Dissertations / Theses on the topic 'Agente intercalante'

Cette these comporte deux parties, chacune traitant un aspect different de la chimie radicalaire. D'une part, les diverses proprietes des radicaux sulfonyles ont permis d'elaborer de nouvelles reactions d'allylation radicalaires. Nous avons notamment tire partie de l'-scission des radicaux alkyl sulfonyles pour mettre au point plusieurs mecanismes radicalaires en chaine. Ainsi, nous avons pu proceder a l'extrusion du dioxyde de soufre de sulfones allyliques, a l'addition d'un groupement allylique sur une olefine, et a l'allylation de derives iodes ou de xanthates. D'autre part, la chimie radicalaire des xanthates, ou dithiocarbonates, permet un acces simple et efficace a divers radicaux carbones. Ces radicaux peuvent s'additionner sur une grande variete d'olefines et donner, apres transfert de la fonction xanthate, un second xanthate plus fonctionnalise. Celui-ci, a son tour, subit une nouvelle sequence radicalaire : une cyclisation sur un noyau aromatique pour former des cycles a six ou sept chainons. Cette methode a ete appliquee a la synthese de nouveaux agents antitumoraux apparentes aux duocarmycines, une famille d'agents intercalants-alkylants. Certains des composes prepares par cette sequence radicalaire d'addition-cyclisation ont ensuite ete couples au bras des duocarmycines. Plusieurs de ces molecules ont revele une activite cytotoxique vis-a-vis de cellules leucemiques.

L'expression genetique des organismes vivants peut etre regulee a l'aide d'oligonucleotides de sequence complementaire a la sequence cible. L'affinite de ces molecules est augmentee en greffant de facon covalente un intercalant a l'oligonucleotide. L'analyse conformationnelle d'oligonucleotide modifies et leur association avec leur sequence-cible a ete obtenue grace aux techniques rmn bidimensionnelles

Les intercalants utilises sont des amino-9 chloro-6 methoxy-2 acridines des amino-4 chloro-7 quinoleines et des amino-4 chloro-7 methyl-1 quinoleiniums sur lesquels ont ete introduites des chaines analogues a celles de la cysteamine et du wr 2727; etude de l'affinite de ces composes avec l'adn

Le ditercalinium est un dimère cationique de 7H-pyridocarbazole relié par une chaîne rigide. Il possède une activité antitumorale et entraîne une toxicité retardée. En relation avec le potentiel de membrane, il se concentre dans les mitochondries et y induit un gonflement. Après un contact de 24 h avec le ditercalinium, les cellules ne peuvent se diviser que 5 a 6 fois et se figent aléatoirement dans toutes les phases du cycle cellulaire. Le ditercalinium induit la dégradation de l'ADN mitochondrial et l'inhibition indirecte de la respiration mitochondriale et l'inactivation de la dihydro-orotate-dehydrogenase. Les cellules peuvent tirer leur énergie de la glycolyse anaérobie et ne sont pas tuées par une atteinte de la respiration aérobie mitochondriale mais par une carence en pyrimidine-ribosephosphate. La toxicité du ditercalinium est diminuée spécifiquement en ajoutant de l'uridine au milieu de culture. Une lignée résistante au ditercalinium (L1210/dit) a été obtenue par une sélection in vivo de cellules traitées in vitro. Elle possède un facteur de résistance de 32 stable en absence de sélection. La lignée L1210/dit ne possède pas de mécanisme de résistance en relation avec le mécanisme de cytotoxicité du ditercalinium induisant la carence en uridine. Les cellules L1210/dit possèdent le phénotype de résistance pleiotropique (multi drug resistance) et accumulent deux fois moins de ditercalinium que les cellules parentales. La toxicité du ditercalinium et son accumulation intracellulaire sont augmentées par le verapamil spécifiquement dans les cellules résistantes. L'efflux de la rhodamine 123, beaucoup plus actif dans les cellules L1210/dit, est inhibe par le verapamil. Des lignées MDR témoins sont résistantes au ditercalinium. Les cellules L1210/dit surexpriment faiblement le gène MDR de façon constitutive sans amplification gnomique en absence de sélection

Notre travail s'inscrit dans le cadre d'un programme d'etudes d'une lesion majeure de l'adn, le site abasique (site-ap). La premiere partie est consacree a la reconnaissance et la coupure des sites abasiques de l'adn par des endonucleases artificielles de structure base-chaine-intercalant: un intercalant a forte affinite pour l'adn (derive de 9-aminoacridine) sert de vecteur, une base nucleique reconnait la loge abasique, et une chaine de jonction aliphatique polyaminee contient l'activite de coupure. Pour preciser le mode d'action de ces molecules, nous avons synthetise une serie d'analogues dans lesquels nous avons change la base nucleique et la nature de la chaine de jonction (fonctions amines secondaires, tertiaires, amides). L'activite endonucleasique a ete determinee a l'aide de plasmide pbr 322 a site-ap. Dans la seconde partie, nous nous sommes interesses au dosage specifique de cette lesion (site abasique) par des sondes fluorescentes de structure fluorophore-chaine de jonction-alkoxyamine. La fonction alkoxyamine reagit specifiquement avec le site abasique dans sa forme aldehyde ouverte et le fluorophore permet de visualiser la fixation sur l'adn a l'aide de methodes spectroscopiques. Nous decrivons la synthese de ces molecules et les premieres etudes de reactivite vis-a-vis d'aldehydes simples et de l'adn contenant des sites abasiques

Notre programme de recherche concerne la synthese et l'etude de molecules capables de reconnaitre une lesion majeure de l'adn : le site abasique. Le premier volet de ma these a pour but l'etude de la reconnaissance et de la coupure du sire abasique par des molecules de synthese. Ces nucleases artificielles sont des molecules tripartites : (i) un intercalant (9-aminoacridine) qui sert de vecteur vis a vis de l'adn, (ii) une base nucleique qui reconnait le site abasique et (iii) une chaine de jonction polyaminee qui a elle seule reunit deux fonctions : l'interaction electrostatique avec les groupes phosphates et l'activite de coupure au niveau du site abasique par un mecanisme de beta-elimination. Pour affiner le mode d'action de ces molecules, nous avons tout d'abord synthetise deux derives possedant respectivement deux et trois groupements methylenes entre les fonctions amines de leur chaine de jonction. Cette difference structurale entraine une modification des valeurs de pka des amines. Ces pka ont ete determines et nous avons pu mettre en evidence que l'etat de protonation global de la molecule etait directement correle avec l'activite de coupure determinee a l'aide de plasmide pbr322 a site abasique. Ensuite, la synthese d'une nuclease artificielle marquee par une sonde nitroxyde en position 2 de la 9-aminoacridine a ete effectuee. Cette molecule a apporte des renseignements interessants quant au mode d'interaction avec l'adn a site abasique. Dans la seconde partie de ma these nous avons synthetise des molecules derivees des precedentes mais ayant perdues toute activite de coupure vis a vis du site abasique. Ces molecules possedent dans leur chaine de jonction des fonctions guanidines a la place des amines secondaires. La reconnaissance par ces molecules du site abasique entraine une inhibition de la reparation cellulaire par les ap-endonucleases. En effet, des experiences realisees avec l'adn depurine en presence de l'enzyme majeure de la reparation chez escherichia coli (l'exonuclease iii qui est une ap-endonuclease), de meme que des tests in vitro sur des cellules cancereuses murines et humaines montrent une activite d'inhibition, par les molecules de synthese, des enzymes de la reparation celulaire.

Notre travail s'inscrit dans le cadre de l'etude par resonance magnetique nucleaire (rmn) d'une des lesions majeures de l'adn : le site abasique. Celui-ci resulte de la perte d'une base nucleique conduisant a la formation du 2-desoxyribose ou de sa forme oxyde, la 2-desoxyribonolactone. La 2-desoxyribonolactone fait l'objet de nombreux travaux mais reste une lesion mal connue, tant d'un point de vue chimique, biologique que structural. Nous avons determine par rmn et modelisation moleculaire, la premiere structure d'un oligonucleotide contenant cette lesion. Par comparaison avec la structure du duplex de reference non modifie et caracterise de la meme facon, nous avons mis en evidence les deformations specifiques induites par la 2-desoxyribonolactone. Une deuxieme partie est consacree a la determination par rmn du mode d'interaction de composes qui reconnaissent specifiquement le site 2-desoxyribose. L'interet majeur de ces molecules est qu'elles pourraient inhiber le systeme de reparation de l'adn dans la cellule. L'etude a ete realisee sur un oligonucleotide contenant un residu tetrahydrofurane, analogue stable du 2-desoxyribose. Nous avons montre qu'une molecule de type base-chaine-intercalant qui potentialise in vitro et in vivo l'effet cytotoxique d'un agent alkylant anticancereux (le bcnu), se complexe de facon specifique avec l'adn. La base de la drogue s'insere notamment dans la loge abasique et forme des liaisons hydrogene de type watson-crick avec la thymine qui fait face a lesion. Par ailleurs, l'etude de l'interaction entre un macrocycle de type bisacridine et ce meme oligonucleotide a montre que la molecule traverse l'adn, une acridine s'intercalant dans la loge abasique, l'autre a une paire de base cote 3, et les chaines polyaminees se positionnent chacune dans un sillon. Une telle molecule constitue ainsi un bon module de reconnaissance du site 2-desoxyribose et pourrait servir de modele a la conception de molecules inhibitrices du systeme de reparation. Ce travail apporte des informations nouvelles sur les lesions abasiques de l'adn et devrait, contribuer a une meilleure comprehension des phenomenes biologiques s'y rapportant ainsi qu'au developpement d'autres molecules a activite anticancereuses.

Recherchant de nouveaux anticancereux reagissant sur l'adn, nous avons synthetise differents derives de la 3-aminoacridine, de la proflavine, de la 10-hydroxy-benzo(b)(1,7)phenanthroline, et de la 6,9-dichloro-2-methoxyacridine. A une partie intercalante, nous avons ainsi associe une fonction alkylante dans le but d'augmenter l'activite biologique. Certains des nouveaux composes prepares sont des precurseurs potentiels de quinone-methides ou quinone-imine-methides, connus dans la litterature pour etre tres reactives. La reactivite des derives de type alcool benzylique, les plus interessants au niveau pharmacologique, a ete etudiee de facon plus approfondie. Outre une reactivite photochimique tout a fait particuliere, ceux-ci reagissent avec les nucleophiles et montrent un taux de fixation covalente sur l'adn particulierement eleve

Preparation et caracterisation de porphyrines cationiques dont le nombre et la position des charges varient. Cytotoxicite vis-a-vis des cellules l1210 et de bacteries sensibles aux intercalants et deficients ou non dans leurs systemes de reparation de l'adn

Dans un programme de recherche de nouveaux heterocycles intercalants de l'adn, nous avons observe une totale regioselectivite de substitution electrophile en position 4 de la 3-aminoacridine. Ce resultat a ete utilise pour la synthese de bases de troger derivees d'aminoacridine. Les acridines etant connues pour leur affinite pour l'adn, les bases de troger correspondantes pourraient egalement interagir avec l'adn et grace a leur chiralite, leurs enantiomeres pourraient presenter differents modes d'association avec la macromolecule. Un enantiomere de la molecule pourrait alors reconnaitre specifiquement une conformation b ou z de l'adn. Une serie de bases de troger polyfonctionnalisees a ete synthetisee. Les proprietes physico-chimiques (rx, uv, rmn, pka) des composes les plus interessants ont ete etudiees. Le dedoublement partiel de deux bases de troger, 1 et 2, a ete partiellement realise par cristallisation de sels diastereomeres, donnant 80% d'exces enantiomerique. L'etude de l'interaction du compose 2 avec l'adn de thymus de veau a ete realisee par partition eau-butanol. L'enantiomere 2 (+) est extrait dans la phase butanolique avec des exces enantiomeriques atteignant 70% pour 15% de produit extrait. L'enantiomere (-) reste dans la phase aqueuse complexe a l'adn (etude par dichroisme circulaire). Cette etude a clairement montre une association preferentielle de l'enantiomere 2 (-) a l'adn

Ce travail s'inscrit dans un programme de recherche dedie a la conception de nouveaux agents intercalants-alkylants de l'adn, par fonctionnalisation du noyau acridine. La premiere partie de notre travail a porte sur la synthese et l'etude de composes modeles de type 4-hydroxymethyl-3-aminoacridine. Des reactions de solvolyse dans des alcools, de formation d'adduits covalents drogue-nucleoside et enfin de fixation covalente sur adn ont ete realisees sur les composes synthetises. Nous avons montre que les derives etudies sont des precurseurs de quinone-imine-methide, intermediaire hautement electrophile, genere in situ par catalyse acide intramoleculaire, et susceptible de reagir avec les sites nucleophiles des bases nucleiques. Dans la seconde partie, nous avons etudie la reactivite de la 3-aminoacridine et de la 3,6-diaminoacridine en substitution electrophile aromatique pour acceder a des molecules presentant la fonction amine ortho hydroxymethylee, mais aussi differents substituants sur le noyau acridine. Pour cela, nous avons introduit des groupes electroattracteurs (modification du pka) et/ou encombrants (accessibilite), de facon a moduler la reactivite des molecules. Dans la troisieme partie, nous avons tire profit de la reactivite des quinone-imine-methide vis-a-vis de l'addition nucleophile pour synthetiser de nouveaux polycycles hetero aromatiques mixtes entre acridine et phenantroline. Nous avons ainsi etudie l'interaction de bases de troger derives d'acridine et de phenantroline avec l'adn. Dans la quatrieme partie, nous avons evalue les proprietes biologiques et pharmacologiques des molecules synthetisees comme agents cytotoxiques sur cellules cancereuses. Les resultats obtenus in vitro montrent l'interet de cette nouvelle famille d'intercalants-alkylants de l'adn comme anticancereux.

Dans le domaine des spectroscopies optiques et magnétiques, différents dispositifs ont été développés afin d'obtenir un signal provenant de cellules vivantes isolées. Le microspectrofluorimètre laser confocal construit par la société DILOR S. A. , mis au point et développé conjointement avec le laboratoire est un de ces dispositifs. Ses caractéristiques permettent d'obtenir des images spectrales bidimensionnelles. Ce microspectrofluorimètre a été utilisé dans deux types d'études. L'une concerne la pénétration et la localisation du bromure d'éthidium (BET), un intercalant des acides nucléiques, dans des glandes salivaires de drosophila melanogaster. L'autre porte sur la pénétration et la localisation d'un peptide chimère immunogène, issu du peptide de fusion du virus de la rougeole et d'un épitope T du virus respiratoire syncytial, à l'intérieur de cellules macrophagiques de souris. Le microspectrofluorimètre a ainsi permis de montrer l'existence d'une forte proportion de BET non-intercalé dans le noyau des cellules de glandes salivaires, alors que ce marqueur est totalement engagé dans des interactions moléculaires dans le cytoplasme. Il a aussi permis de montrer la pénétration et la localisation cytoplasmique du peptide chimère dans les cellules immunocompétentes.

Les avancees considerables realisees dans le domaine de la synthese de fragments d'adn et des methodes d'analyse de structures, notamment en resonance magnetique nucleaire (rmn) et en modelisation moleculaire, ont permis d'ameliorer nos connaissances des interactions adn-ligand. Notre travail s'inscrit dans cette problematique. Nous avons plus particulierement etudie deux classes de molecules qui ont respectivement des applications potentielles comme (1) sondes de chiralite de l'adn ou comme (2) nucleases artificielles interagissant specifiquement au niveau des lesions abasiques (ap-lyases). A l'aide d'une approche theorique par modelisation moleculaire, nous avons evalue la capacite de reconnaissance chirale de l'adn en conformation b (helice droite) de la base de trger 9,19-methano-9,10,19,20-tetrahydrodiacridino-b,f-1,5-diazocine. Cette molecule composee de deux noyaux aromatiques formant entre eux un angle d'environ 90, existe sous la forme de deux enantiomeres 1r,5r et 1s,5s. Nous avons montre que l'enantiomere 1s,5s etait susceptible de s'associer plus fortement avec l'adn-b que l'enantiomere 1r,5r. D'autre part par la rmn et par la modelisation moleculaire, nous avons determine la structure tridimensionnelle d'un undecamere contenant en son centre un analogue chimiquement stable du site abasique de type tetrahydrofurane (x), et de sequence d(cgcacxcacgc). D(gcgtgtgtgcg). Si pour cette sequence la thymine situee en face du site abasique conserve une position intrahelicoidale, la lesion induit toutefois un coude d'environ 30. L'utilisation conjointe des techniques de rmn et modelisation moleculaire, nous a permis d'etudier egalement la reconnaissance de cette lesion par des systemes de type base-chaine-intercalant doues d'activite de coupure, et de preciser le mode d'interaction de ces ap-lyases de synthese: (1) la base est situee dans la loge abasique et probablement appariee avec la thymine qui lui fait face, selon un mode de type hoogsteen ; (2) la chaine est positionnee dans le petit sillon ; (3) l'intercalant est situe a deux paires de bases et uniquement du cote 5' du site abasique. Nous avons enfin mis en evidence par rmn que le site abasique constituait un site d'intercalation preferentiel pour l'intercalant bromure d'ethidium. L'ensemble de ces resultats constitue une base structurale importante pour la recherche de nouvelles sondes de chiralite de l'adn ou de molecules capables d'interagir specifiquement au niveau des lesions abasiques

Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas<br>As Moléculas intercalantes são usadas como agentes de deteção e quantificação de ADN. Estas moléculas intercalam entre as cadeias duplas de ADN, em solução aquosa, devido às interações hidrofóbicas existentes entre as moléculas. Estas moléculas intercalantes são fluorescentes mas, quando intercaladas, exibem um aumento significativo da sua intensidade de fluorescência. Este efeito não é observado quando a solução deixa de ser a solução aquosa habitual, como por exemplo, uma solução composta por um líquido iónico à temperatura ambiente (RTILs). O decréscimo da fluorescência dos intercalantes poderá estar relacionada com o facto de estes não intercalarem com o ADN, devido às fortes interações iónicas entre o solvente e a cadeia de ADN, ou através de outros fenómenos envolvidos na interação entre as moléculas estudadas. Com este projeto pretendemos verificar se estamos perante um fenómeno de exclusão por parte do Liquido Iónico, ou se a intercalação é espontânea, estudando os mecanismos moleculares envolvidos intercalação na cadeia de ADN e em que condição a interação entre ADN e intercaladores poderá ser restabelecida em líquidos iónicos. Foram estudados 5 intercaladores (Brometo de Etidio, Berberine, Proflavine, Proflavine Reduzida e DAPI), com afinidades pelas bases de ADN e cargas diferentes, em 10 líquidos iónicos distintos. Fomos capazes de mostrar os mecanismos envolvidos nas interações entre os intercaladores e a cadeia de ADN e, a partir destas observações, foi possível mostrar qual dos agentes intercalantes estudados apresentou as condições mais favoráveis para uma intercalação em meio de líquido iónico. Constatamos que não há exclusão dos intercaladores e que eles se associam espontaneamente ao ADN em líquidos iónicos, contradizendo as interpretações de algumas evidências experimentais anteriores. Com base nos estudos de PMF complementado com a análise das interações energéticas, foi possível concluir que o DAPI é o intercalador que apresenta a intercalação mais forte e estável e, com base nos resultados de PMF, o Liquido Iónico que promove uma intercalação mais forte e espontânea, é o [BPYRR+] [PF6-].<br>Intercalating molecules are used as agents of detection and quantification of DNA. These molecules intercalate between DNA double chains in aqueous solution due to hydrophobic interactions between this molecules. These intercalating molecules are fluorescent but, when intercalated, they exhibit a significant increase in their fluorescence intensity. This effect is not observed when the solution ceases to be the usual aqueous solution but, a solution composed of an ionic liquid at room temperature (RTILs). The decrease of fluorescence of the intercalating agents, might be related to the fact that they do not intercalate within DNA helix, due to the strong ionic interactions between the solvent and DNA chain, or by other phenomena involved in the interaction between these molecules. With this project we intend to verify if this is a phenomenon of exclusion by the Ionic Liquid, or if the intercalation is spontaneous by studying the molecular mechanisms involved in the intercalation and in what condition the interaction between DNA and the intercalator may be restored in liquids ion. Five intercalators were studied (ethidium bromide, Berberine, Proflavine, reduced Proflavine and DAPI) with different DNA base-pair affinity and different loads, in ten different ionic liquids. We were able to show the mechanisms involved in the interactions between intercalators and DNA chain and, from these observations, it was possible to show which of the intercalating agents studied showed the most favorable conditions for an intercalation in ionic liquid medium. We observed that there is no exclusion of the intercalators and they spontaneously associate with DNA in ionic liquids, contradicting the interpretation of some previous experimental evidences. Based on studies of PMF, complemented with the analysis of energetic interactions, we concluded that the DAPI is the intercalator with the stronger and more stable and, based on PMF results, the ionic liquid which promotes a stronger and spontaneous intercalation is the [BPYRR+] [PF6-].