrar ligandos selectivos del heterómero D1R-H3R.
Huntington's disease (HD) presents alterations in dopamine neurotransmission; a direct intervention on dopamine D1 receptors (D1R) would cause numerous side effects. The heteromer with the histamine H3 receptor (D1R-H3R), which has new pharmacological properties, could regulate the overactivation of D1R through modulation by H3R in early stages of HD. In Wt and HD model cells, we demonstrated the presence of the heteromers A1R-D1R, A2AR-D2R, D1R-D3R, D1R-NMDAR and H3R- NMDAR. With cAMP signaling, H3R-NMDAR presented a positive cross-talk of NMDAR over H3R for Wt cells and negative for HD cells. Through binding assays, imetit, RAMH, A331440, carcinin, conessin and VUF 4904 allosterically modulate the binding of dopamine to the second protomer of the D1R-D1R homomer, which is part of the D1R- D1R-H3R-H3R heterotetramer and that can differentially activate the Gαs and Gαi subtypes, the latter at high concentrations of D1R agonists. The D1R-H3R heteromer has a preference for the Gαi1 and Gαo2 subtypes. The antagonists A331440, ROS, conessin and JNJ10181457 showed a greater affinity for the D1R-H3R heteromer than for the H3R-H3R homomer, which indicates an allosteric modulation of D1R on the orthosteric center of H3R favoring the binding of these ligands to H3R. JNJ10181457 also presented a higher blocking power of the cAMP signal induced by the activation of the H3R in the heteromer. This means that D1R acts as a positive allosteric modulator of both the binding and the antagonistic effect of the JNJ10181457 on cAMP pathway. It would be a lead compound in the search for selective H3R ligands of the D1R-H3R heteromer. The H3R-H3R and D1R-H3R complexes can activate all the Gαi protein subtypes when treated with selective H3R agonists; RAMH for Gαo1, proxyfam for Gαi1, SAMH for Gαi2 and imetit for Gαi1 and Gαi3 have a preference for the heteromer. When analyzing the activation pathway of ERKs, immepip activated the H3R of the D1R-H3R heteromer with a level of signaling similar to that of SKF 81297. Opposite results were found when analyzing the pathway of ERKs and that of cAMP with the ligands RAMH, immethridine, histamine and SAMH that could suggest a biased agonism that must be confirmed.

El caràcter minoritari de la malaltia de Huntington ha suposat, en comparació a altres processos neurodegeneratius més freqüents, un desajustat i lent avanç en la comprensió dels mecanismes neuropatològics responsables de la malaltia i en la identificació i descripció detallada dels fenotips clínics que la caracteritzen . Històricament, les manifestacions clíniques de la malaltia de Huntington, han estat preferentment atribuïdes a la característica atròfia subcortical que presenten tots els pacients. En correspondència amb aquesta atròfia dels ganglis basals, des del punt de vista neuropsicològic, la malaltia de Huntington ha estat considerada un paradigma de demència subcortical amb un perfil neurocognitiu frontal-disexecutiu caracteritzat per alentiment cognitiu, disfunció executiva, apatia i canvis de personalitat. El desenvolupament d'estudis observacionals de caràcter multicèntric i internacional, ha permès al llarg dels últims 15 anys, aprofundir de manera notable en el coneixement de la malaltia gràcies a l'seguiment de grans cohorts de persones afectades. Aquests estudis han il·lustrat que, des d'etapes primerenques de la malaltia i fins i tot durant la fase asimptomàtica, alguns dels canvis neuropatològics més evidents s'estenen més enllà dels ganglis basals i afecten extensos territoris corticals, principalment en àrees parieto-occipitals i temporals. En paral·lel a aquestes troballes, els treballs que han explorat la correspondència de les anomalies cerebrals amb les manifestacions clíniques de la malaltia, han revelat que les alteracions cognitives desborden àmpliament el perfil disexecutiva i que l'alteració de múltiples dominis i processos il·lustren un fenotip cognitiu bastant més complex i divers a l'inicialment descrit. Tot i això, queden moltes incògnites per resoldre. Actualment sabem que canvis cognitius i conductuals subtils, objectivables a través del rendiment en determinades tasques, poden posar-se de manifest fins a 15 anys abans que les primeres manifestacions motores siguin evidents. Això ha suposat que la comunitat científica dedicada a la malaltia hagi centrat importants esforços a explorar les variables cognitives que caracteritzen la malaltia i que prediuen la seva progressió, així com la manera en què podem capturar de manera eficient les primeres manifestacions preclíniques. També sabem, que independentment de la càrrega genètica de la malaltia, hi ha una notable variabilitat tant en l'edat d'inici com en la forma i en el curs que adquireix la malaltia al llarg de la seva evolució. Ampliar el nostre camp de visió més enllà dels ganglis basals ha contribuït a desvetllar un conjunt d'elements encara difícils d'encaixar amb precisió en el conjunt de la malaltia, però que reafirmen la necessitat d'aprofundir en l'estudi dels seus mecanismes causals. Seguim sense comprendre clarament: 1) perquè la malaltia es comporta de diferent manera en persones la càrrega genètica i edat és la mateixa; 2) quin paper tenen alguns dels canvis cerebrals més subtils i primerencs que esdevenen en el curs de la malaltia; 3) quin és el patró de neurodegeneració cerebral associat a determinades manifestacions neuropsiquiàtriques amb la limitació que això comporta per als plantejaments terapèutics; 4) quin és el perfil neurocognitiu concret de les formes greus de deteriorament cognitiu en la malaltia, ni com podem mesurar aquests perfils en les seves formes lleus i greus ni, 5) quin sigui el patró neurodegeneratiu que presenten els pacients que desenvolupen demència. Els objectius d'aquesta tesi, com posen de manifest els treballs publicats que la conformen, s'han dirigit a la recerca d'algunes respostes per a aquestes incògnites que suposin avenços concrets per al coneixement i el maneig clínic d'aquesta devastadora malaltia.
El carácter minoritario de la enfermedad de Huntington ha supuesto, en comparación a otros procesos neurodegenerativos más frecuentes, un desajustado y lento avance en la comprensión de los mecanismos neuropatológicos responsables de la enfermedad y en la identificación y descripción pormenorizada de los fenotipos clínicos que la caracterizan. Históricamente, las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Huntington, han sido preferentemente atribuidas a la característica atrofia subcortical que presentan todos los pacientes. En correspondencia con esta atrofia de los ganglios basales, desde el punto de vista neuropsicológico, la enfermedad de Huntington ha sido considerada un paradigma de demencia subcortical con un perfil neurocognitivo frontal-disejecutivo caracterizado por enlentecimiento cognitivo, disfunción ejecutiva, apatía y cambios de personalidad. El desarrollo de estudios observacionales de carácter multicéntrico e internacional, ha permitido a lo largo de los últimos 15 años, ahondar de manera notable en el conocimiento de la enfermedad gracias al seguimiento de grandes cohortes de personas afectadas. Estos estudios han ilustrado que, desde etapas tempranas de la enfermedad e incluso durante la fase asintomática, algunos de los cambios neuropatológicos más evidentes se extienden más allá de los ganglios basales y afectan a extensos territorios corticales, principalmente en áreas parieto-occipitales y temporales. Los objetivos de esta tesis, como ponen de manifiesto los trabajos publicados que la conforman, se han dirigido a la búsqueda de algunas respuestas para estas incógnitas que supongan avances concretos para el conocimiento y el manejo clínico de esta devastadora enfermedad.
The minority nature of Huntington's disease has meant, in comparison to other more frequent neurodegenerative processes, an imbalanced and slow progress in the understanding of the neuropathological mechanisms responsible for the disease and in the identification and detailed description of the clinical phenotypes that characterize it. Historically, the clinical manifestations of Huntington's disease have been preferentially attributed to the characteristic subcortical atrophy that all patients present. In correspondence with this atrophy of the basal ganglia, from the neuropsychological point of view, Huntington's disease has been considered a paradigm of subcortical dementia with a frontal-dysexecutive neurocognitive profile characterized by cognitive slowing, executive dysfunction, apathy and personality changes. Over the last 15 years, the development of multicenter and international observational studies has made it possible to significantly deepen our knowledge of the disease thanks to the follow-up of large cohorts of affected people. These studies have illustrated that, from the early stages of the disease and even during the asymptomatic phase, some of the most obvious neuropathological changes extend beyond the basal ganglia and affect extensive cortical territories, mainly in parieto-occipital and temporal areas. Parallel to these findings, studies that have explored the correspondence of brain abnormalities with the clinical manifestations of the disease have revealed that cognitive disturbances go far beyond the dysexecutive profile and that the alteration of multiple domains and processes illustrate a fairly cognitive phenotype more complex and diverse than initially described. Despite this, many unknowns remain to be resolved. We now know that subtle cognitive and behavioral changes, observable through performance in certain tasks, can become apparent up to 15 years before the first motor manifestations are evident. This has meant that the scientific community dedicated to the disease has focused important efforts on exploring the cognitive variables that characterize the disease and that predict its progression, as well as the way in which we can efficiently capture the first preclinical manifestations. We also know that regardless of the genetic load of the disease, there is a notable variability both in the age of onset and in the form and course that the disease acquires throughout its evolution. Expanding our field of vision beyond the basal ganglia has contributed to uncovering a set of elements that are still difficult to fit precisely into the disease as a whole, but which reaffirm the need to deepen the study of its causal mechanisms. We still do not clearly understand: 1) why the disease behaves differently in people whose genetic makeup and age is the same; 2) what role do some of the most subtle and early brain changes that occur in the course of the disease have; 3) what is the pattern of brain neurodegeneration associated with certain neuropsychiatric manifestations with the limitation that this entails for therapeutic approaches; 4) what is the specific neurocognitive profile of severe forms of cognitive impairment in the disease, or how can we measure these profiles in their mild and severe forms, or 5) what is the neurodegenerative pattern that patients who develop dementia present. The objectives of this thesis, as evidenced by the published works that comprise it, have been aimed at finding some answers to these unknowns that represent concrete advances in the knowledge and clinical management of this devastating disease.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina

Huntington's disease (HD) is an autosomal-dominant inherited neurodegenerative disorder, characterized by progressive behavioral, motor and cognitive deficits (HDCRG, 1993; Ross & Margolis, 2001). The predominant neuropathological hallmark of HD is the selective loss of medium spiny neurons within the striatum that extends to other brain regions with the progression of the disease (Martin & Gusella, 1986). Although mutant huntingtin (mHtt) represents a key factor in the pathogenesis of the disease, the molecular mechanisms underlying the preferential vulnerability of the striatum to mHtt toxicity remain unclear. Compelling evidence suggest that mitochondrial defects may play a crucial role in the disease, however, it is still debated whether mitochondrial dysfunction represents just an epiphenomenon of the cellular degeneration or it has an actual pathogenic role. In this Thesis, the general purpose was to identify possible mitochondrial impaired mechanisms and to investigate their role in the selective striatal vulnerability of HD, in order to provide important insights for the development of new therapeutic strategies. The first aim was to clarify whether mitochondrial injuries perpetrate the dopaminergic neurotoxicity in HD striatal degeneration. Since Cdk5 has been proposed as a critical regulator of mitochondrial fission (Meuer et al., 2007) and as a deleterious player in the striatal vulnerability upon dopamine signalling (Paoletti et al., 2008), we hypothesize a new detrimental role for Cdk5 in HD pathology by mediating dopaminergic neurotoxicity through deregulation of mitochondrial dynamic processes. On the other hand, several studies have proposed mitochondrial Ca mishandling as a component of Ca controversial and a conclusive cause remains uncertain. We propose that the propensity of mitochondria to undergo fragmentation in HD could result in the disruption of ER-mitochondria contacts, which are essential for the proper buffering of Ca whether defects in ER-mitochondria associated membranes could be responsible for the alteration of mitochondrial Ca handling in HD. dyshomeostasis in HD. However, the results appear 2+ 2+ by mitochondria. Therefore, the second aim of this study was to investigate.
La enfermedad de Huntington (EH) es un trastorno neurodegenerativo de herencia autosómica dominante, causado por la expansión del trinucleótido CAG en el gen IT15 que codifica para la proteína huntingtina (htt) (HDCRG, 1993). Los pacientes con EH desarrollan alteraciones neurológicas tales como trastornos psiquiátricos, motores y cognitivos (Ross & Margolis, 2001). El sello neuropatológico más característico de este trastorno es la atrofia del cuerpo estriado que se extiende a otras regiones del cerebro con la progresión de la enfermedad (Martin & Gusella, 1986). Aunque la huntingtina mutada (mHtt) representa un factor clave en la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos implicados en la selectiva degeneración estriatal todavía se desconocen. Estudios previos de nuestro grupo de investigación han demostrado que el aumento de la vulnerabilidad de las células estriatales a la mHtt tras activación dopaminérgica implica la actividad aberrante de Cdk5 (Paoletti et al., 2008). Por otra parte, estudios recientes han involucrado también Cdk5 en la regulación de la fisión mitocondrial (Meuer et al., 2007). En este escenario hemos planteado la hipótesis de que la desregulación de Cdk5 inducida por la mHtt podría contribuir a la patología estriatal en la EH. Por ello el primer objetivo de esta Tesis ha sido definir si el aumento de la actividad de Cdk5 inducida por la mHtt incrementa la vulnerabilidad estriatal a insultos excitotóxicos mediante la alteración de la dinámica mitocondrial. Por otra parte, estudios recientes identifican una defectuosa captación del calcio mitocondrial como otro mecanismo responsable de la patogénesis y progresión de la EH (Giacomello et al., 2011). Un excesiva fragmentación mitocondrial podría alterar la dispersión de los orgánulos en el espacio intracelular alterando su capacidad de captación del Ca endoplásmico (RE). Por lo tanto, el segundo objetivo de esta Tesis fue investigar el papel de los sitios de contacto entre mitocondria y RE en la alteración de la señalización del Ca y la interacción con otras membranas, tales como las del retículo 2+ que caracteriza la EH.

La enfermedad de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa que cursa con graves trastornos motores y declive cognitivo. La neuropatología de la enfermedad radica en la mutación del gen de la huntingtina y una degeneración selectiva de las neuronas GABAérgicas de los núcleos Caudado y Putamen del cerebro (núcleo estriado en ratones). Esta enfermedad no tiene cura y su tratamiento actual es paliativo. En la presente tesis se ha abordado el estudio de los factores tróficos, debido a su importancia en el desarrollo y supervivencia de las neuronas. Se ha caracterizado la importancia de la neurotrofina BDNF (brain derived neurotrophic factor) desarrollando para este fin un modelo animal transgénico con el exón I de la huntingtina mutada y niveles disminuidos de la neurotrofina. La disminución de BDNF provoca un empeoramiento de la enfermedad adelantándose la edad de manifestación y la severidad de la misma por muerte de las neuronas encefalinérgicas del núcleo estriado. Se ha observado que además de la degeneración del núcleo estriado también ocurre una disfunción en las células dopaminérgicas de la sustancia negra (ésta última envía conexiones hacia el núcleo estriado). Se han realizado varias terapias de protección en animales modelo de la enfermedad. Por un lado, se ha realizado una administración exógena de BDNF, observándose una mejora de las neuronas encefalinérgicas del núcleo estriado, lo que ha dado lugar a utilizar el fármaco Cisteamina (el cual provoca un pico puntual de liberación endógena de BDNF tras su administración) observándose una protección en los ratones modelo de Huntigton R6/1. Se han realizado terapias de neuroprotección empleando para ello células madre modificadas genéticamente para que liberen el factor trófico GDNF y expresen los marcadores GFP y luciferasa pudiendo así localizarlas tras el transplante ya sea mediante un método de detección de luz no-invasivo in vivo que se puede usar a lo largo del tiempo de la vida del animal, o bien por la GFP en estudios post-mortem, observándose una protección del núcleo estriado ante lesiones excitotóxicas con ácido quinolínico (que mimetiza la enfermedad en los ratones normales). Por último se ha llevado a cabo un protocolo de diferenciación de células madre neurales hacia el fenotipo GABAérgico para su posterior transplante en vista a realizar terapia celular sustitutiva, observándose una buena supervivencia e integración en el tejido del hueste, manteniendo una vez transplantadas el fenotipo GABAérgico adquirido in vitro.
The Huntington's disease is a neurodegenerative disorder with serious motor impairment and cognitive declivity. The mutation of huntingtin gene leads a selective degeneration of GABAergic neurons from Caudate and Putamen nuclei (nucleus striatum in mice). There are not cure for this disease and its present treatment is palliative. In the present thesis the study is focused in trophic factors, due to its importance in the development and survival of the neurons. The importance of BDNF (brain derived neurotrophic factor) neurotrophin has been characterized developing for this aim a transgenic animal model with exon I of the mutated huntingtin with diminished levels of this neurotrophin. The diminution of BDNF modulate the onset and the severity of the motor dysfunction disease associated to the the earlier death of the enkephalinergic neurons of the striatum. It has been observed that in addition to the degeneration of the nucleus striatum there are also a dysfunction in the dopaminergic cells of the substantia nigra. Several therapies of protection have been made in animal model of the disease. On the one hand, an exogenous administration of BDNF has been made, being observed an improvement of the enkephalinergic neurons of the nucleus striatum, which has given rise to use the Cisteamina drug being observed a protection in the mice model of Huntigton R6/1. Neuroprotection therapies have been made using for it stem cells modified genetically so that they release trophic factor GDNF and expression of markers GFP and luciferasa, so it is possible to locate them after the graft by means of a method of alive detection of not-invasive light emission (with this is possible to be used throughout the time of the life of the animal) or by the GFP in studies post-mortem, being observed a protection of the nucleus striatum before excitotoxic lesions with quinolinic acid. Finally, in order to do a substitutive cell therapy we made a differentiation protocol of neural stem to improve the GABAergic phenotype for graft them. We observed a good cell survival and integration in the rodent striatum, maintaining once transplanted the GABAergic phenotype acquired in vitro.

Objetivos: Determinar las características epidemiológicas y genealógicas de los pacientes con diagnóstico de Enfermedad de Huntington (EH) que han acudido al IECN en el periodo 1974 -2003 Población y métodos: Estudio descriptivo retrospectivo realizado en el Instituto de Ciencias Neurológicas (IECN) “Oscar Trelles Montes” de todos los pacientes con diagnóstico de EH que acudieron al IECN en el periodo de 1974 – 2003. Resultados: Se identificaron un total de 68 pacientes diagnosticados de EH, de los cuales, 42 (61.76%) eran mujeres y 26 (38.24%) eran varones. Del total de pacientes con EH, 31 (45.58%) había nacido en Lima, 18 (54.5%) de ellos eran naturales de Cañete, constituyéndose la zona con mayor cantidad de pacientes. La edad de inicio de los síntomas fue 39.54 años, observándose un inicio más precoz de la enfermedad en aquellos pacientes tenían un patrón de transmisión paterna (36 años), en comparación de aquellos que tenían transmisión materna (42 años), siendo esta diferencia significativa (p = 0.04, IC: 95%). Se observa que la mayor cantidad de pacientes se encuentra en el intervalo comprendido entre los 20 y 50 años, quienes corresponden a la EH de inicio en la adultez (74.6%). Los síntomas de inicio de la enfermedad fueron: Movimientos involuntarios de tipo coreico 68 (100%), alteraciones de la marcha 30 (44.1%), e irritabilidad en 23 (33.8%) pacientes. Se reconstruyeron 52 árboles genealógicos representando a 60 pacientes tanto de manera ascendente como descendente, agrupando 1768 individuos. Se reportaron en las historias clínicas 241 casos de EH, de los cuales 118 (49%) eran varones y 123 (51%) mujeres. El árbol genealógico con mayor número de individuos fue el correspondiente al caso número 14 con 186 individuos, reportándose también en el mismo árbol EH en gemelos dicigóticos. No se pudo llegar al objetivo de encontrar un ancestro común que haya introducido la EH en nuestro país. Conclusiones: Cañete constituye una de las zonas con mayor cantidad de casos de EH en nuestro país. La mayoría de los pacientes comienza a presentar los primeros síntomas de la enfermedad en la cuarta década de la vida, en forma de movimientos coreicos y alteraciones del comportamiento en su mayoría. Esta enfermedad se presenta en plena edad productiva, cuando muchos de ellos ya han presentado descendencia, haciéndose difícil el consejo genético, mas aún si las personas no tienen acceso al diagnóstico genético de esta enfermedad, la cual puede informar con anticipación la posibilidad o no de desarrollo de la enfermedad.
Tesis de segunda especialidad

En el desarrollo de esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de diferentes vías de señalización intracelular implicadas en los procesos de supervivencia y muerte neuronal en el contexto de la enfermedad de Huntington, con el objetivo de entender cómo la presencia de la proteína "htt" mutada afecta de forma específica a la normal viabilidad y supervivencia de las neuronas GABAérgicas del núcleo estriado.

En un primer trabajo se estudió la implicación de los sistemas glutamatérgicos y dopaminérgicos en la mayor vulnerabilidad de las células estriatales. Los resultados obtenidos nos demostraron que la presencia de la htt mutada potencia la muerte celular inducida por la activación de los receptores glutamatérgicos y dopaminérgicos. Asimismo, demostramos que el efecto neurotóxico asociado a la activación glutamatérgica y dopaminérgica está mediado por una aberrante activación de la vía de la quinasa Cdk5. De esta manera, la htt mutada incrementa la sensibilidad estriatal al glutamato y a la dopamina, modificando una vía de señalización común a ambos sistemas, la vía de Cdk5.

En un segundo trabajo se analizó si la alteración en los niveles del receptor TrkB asociada a la expresión de la htt mutada se traduce en una anómala señalización intracelular en respuesta a BDNF. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que en presencia de la htt mutada se produce una específica alteración en la vía de señalización de TrkB-ERK1/2. Además, comprobamos que la menor activación de esta vía intracelular conlleva una mayor susceptibilidad de las células estriatales frente a un estímulo de estrés oxidativo inducido con H2O2.

De acuerdo con los resultados obtenidos en esta tesis, la mayor vulnerabilidad de las neuronas estriatales frente a la presencia de la htt mutada podría ser el resultado de (1) una sobreactivación de vías intracelulares con un efecto neurotóxico, como sería, en este caso, la vía de Cdk5 tras una estimulación glutamatérgica y dopaminérgica, y (2) una menor activación de las vías intracelulares involucradas en el mantenimiento de la supervivencia neuronal, como es la vía de ERK1/2.

La identificación y caracterización de los diferentes mecanismos moleculares responsables de la selectiva muerte neuronal en la enfermedad de Huntington puede ser de gran utilidad para el futuro diseño de nuevas terapias farmacológicas que permitan retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad.

La oligomerización es un proceso común en la biología de los receptores de membrana, compartida por los GPCRs. Los GPCRs constituyen aproximadamente un 45% de las dianas de los fármacos comercializados en la actualidad y siguen siendo el foco principal de la investigación biomédica y de los programas de desarrollo de nuevos fármacos. Aún así, el problema clave sigue siendo la falta de selectividad de los ligandos ortostéricos y la gran variedad de procesos que se ven modulados por la estimulación de un mismo GPCR dependiendo de su localización o interacción con otros receptores o proteínas. Los heterómeros de receptores se consideran un nuevo tipo de diana farmacológica por su posible especificidad de localización y por sus características bioquímicas y funcionales demostrablemente diferentes a las de sus componentes individuales, entre ellas las modulaciones alostéricas. El alosterismo puede ser debido a varias circunstancias entre las que destacan interacciones entre los protómeros del complejo y entre éstos y las proteínas G. Las consecuencias a nivel farmacológico y funcional son el reconocimiento diferencial de ligandos y la modulación del tráfico intracelular y del acoplamiento a proteínas G. El sistema orexinérgico es un buen ejemplo de sistema implicado en un amplio abanico de procesos fisiológicos y fisiopatológicos, desde el control de la ingesta y la regulación de los estados de sueño/vigilia a la regulación neuroendocrina y la participación en los mecanismos moleculares de adicción a drogas. La oligomerización de GPCRs constituye un proceso de regulación de orden superior poco explorado en el caso del receptor OX1 pero que se sugiere de gran relevancia para explicar los efectos moduladores de las orexinas. En esta Tesis se ha descrito por primera vez la formación de heterodímeros entre los receptores OX1, GHS-R1a y LEP y del heterotrímero LEP-GHS-R1a-OX1 en un sistema de expresión heteróloga, y se ha obtenido evidencia de la expresión del complejo heterotrimérico en neuronas hipotalámicas de rata. Estos resultados sugieren un papel importante de la oligomerización en la mediación de la respuesta combinada a señales orexigénicas y anorexigénicas originadas tanto a nivel central como periférico. En esta Tesis se describe también por primera vez la formación del heterómero de receptores CRF2-OX1 y su interacción con los receptores σ. El balance σ1/σ2 y la expresión de los heterómeros OX1/CRF2 en una célula determinada condicionan el efecto de la anfetamina y la señalización inducida por orexina y CRF. El sistema cannabinoide desempeña, asimismo, un marcado papel modulador en múltiples procesos fisiológicos y su desregulación se asocia con alteraciones patológicas, desde enfermedades neurodegenerativas a procesos de inflamación, desórdenes cardiovasculares y cáncer. La actividad neuroprotectora de los cannabinoides se ha descrito tanto in vivo como in vitro y hoy en día se investiga su gran potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis se ha identificado una localización preferente del heterómero de receptores A2A-CB1 en proyecciones GABAérgicas del estriado dorsal, neuronas afectadas de manera paradigmática en la enfermedad de Huntington, y una disminución de la expresión del complejo en estadios avanzados de la enfermedad. Los resultados sugieren la importancia de funciones específicas asociadas a la formación de dicho complejo que se ven afectadas negativamente en estadios tardíos de la progresión de la enfermedad. La capacidad protectora de los cannabinoides se observa también en procesos oncogénicos. Los receptores CB2 y GPR55 se encuentran sobre-expresados en diversos tipos de tumores humanos y se ha descrito su implicación en el control del destino de las células tumorales. En esta Tesis se ha descrito la formación de heterodímeros de receptores CB2-GPR55 en células cancerígenas y cómo la modulación de estos complejos puede modificar la actividad anti-tumoral de los cannabinoides in vivo.
The ‘receptor heteromer’ concept, in which receptors of the same and different gene families can combine among themselves to generate new and unique biochemical and functional characteristics, is becoming widely accepted for GPCRs and constitutes an emerging area in the field of GPCR cell signaling. Receptor heteromers must be understood as dimeric or higher order molecular entities that are the result of combinatorial evolution and they constitute novel therapeutic targets due to their possible specific location and their unique biochemical and functional properties, such as the allosteric modulations. Allosterism, as a result of interactions between individual protomers in the oligomer or between them and G proteins, can cause differential ligand binding and/or the modulation of intracellular trafficking and G protein coupling. In this context, the results here presented show the relevant role of GPCR oligomerization in different pathological processes such as addiction, Huntington’s disease and cancer, focusing on orexinergic and cannabinoid systems as modulatory systems involved in a wide range of physiological and pathophysiological processes. Here we describe for the first time the formation of heterodimers between LEP, GHS- R1A and OX1 receptors in a heterologous system, and the formation of heterotrimers involving the three receptors in hypothalamic primary cultures, suggesting an important role of these complexes in the response to a combination of different orexigenic and anorexigenic signals originated both centrally and peripherally. We demonstrate the formation of CRF2-OX1 receptor heteromers in a heterologous system and in the rat VTA. These receptors can interact also with sigma receptors, and the final balance between σ1/σ2 receptors and the expression of CRF2-OX1 receptor heteromers in a particular cell determines the effect of amphetamine and the signaling induced by orexin and CRF. Here we also identified the precise location of CB1-A2A receptor heteromers in the GABAergic projections in the dorsal striatum, that these complexes possess unique signaling properties and undergo an unprecedented dysfunction in Huntington’s disease, an archetypal disease that affects striatal neurons. Finally, we show that CB2R and GPR55 form receptor heteromers in cancer cells, that these structures possess unique signaling properties and that the modulation of these heteromers can modify the antitumoral activity of cannabinoids in vivo.

La memoria titulada "Estudio de los mecanismos implicados en la neurodegeneración estriatal en modelos murinos de la enfermedad de Huntington" ha perseguido determinar la implicación de las neurotrofinas endógenas BDNF y la NT-3 en la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos transgénicos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington, estudiar la implicación de los agregados intraneuronales y de la excitotoxicidad mediada por los receptores NMDA en modelos transgénicos de la enfermedad de huntington y analizar el potencial de dos aproximaciones terapéuticas para la enfermedad de Huntington basadas en la administración de BDNF intra-estriatal o en el silenciamiento del gen causante de la patología. En dicha memoria se han empleado modelos murinos de la enfermedad de Huntington, el modelo excitotóxico y diversos modelos transgénicos con alteraciones específicas de los niveles de BDNF o la NT-3, ratones condicionales de la huntingtina mutada, así como también cultivos primarios y de precursores neuronales estriatales. Los resultados se han presentado como 3 artículos científicos originales publicados en revistas indexadas ("The Journal of Neuroscience" y "Neuroscience") y un artículo original en fase de preparación. Además, se ha realizado una discusión conjunta de los resultados presentados en los diferentes artículos científicos cumpliendo completamente con lo objetivos planteados. En conjunto, los resultados aportan datos relevantes que ayudan a entender la fisiopatología de la enfermedad de Huntington y la fisiología de las neuronas estriatales. En esta tesis se ha determinado que la disminución de los niveles de neurotrofinas afecta diferencialmente la susceptibilidad de las neuronas estriatales en modelos murinos y excitotóxicos de la enfermedad de Huntington. Así, el BDNF es el factor que modula el inicio y la severidad de la alteraciones motoras asociados a la degeneración selectiva de las neuronas estriatales de proyección en el modelo transgénico R6/1. Por su parte es la NT-3 el factor neurortófco que modula la susceptibilidad excitotóxica de las neuronas estriatales al regular la expresión de los receptores de glutamato tipo NMDA. Además, se ha demostrado que la toxicidad de los agregados intraneuronales presentes en los modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington podría depender de su ubicación y el grado de empaquetamiento de la huntingtina dentro del agregado, puesto que dos modelos con el mismo número de agregados estriatales difieren significativamente en el grado de neuropatología estriatal. Además, se logró la reversión total de la patología en un modelo transgénico condicional a pesar de la presencia de agregados de tipo amiloideo, sugiriendo que este tipo de agregados no constituyen la especie más tóxica de la huntingtina mutada. Por último, se ha demostrado que los tratamientos basados en la administración del BDNF o en el silenciamiento del gen de la huntingtina mutada son capaces de revertir ciertas alteraciones neuropatológicas y funcionales de las neuronas estriatales en modelos transgénicos de la enfermedad de Huntington, apoyando la hipótesis de que estas herramientas constituyen alternativas terapéuticas efectivos para la enfermedad de Huntington.

DE LA TESIS:

El objetivo de esta tesis ha sido el de determinar los diferentes mecanismos intracelulares de muerte neuronal así como en su posible modulación mediante factores tróficos. Estos estudios se han realizado en el núcleo estriado, zona que degenera en la enfermedad de Huntington, con el propósito de identificar nuevas dianas sobre las que actuar para detener la neurodegeneración específica y desarrollar nuevos tratamientos neuroprotectores para la enfermedad.
Comenzamos el trabajo con el estudio de las vías intracelulares que median los efectos biológicos del GDNF sobre las neuronas estriatales, estudio para el que se emplearon cultivos primarios de neuronas estriatales. Seguidamente, nos centramos en el estudio de mecanismos de muerte y supervivencia in vivo, y más concretamente en la regulación de las proteínas de la familia de Bcl-2 en el núcleo estriado analizando tres paradigmas diferentes: (1) El desarrollo postnatal; (2) un modelo excitotóxico de la enfermedad de Huntington donde se produce una lesión estriatal aguda; y (3) un modelo transgénico de la enfermedad donde se produce una degeneración estriatal paulatina. En un trabajo previo de nuestro grupo se describió un papel esencial de la proteína Bax en el proceso apoptótico de las neuronas estriatales activado por la inyección de agonistas de los receptores de glutamato, por lo que nos interesamos en estudiar específicamente a esta proteína pro-apoptótica, y comenzamos por analizar su participación en el proceso apoptótico utilizando un animal KO para la proteína. Finalmente, la escasa muerte neuronal que se produce en el modelo transgénico, nos condujo a estudiar la activación de la vía de supervivencia AKT en respuesta a la toxicidad inducida por la expresión de htt mutada, y su posible participación en la compensación de las vías de muerte neuronal.
En esta tesis se ha determinado la importancia del GDNF en la modulación de la arborización de las neuronas estriatales, describiendo además los precisos mecanismos intracelulares que median estos efectos. Además se han descrito la participación de las diferentes proteínas de la familia de Bcl-2 en diferentes paradigmas, desde el desarrollo postnatal, a modelos de enfermedad de Huntington agudos y crónicos. Con estos estudios se ha demostrado la participación esencial de la proteína pro-apoptótica multidominio Bax en la muerte de las neuronas estriatales, además de una relación directa de la expresión de formas mutadas de la proteína huntingtina con la regulación de las miembros pro-apoptóticos de la subfamilia solo-BH3, observándose que el gran incremento y localización mitocondrial de estas proteínas influye en la disfunción neuronal descrita durante el desarrollo de la enfermedad. Fruto de estos analísis se propone a la proteína pro-apoptótica Bim como sensor frente a un amplio rango de estímulos nocivos dentro del núcleo estriado, subrayando la gran importancia de su regulación en las primeras etapas de los procesos de muerte, y además, señalando que los incrementos de esta proteína podrían reflejar en parte un soporte molecular al adelanto de las alteraciones motoras descritas en los modelos de Huntington tras la reducción de los niveles de BDNF. Por último, se ha demostrado que diferentes modelos de enfermedad de Huntington que expresan el exon 1 de la proteína huntingtina mutada mantienen una elevada actividad de la quinasa AKT que mantiene su naturaleza anti-apoptótica hasta las etapas más avanzadas de la enfermedad. Se postula que la subsistencia de esta actividad permitiría que las neuronas estriatales pudieran sobrevivir durante un largo tiempo con la expresión de la htt mutada. Estos datos subrayan la relevancia de la vía anti-apoptótica durante la progresión de la enfermedad, y apoyan la importancia de mantener unos niveles elevados de AKT fosforilada y su uso en terapias combinadas como un medio efectivo de retrasar la pérdida irreversible de las neuronas estriatales.

Huntington's disease (HD) and Parkinson's disease (PD) are devastating neurodegenerative diseases that progress with the death of selective neuronal subpopulations. Neuronal dysfunction and death are consequence of multiple pathogenic processes which alter signalling cascades. The identification of such molecular pathways is crucial to understand the cellular processes that triggers the symptomatology of diseases. One of the common affected pathways in neurodegeneration is the mTOR pathway. It regulates multiple cellular processes to preserve cellular viability and function. Consequently, to maintain a proper function mTOR activity needs to be fine-tuned. RTP801 is an mTOR negative regulator whose action over this pathway plays a significant role in neurodegeneration. RTP801 protein is induced in an attempt to cope cellular stress. However a sustained RTP801 increase leads to neuronal death by sequentially inactivating first mTOR and then Akt pro-survival kinase. RTP801 pathological increase has been involved in neurodegenerative diseases such as PD. Therefore, identifying RTP801 as a possible new therapeutic target in HD would be highly valuable in designing new pharmacological therapies that block, or at least delay, the neurodegeneration and changes in synaptic plasticity associated with it. Our results show that the overexpression of pathogenic N-terminal htt increases RTP801 levels by both lengthening the protein half-life and up-regulating its gene expression. Blockade of RTP801 expression prevents mhtt-induced cell death in HD cellular models. Importantly, RTP801 is elevated in HD-iPSC and putamen, caudate nucleus and cerebellum of human HD post-mortem brain. Although total RTP801 levels in the striatum of HD murine models are not altered, RTP801 is increased in the synaptic compartment which contributes to motor learning deficits in the R6/1 model. Downregulation of striatal RTP801 preserves motor learning skills in R6/1 mice. Hence, RTP801 is identified as a novel downstream effector of mhtt which mediates its toxicity. Recently, exosomes have emerged as a key mechanism to maintain trophic support between neural cells and as vehicle for the clearance of toxic proteins from neurons. Since RTP801 is upregulated under stressful conditions, its propagation by exosomes may allow the neuron-to-neuron spreading of RTP801 toxicity through the modulation of mTOR/Akt pathway. Our results have elucidated a novel function of RTP801 as an exosomal protein. We demonstrate that both ectopic and endogenous RTP801 can be found in exosomes derived from HEK293 cells. In cortical neurons, exosomal RTP801 elevation is sensitive to PD mimetic 6-OHDA (6-hydroxydopamine) but not to potassium depolarization. Consequently, 6-OHDA exposure induces the loading of RTP801 into exosomes released from cortical neurons. Intriguingly, mhtt does not elevate RTP801 in exosomes obtained from a cellular model. In addition, we demonstrate that exosomes have a protective role promoting the activation of both mTOR complex 1 and 2 in recipient neurons, but increased RTP801 counteracts exosomal mTOR pathway activation suggesting that RTP801 negatively modulates pro-survival signals transneuronally. Altered protein functions of the mTOR pathway are a common hallmark in many neurodegenerative diseases. However, little is known about the contribution of genetic variants or single nucleotide polymorphisms (SNPs) that belong to the mTOR pathway. As a multifactorial disease, we studied the association of SNPs in genes encoding mTOR pathway protein components with the susceptibility PD and the response to levodopa (L-DOPA) treatment. The data found indicate that polymorphisms in genetic markers of the mTOR pathway contribute to the susceptibility to PD and the response to L-DOPA treatment in PD patients. We show that these SNPs influence the outcome individually or interacting epistatically with other genetic markers. Taken together, our findings indicate that deregulation of the mTOR signalling pathway plays an important role in the pathogenesis associated with PE and HD and its regulation is crucial to maintain adequate neuronal function and viability.
La enfermedad de Huntington (EH) y la enfermedad de Parkinson (EP) son enfermedades neurodegenerativas devastadoras caracterizadas por la muerte de subpoblaciones neuronales selectivas. La disfunción neuronal y la muerte son consecuencia de múltiples procesos patogénicos que llevan a la alteración de cascadas de señalización. Una de las vías afectadas de forma común en los procesos neurodegenerativos es la vía mTOR. Como modulador de numerosos procesos celulares, la vía de mTOR está regulada para mantener la supervivencia neuronal y la plasticidad sináptica. Una de las proteínas que modula esta cascada de señalización es RTP801. RTP801 se induce en respuesta a factores de estrés celular y su aumento desencadena la muerte neuronal al regular negativamente la vía mTOR/Akt. La implicación de RTP801 en la EP ha sido ampliamente estudiada, sin embargo, su contribución a la patogénesis de la EH nunca antes había sido explorada. Específicamente, nuestros resultados han identificado a RTP801 como un mediador de la toxicidad inducida por huntingtina mutada. El aumento de RTP801 medía la muerte celular inducida por huntingtina mutada y contribuye a la disfunción del aprendizaje motor en el modelo murino R6/1. El silenciamiento de RTP801 en el estriado de los ratones R6/1 contribuye a preservar la plasticidad sináptica de la vía corticoestriatal, y por tanto del aprendizaje motor. Por otra parte, mostramos que los exosomas secretados por neuronas activan la vía de supervivencia mTOR/Akt en neuronas recipientes. Sin embargo, ante un estrés celular, la toxicidad de RTP801 es propagada a través de exosomas que contrarrestan la activación trófica de la vía mTOR/Akt. Finalmente, demostramos que variaciones genéticas en los componentes de la vía de mTOR modulan la susceptibilidad y la edad de inicio de la EP y, contribuyen a la aparición y severidad de la discinesia inducida por levodopa. En conjunto, nuestros hallazgos indican que la desregulación de la vía de mTOR desempeña un papel importante en la patogénesis asociada a la EP y la EH y, su correcta regulación es crucial para mantener la viabilidad y función neuronal.

La presente tesis posee una introducción donde se plantea y explica la sintomatología, genética y fisiopatología de la enfermedad de Huntington (EH). También explicamos los distintos modelos animales usados para el estudio de la enfermedad y resaltamos su relevancia para propuestas terapéuticas. Seguidamente introducimos lo que son las ideas principales de la tesis. Estas son, el interés por el estudio de los procesos fisiopatológicos de aparición más temprana para la planificación terapéutica adecuada, la importancia de la neurotrofina llamada BDNF como reguladora de la mayoría de todos estos procesos y, finalmente, la propuesta de una línea de intervención mediante el uso de terapia génica-celular teniendo en cuenta los dos primeros puntos. Los resultados que hemos obtenido en esta tesis indican y muestran que existe una alteración clara y temprana de múltiples moléculas sinápticas relacionadas con la plasticidad sináptica y, además, estos se encuentran altamente relacionados con los primeros síntomas (cognitivos) detectables en todos los modelos animales estudiados. Adicionalmente, encontramos que la neurotrofina BDNF es uno de los mayores reguladores de estos procesos y por eso la proponemos como elemento terapéutico potencial principal. Como consecuencia a este último punto, se diseñaron unos animales transgénicos, en colaboración con los Drs. Friedman y Patterson de la Universidad McGill de Canadá, que sobre-expresa BDNF solamente en astrocitos. Se aislaron estos tipos celulares de estos animales transgénicos, se cultivaron y se expandieron para luego utilizarlos como terapia celular en modelos animales transgénicos transplantándolos intra-cerebralmente con resultados bioquímicos, morfológicos y funcionales satisfactorios. Conjuntamente, todos estos puntos nos sirven para demostrar que una terapia temprana centrada en las alteraciones sinápticas y mediante la administración de BDNF controlada tiene el potencial de mejorar la sintomatología en la EH o retrasar significativamente su aparición sin efectos colaterales adversos importantes.
The present thesis has an introduction where the symptomatology, genetics and physiopathology of Huntington's Disease (HD) are explained. Distinct mouse models used in the present thesis and their usefulness are also exhibited. Next, the main ideas and messages of the thesis are presented; first, the interest to study the earliest physiopathologic processes in order to draw up a plan for therapeutics. On the other hand, we focused on the relevance of the neurotrophin namely BDNF in the modulation of the disease. Finally, is also proposed the use of gene/cell therapy accordingly to the first two aims of the thesis. The results obtained show and demonstrate the existence of clear and early alterations of several molecules related to synaptic plasticity and function. Moreover, all these molecular alterations are highly involved and correlated with the first detectable cognitive symptoms in all mouse models tested. Furthermore, we found that the neurotrophin BDNF is one of the strongest regulator of the physiopathologic processes studied here. For this reason, we propose the neurotrophin as a major candidate for HD therapeutics. In line with this, in collaboration with the Drs. Friedman and Patterson from the McGill University in Canada, a new transgenic animal has been generated. This mouse over-express BDNF under control of the GFAP promoter (pGFAP-BDNF mice). We cultured astrocytes derived from these mice and grafted them in striata of wt mice. These transgenic astrocytes, when grafted and subjected to excitotoxic stimuli, were more neuroprotective than wt grafted astrocytes. Altogether demonstrates that an early therapeutic intervention focused on synaptic alterations by delivering BDNF in a conditional way have the potential to improve the symptomatology of HD and delay significantly its onset without important collateral and negative effects.

Huntington’s disease (HD) is a rare genetic disorder caused by an aberrant expansion of a CAG trinucleotide in the huntingtin gene (Htt). The neuropathology of the disease is characterized by progressive neuronal dysfunction and degeneration in specific regions within the central nervous system, which causes a triad of symptoms including motor, cognitive and psychiatric features. Current treatments only alleviate some of these symptoms without preventing the inevitable neuropathological progression and, therefore, there is great need for finding new therapies that act at the root of the illness. Transcriptional dysregulation, somatic CAG repeat instability and neurotrophic signaling alterations appear early in HD and have been considered important underlying pathogenic mechanisms. Additionally, it has been recently suggested that HDAC3 and p75NTR could participate in some of these processes. Accordingly, the main aim of this thesis was to evaluate the potential therapeutic benefits of the pharmacological inhibition of HDAC3 and the genetic reduction of p75NTR in a knock-in mouse model of HD, termed HdhQ7/Q111. Our results have demonstrated that the selective inhibition of HDAC3 ameliorates cognitive deficits (motor learning and long-term memory alterations) in HdhQ7/Q111 mice by restoring the neuronal activity- dependent transcription of important memory-related genes, such as Arc and Nr4a2. This effect could be due to an increase in histone acetylation, leading to a relaxed DNA configuration, as well as an increase in CBP acetylation, potentially promoting its transcriptional activity. Besides, we have observed that chronic HDAC3 inhibition suppresses somatic CAG repeat expansions in Htt gene. Results of this thesis have shown that HDAC3 inhibition increases Msh2 acetylation at lysine 73, probably altering its DNA repair activity, which has been involved in promoting somatic CAG repeat length increases. Finally, our results have shown that p75NTR levels are increased in HdhQ7/Q111 mice from symptomatic stages. Interestingly, p75NTR normalization delays the onset of motor coordination alterations, several neuropathological HD hallmarks and the overall neurotrophic signaling imbalance in HdhQ7/Q111 mice, which comprise a reduction of the neurotrophin BDNF, a reduction and disrupted activation of its specific receptor, TrkB, and an overactivation of the p75NTR-dependent JNK signaling pathway. However, normalization of p75NTR levels at late disease stages is not able to prevent the loss of striatal integrity and motor coordination in KI mice. This might be the result of the unstoppable advance of other pathological mechanisms that do not depend on p75NTR expression. Therefore, a pharmacological strategy aimed to reduce the expression or activity of p75NTR in HD could provide some benefits at early stages of the disease but, as the pathogenic process progresses, the benefits would be limited. Collectively, our results have provided further insight into the contribution of transcriptional dysregulation, somatic CAG instability and neurotrophin signaling disturbances to HD neuropathological progression and highlight HDAC3 and p75NTR as promising therapeutic targets to correct these pathogenic mechanisms and ameliorate cognitive and motor behavioral impairments in HD.
La malaltia de Huntington (MH) és un trastorn neurodegeneratiu i hereditari que es caracteritza per la presència d’alteracions motrius, cognitives i psiquiàtriques. Actualment no existeix cap tractament que aconsegueixi frenar la progressió d’aquesta patologia, de manera que l’avaluació de dianes terapèutiques esdevé de vital importància. La desregulació transcripcional, l’expansió somàtica del triplet CAG i l’alteració de la senyalització neurotròfica s’han descrit com importants mecanismes subjacents i s’ha determinat que les proteïnes HDAC3 i p75NTR podrien promoure alguns d’aquests processos. Per això, en aquesta tesi hem avaluat els possibles beneficis resultants de la inhibició farmacològica de la HDAC3 o de la reducció genètica del receptor p75NTR en un model de ratolí de la MH, anomenat HdhQ7/Q111. Els nostres resultats han demostrat que la inhibició de la HDAC3 en ratolins HdhQ7/Q111 aporta millores cognitives degut a la prevenció de les alteracions transcripcionals. Aquest efecte podria ser conseqüència d’un increment de l’acetilació d’histones, promovent una conformació més relaxada de l’ADN, i d’un increment de l’acetilació de la proteïna CBP, estimulant la seva activitat transcripcional. A més, hem demostrat que la inhibició de la HDAC3 suprimeix l’expansió somàtica del triplet CAG en el gen mutat de la proteïna huntingtina, possiblement degut a que s’incrementen els nivells d’acetilació de la proteïna Msh2 en un residu que podria alterar la seva activitat, la qual s’ha vist recentment implicada en l’allargament del tram CAG. Per últim, els nostres resultats han determinat que la normalització del receptor p75NTR en els ratolins HdhQ7/Q111 endarrereix l’aparició de les alteracions en coordinació motora, coincidint amb una millora de diferents característiques neuropatològiques de la MH i amb una recuperació de l’alterada senyalització neurotròfica. No obstant, en etapes avançades de la malaltia, l’efecte d’altres mecanismes patogènics que ocorren de forma progressiva en la MH acaben anul·lant els efectes positius de la reducció en els nivells de p75NTR. Les evidències experimentals recopilades permeten concloure que les proteïnes HDAC3 i p75NTR participen en l’aparició de mecanismes patològics clau per a la correcta funció neuronal en diferents regions cerebrals i, per tant, representen prometedores dianes terapèutiques per tractar la simptomatologia motora i cognitiva de la MH.

La adenosina es un metabolito presente en todo el organismo con distintas funciones fisiológicas. En el sistema nervioso central, desempeña un importante papel como neuromodulador a través de la interacción con sus receptores de membrana: los receptores de adenosina A(1), A(2A), A(2B) y A(3), siendo los más abundantes en el cerebro el A(1 )y el A(2A). El receptor de adenosina A(2A) (A(2A)R) presenta una elevada expresión en el estriado, especialmente en las neuronas GABAérgicas medianas espinosas que conforman la vía indirecta de los ganglios basales. La actividad de esta vía está relacionada con la inhibición motora. La actividad del A(2A)R puede modular de hecho la actividad motora. Es bien conocido cómo, tanto en modelos animales como en humanos, los antagonistas del receptor, como la cafeína, estimulan el movimiento, mientras que sus agonistas tienen actividad sedante. Las tres enfermedades abordadas en este trabajo han sido previamente relacionadas con alteraciones del sistema adenosinérgico. En la enfermedad de Parkinson, coincidiendo con una sintomatología hipocinética, se ha descrito una sobreexpresión patológica del A(2A)R en el estriado. La reducción de los niveles del receptor ha sido descrita en la misma región cerebral en el contexto de la enfermedad de Huntington, en la que se da una sintomatología hipercinética. La esquizofrenia, a su vez, ha sido relacionada con una disfunción de los ganglios basales y un déficit en la señalización adenosinérgica. La línea de investigación en la que se enmarca este trabajo había determinado previamente cómo la expresión tejido específica del A(2A)R en el cerebro está controlada por la metilación de la región 5'UTR de su gen, ADORA2A. A lo largo de la presente tesis se ha investigado si éste u otros mecanismos epigenéticos están implicados en la aparición de niveles anómalos del receptor en las enfermedades de Parkinson y Huntington. Además, se han explorado los niveles de expresión del receptor en el estriado en personas con esquizofrenia. Para todo ello se ha trabajado fundamentalmente con muestras de putamen postmortem, una de las regiones del estriado que ha sido vinculada más estrechamente con el control motor. Este trabajo ha permitido confirmar que la sobreexpresión patológica del A2A en el estriado en la enfermedad de Parkinson se produce ya en los primeros estadios de la enfermedad (estadios de Braak 1 a 3), coincidiendo con una bajada de los niveles del microARN hsa-miR-34b. El descenso en los niveles de este microARN había sido previamente descrito en cerebros postmortem de personas con Parkinson pero en otras regiones cerebrales, relacionándolo con estrés mitocondrial. En este trabajo se ha validado el A(2A)R como diana para este microARN mediante ensayos funcionales in vitro, por lo que se propone que el descenso del hsa-miR-34b promueve un aumento de los niveles del A(2A)R en el putamen desde las primeras etapas de la progresión patológica. En cuanto a los resultados en la enfermedad de Huntington, se ha mostrado cómo la reducción de la expresión del A(2A)R en el estriado humano coincide con un incremento en los niveles de metilación y una reducción en los niveles de hidroximetilación de la región 5'UTR del ADORA2A. El estudio llevado a cabo en la esquizofrenia ha revelado un importante descenso de la expresión del A(2A)R en la mitad de los casos patológicos analizados, coincidiendo con hipermetilación de la región 5'UTR del ADORA2A. Estos casos presentan además una sintomatología motora particular, lo que ha permitido proponer la existencia de un subgrupo de pacientes en esta enfermedad. Esto resultados ofrecen soporte a ciertas estrategias terapéuticas propuestas para estas enfermedades y basadas en la modulación de la actividad o de la expresión del A(2A)R. Indican además un uso potencial para la medida de los niveles del A(2A)R en los pacientes con trastorno motor. Esta información permitiría una mayor personalización de los tratamientos y una mejora en la interpretación de las respuestas individuales a los fármacos.
Adenosine is a metabolite distributed throughout the entire organism with multiple physiological functions. In the central nervous system it plays a main role as neuromodulator, interacting with specific membrane receptors: A(1), A(2A), A(2B) and A(3). The most brain-enriched are A1 and A2A. Adenosine receptor A(2A) (A(2A)R) is highly expressed in the striatum, specially in the GABAergic medium-sized spiny neurons that form the indirect pathway of the basal ganglia, whose activity has been related with motor inhibition. There is evidence for A(2A)R activity involvement in motor behavior: A(2A)R antagonists, as caffeine, stimulate locomotion, while A(2A)R agonists are sedative. The three diseases studied in this work have previously been related to adenosinergic system dysfunction. In Parkinson's disease, characterized by hypokinesia, a pathological overexpression of striatal A(2A)R has been described. In Huntington's disease, characterized by hyperkinesia, striatal A(2A)R expression is reduced. Schizophrenia has been related to basal ganglia dysfunction and reduced adenosinergic signaling. In previous studies, the group described how DNA methylation regulates ADORA2A (A(2A)R gen) basal expression in different cell lines as well as its tissue-specific expression in brain. In the present thesis, it was studied whether this or other epigenetic mechanisms were involved in A(2A)R pathological expression levels detected in Parkinson or Huntington diseases. Besides, A(2A)R levels were analyzed in striatum of schizophrenia patients. The work has been performed mainly using human postmortem putamen samples, a striatal region strongly related to motor control. Overall, the obtained results (i) reinforce the relation between A(2A)R striatal expression and motor control, (ii) demonstrate involvement of epigenetic mechanisms in pathological A(2A)R expression in different neuropathological contexts and (iii) support therapeutic strategies previously proposed based on the modulation of A(2A)R expression, and indicate potential usefulness of A(2A)R levels measure in patients with motor alterations, considering that this information would allow a better personalization of treatments and a better understanding of individual reactions to drugs.

Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder caused by an autosomic mutation on the Huntingtin (HTT) coding gene. HD is mainly characterized by the appearance of motor symptoms or choreas, which are associated to the selective degeneration of striatal neurons, and by the presence of cognitive disturbances, which are attributed to alterations in corticostriatal connectivity and to hippocampal dysfunction. For this reason, finding targets involved both on striatal vulnerability and cognitive disturbances, might result in therapeutic strategies able to act simultaneously on HD’s motor and cognitive symptoms. In this Thesis we have focused on Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) as one of these putative targets. Cdk5 acts mainly in the central nervous system, where its activator p35 is expressed, and it plays a major role on synaptic plasticity regulation. In addition, altered Cdk5 activity has been described in several neurodegenerative disorders, including HD, where Cdk5 deregulation has been associated to increased striatal vulnerability to excitotoxicity. Moreover, alteration of Cdk5 activity and/or subcellular distribution has also been linked to neuronal cell cycle re-entry, which has been proposed as a possible mechanism leading to neuronal dysfunction and eventual death in several neurodegenerative conditions. Therefore, on one hand, we aimed to study Cdk5 involvement in cognitive deficits and synaptic plasticity alterations in HD. To this end, we generated a new double mutant mice model which expresses one copy of mutant HTT (mHTT) (knock-in or KI), and is conditionally heterozygous for Cdk5 (Cdk5+/). We described that double mutant mice (KI:Cdk5+/-) presented restored corticostriatal and hippocampal cognitive function when compared to their KI littermates. We also observed that preserved corticostriatal function correlated with recovery of corticostriatal NR2B surface levels, which were reduced in KI mice. Moreover, recovery of NR2B surface levels was associated to normalization of NR2B total levels and of the pSrc/pNR2B pathway in the cortex of KI:Cdk5+/- mice. On the other hand, preserved hippocampal cognitive function correlated with recovery of CA1 dendritic spine density, as well as, with increased Rac1 activity in KI:Cdk5+/- mice. Restoration of dendritic spine density was also observed in layer V cortical neurons, in a Rac1-independent manner. Finally, we described that KI mice showed reduced physiological p35 plasma membrane levels in the cortex, which was recovered in KI:Cdk5+/- mice, correlating with preferential alteration of Cdk5 substrates phosphorylation levels in this brain region. In sum, our results demonstrate Cdk5 complex and brain region-specific involvement in cognitive deficits appearance and in synaptic alterations in HD. On the other hand, we also assessed whether Cdk5 deregulation might cause cell cycle re-entry of striatal neurons in HD. Cdk5 forms a nuclear complex with p27 and E2F1 in differentiated neurons, thus preventing E2F1 from binding to its coactivator DP1 and from activating transcription of cell cycle progression genes. For this reason, we analysed nuclear levels of Cdk5 and p27, and we observed that KI mice showed reduced Cdk5 and p27 nuclear levels, which could induce neuronal cell cycle re-entry. In agreement, we also observed increased levels of CyclinD1 in the striatum of KI mice since early symptomatic stages, and increased Cdk4 levels at late disease stages. Finally, we observed that NMDA treatment of striatal primary cultures caused a general reduction of cell cycle proteins neuronal expression, and importantly, it altered their subcellular distribution, reducing nuclear localization of the cell cycle inhibitor p27 and inducing nuclear presence of cell cycle progression proteins, E2F1 and Cdk4. Our results also suggested that presence of mHTT might further potentiate NMDA-induced subcellular distribution alteration of cell cycle proteins. Therefore, we suggest that reduction of Cdk5 nuclear levels might induce cell cycle re-entry of striatal neurons, a process which could be favoured by alterations in NMDA receptors activation, present in HD.
La malaltia de Huntington (MH) és un desordre neurodegeneratiu causat per una mutació al gen que codifica per la proteïna Huntingtina (HTT), i que consisteix principalment en l’aparició de dèficits motors, associats a la degeneració selectiva de l’estriat; i en l’aparició de dèficits cognitius, associats a una alteració en la connectivitat corticoestriatal i a una disfunció hipocampal. En aquesta Tesi, hem analitzat la implicació de la cinasa Cdk5, per una banda, en l’aparició dels dèficits cognitius; i per l’altre banda, en la reentrada neuronal al cicle cel·lular com a un possible mecanisme de susceptibilitat a la vulnerabilitat estriatal en la MH. Els nostres resultats han mostrat que la reducció genètica de Cdk5 en un model murí de la MH (KI), prevé l’aparició dels dèficits cognitius corticoestriatal i hipocampals. Aquesta millora cognitiva està associada a la recuperació dels nivells de membrana de NR2B a nivell corticoestriatal, i a la restauració de la densitat d’espines dendrítiques a l’hipocamp i a l’escorça, indicant una implicació de Cdk5, complexa i específica de regió cerebral, en les alteracions sinàptiques i l’aparició dels dèficits cognitius en la MH. D’altre banda, hem observat que els nivells nuclears de Cdk5 estan disminuïts a l’estriat dels ratolins KI, cosa que podria alterar la seva funció com a inhibidor de la progressió del cicle cel·lular en neurones diferenciades. En concordança amb aquesta hipòtesi, diferents proteïnes del cicle cel·lular presenten una alteració en els seus nivells proteics, tant en ratolins KI, com en mostres de pacients humans. A més, l’activació dels receptors NMDA en neurones estriatals porta a una alteració de la distribució subcel·lular de les proteïnes del cicle cel·lular prèviament analitzades, un efecte que podria ser potenciat per la presència de la HTT mutada. En conclusió, els resultats d’aquesta Tesi, mostren la complexa implicació de Cdk5 en l’aparició dels dèficits cognitius en la MH, i suggereixen que l’alteració de la localització nuclear de Cdk5 podria portar a la desregulació de diferents proteïnes del cicle cel·lular, un mecanisme que es podria veure afavorit per alteracions en l’activació dels receptors NMDA, presents en la MH.

In this dissertation we studied the pharmacological and functional consequences of adenosine A2A receptor interaction with other proteins, as other neurotransmitter receptores localized in the human brain and an important enzyme regulating the extracellular concentration of adenosine, the ecto-ADA (adenosine desaminase). The first aim of this thesis was to study the molecular and functional interaction of A(2A)Rwith ADA. We found out that A(2A)Racted as a membrane anchoring protein of ADA, more exactly, that ADA bound to A2A receptor homomers and induced a strong modification of their quaternary structure in the way it behaved as a positive allosteric ligand. In addition at the functional level, ADA markedly enhanced A2A receptor signalling, increasing the A2A receptor agonist-induced ERK 1/2 phosphorylation. This powerful regulation of A2A function exerted by ADA might have important implications in the physiology and pharmacology of neuronal A2A receptors that are implicated in the striatal motor regulation. The second aim of this thesis was to search for a compound possibly useful in the treatment Huntington´s disease (among other neurological diseases), concretely a more selective antagonist of A2A receptor for presynaptic A1-A2A receptor heteromers versus postsynaptic A2A-D2 receptor heteromers. Applying in vitro and in vivo approaches, we discovered that the A2A receptor antagonists SCH-442416 showed a presynaptically preferential profile and, on the other hand, the KW-6002 behaved as a postsynaptically preferential A(2A)Rantagonist. Other analysed compounds ZM-241385, MSX-2, SCH-420814, and SCH-58261 showed no clear presynaptic or postsynaptic preference, i.e. presented a mixed profiles. The presynaptic preference of SCH-442416 was due to a strong negative cooperativity induced by the physical presence of dopamine D2 receptor in the A2A-D2 receptor heteromer that was detected by the compound SCH-442416. This cooperativity also indicates that A2A-A2A receptor homodimers are present in the A2A-D2 receptor heteromers. In summary, on the basis of their preferential pre- versus postsynaptic actions, SCH-442416 can be used as a lead compound in the development of antidyskinetic drugs in Huntington’s disease, meanwhile KW-6002 confirms to be possibly beneficial in Parkinson’s disease. The third aim of this thesis consisted in investigation of pharmacological and functional properties of A2A receptors in the A2A-CB1 receptor heteromers and determination whether selective A2A receptor antagonists show different selectivity for A2A receptors or A2A-CB1 receptor heteromers. We observed that adenosine A2A receptor changed its G-protein coupling from stimulatory Gs to inhibitory Gi protein when it formed heteromer with CB1 receptor and a synergistic cross-talk in G-protein activation was observed when both receptors were co-activated. At the same time, we saw that CB1 receptor mainly controled the ERK 1/2 signalling under the A2A-CB1 receptor heteromer. The A2A-CB1 receptor heteromers did not show allosteric effects at the ligand binding level. The two specific A2A receptor antagonist, KW-6002 and VER-7835 lost affinity for A2A receptors when expressed in A2A-CB1 receptor heteromers. This all means that A2A-CB1 receptor heteromers constitute a singular unit for adenosine and cannabinoids signalling, introducing diversity in A2A receptor signalling that can be therapeutically relevant in neurological diseases involving striatal neurons. In summary, the results presented in this Thesis show the importance of GPCR heteromers in the brain striatum and their physiological importance for the treatment of neurological diseases.
En esta Tesis hemos estudiado las consecuencias farmacológicas y funcionales de la interacción del receptor A2A de adenosina con otras proteínas, concretamente con otros receptores de neurotransmisores localizados en el cerebro humano y la enzima ecto-adenosina desaminasa. Hemos demostrado que el A2AR actúa como una proteína de anclaje de ADA que se une a los homodímeros de este receptor y a su vez induce una fuerte modificación en su estructura cuarternaria. Esta propiedad hace de ADA un ligando alostérico de los A2AR que modula positivamente la unión de agonistas y antagonistas al sitio ortostérico de este receptor. En segundo lugar, buscamos un antagonista de A2AR potencialmente útil para el tratamiento de la enfermedad de Huntigton, concretamente un antagonista preferencialmente más selectivo para el heterodímero "presináptico" A1R-A2AR versus el heterodímero "postsináptico" A2AR-D2R. Encontramos un compuesto, SCH-442416, que mostró este perfil presináptico, cual fue debido a una fuerte cooperatividad negativa inducida por presencia física del receptor de dopamina D2 en el heterómero A2AR-D2R. Al revés, otro compuesto, KW-6002, mostró un perfil preferencial postsináptico. Por ello, SCH-442416 puede ser utilizado como un compuesto de partida para el desarrollo de fármacos antidiscinéticos para la enfermedad de Huntington, y por su parte KW-6002 comprobó ser posiblemente beneficioso en la enfermedad de Parkinson. En tercer lugar demostramos que el receptor CB1 influye al A2AR cual cambia su acoplamiento de una proteína Gs estimuladora a una Gi inhibidora en el heterodímero A2AR-CB1R y también controla la señalización de ERK 1/2 y que el KW-6002 pierde afinidad por los receptores A2A en este heterómero. En resumen esta Tesis muestra la importancia de heterómeros de receptores acoplados a proteína G en el cerebro y su relevancia fisiológica a la hora de búsqueda de tratamiento para las enfermedades neurológicas.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Analiza los haplotipos de la enfermedad de Huntington en una población peruana atendida en el Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas durante el período 2000-2013. Como método utiliza 23 tag SNPs del gen HTT, se identifican y categorizaron los 3 haplogrupos principales (A, B y C) y sus respectivas variantes en un total de 60 cromosomas EH, 130 cromosomas controles y 82 cromosomas amerindios. Los resultados revelan que la variante A1 está sobrerrepresentada en los cromosomas EH (72%) respecto a los cromosomas controles (16%), siendo el Valle de Cañete el lugar donde se concentran la mayoría de casos (59.26%) con esta variante. Además, en los cromosomas amerindios se encuentra una pequeña proporción de la variante A1 (7%). Concluye que la variante A1 del haplogrupo A está asociada a la EH en la población peruana estudiada, además es el haplogrupo más frecuente en los cromosomas EH.
Tesis

La malaltia de Huntington és un trastorn neurodegeneratiu progressiu causat per una expansió de repeticions del triplet CAG (més de 37) en l’exó 1 del gen de la huntingtina que genera una proteïna aberrant. Aquesta proteïna modificada és tòxica i provoca una pèrdua selectiva de neurones GABAèrgiques de projecció en el nucli estriat, tot i que també s’han detectat alteracions i degeneració en altres àrees de l’encèfal, generant una simptomatologia complexa que engloba alteracions motores, cognitives i emocionals. Un marcador de la patologia és la formació d’agregats proteics, principalment compostos per fragments N-terminals de la huntingtina mutada que es generen per l’acció de proteases. Un dels processos que condueix a la mort selectiva de les neurones és l’activació de l’apoptosi. L’equilibri entre vies pro-apoptòtiques i vies de supervivència no només és el que regula el destí de la cèl•lula, sinó que també podria participar en la regulació de l’aparició dels primers símptomes de la patologia en un individu afectat. En aquesta Tesi es descriuen tres possibles mecanismes cel•lulars activats en un model murí de malaltia de Huntington, que podrien participar en compensar la toxicitat que genera la huntingtina mutada i així retardar-ne la patologia: (1) la sobreactivació de l’autofàgia selectiva a estadis inicials de la patologia, important per la degradació de la huntingtina mutada; (2) la sobreactivació de la via de senyalització mTOR-AKT, que participa en mecanismes de supervivència cel•lular; i (3) la inhibició de la via de senyalització de la PKCδ, que quan es troba activada genera apoptosis cel•lular en cèl•lules que expressen la huntingtina mutada. Potenciar des d’edats primerenques qualsevol d’aquests tres mecanismes, doncs, podria ser una bona estratègia terapèutica per a la malaltia de Huntington.
Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder caused by a CAG expansion (more than 37 repeats) in the exon 1 of the huntingtin gene, which results in the synthesis of a mutant protein that is toxic for some neuronal types. The striatum is the most affected brain region, although other brain areas, such as the cerebral cortex or hippocampus are also affected. Aggregates are a pathological hallmark of the disease, which are mainly composed by N-terminal mutant huntingtin fragments and are present within the cells in both cytoplasm and nucleus. Apoptotic activation is one of the mechansims by which neurodegeneration occurs. Thus, whether a neuron lives or dies in pathological condition is the result of a complex balance between anti- and pro-apoptotic signals, which is crucial to determine cell fate. Moreover, this balance might strongly regulate the onset of the disease. Here, we have characterized three putative compensatory pro-survival processes that are altered in Huntington’s disease and could be involved in delaying the pathology progression. First, we have studied selective autophagy, a mechanism that degrades toxic mutant huntingtin species. To this end, we analyzed protein levels and intracellular localization of p62 and NBR1 (two selective autophagy receptors that specifically recognize cell components that need to be removed by means of autophagy) in the R6/1 mouse model of HD along the progression of the disease.,. We have observed that at early stages of the disease, p62 and NBR1 protein levels are reduced, indicating increased autophagic activity that could play a role in degrading mutant huntingtin. However, at later stages of the disease protein levels of both proteins have a different pattern depending on the cerebral region analyzed. In the cortex protein levels of both proteins are still reduced, indicating that selective autophagy is overactivated until later stages of the disease. However, in the striatum and in the hippocampus they accumulate due to distinct factors. p62 is sequestered by nuclear mutant huntingtin aggregates, while NBR1 is still in the cytoplasm, thus still taking part in the autophagy process. Its accumulatiion could be due to an inefficient selective autophagy that could get worst with age. We have also studied whether different intracellular signalling pathways, involved in cell survival or apoptosis, are altered by mutant huntingtin expression. We have observed that the mTOR signalling pathway, through the mTORC2 but not mTORC1 complex, is over-activated in the striatum of R6/1 mice, and we think that this overactivation could play a role in the previous reported increased phosphorylation of the pro-survival kinase AKT in the same HD mouse model. An increase in the activity of the mTORC2 complex, could be due to an increase in Rictor protein levels that have been found specifically in the striatum of R6/1 mice and in the putamen of HD patients. Finally, we also analyzed the PKC signalling pathway, since PKCs regulate different processes important for neuronal survival and plasticity. We have observed that protein levels of different PKC isoforms, PKCα, PKCβII and PKCδ, are reduced in the striatum, cortex and hippocampus of R6/1 mice. The most important reduction was observed for the proapototic PKC isoform PKCδ, which started already at early stages of the disease. This suggests that neurons could try to block this signalling pathway in order to reduce mutant huntingtin toxicity. We have obsereved that striatal cells that express mutant huntingtin, but not wild-type huntingtin, are more vulnerable to undergo apoptosis when they overexpress PKCδ. The present Thesis describes the up-regulation of several compensatory prosurvival mechanisms in HD to counteract the mutant huntingtin-induced toxicity. The potentiation of such prosurvival mechanisms could be a good therapeutical approach in HD.

Understanding the molecular underpinnings of neuronal dysfunction and degeneration involved in Huntington’s disease is a goal of increasing urgency for society and scientific community. In this Thesis we have studied different proteins and signaling pathways, specifically altered by the presence of mutant huntingtin, as new potential candidates to develop pharmacological strategies to treat or delay motor and cognitive deficits in Huntington’s disease. AIM 1. To study the contribution of CBP/CREB pathway in the cognitive deficits present in Huntington’s disease. AIM 2. To study the molecular mechanisms involved in neurotrophic support dysfunction in Huntington’s disease. 2.1. To analyze the role of p75NTR/TrkB receptors in the major striatal vulnerability in Huntington’s disease. 2.2. To study the role of p75NTR in cognitive deficits in Huntington’s disease. AIM 3. To study the molecular mechanisms involved in corticostriatal dysfunction in Huntington’s disease. 3.1. To characterize corticostriatal deficits in HD mouse models and analyze the role of Kalirin-7 in the alteration of corticostriatal excitatory synapses in HD. AIM 4. To study the role of Cdk5 in cognitive deficits in Huntington’s disease. AIM 5. To study the role of D1R-H3R heteromers in neuronal cell death and cognitive deficits in Huntington’s disease.
La malaltia de Huntington (MH) és un desordre neurodegeneratiu caracteritzat per la disfunció i mort neuronal de regions específiques del cervell. La regió més afectada és l’estriat (nuclis caudat i putamen en humans), tot i que en estadis més avançats de la malaltia s’ha descrit una atròfia i pèrdua neuronal del còrtex cerebral i hipocamp (Vonsattel et al., 1985;Vonsattel and DiFiglia, 1998). La temprana disfuncionalitat de les neurones hipocampals i corticals es creu crítica per restablir les deficiències cognitives i de memòria en aquesta patologia. La malaltia s’hereta de forma autosòmica dominant i és causada per la mutació del gen IT15, localitzat en el braç curt del cromosoma 4 (4p.16.3), que codifica per la proteïna anomenada huntingtina (htt). Aquesta mutació va ser identificada l’any 1993 com una expansió de repeticions del triplet CAG que codifiquen per una regió poliglutamínica (poliQ) a l’extrem N-terminal de la proteïna htt (350KDa) (HDCRG, 1993). En individus sans, el nombre de repeticions oscil·la de 6 a 35; quan el nombre de repeticions d’aquest triplet és superior a 40, l’individu desenvoluparà la malaltia. Les primeres manifestacions de la malaltia solen produir-se als 35 anys d’edat conduint a la mort 15-­20 anys després de l’aparició dels símptomes (Bates, 2003;Martin and Gusella, 1986). La simptomatologia inclou disfunció motora, associada majoritàriament a l’atròfia estriatal, acompanyada de trastorns cognitius i emocionals associats a l’afectació corticoestriatal i hipocampal que son de manifestació primerenca, fins i tot prèvia a la simptomatologia motora. Aquestes alteracions cognitives i emocionals constitueixen un dels pilars discapacitants en aquesta patologia, per això al llarg d’aquesta Tesi doctoral proposem un estudi dual que ens permeti definir diverses estratègies terapèutiques dirigides al tractament d’ambdues simptomatologies: motora i cognitiva. Si bé es coneix que aquesta mutació és la causant de la malaltia, avui en dia no es coneixen els mecanismes cel·lulars i moleculars responsables de la disfunció i mort neuronal en la MH. Diversos estudis han postulat que la pèrdua de funció de la proteïna wild-type i/o el guany de funció de la proteïna mutada (mhtt) juguen un paper clau en el desenvolupament de la malaltia. Així s’ha descrit que l’expressió de la proteïna huntingtina mutada resulta en l’alteració de diversos processos cel·lulars i moleculars, tals com l’agregació proteica, alteracions en el sistema ubiqüitina­proteosoma, desregulació en la maquinària transcripcional així com en la remodelació de la cromatina, alteracions en la síntesi proteica, reducció del suport tròfic, alteracions en les vies de senyalització intracel·lulars, alteració en la homeòstasis del calci, dany mitocondrial, excitotoxicitat, activació de caspases, alteracions en les interaccions proteïna-proteïna i alteració en la circuiteria neuronal (Cattaneo et al., 2005;Zuccato and Cattaneo, 2009). En aquesta Tesis ens hem centrat en estudiar alguns dels mecanismes moleculars implicats en la mort neuronal, així com en els dèficits cognitius i alteracions en la plasticitat sinàptica produïda per la presència de la huntingtina mutada, mitjançant l’estudi de les alteracions produïdes en: 1) maquinària transcripcional, 2) suport neurotròfic, 3) canvis estructurals en les sinapsis excitadores, 4) senyalització de proteïnes cinasa i fosfatasa i 5) formació d’heteròmers entre receptors acoblats a proteïnes G.

Huntington’s disease is a progressive neurodegenerative disorder caused by the expansion of a CAG tract in the exon-1 of the huntingtin gene. Mutant huntingtin induces a large amount of toxic effects that trigger cell dysfunction and consequently, behavioral alterations such as motor dysfunction, cognitive decline and psychological disturbances. However, before the onset of symptoms individuals are healthy. Thus, it is plausible that compensatory mechanisms may be activated to regulate a balance between cell death and survival. This compensatory mechanism might modulate the progression of Huntington’s disease. Understanding altered mechanisms due to mutant huntingtin expression in order to find new therapeutic targets to reduce neuronal dysfunction/death in Huntington’s disease must be a priority. It is believed that there is a balance between positive signaling for cell survives or dies. Many of the pathways involved in these processes are controlled at the level of phosphorylation and transcription. In this thesis we have studied mechanisms of transcription and protein activation, which are considered one of the main causes that trigger to mutant huntingtin-induced neuronal dysfunction. We have identified two targets, the protein kinase p90Rsk and the transcription factor Elk-1, that are activated during the progression of Huntington’s disease in order to protect striatal cells against mutant huntingtin-induced cell death. These two proteins are tightly related to neuronal survival and transcription regulation. p90Rsk is a kinase that phosphorylates substrates in the cytoplasm inhibiting their pro-apoptotic activity and phosphorylate transcription factors in the nucleus promoting their pro-survival activity. Likewise, Elk-1 promotes the transcription of many immediate early genes related to synaptic plasticity and neuronal survival. We observed an up-regulation of these to proteins during the progression of Huntington’s disease in different mouse models. This up-regulation was necessary to protect striatal cells from mutant-huntingtin. The prevention of cell death is an important point for neurodegenerative diseases; even so, it is unlikely that cellular machinery works well until the death of the cells. In many neurodegenerative diseases, such as Huntington’s disease, neuronal and synaptic dysfunction precedes cell death and occurs long before, or sometimes in absence of cell death. Recent studies suggest that targeting early pathophysiological disturbances in models of Huntignton’s disease can reverse neuronal dysfunction and delay progression to neurodegeneration. In this thesis, we also point out for the first time the modulation of Prostaglandin E2 (PGE2) EP receptors, namely EP1 and EP2, as a therapeutic targets in Huntington’s disease. The activation of EP1 receptor produces an increase in intracellular levels of calcium, while EP2 receptor activation increases cAMP; therefore, the activation of different EP receptors can have opposite effects. Whereas the blockade of EP2-EP4 receptors can aggravate neurodegeneration, antagonizing EP1 receptor has neuroprotective effects. We observed that pharmacological inhibition of EP1 receptor improves motor coordination and reduces memory decline in R6/1mice model of Huntington’s disease. Moreover, EP1 antagonism increases the expression of specific synaptic markers in the striatum and the hippocampus of these mice and also improves the long-term potentiation in the hippocampus. Finally, EP1 receptor antagonism reduces the presence of striatal and hippocampal mutant huntingtin nuclear aggregates in the striatum and the hippocampus of treated-R6/1 mice. Contrary to EP1 receptor, EP2 receptor plays a neuroprotective role in Huntington’s disease. We observe that EP2 receptor activation improves long-term memory in R6/1 mice. Moreover, EP2 activator increases dendritic branching in a BDNF-dependent manner, increases the protein levels of BDNF and the total number of PSD-95+ spines in the hippocampus of these mice. In conclusion, we propose the modulation of PGE2 receptors as a new therapeutic strategy in Huntington’s disease.
La malaltia de Huntington és un trastorn neurodegeneratiu progressiu caracteritzat per la presencia d’alteracions motores i dèficits cognitius. Aquesta malaltia està causada per l’expansió anòmala del triplet CAG en l’exó 1 del gen que codifica per la proteïna huntingtina. La huntingtina mutada indueix gran quantitat d’efectes tòxics que desencadenen la disfunció cel•lular i, en conseqüència, les alteracions en la conducta característiques d’aquesta malaltia. Tot i així, abans de l’aparició del símptomes, els individus són sans. Per tant, és plausible pensar que es produeix una activació de mecanismes compensatoris per a regular l’equilibri entre la mort i la supervivència cel•lular. En aquesta tesis, ens hem centrat en dos objectius principals: (1) l’estudi dels mecanismes compensatoris activats en la presencia de la huntingtina mutada per tal de millorar la supervivència cel•lular i (2) la identificació de dianes moleculars per a reduir els dèficits motors i cognitius, així com per a millorar la plasticitat sinàptica en models murins de la malaltia de Huntington. Específicament, els nostres resultats han ajudat a entendre el paper de la proteïna cinasa p90Rsk i del factor de transcripció Elk-1 en la susceptibilitat de les neurones estriatals a la mort induïda per la huntingtina mutada. Per altre banda, mostrem per primera vegada el potencial terapèutic dels receptors de la prostaglandina E2, EP1 i Ep2, per al tractament dels símptomes clínics y histopatològics en la malaltia de Huntington.

The aims of this thesis are: Aim 1. The involvement of A(1)R-A(2A)R heteromer in glial cells and its study at a molecular level. Aim 2. To find evidence for allosteric interactions between partner receptors in the A(2A)RD(2)R receptor heteromer which confer specific pharmacological characteristics to the heteromer. Aim 3. Search for selective antagonists of A(2A)R for presynaptic A(1)R-A(2A)R heteromers versus postsynaptic A(2A)R-D(2)R heteromers that can be useful for treatment of neurological disorder’s treatment, particularly Huntington’s disease. Aim 4. Investigate the pharmacological and functional properties of A(2A)R in the A(2A)CB1 heteromer. Aim 5. Compound screening of different A(2A)R antagonists in stable CHO cell lines expressing A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R or A(2A)R-CB(1)R heteromers. The conclusions of the objectives are: Conclusions derived from the first aim: The involvement of A(1)R-A(2A)R heteromer in glial cells and its study at a molecular level. - Upon GABA uptake, adenosine has a biphasic effect, which is mediated by A(1)RA(2A)R heteromers coupled to both Gi/0 and Gs proteins. Extracellular adenosine acting on these A(1)R-A(2A)R functional units operates in a concerted way to balance a PKA-dependent action on GABA uptake. The neural output would thus be inhibitory at low firing rates and facilitatory at high firing rates. - Adenosine by acting on adenosine receptors in astrocytes may significantly contribute to neurotransmission in a dual manner, which depends on the concentration of the nucleoside that is in turn dependent on neuronal firing activity. - BRET and single molecule tracking with TIRF microscope show that the minimal GPCR heteromer unit may consist of four protomers and two G proteins. The strong similarity between GPCRs suggests that the molecular model proposed could apply to other receptors. - These heteromers can be formed in the plasma membrane and are stable on the order of minutes. Such stability suggests that designing ways to target these heteromers may indeed be a viable strategy. - The orientation of the alpha-subunits of the G proteins is on the distal receptors, suggesting that G proteins cross-talk could occur via receptors across the heteromer complex. - The heteromeric unit described, with its dynamic and structural limitations, provides the molecular framework to understand why heteromers are functionally distinct units and not merely the aggregation of two entities with independent functions. Conclusions derived from the second aim: To find an evidence for allosteric interactions between partner receptors in the A(2A)R-D(2)R receptor heteromer which confer specific pharmacological characteristics to the heteromer. In cell culture, the agonist and antagonist binding to the adenosine A(2A)R diminish the affinity of dopamine D(2)R agonists and antagonists. - Those negative interactions between ligands are consequence of allosteric interactions between both receptors conforming the A(2A)R-D(2)R heteromer and constitute a unique biochemical property of this heteromer. - In ex vivo tissue, using these allosteric interactions as a heteromer fingerprint, it has been demonstrated the expression of A(2A)R-D(2)R heteromer in human striatum. - The fact that the A(2A)R antagonists are able to modulate dopamine D(2)R pharmacology has to be taken into account to understand pathologies such as Parkinson’s disease or for human PET neuroimaging. Conclusions derived from the third aim: Search for selective antagonists of A(2A)R for presynaptic A(1)R-A(2A)R heteromers versus postsynaptic A(2A)R-D(2)R heteromers that can be useful for neurological disorder’s treatment, particularly Huntington’s disease. - The physical presence of dopamine D(2)R in the A(2A)R-D(2)R heteromer induced a strong negative cooperativity in the A(2A)R that was detected by SCH-442416. This cooperativity indicates that A(2A)R-A(2A)R homodimers are present in the A(2A)R-D(2)R heteromer. - Based on in vitro and in vivo approaches, the compound SCH-442416 was classified as a preferential presynaptic A(2A)R antagonist, and the compound KW- 6002 was classified as a preferential postsynaptic A(2A)R antagonist. Considering this, SCH-442416 can be used as a lead compound in the development of antidyskinetic drugs in Huntington’s disease; meanwhile KW-6002 can be beneficial in Parkinson’s disease. Conclusions derived from the fourth aim: Investigate the pharmacological and functional properties of A(2A)R in the A(2A)R-CB1R heteromer. - Adenosine A(2A)R changes its G-protein coupling from stimulatory Gs to inhibitory Gi when it forms heteromer with CB1R and a synergistic cross-talk in G-protein activation is observed when both receptors are coactivated. - CB1R mainly controls the ERK1/2 signaling under the A(2A)R-CB1R heteromer. - The A(2A)R-CB1R heteromer does not show allosteric effects at the ligand binding level. Conclusions derived from the fifth aim: Compound screening of different A(2A)R antagonists in stable CHO cell lines expressing A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R or A(2A)R-CB1R heteromers. - Compound number 9 could be a good candidate to treat Parkinson’s disease due to its preferential binding to A(2A)R forming A(2A)R-D(2)R heteromer.
Els objectius de la tesi doctoral són: - Objectiu 1. Implicacions de l’heteròmer A(1)R-A(2A)R a les cèl•lules glials i el seu estudi a nivell molecular. - Objectiu 2. Trobar evidències de modulacions al•lostèriques entre receptors a l’heteròmer A(2A)DD(2)R que confereixen característiques farmacològiques específiques a l’heteròmer. - Objectiu 3. Recerca d’antagonistes selectius de A(2A)R per a heteròmers presinàptics A(1)R-A(2A)R versus heteròmers postsinàptics A(2A)R-D(2)R que poden ser útils en el tractament de malalties neurològiques, particularment en la malaltia de Huntington. - Objectiu 4. Investigar les propietats funcionals i farmacològiques de A(2A)R en l’heteròmer A(2A)RCB(1)R. - Objectiu 5. Anàlisi de diferents compostos antagonistes de A(2A)R en línies cel•lulars estables CHO expressant A(2A)R, A(1)R-A(2A)R, A(2A)R-D(2)R o A(2A)R-CB(1)R. Les conclusions de la tesi són les següents. Primer objectiu: - En la recaptació de GABA, l’adenosina te un efecte bifàsic, el qual està mediat pels heteròmers A(1)R-A(2A)R que es troben acoblats a proteïnes Gi/o i Gs. L’adenosina extracel•lular actuant sobre aquests heteròmers opera en el balanç de recaptació de GABA depenent de l’activitat PKA. La senyalització neural serà inhibitòria a baixa activació neuronal i facilitadora a alta activitat neuronal. - BRET i experiments de “single molecule tracking” amb microscopi TIRF demostren que l’expressió mínima d’aquest heteròmer consta de quatre protomers i dues proteïnes G. La gran similitud entre GPCR suggereix que aquest model molecular podria ser aplicable a altres receptors. - Aquests heteròmers poden formar-se a la membrana plasmàtica i són estables durant minuts. Aquesta estabilitat suggereix que el disseny de fàrmacs dirigits contra aquests heteròmers és una estratègia viable. Segon objectiu: - En cultius cel•lulars, la unió d’agonistes i antagonistes a A(2A)R fa disminuir l’afinitat d’agonistes i antagonistes per al D(2)R. - Aquestes interaccions negatives entre lligands són conseqüència d’interaccions al•lostèriques entre ambdós receptors que conformen l’heteròmer A(2A)R-D(2)R i constitueixen una unitat bioquímica. - El fet de que els antagonistes de A(2A)R són capaços de modular la farmacologia de D(2)R ha de ser tingut en compte per poder entendre patologies com la malaltia de Parkinson i per a la neuroimatge per PET. Tercer objectiu: - La presència física de D(2)R en l’heteròmer A(2A)R-D(2)R indueix una forta cooperativitat negativa a A(2A)R la qual va ser detectada per SCH 442416. Aquesta cooperativitat indica que el homodimers A(2A)R-A(2A)R es troben presents a l’heteròmer A(2A)R-D(2)R. - Basant-nos en experiments in vitro i in vivo, el compost SCH 442416 va ser classificat com a preferentment antagonista de receptor A(2A) presinàptic, i el compost KW 6002 va ser classificat com a antagonista preferentment postsinàptic. Considerant això, SCH 442416 pot ser utilitzat pel desenvolupament de fàrmacs antidiscinètics pel tractament de la malaltia de Huntington, mentre que KW 6002 pot ser beneficiós per a tractar la malaltia de Parkinson. Quart objectiu: - A(2A)R canvia el seu acoblament a proteïna Gs per Gi quan passa a formar heteròmers amb CB(1)R i un “cross-talk” sinergístic en activació de proteïna G s’observa quan tots dos receptors es troben co-activats. Cinquè objectiu: - El compost número nou podria ser un bon candidat per tractar la malaltia de Parkinson degut a la seva unió preferencial al receptor A(2A) present a l’heteròmer A(2A)R-D(2)R.

Huntington disease is a neurodegenerative disorder characterized by motor, cognitive and psychiatric dysfunction. Huntington disease is caused by an expanded CAG trinucleotide repeat at the exon 1 of the IT15 gen, which encodes for the huntingtin protein. It has been determined that the presence of mutant huntingtin activates distinct pathological cellular mechanisms that generate neuronal dysfunction and lead to neuronal death. One of the central aims in Huntington disease research is the study of molecular alterations to find new therapeutic targets to stop or delay Huntington disease progression. In particular, in this thesis we have observed alterations in ERK5 and MEF2 proteins and its involvement in Huntington disease pathology. Additionally, the results of this thesis contribute to describe EP2 receptor therapeutic role, promoting BDNF trophic effect, in Huntington disease.
La malaltia de Huntington és un trastorn neurodegeneratiu caracteritzat per la presencia de símptomes motors, cognitius i psiquiàtrics. El motiu causal de la malaltia de Huntington és l’expansió del triplet CAG en l’exó 1 del gen que codifica per a la proteïna huntingtina. La presencia de la htt mutada causa l’activació de processos cel·lulars patològics causant primer la disfunció, i després la mort neuronal. Un dels punts centrals en la recerca de la MH és l’estudi d’alteracions moleculars per a poder trobar nous candidats terapèutics que puguin aturar o atenuar la inexorable progressió de la malaltia. En concret, en aquesta tesi hem observat l’alteració de les proteïnes ERK5 i MEF2 i la seva implicació en la patología de la malaltia de Huntington. Per altra banda, els resultats d’aquesta tesi també han contribuït a descriure el rol terapèutic de l’estimulació del receptor EP2, promovent l’efecte tròfic mediat pel BDNF, en la malaltia de Huntington.

La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria caracterizada por movimientos involuntarios, deterioro cognitivo y cambios de comportamiento. Usualmente, se manifiesta entre la tercera y quinta década de vida; sin embargo, existe gran variabilidad en la edad de inicio. Esta enfermedad es causada por la expansión de un microsatélite compuesto por la secuencia repetitiva (CAG)n en el gen de la Huntingtina (HTT). La edad de inicio, mayormente referida a la edad de inicio motor, está determinada por el número de repeticiones CAG en el alelo mutante: a mayor número de repeticiones, menor es la edad de inicio. La mayoría de intentos por predecir la edad de inicio de la EH emplean modelos de regresión lineal, un método que presenta escasa capacidad predictiva. El objetivo de este estudio fue predecir la edad de inicio de la EH mediante modelos de supervivencia y modelos de regresión lineal con efectos fijos y mixtos. Este estudio incluyó 220 individuos de 172 familias. Se encontró evidencia que el modelo con mayor exactitud fue el modelo lineal mixto. Además, se registró que los efectos aleatorios explican un porcentaje adicional de la varianza de la edad de inicio en individuos con la EH.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). 098-2017-FONDECYT

Huntington's disease (MH) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by a motor dysfunction, cognitive impairment, and psychiatric symptoms. At neuropathological level, it has been described that cognitive disorders are associated with cortical and hippocampal function and motor symptoms with cortical and striatal function. It has been proposed that restoring the hippocampal and striatal function would be key to recover cognitive and motor function respectively. For this reason, throughout this thesis we propose a dual study that allows us to define different therapeutic compounds with the capacity to restore synaptic plasticity and to protect against neuronal death. We have described two new compounds with therapeutic potential, PACAP and EGCG; and we have proposed two new therapeutic targets, PAC1 receptor and the FASN enzyme. Thus, the results obtained in this thesis open two new doors for the treatment of cognitive and motor symptoms in HD.
La malaltia de Huntington (MH) és un trastorn neurodegeneratiu progressiu caractritzat per una alteració del control motor, per dèficits cognitius i símptomes psiquiàtrics. A nivell neuropatològic, s’ha descrit que els trastorns cognitius estan associats a la funció cortical i hipocampal i els símptomes motors amb la funció cortical i estriatal. S’ha proposat que restablir la funció hipocampal i estriatal seria clau per recuperar la funció cognitiva i motora respectivament. Per això, al llarg d’aquesta tesi proposem un estudi dual que ens permeti definir compostos terapèutics amb capacitat de restablir la plasticitat sinàptica i de protegir enfront de la mort neuronal. Hem descrit dos nous compostos amb capacitat terapèutica, el PACAP i el EGCG; i hem proposat dues noves dianes terapèutiques pels seus efectes, el receptor PAC1 i l’enzim FASN. Amb tot, els resultats obtinguts amb aquesta tesi obren noves portes pel tractament dels símptomes cognitius i motors de la MH.

La instauración de terapias de sustitución celular en enfermedades neurodegenerativas requiere disponer de una población homogénea del tipo celular concreto que ha de ser reemplazado. Para ello va a ser necesario una diferenciación controlada de células madre hacia el fenotipo de interés. Una buena aproximación a la hora de de guiar la diferenciación de células madre es seguir los mecanismos que gobiernan la generación de dichas células durante el desarrollo del sistema nervioso. Por lo tanto va a ser necesario estudiar las poblaciones de precursores neurales que van a dar lugar a la generación de la inmensa diversidad celular existente en el cerebro, así como los factores de transcripción y factores solubles que modulan la determinación de esos precursores hacia linajes específicos.

La enfermedad de Huntington cursa con la degeneración selectiva de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales, es por ello que el objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de factores solubles así como de factores de transcripción que están implicados en la diferenciación de dichas neuronas. Para ello se han utilizado diferentes aproximaciones. En primer lugar se han utilizado ESC de ratón para el estudio de la implicación del ácido retinoico y LIF, dos factores solubles, en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas estriatales. El ácido retinoico es un potente factor neurogénico que ha sido ampliamente utilizado para inducir la diferenciación neuronal de ESC (Bain y col., 1996; Okada y col., 2004). Por su parte LIF es un factor que se utiliza para mantener las células madre embrionarias en un estado indiferenciado. Sin embargo, diversos autores lo utilizan también en sus protocolos de diferenciación neuronal de dichas células (Tropepe y col., 2001; He y col., 2006). Nosotros hemos estudiado la interrelación entre estos dos factores en la diferenciación neuronal de ESC de ratón en cultivos a corto y largo plazo. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento con LIF inhibe la diferenciación neuronal inducida por ácido retinoico. En segundo lugar, el tratamiento con elevadas concentraciones de ácido retinoico en ausencia de factores de crecimiento induce una diferenciación neuronal madura que supone una reducción en la viabilidad de las ESC diferenciadas a largo plazo. Además el elevado número de neuronas derivadas de la diferenciación de las ESC tratadas con ácido retinoico in vitro no se observa tras el trasplante cerebral de éstas.

En una segunda aproximación al estudio de los factores implicados en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales y teniendo en cuenta que durante el desarrollo de los precursores estriatales intervienen diversos factores de transcripción, en la presente tesis se ha estudiado el papel del factor de transcripción Ikaros durante el desarrollo del núcleo estriado y en concreto en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas estriatales. Nuestros resultados muestran que Ikaros es esencial para la correcta generación de neuronas encefalinérgicas estriatales a partir de la diferenciación de precursores neurales Dlx-2 positivos de la LGE. La salida de ciclo de los precursores que van a poblar la matriz del núcleo estriado requiere Ikaros y la falta de éste afecta a las poblaciones de células madre de la zona germinal, no sólo durante el desarrollo sino también en el adulto. En consecuencia, el embrión deficiente de Ikaros presenta una zona germinal mayor a expensas de una reducción en el volumen estriatal. El menor tamaño del núcleo estriado observado en el ratón deficiente de Ikaros en comparación con el ratón normal es debido a la disminución en el número de neuronas totales y en particular de la subpoblación encefalinérgica de neuronas de proyección. Es decir, que Ikaros induce la diferenciación neuronal encefalinérgica en precursores neurales tal y como se confirma mediante experimentos de sobre-expresión de Ikaros-1.

El estudio de la implicación del ácido retinoico y LIF, como factores solubles, y de Ikaros, como factor de transcripción, en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales nos acerca un poco más al establecimiento de un método reproducible y controlado de diferenciación de células madre que permita la generación ex vivo de neuronas GABAérgicas funcionales que puedan ser utilizadas para el trasplante en terapias sustitutivas de la enfermedad de Huntington.

Les Maladies Neurodégénératives Rares à Expression Motrice (MNDREM) sont un groupe très hétérogène de pathologies neurodégénératives de physiopathologie acquise ou innée, pouvant se déclarer à tout âge. Elles impactent de façon ciblée, les structures neurologiques centrales ou périphériques impliquées dans l’activité motrice. Ces structures sont fonctionnellement et topographiquement proches des centres de cognition. C’est ainsi que dans certaines conditions, la neurodégénérescence des structures motrices impacte les fonctions cognitives. Elles se traduisent par des troubles de la marche et /ou de l’équilibre, une diminution ou une absence de mouvement, une atteinte cognitive variée pouvant aller jusqu’à la démence.Les MNDREM sont sporadiques ou familiales. Ces dernières sont donc à composante héréditaire et représentent des modèles d’étude intéressants car elles offrent la possibilité d’analyser des ADN d’apparentés et d’augmenter de ce fait la puissance de recherche de facteurs génétiques impliqués dans une symptomatologie familiale. La littérature scientifique indique un nombre important de variants génétiques pathogènes responsables des MNDREM, ce qui aide la classification mais la complexifie également puisqu’on constate qu’un même gène peut être impliqué dans plusieurs pathologies et une pathologie peut être causée par différents gènes. Par conséquent, dans les MNDREM, on observe des symptomatologies atypiques, des chevauchements ou « overlap » cliniques des maladies alléliques.Aux Antilles françaises, les données de la littérature en matière de MNDREM sont limitées mais riches de certaines observations confortant les atypies comme par exemple le syndrome parkinsonien atypique des Caraïbes. Sur le plan génétique, les investigations diagnostiques sont restreintes aux filières médicales basées en métropole et sur la comparaison de données génomiques de populations le plus souvent caucasiennes.Le travail de thèse présenté s’articule autour de 2 aspects : le premier, clinique et génétique, a permis de dresser un état des lieux des MNDREM en Martinique en les caractérisant sur ces plans, le deuxième sur la recherche de variants causaux par une technique de Séquençage Haut Débit (NGS) de 2e génération nommée CoDEseq (Copy number variation Detection and Exome sequencing). L’état des lieux des MNDREM en Martinique, et le travail expérimental d’analyse de données de NGS, sont les premiers travaux de ce type dans le domaine et dans notre région.La méthode CoDEseq est innovante car elle autorise l’analyse exome entier à la recherche de Variants Simples Nuclotidiques (SNVs) ou Variants de Nombre de Copies (CNVs). Elle n’avait presque jamais été utilisée dans l’analyse des MNDREM. Nous l’avons employée car c’est une méthode de choix de recherche à la fois de variants simples et de variants de structures nouveaux.Les résultats montrent une rentabilité diagnostic de 58% puisque nous avons identifié un variant probablement pathogène chez 7 patients sur 12 testés. Nous avons trouvé ces variants dans des gènes connus de MNDREM parfois décrits dans des populations asiatiques, mais aussi, d’ascendance africaine ou caucasienne. Certains de ces gènes peuvent être impliqués dans plusieurs symptomatologies, confortant le constat de chevauchement clinique dans ces maladies.Ce travail jette les bases épidémiologiques des MNDREM aux Antilles et propose un socle de registre en la matière. Sur le plan expérimental, il a permis de proposer une étiologie moleculaire impliquant des variants préalablement décrit ou nouveaux. Il est également une preuve de concept quant aux moyens bioinformatiques d’analyse de données de NGS en Martinique. Il ouvre la voie vers d’autres travaux du même genre, susceptibles de dresser les spécificités géniques des MNDREM de notre région et étoffer les données de la littérature scientifiques et médicales
Rare Neurodegenerative Diseases with Motor Expression (RNDME) are a very heterogeneous group of neurodegenerative pathologies of acquired or innate physiopathology that can occur at any age. They have a targeted impact on the central or peripheral neurological structures involved in motor activity. These structures are functionally and topographically close to the centers of cognition. Thus, under certain conditions, the neurodegeneration of motor structures impacts cognitive functions.They result in gait and/or balance disorders, a decrease or absence of movement, a varied cognitive impairment that can go as far as dementia.RNDME are sporadic or family based. The latter have a hereditary component and therefore represent interesting study models because they offer the possibility of analyzing the DNA of relatives and thus increase the research power of genetic factors involved in a family symptomatology.The scientific literature indicates an important number of genetic pathogenic variation responsible for RNDMEs, which allows classification but also makes it more complex because it can be observed that the same gene can be involved in several pathologies and a pathology can be caused by different genes. Consequently, in RNDMEs, atypical symptoms, clinical overlaps or allelic diseases are observed.In the French West Indies, the data in the literature on RNDMEs are limited but rich in certain observations confirming the atypical RNDMEs seach as the atypical Caribbean Parkinson's syndrome.On the genetic level, diagnostic investigations are limited to medical fields based in metropolitan France and most often about the comparison of genomic data of Caucasian populations.The thesis work is about 2 aspects: the first, clinical and genetic, has allowed to draw up an inventory of the RNDMEs in Martinique by characterizing them on these plans, the second on the search for causal variants by a Next Generation Sequencing (NGS) technique called CoDEseq (Copy number variation Detection and Exome sequencing). The inventory of RNDMEs in Martinique and the experimental work of data analysis of NGS, are the first works of this type, in the field and in our region.The CoDEseq method is innovative because it allows whole exome analysis in the detection of Single Nucleodis Variants (SNVs) and Copy Number Variants (CNVs). It had almost never been used in the analysis of RNDMEs. We used it because it is a method of choice for searching for both simple and structural variants. The results show a diagnostic cost-effectiveness of 58% since we identified a variant probably pathogenic in 7 patients out of 12 tested. We found these variants in known RNDMEs genes sometimes described in Asian populations, but also of African or Caucasian descent. Some of these genes may be involved in several symptomatologies, confirming the finding of overlap in these diseases.This work lays the epidemiological basis for RNDMEs in the West Indies and provides a basis for a registry in this area. On the experimental level, it allow to propose a molecular cause associated with previously described or new variations. It is also a proof of concept regarding the bioinformatics means of analyzing NGS data in Martinique. It paves the way for other work of the same kind, susceptible to draw up the gene specificities of the RNDMEs in our region and to expand the data in the scientific and medical literature
Las Enfermedades Neuro-Degenerativas Raras con Expresión Motora (ENDREM) son un grupo muy heterogéneo de patologías neurodegenerativas de fisiopatología adquirida o innata que pueden presentarse a cualquier edad. Tienen un impacto específico en las estructuras neurológicas centrales o periféricas involucradas en la actividad motora. Estas estructuras están funcional y topográficamente próximas a los centros de cognición. Así, bajo ciertas condiciones, la neurodegeneración de las estructuras motoras impacta las funciones cognitivas. Producen trastornos de la marcha y / o del equilibrio, una disminución o ausencia de movimiento, un deterioro cognitivo variado que puede llegar hasta la demencia. Las ENDREM son esporádicas o familiares. Estos últimos tienen un componente hereditario y, por tanto, representan modelos de estudio interesantes porque ofrecen la posibilidad de analizar el ADN de familiares y así aumentar el poder de investigación de los factores genéticos implicados en una sintomatología familiar. para las ENDREMs, lo que permite la clasificación pero también la hace más compleja porque se puede observar que un mismo gen puede estar involucrado en varias patologías y una patología puede ser causada por diferentes genes. En consecuencia, en las ENDREMs se observan síntomas atípicos, solapamientos clínicos o enfermedades alélicas.En las Antillas francesas, los datos de la literatura sobre las ENDREMs son limitados pero ricos en ciertas observaciones que confirman la búsqueda de las ENDREMs atípicas como síndrome de Parkinson del Caribe atípico. En el nivel genético, las investigaciones de diagnóstico se limitan a los campos médicos basados en la Francia metropolitana y con mayor frecuencia sobre la comparación de datos genómicos de poblaciones caucásicas.El trabajo de tesis gira en torno a 2 aspectos: el primero, clínico y genético, ha permitido elaborar un inventario de las ENDREMs en Martinica caracterizándolas en estos planos, el segundo sobre la búsqueda de variantes causales mediante una secuenciación de próxima generación (NGS) técnica denominada CoDEseq (Detección de variación de número de copias y secuenciación de exomas). El inventario de ENDREMs en Martinica y el trabajo experimental de análisis de datos de NGS, son los primeros trabajos de este tipo, en el campo y en nuestra región.El método CoDEseq es innovador porque permite el análisis del exoma completo en la detección de variantes de núcleo único (SNV) y variantes de número de copias (CNV). Casi nunca se había utilizado en el análisis de las ENDREMs. Lo usamos porque es un método de elección para buscar variantes simples y estructurales. Los resultados muestran una rentabilidad diagnóstica del 58% ya que identificamos una variante probablemente patogénica en 7 pacientes de los 12 analizados.Encontramos estas variantes en genes ENDREMs conocidos que a veces se describen en poblaciones asiáticas, pero también de ascendencia africana o caucásica. Algunos de estos genes pueden estar implicados en varias sintomatologías, lo que confirma el hallazgo de superposición en estas enfermedades.Este trabajo sienta las bases epidemiológicas para las ENDREMs en las Indias Occidentales y proporciona una base para un registro en esta área. A nivel experimental, permite proponer una causa molecular asociada a variaciones nuevas o descritas anteriormente. También es una prueba de concepto con respecto a los medios bioinformáticos de analizar datos NGS en Martinica.Allana el camino para otros trabajos del mismo tipo, susceptibles de trazar las especificidades genéticas de las ENDREMs en nuestra región y ampliar los datos en la literatura científica y médica