Dissertations / Theses on the topic 'Antituberculeux'

Le contrôle de la tuberculose est un enjeu majeur de Santé Publique dans le monde. Nous avons utilisé les systèmes de surveillance mis en place dans deux pays de profil épidémiologique de la tuberculose différent (France et Chine) pour étudier la prise en charge des malades et la résistance aux antituberculeux. En France, nous avons analysé la mono-résistance primaire à l'isoniazide selon les cohortes de naissance et montré des taux de résistance plus élevés parmi les cohortes de jeunes patients nés en France. Ceci suggère une transmission récente de ces souches en France. Les données disponibles actuellement dans les réseaux ne permettent pas d'analyser plus précisément les causes de cette augmentation (origine des parents, type d'exposition, circulation d'un clone particulier ...). Pour ce qui concerne la mono-résistance à la rifampicine, son incidence est très faible (<1%). Nous avons montré que sa prise en charge est très hétérogène et que le taux de succès thérapeutique peut être amélioré. Une réflexion identique à celle qui a eu lieu pour les cas multi résistants doit être mise en place. En Chine, en utilisant un réseau régional, nous avons confirmé que la toux et l'appartenance à des populations vulnérables étaient des facteurs de risque de diagnostic tardif. La formation médicale et l'accès aux structures de soins doivent être améliorés. Les réseaux de surveillance sont des outils clés pour collecter des données permettant de fournir des indicateurs sur les caractéristiques épidémiologiques de la tuberculose sur lesquels vont se baser les programmes de lutte contre la tuberculose

L'agent pathogene de la tuberculose (m. Tuberculosis) fait partie de la famille des mycobacteries. La paroi mycobacterienne est caracterisee par la presence d'au moins 40% (en poids) d'acides gras specifiques, a tres longue chaine, les acides mycoliques et il a ete postule que leur biosynthese serait la cible d'antibiotiques antituberculeux specifiques des mycobacteries. L'extrait acellulaire synthetisant ces acides est un bon modele experimental pour l'etude de l'action de l'isoniazide. Ce metabolisme lipidique est une cible directe de la drogue et son inhibition n'est pas la consequence de la perturbation d'un metabolisme cellulaire plus general (nad ou pyridoxal phosphate). L'interaction entre l'inh et la multienzyme est rapide et met en jeu d'abord une liaison faible qui se transforme ensuite en une modification irreversible. La reaction-cible serait une etape de transformation de precurseurs de la chaine meromycolique. L'intervention d'une desaturase n'a pu etre prouvee. On peut envisager en alternative une deshydratation d'acides gras hydroxyles. L'etude de souches resistantes a l'isoniazide a permis de confirmer que la biosynthese des acides mycoliques etait une cible primordiale de l'isoniazide mais qu'il existe peut-etre une seconde cible. Un appauvrissement en acides mycoliques de la paroi entrainerait sa fragilisation, qui serait a l'origine de changements morphologiques observes en cytochimie ultrastructurale. L'action bactericide de l'isoniazide pourrait donc etre liee a une deficience de l'enveloppe cellulaire. Il est peu vraisemblable par contre que la biosynthese des acides mycoliques soit le site d'action de l'ethionamide, un autre medicament antituberculeux

Hirsutellones are fungal polyketides with beautiful structures including a decahydrofluorene (tricyclic) core and a highly strained 12- or 13-membered macrocycle. Inspired by a biosynthetic hypothesis concerning their skeletons, we envisaged a biomimetic strategy for the total synthesis of hirsutellone B, via a coupling and a cascade cyclization from a tetramic acid moiety and a linear polyunsaturated precursor. In this dissertation, we will describe the synthesis of several tetramic acids and linear polyene building blocks, as well as the attempts on their coupling and macrocyclization. Furthermore, through a designed linear polyene precursor with both nucleophilic and electrophilic functional groups, we will present the biomimetic electrophilic cyclization followed by an IMDA reaction towards the tricyclic core of hirsutellone B and thus the achievement of the formal total synthesis of hirsutellones A, B and C. In the context of searching for biologically active compounds, the respiratory chain inhibitory isoprenoid quinoline alkaloids aurachins captured our attention for their synthesis, which was inspired by another biosynthetic hypothesis. Therefore, as an international collaboration project, the first total synthesis of the natural product aurachin D and its analogues with chain length or aromatic cycle variations will be presented, using a key Conrad-Limpach process. An interesting reductive epoxide-opening cascade will be described towards the synthesis of aurachin H analogues. A new biosynthetic hypothesis will also be presented from aurachin C to B. Furthermore, their biological activity was extensively studied by our collaborators and will be summarized
Les hirsutellones sont des polycétides fongiques possédant une structure intéressante avec un noyau decahydrofluorène (tricycliques) et un macrocycle particulièrement contraint à 12- ou 13- chaînons. S'inspirant d'une hypothèse de biosynthèse sur le squelette des hirsutellones, nous avons envisagé une stratégie biomimétique pour la synthèse totale de l'hirsutellone B, par l'intermédiaire d'un précurseur polyinsaturé linéaire. Dans cette thèse, nous décrirons la synthèse de plusieurs acides tétramiques et polyènes linéaires intermédiaires, ainsi que les tentatives de leur couplage et de macrocyclisation. En outre, grâce à un précurseur polyène linéaire porteur de groupes fonctionnels nucléophile et électrophile, nous présenterons la cyclisation électrophile biomimétique suivie d'une réaction IMDA vers le noyau tricyclique de hirsutellone B, et donc la réalisation d'une synthèse totale formelle des hirsutellones A, B et C. Dans le cadre de la recherche de composés biologiquement actifs, des alcaloïdes inhibiteurs de la chaîne respiratoire, les aurachines de type isoprénoïde-quinoléine, ont attiré notre attention pour réaliser leur synthèse qui a été inspiré par une autre hypothèse biosynthétique. Par conséquent, la première synthèse totale de l'aurachine D et de ses analogues de chaîne ou de cycle aromatique sera présentée. Une cascade d'ouverture d'époxyde suite à une hydrogénation sera décrite vers la synthèse d'analogues de l'aurachine H. Une nouvelle hypothèse de biosynthèse sera également présentée de l’aurachine C au B. Enfin, leurs activités biologiques ont été extensivement étudiées par nos collaborateurs et seront résumées

La tuberculose demeure un fléau dans le monde avec près de 8,6 millions de nouveaux cas et 1,3 million de décès en 2012. L'émergence de souches résistantes au traitement actuel met en évidence la nécessité de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles classes de composés chimiques. L'isoniazide est un antituberculeux de première ligne agissant comme une pro-drogue dont le métabolite actif vise principalement la protéine InhA. Cette protéine est une enzyme dépendante du cofacteur NADH et joue un rôle clé dans la biosynthèse des acides mycoliques, éléments essentiels de la paroi cellulaire mycobactérienne. De par cette spécificité, la protéine InhA est devenue une cible de choix dans la conception de nouveaux médicaments antituberculeux. Ainsi, nous nous sommes intéressés dans un premier temps à résoudre la structure tridimensionnelle de la protéine InhA sous sa forme apo (sans ligand) et en présence de son cofacteur, NADH. Des essais de trempage du cristal InhA:NADH ont également été réalisés avec la forme active de l'isoniazide obtenue par voie chimique. Ces résultats ont alors mis en évidence la fixation préférentielle de l'adduit céto amide de configuration 4S, formé en dehors du site actif d'InhA. De façon opportuniste, nous avons également obtenu une orientation originale du triclosan, molécule antibactérienne à large spectre ciblant la protéine InhA, permettant ainsi de guider la conception vers de nouveaux dérivés. Nous avons par ailleurs développé une stratégie de synthèse s'appuyant sur le motif azaisoindolinone préalablement identifié comme potentiellement actif à la fois sur l'inhibition de l'activité enzymatique de la protéine InhA et également sur la croissance de M. Tuberculosis. Parallèlement, nous nous sommes appuyés sur la structure du composé GENZ10850 pour développer des dérivés à la fois plus efficaces sur la protéine InhA et garantissant une activité ex vivo sur la souche mycobactérienne
Tuberculosis remains a scourge in the world with nearly 8. 6 million new cases and 1. 3 million deaths in 2012. The emergence of resistant strains to current treatment highlights the increasing need to discover new therapeutic targets and new classes of chemical compounds. Isoniazid is a first-line drug acting as a prodrug whose active metabolite primarily targets the InhA protein. This protein is an NADH-dependent enzyme having a key role in the biosynthesis of mycolic acids, essential elements of the mycobacterial cell wall. With this specificity, InhA protein has become a prime target in the design of new highly specific TB drugs. Initially, we were interested in solving the three-dimensional structure of the InhA protein in its apo form (without ligand) and in the presence of a cofactor molecule, NADH. Soaking assays of the binary crystal InhA:NADH were performed with the active form of isoniazid, pre-formed by a biomimetic approach. These results highlighted the preferential binding of 4S keto amide adduct, pre-formed outside the active site of InhA. In an opportunistic manner, we highlighted an original orientation of triclosan, a broad spectrum antibacterial molecule targeting InhA protein, within the active site of InhA which consequently could guide the design of new derivatives. We also developed a synthetic strategy based on the azaisoindolinone scaffold previously identified as potentially active in both the inhibition of the enzymatic activity of the InhA protein and on the growth of M. Tuberculosis. Meanwhile, we relied on the structure of compound GENZ10850 to develop derivatives both more effective on the InhA protein and displaying ex vivo activities on mycobacterial strains

Le travail présenté dans ce manuscrit concerne la synthèse du fragment C12-C25 de la Thuggacine A, macrolide antibiotique, par deux voies de synthèse. La première voie de synthèse nous a permis de créer 4 des 5 centres stéréogéniques à partir du (R)-glycéraldéhyde acétonide. L'étape-clé d'induction asymétrique a montré que les 3 centres C18 à C20 présentent une configuration relative syn présente dans la Thuggacine A mais que les centres C17-C18 sont anti-configurés, configuration confirmée par cristallographie du composé 84. Les faibles rendements ainsi qu'un contrôle insuffisant de la diastéréosélectivité de ces 4 centres asymétriques nous ont conduit à étudier une stratégie de synthèse alternative. La deuxième voie de synthèse nous a permis d'obtenir le fragment C13-C25 en 10 étapes linéaires et avec un très bon contrôle de la stéréochimie des 5 centres stéréogéniques créés. Les 4 centres asymétriques C-17 à C-20 ont été construits grâce à deux réactions d'aldolisations type Evans, tandis que l'addition d'un allényl-stannane a permis l'introduction stéréosélective du centre C-16
The herein presented study is concerned by the synthesis of the C12-C25 fragment of Thuggacine A, a potent antibiotic macrolide, through two distinct synthetic pathways. The first synthetic pathway enabled us to form 4 among 5 stereogenic centers from (R)-glyceraldehyde acetonide. The key induction asymmetric step showed that the 3 chiral centers C18-C20 were formed with a syn-configuration as in Thuggacine A and the C17-C18 stereocenters were anti-configurated, a result confirmed by X-ray cristallography of compound 84. Low yields and low diastereocontrol of these four chiral centers led us to envisage an alternative synthetic strategy. The second synthetic pathway enabled us ti obtain the C13-C25 fragment within ten linear steps and a high diastereocontrol of the five required stereogenic centers. The 4 chiral centers C-17 to C-20 were formed through two Evans's aldolization steps while the stereochemistry of the C16 center was secured by an allenyl-stannane homologation

Partie1: L'éthionamide 5ETH) est un antituberculeux de seconde-ligne utilisé pour le traitement de patients infectés par des souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes. Bien que ETH soit un analogue structural de l'isoniazide, seule une faible résistance croisée à ces deux médicaments est observée. Deux gènes ont été récemment identifiés chez M. Tuberculosis, Rv3854c (ethA) et Rv3855 (ethR), comme étant impliqués dans la résistance à ETH. Le gène ethA code une protéine qui appartient à la famille des monooxygénasase à flavine, et le gène ethR code un régulateur appartenant à la famille des régulateurs transcriptionnels TetR/CamR. La monooxygénase EthA est capable de transformer ETH d'une forme inactive en une forme active par S-oxydation, indiquant que ETH est un pro-médicament. Le gène ethR code un répresseur transcriptionnel qui régule négativement l'expression de ethA. Le gène ethR interagit avec la région promotrice longue de 75pb de ethA (Engohang-Ndong et al. 2004) et il est ainsi responsable de la faible activation de ETH par ethA. Contrairement aux autres membres de la famille TetR/CamR qui classiquement lient des opérateurs de 15 pb, EthR reconnaît une région anormalement longue de 55pb avec huit molécules de EthR liant coopérativement l'opérateur. D'un point de vue mécanistique, toutes ces données fonctionnelles sont dans l'attente d'analyses structurales pour être décrites à un niveau moléculaire. Ceci a constitué le sujet de la première partie de la thèse. Nous avons entrepris l'étude de la protéine EthR exprimée dans E. Coli K12 et nous avons déterminé la structure tridimensionnelle de EthR par SAD (Single Anomalous Diffraction). La structure révèle la présence d'un ligand fortuit qui a été capturé durant l'expression et identifié en spectrométrie de masse comme étant l''exadécyloctanoate (HecOc). L'analyse structurale révèle aussi que l'HexOc est capable d'induire EthR dans une conformation ne permettant pas la fixation sur l'ADN opérateur cible. Comme EthR est un répresseur présent chez Mycobacterium tuberculosis, nous avons conséquent exprimé le répresseur dans une mycobactérie afin de déterminer si la protéine est aussi capable de capturer le ligand dans un système d'expression homologue. De ce fait, EthR a été exprimé dans Mycobacterium smegmatis, purifié et cristallisé. Nous avons déterminé la structure 3D par la méthode de remplacement moléculaire. L'analyse de la structure a révélé la présence d'un ligand la présence d'un ligand fortuit similaire en composition chimique à celui identifié au niveau de la structure de " E. Coli ". L'identification du ligand par spectrométrie de masse est restée jusqu'à maintenant sans succès. Néanmoins, sa caractérisation à partir de la densité électronique suggère que les vraies ligands de EthR doivent être reliés à la voie de synthèse ou de dégradation des acides mycoliques dans les mycobactéries. D'autre part, la présence dans E. Coli de molécules telles que l'HexOc reste inexpliquée. L'expression de EthR dans une autre souche de E. Coli , E. Coli C41, révèle que l'HexOc n'est pas présent au niveau du site de liaison au ligand, mais a été remplacé par 2 molécules cycliques qui étaient capables d'induire EthR. Ces données structurales ont permis de définir un pharmacophore censé induire EthR dans une conformation ne permettant pas la fixation sur l'opérateur. En collaborationavec les équipes de microbiologistes et de chimistes, un programme de conception de médicaments basé sur la structure a été initié. Les premiers hits ont été identifiés, et deux des composés les plus prometteurs ont été co-cristallisés avec EthR. Ces structures sont présentées. D'un point de vue thérapeutique, ces composés devraient permettre d'agir en synergie avec l'éthionamide en augmentant l'activation de ETH par EthA, et ainsi de réduire les doses d'ETH requises pour traiter les patients. Les effets secondaires de la drogue devraient également être réduits. Finalement, nous avons continué l'étude structurale de EthR à un niveau plus fondamental, en analysant les structures de quelques mutants de EthR exprimés dans E. Coli K12. Ces mutants ont été conçus dans le but d'étudier les caractéristiques du site de liaison au ligand qui ont été mis en lumière à partir des analyses structurales préalables. Partie 2: Les LXRs (Liver X Receptor) sont des récepteurs nucléaires importants qui ciblent de nombreux gènes associés au transport et à la régulation du cholestérol. En particulier, ils agissent sur des produits de gènes en bloquant l'accumulation de cholestérol dans les lésions arthérosclérotiques, qui sont à l'origine de maladies cardiovasculaires. La recherche d'agonistes des LXRs constitue actuellement des domaines de recherche prioritaires de nombreuses industries pharmaceutiques. Le but de la seconde partie de la thèse a été de progresser dans la détermination du domaine de liaison au ligand (LBD) de LXRβ en complexe avec des ligands candidats-médicaments. Nous avons développé un protocole d'expression et de purification pour ce récepteur nucléaire qui souligne le rôle crucial du ligand dans la stabilisation de LXRβ. Nous avons tout d'abord étudié l'expression de LXRβ avec son agoniste stéroïdien naturel, l'époxycholestérol, pour tester les capacités d'expression de nombreuses constructions plasmidiques élaborées en collaboration avec les " Laboratoires Fournier ". Ensuite, nous avons testé d'autres ligands conçus et synthétisés par nos collaborateurs, dans le but d'augmenter nos chances d'obtenir un cristal. Un ligand nous a permis d'obtenir des cristaux de petite taille apparus après plus de 5 mois et grâce à un kit de cristallisation commercial. Cette condition a ensuite été affinée afin d'obtenir des cristaux de taille convenable, utilisables pour des tests de diffraction. Un jeu de données à l'ESRF a été enregistré avec notre meilleur cristal qui appartient au groupe d' espace P6522. La structure qui a été déterminée par la méthod de remplacement moléculaire avec un jeu de données limité à 4Å de résolution est brièvement présentée. Malheureusement, la limite de résolution ne nous a pas permis de décrire le ligand dans la cavité de LXRβ. Nous sommes actuellement en cours d'amélioration de la qualité de ces cristaux, afin de caractériser le processus de liaison du ligand à un niveau moléculaire
Part1: Ethionamide (ETH) is a second-line drug used for the treatment of patients infected by multiresistant strains of Mycobacterium tuberculosis. Although ETH is a structural analogue of isoniazid, only a weak cross-resistance to these two antibiotics is observed. Two genes have been identified in Mycobacterium tuberculosis, RV3854c (ethA) and Rv3855 (ethR) as being involved in ETH resistance. The gene ethA codes for a flavin monooxygenase and the gene ethR codes for a trancription factor that belongs to the TetR/CamR family. The monooxygenase EthA is able to process ETH from an inactive form to an active form by S-oxydation, revealing that ETH is a pro-drug. The gene ethR codes for a transcriptional repressor which regulates negatively the expression of EthA. EthR interacts with the 75 bp promoter region of ethA (Engohand-Ndong et al. , 2004) and is thus responsible for the low activation of ETH by EthA. Unlike other TetR/CamR family members which classically bind operator region of 15bp, EthR recognizes an unusually wide region of 55bp with eight molecules of EthR binding cooperatively to the operator. From a mechanistic point of view, all these functional data are awaiting structural analyses in order to be characterized at the molecular level. This is the purpose of the first part of the thesis. We have carried out a structural study of EthR expressed in E. Coli K-12 strains, and we have determined the first 3D structure of EthR by the SAD (Single Anomalous Diffraction) method. The structure reveals the presence of a fortuitous ligand that has been captured during protein expression, identified by mass spectrometry as a molecule of hexadecyl octanoate (HexOc). The structural analysis also reveals that the HexOc is able to induce EthR, resulting in a conformation unable to bind to its DNA target operator. As EthR is a repressor from Mycobacterium tuberculosis, we have subsequently expressed it in Mycobacteria, in oder to investigate whether the protein was also able to capture a ligand in an homologous expression host. Thus EthR was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and crystallized. We have determined this 3D structure by the molecular replacement method. The structure analysis has revealed the presence of a fortuitous ligand similar in chemical composition to that identified in the " E. Coli " structure. Identification of this ligand by mass spectrometry has been so far unsuccessful. Nevertheless its characterization from the electron density suggests that true EthR ligands may be related to pathways of synthesis or degradation of mycolic acids in Mycobacteria. On the other hand, the presence in E. Coli of molecules such as the HexOc remains unexplained. Expression of EthR in another E. Coli strain (C41) revealed that the HexOc was not present anymore in the ligand binding site, but was replaced by cyclic molecules that were still able to induce EthR. Altogether, these structural data have allowed to define a pharmacophore expected to induce EthR in a conformation unable to bind to its DNA operator. In partnership with the microbiology and chemistry teams, aprogram of structure-based drug design has been initiated. The first hits have been identified, and two of the most promising compounds have been co-crystallized with EthR. These structures are presented. From a therapeutic point of view, these compounds would allow to act in synergy with ETH, by increasing ETH activation by EthA, thus reducing the ETH doses required to treat the patients, lowering the important side effects of this drug. Finally we have studied EthR at a more fondamental level by analysing structures of several mutants expressed in E. Coli K12. These mutants were designed in oder to investigate important features of the ligand binding site that were highlighted from previous structural analyses. Part 2: LXRs (Liver X Receptors) are important nuclear receptors that target several genes associated to the transport and regulation of cholesterol. In particular, they act on gene products blocking the accumulation of cholesterol in artherosclerosis lesions, a major cause of cardiovascular deseases. The research of LXRs agonists constitutes at the present time a very active domain in the pharmaceutical industry. The aim of the second part of the thesis was to progress in the structure determination of the ligand binding domain (LBD) of LXRβ in complex with ligands that are drug candidates. We have developed an expression and purification protocol for this nuclear receptor, which underlines the crucial rôle of the ligand in the stabilization of LXRbeta. We hav first studied the expression of LXRβ with its natural steroid agonist epoxycholesterol, evaluating this way the expression capabilities of the various plasmid constructions elaborated in collaboration with the " Laboratoires Fournier ". Next we have turned to other ligands designed and synthesized by our collaborators, in order to improve the expression level and the stability of the LXRbeta LBD, with the hope to increase our chances of getting crystals. One ligand has allowed us to obtain small crystals that appeared after 5 months with a commercial kit. This condition has been subsequently refined and allowed to obtain crystals that could be used in diffraction experiments. Diffraction data have been determined by the molecular replacement method with a diffraction data set limited at 4Å resolution, is briefly presented. Unfortunately this limited resolution does not allow us to already discuss ligand binding in LXRbeta. We are now in the process of improving the quality of these initial crystals, in order to be able to characterize the ligand binding process at the molecular level

En 1993, l’Organisation Mondiale de la Santé déclarait que la tuberculose était « une urgence de santé publique mondiale ». Plus de 20 ans après, cette maladie infectieuse causée par Mycobacterium tuberculosis, reste toujours un problème à l’échelle de la planète. Malgré des progrès très importants enregistrés dans la lutte contre la tuberculose dans le monde, l’OMS estime que 9 millions de personnes ont contracté cette maladie en 2013 et que 1,5 million sont morts durant cette même année. De plus, l'émergence de la tuberculose multirésistante nécessite le développement de nouveaux outils et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Récemment, deux nouveaux composés, bedaquiline et delamanid ont reçu une autorisation temporaire d’utilisation dans le but de renforcer l’arsenal thérapeutique. Néanmoins, il existe toujours la possibilité que la bactérie puisse rapidement développer des résistances liées au mécanisme d’action de ces nouveaux médicaments. C’est pour toutes ces raisons que l’arsenal thérapeutique doit être renforcé. Ce travail de thèse repose sur la découverte et l'optimisation de nouveaux composés antituberculeux selon des approches dont le point de départ commun est le criblage de petites molécules appelées fragments.La première partie de ce manuscrit présente la continuité d’un travail démarré au cours de la thèse de Baptiste Villemagne et qui a pour but de potentialiser l’activité de l'éthionamide, un médicament antituberculeux utilisé pour le traitement de seconde intention. Le répresseur transcriptionnel EthR a été validé comme élément clé dans la bioactivation de l’éthionamide. Les inhibiteurs de cette cible, développés selon une approche par fragments ont permis de potentialiser l'activité de l'éthionamide in vitro. Cependant, la faible stabilité microsomale de ces composés a limité leur utilisation in vivo. L’étude de la métabolisation du composé tête de série et la modification structurale de ce dernier a permis le développement des nouveaux inhibiteurs d’EthR présentant des propriétés pharmacocinétiques et physico-chimiques désormais acceptables pour la réalisation de tests in vivo.La deuxième partie de cette thèse s’est concentrée sur la synthèse d’inhibiteurs de MabA, une β-cétoacyl-ACP réductase mycobactérienne participant à la synthèse des acides gras à longue chaîne, précurseurs des acides mycoliques qui sont les constituants majeurs de la paroi mycobactérienne. Cette enzyme a été montrée comme étant indispensable à la survie de la bactérie mais aucun inhibiteur à ce jour n’a été identifié. Le criblage d’une chimiothèque de fragments sur MabA a été réalisé via deux tests différents (un test d’affinité pour la cible (TSA) et un test enzymatique). Les hits ainsi identifiés ont été resynthétisés et testés dans un test fonctionnel. Les étapes d’optimisation de l’activité des hits reconfirmés sont ainsi décrites. Ces résultats ont permis de développer des composés présentant des activités de l’ordre du micromolaire. Dans la troisième partie, un travail de conception et de synthèse de nouveaux fragments, visant à compléter la chimiothèque actuelle a été effectué. Les fragments originaux contenant un motif isoxazoline ont été synthétisés à partir d’alcènes et d’aldoximes utilisés en tant que synthons de départ, selon une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire. L’analyse conformationnelle de ces fragments a permis de montrer que ces structures venaient enrichir l’espace de la diversité, notamment par l’introduction d'un motif permettant le déploiement des substituants dans les trois dimensions de l’espace. La solubilité expérimentale de ces fragments a été également mesurée et nous avons pu montrer que ces molécules étaient adaptées au criblage
In 1993, the World Health Organization (WHO) declared Tuberculosis (TB) as a global public health emergency. Over 20 years later, this infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a major public health problem. Despite the significant progress in the fight against TB worldwide, WHO estimates that 9 million people contracted the disease in 2013 and 1.5 million died in that year. In addition, the emergence of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) requires the development of new tools and new therapeutic strategies. Recently, two new compounds, bedaquiline and delamanid were approved in MDR-TB treatment in order to strengthen the actual MDR-TB chemotherapy. Nevertheless, there is always the possibility that the tubercle bacillus can quickly develop resistance related to the mechanism of action of these new drugs. Therefore, the actual therapeutic arsenal must be strengthened. This thesis is based on the discovery and optimization of new anti-TB compounds starting from the screening of small molecules called fragments.The first part of this thesis is the continuation of the research project which was started during the thesis of Baptiste Villemagne. This work aims to develop compounds that can boost the activity of ethionamide, a second-line drug used to treat MDR-TB. The transcriptional repressor EthR has been validated as a key element in the bioactivation of ethionamide. EthR inhibitors were identified using a fragment-based approach and were optimized to potentiate the activity of ethionamide in vitro. However, the low microsomal stability of the lead compound has limited its use in vivo. The metabolism study of the lead compound and key structural modifications allowed a development of new potent EthR inhibitors having acceptable pharmacokinetic and physico-chemical properties for in vivo testing.The second part of this thesis focused on the synthesis of MabA inhibitors. MabA is a mycobacterial β-ketoacyl-ACP reductase involved in the synthesis of long-chain fatty acids, precursors of mycolic acids, which are major constituents of the mycobacterial cell wall. This enzyme has been shown to be essential for the survival of the bacteria but until now no inhibitor has been identified. Screening of a library of fragment molecules on MabA was performed via two different assays (affinity assay using TSA and an enzymatic assay). The identified hits were re-synthesized and tested in a functionnal assay. The optimization steps to improve the activity of the hits are also described. Compounds with activity in the micromolar range were discovered.In the third part, a design and synthesis of new fragments is described. The aim of this project is to build a collection of original fragments showing a 3D-structure scaffold amenable for rapid derivatization. The fragments that contain an original isoxazoline motif were synthesized from alkenes and aldoxime as starting building-blocks by using 1,3-dipolar cycloaddition. The conformational analysis of these structures has shown that they were, as expected, able to deploy substituents in the 3D space. The experimental solubility of these fragments was also measured and the results demonstrated that these molecules are suitable for the screening against new biological targets to help kick-start hit discovery program

La tuberculose (TB) est une maladie causée par le bacille de Koch. Elle est la neuvième cause de décès dans le monde et la première cause de décès d’origine infectieuse, devant le VIH/SIDA. Le développement de résistance due à une mauvaise utilisation des médicaments antituberculeux a donné naissance à de nouvelles formes de tuberculose, dont la tuberculose multirésistante (TB-MR). La TB-MR est une forme particulièrement dangereuse de TB qui se défini par la résistance à la fois à l’isoniazide et à la rifampicine, les deux antituberculeux de première intention les plus efficaces. Les pays en voie de développement, dont le Cameroun, sont particulièrement touchés. Un traitement efficace de la TB-MR passe par l’association de plusieurs médicaments pendant une longue période comme le recommande l’Organisation mondiale de la Santé. En effet, depuis 2016 le régime de traitement court et standardisé recommandé par l’OMS subdivisait la prise en charge de la TB-MR en deux phases distinctes pouvant aller de 9 à 11 mois. La première phase dite intensive durait 4 à 6 mois avec la prise de 7 antituberculeux (Kanamycine/amikacine, moxifloxacine, prothionamide, isoniazide haute-dose, clofazimine, ethambutol, et pyrazinamide). La deuxième phase dite phase continue avait une durée fixe de 5 mois avec 4 antituberculeux (Moxifloxacine, clofazimine, ethambutol, and pyrazinamide). L’objectif de cette thèse était d’évaluer la sécurité des médicaments antituberculeux utilisés dans la prise en charge de la TB-MR au Cameroun. Dans un premier temps, nous avons réalisé une étude dont l’objectif principal était d’évaluer le profil de sécurité des traitements utilisés pour la TB-MR dans le principal hôpital de prise en charge de cette maladie au Cameroun. Cette étude a permis d’identifier la surdité liée aux aminosides comme principale cause de changement ou d’arrêt de traitement. Deuxièmement, nous avons évalué la conformité aux recommandations de l’OMS sur le traitement de la TB-MR, ainsi que la persistance des patients au programme et au traitement. Cette étude a quant à elle révélé une très bonne conformité aux recommandations de l’OMS, mais aussi une baisse progressive de la persistance, en particulier pendant la phase continue. Enfin, étant donné qu’au cours de notre thèse, les aminoglycosides ont été remplacés par la bédaquiline dans le nouveau régime de traitement court et standardisé recommandé par l’OMS, en raison de problèmes d’ototoxicité et autres, nous avons réalisé une étude préliminaire de la sécurité et de la persistance de ce nouveau traitement. Ce travail a montré que les problèmes d’ototoxicité ont disparu et que la persistance au traitement s’est améliorée, tout en soulignant les risques de douleurs articulaires et de problèmes cardiaques associés au nouveau régime. Ces résultats montrent que malgré le changement de médicaments, les effets indésirables sont couramment associés aux schémas thérapeutiques de la TB-MR au Cameroun. Il est donc nécessaire de mettre en place un système solide de surveillance de la sécurité des médicaments qui permettra aux prestataires de soins de santé et aux décideurs politiques d’évaluer en permanence le profil de sécurité des médicaments utilisés et d’améliorer les résultats cliniques. Comme le traitement mis en œuvre est maintenant basé sur la bédaquiline, il faut être prudent dans la surveillance des événements cardiovasculaires car d’autres médicaments comme la clofazimine, et la moxifloxacine ont également le pouvoir de prolonger l’intervalle QT
Tuberculosis (TB) is a disease caused by Koch’s bacillus. It is the ninth leading cause of death worldwide, and the most common infectious cause of death, surpassing HIV/AIDS. The development of resistances due to misuse of anti-tuberculosis drugs has resulted in new forms of TB, including multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). MDR-TB is a particularly dangerous form of tuberculosis, characterized by its resistance to both isoniazid and rifampicin, the two main and most effective anti-tuberculosis drugs. Developing countries, including Cameroon, are heavily affected. Effectively treating MDR-TB requires the combination of several drugs over several months. Indeed, from 2016 to 2020 the World Health Organization recommended the use of shorter treatment regimen for MDR-TB patients. This lasts for 9–11 months and is divided into two phases: An intensive phase, and a continuous ambulatory phase. The intensive phase involved 4–6 months of daily treatment with 6 antibiotics (moxifloxacin, protionamide, isoniazid high-dose, clofazimine, ethambutol, and pyrazinamide) associated with kanamycin or amikacin. The continuous ambulatory phase had a fixed treatment duration of 5 months with 4 antibiotics: Moxifloxacin, clofazimine, ethambutol, and pyrazinamide. The aim of this thesis was to assess the safety of anti-tuberculosis drugs used in the management of MDR-TB in Cameroon. Initially, we conducted a study to assess the safety profile of treatments used for MDR-TB in the main TB treatment center or hospital in Cameroon. This study identified aminoglycoside-related deafness as the main cause of treatment change or discontinuation. Secondly, we assessed compliance with WHO recommendations on MDR-TB treatment, as well as patient persistence with the program and the treatment. This study revealed very strong compliance with the WHO recommendations, although a progressive decline in persistence was recorded notably during the continuation phase. Finally, in view of the fact that during the course of our thesis, aminoglycosides were replaced by bedaquiline in the WHO-standardized MDR-TB treatment regimen, due to ototoxicity and other problems, we carried out a preliminary study on the safety and persistence of the new MDR-TB regimen. This work showed that ototoxicity problems disappeared, and that treatment persistence improved, while highlighting the risks of joint pain and cardiac problems associated with the new regimen. These results demonstrate that MDR-TB treatment regimens in Cameroon are consistently associated with adverse drug reactions despite changes in the medicines used. Thus, there is a need to implement a strong drug safety monitoring system which will allow health care providers and policy makers to continuously evaluate the safety profile of drugs in use and improve clinical outcomes. As the current treatment regimen is now bedaquiline-based, the strict monitoring of cardiovascular events is vital since other drugs like clofazimine, and moxifloxacin can also prolong the QT interval

La thèse est consacrée à la synthèse de pyrrolidine- 2,5-diones 1,3- disubstituées et l'évaluation de leur activité inhibitrice contre la protéine de InhA et Mycobacterium tuberculosis. En particulier, de nouvelles conditions catalytiques pour la réaction de Michael ont été trouvées. Des acides de Lewis (par exemple: AlCl3, ZnCl2 et LiClO4) ont été développés en tant que catalyseurs efficaces pour la série d'addition conjuguée de nucléophiles hétérocycles à maléimides. De nouvelles conditions ont permis la synthèse efficace de composés pyrrolidine-2,5-diones substituées par des hétérocycles en position 3. Des produits d'addition double-conjugués ont été obtenus dans des réactions avec des 2-aminopyridines et les 2-aminothiazoles dans des conditions douces en présence d'une quantité catalytique de perchlorate de lithium. Un mécanisme possible de la formation des produits désirés est proposé. De nouvelles structures d'inhibiteurs potentiels de la protéine InhA ont été conçues en utilisant la modélisation moléculaire et des outils de criblage in silico. La structure-clé 3-(9H-fluorène-9-yl) pyrrolidine -2,5- dione identifiés à partir des études de docking a été synthétisée par deux approches différentes. Ainsi, une série de dérivés N-substitués avec divers substituants ont été synthétisés pour identifier des relations structure-activité. De plus, une série ß-amide de l'acide 2-( 9H- fluorène-9 -yl)-succinique ont également été synthétisée. Des conditions optimisées de réduction de 3-(9H-fluorène- 9-yl)pyrrolidine-2,5-dione en utilisant un complexe de sulfure de diméthyle borane ont permis la préparation de deux produits désirés dans une seule et même réaction avec des rendements quantitatifs. La série de composés correspondants avec des coeurs pyrrolidone et pyrrolidine ont été obtenus. Les réactions des composés 3-(9H-fluorène-9 -yl)pyrrolidine-2,5-dione et de ses dérivés substitués sur l'azote avec de l'hydrure de lithium-aluminium ont été étudiés. Ces réactions tandem réduction/oxydation de pyrrolidine-2,5-dione comportant une partie fluorène a été effectuée en utilisant 4 équivalents de LiAlH4 sous air. Ainsi une série de dérivés 9 - hydroxy fluorényle a été synthétisée avec de bons rendements. Un mécanisme d'oxydation des composés fluorényle est proposé. Trois familles de composés synthétisés ont été évalués in vitro pour l'inhibition de l'enzyme de InhA et la croissance de M. Tuberculosis. Presque tous les composés synthétisés ont montré une bonne activité inhibitrice contre InhA et / ou Mycobacterium tuberculosis (souche H37Rv ). Certains des composés évalués pourraient représenter de nouvelles pistes pour le développement de candidats-médicaments
The thesis is devoted to the synthesis of 1,3-disubstituted pyrrolidine-2,5-diones and evaluation of their inhibitory activity against InhA protein and Mycobacterium tuberculosis. In particular, new catalytic condition of the Michael reaction were found. Lewis acids (such as: AlCl3, ZnCl2 and LiClO4) are developed as efficient catalysts for series of conjugate addition of maleimides to nucleophilic heterocycles. New conditions enabled efficient synthesis of 3-heteryl substituted pyrrolidine-2,5-diones. Double-conjugate addition products were obtained in the reactions with 2-aminopyridines and 2-aminothiazoles under mild conditions in presence of catalytic amount of lithium perchlorate. The possible mechanism of the formation of desired products is proposed. The structure of new potential inhibitors of InhA protein were designed using molecular modeling and in silico screening tools. Key structure of 3-(9H-fluoren-9-yl)pyrrolidine-2,5-dione identified from the docking studies was synthesized in two different approaches. The series of N-substituted derivatives of this scaffold with divers substituents were synthesized to identify structure-activity relationships. Moreover the series of ß-amides of 2-(9H-fluoren-9-yl)-succinic acid were also synthesized. Identified and optimized condition of reduction of 3-(9H-fluoren-9-yl)pyrrolidine-2,5-dione using borane dimethyl sulfide complex have enabled prparation of two desired products in one reaction with quantitative yields. The series of corresponding compounds with pyrrolidone and pyrrolidine ring were obtained. The reactions of 3-(9H-fluoren-9-yl)pyrrolidine-2,5-dione and its N-substituted derivatives with lithium aluminium hydride were investigated. Tandem reduction/oxidation of pyrrolidine-2,5-dione and fluorenyl rings was performed using 4 equivalents of LiAlH4 under air, affording the series of corresponding 9-hydroxy fluorenyl derivatives in good yields. Possible mechanism of oxidation of 9-substituted fluorenyl compounds is proposed. Three families of synthesized compounds were evaluated in vitro for the inhibition of InhA enzyme and M. Tuberculosis growth. Almost all of synthesized compounds have shown good inhibitory activity against InhA and/or Mycobacterium tuberculosis (H37Rv strain). Some of evaluated compounds could represent new leads for the development of drug candidates

Mycobacterium tuberculosis est l’agent étiologique de la tuberculose. En raison de l’épidémie de SIDA et de l’apparition de souches résistantes au traitement, la tuberculose est aujourd’hui la première cause de mortalité dans le monde due à une infection bactérienne. L’objectif de ce travail est l’amélioration du traitement de la tuberculose par l’éthionamide (ETH), un antituberculeux de seconde intention. Sur le terrain, l’efficacité de cet antibiotique est lourdement contrebalancée par sa toxicité, ce qui entraîne trop souvent une faible compliance des patients face à leur traitement et favorise l’émergence de bacilles résistants. L’ETH est une drogue qui nécessite une étape d’activation afin d’exercer son effet bactéricide. Ce mécanisme enzymatique est lié à la monooxygénase mycobactérienne EthA. Le répresseur transcriptionnel EthR de M. Tuberculosis a été identifié comme régulateur du gène ethA et donc, par conséquent, de la bio-activation de l’ETH. Nous avons approfondi l’étude de ces mécanismes de contrôle entamée par nos prédécesseurs et nous avons élaboré une stratégie chimiothérapique visant à dérégler ce système afin de rendre la bactérie hypersensible à l’ETH. Deux structures cristallographiques d’EthR ont révélé la présence de ligands fortuits capables d’inhiber la fonction répressive de cette protéine. En s’inspirant de ces études structurales, et en collaboration avec une équipe de chimistes médicinaux, nous avons développé une première famille d’inhibiteurs « drug-like » de ce répresseur et nous avons montré qu’ils permettent d’augmenter l’action de l’ETH d’un facteur dix in vitro et d’un facteur trois dans un modèle murin de tuberculose. A l’aide de plusieurs techniques de biophysique, nous avons d’une part étudié les relations structureaffinité de cette famille de composés, et d’autre part révélé l’importance d’acides aminés clés pour l’interaction inhibiteur-régulateur. Enfin, nous avons identifié très précisément la zone d’EthR qui perçoit la présence du ligand dans la poche et qui est donc à l’origine du changement conformationnel menant à la forme inactive du répresseur. La fixation de quatre dimères d’EthR sur un opérateur de 56 pb démuni de toute signature palindromique reste une originalité et une énigme. A l’aide d’un criblage génétique systématique, nous avons étudié l’implication de chaque paire de bases de l’opérateur dans la répression du gène ethA. Ces travaux ont permis de proposer un modèle de fixation coopérative inédit d’EthR sur l’ADN.

Mycobacterium tuberculosis comme d'autres mycobacteries pathogenes strictes ou opportunistes, a la capacite de survivre dans les macrophages de l'hote infecte. Cette capacite pourrait etre due a la nature singuliere des composes de l'enveloppe des mycobacteries ; cette enveloppe constituerait une barriere de permeabilite. L'analyse des activites enzymatiques presentes dans la couche externe d'especes mycobacteriennes pathogenes et non pathogenes a demontre la presence d'enzymes clefs a la surface de m. Tuberculosis et de m. Bovis (pathogenes) telles que la superoxyde dismutase, la catalase/peroxydase, la glutamine synthetase qui peuvent jouer un role dans la resistance aux mecanismes bactericides du macrophages. Ces enzymes sont absentes de la surface de m. Smegmatis (non pathogene) mais detectees dans les couches plus profondes de l'enveloppe, suggerant que l'architecture de l'enveloppe peut etre un important facteur dans la pathogenicite. Afin de mieux apprehender le role de barriere de permeabilite de l'enveloppe et de mettre en evidence le role de certains de ces constituants, notamment les acides mycoliques, nous avons caracterise puis mesure l'entree de molecules radiomarquees (isoniazide, pyrazinamide, glycerol et chenodesoxycholate), dans une souche de m. Tuberculosis et son mutant possedant 40% d'acides mycoliques en moins. La traversee de la zone de l'enveloppe comportant les acides mycoliques semble etre une etape limitante dans le transport du glycerol et du chenodesoxycholate, ces deux molecules etant incorporees plus rapidement par le mutant. Aucune difference n'est observee quant a l'accumulation des deux antituberculeux, isoniazide et pyrazinamide, entre les deux souches. L'enveloppe semble donc etre une barriere de permeabilite selective pour certaines molecules independamment de leur polarite et du systeme de transport utilise.

La lutte contre la tuberculose est encore aujourd’hui un enjeu de santé publique majeur au niveau mondial. Cette maladie infectieuse, causée par Mycobacterium tuberculosis, reste en 2020 la première cause de mortalité par un agent infectieux à travers le monde. En plus de ce problème de mortalité, s’ajoute l’émergence de souches résistantes qui complexifient d’autant la prise en charge de cette pathologie. De ce fait, le développement de nouvelles molécules est capital pour obtenir une alternative efficace contre ces bactéries résistantes.Plusieurs stratégies sont explorées pour découvrir de nouvelles molécules, parmi celles-ci la plus classique est le développement de nouveaux médicaments avec un mécanisme d’action original. Cela passe par l’inhibition d’une nouvelle cible qui se doit d’être essentielle, pour entraîner la mort de l’organisme, mais aussi spécifique à la bactérie afin de minimiser les effets secondaires. De plus, inhiber de telles cibles permet de s’assurer une action vis-à-vis des souches résistantes aux médicaments déjà sur le marché.Une seconde stratégie consiste à développer des boosters, qui sont des molécules inactives, capables de potentialiser l’action de médicaments déjà existants. Cela conduit à une amélioration de l’effet sur les souches sensibles mais également au rétablissement de leur action sur les souches résistantes. Dans cette thèse, les avantages et inconvénients de ces deux stratégies sont exposés.Dans une première partie la stratégie consistant à inhiber une cible innovante est présentée. L’enzyme MabA, qui catalyse une étape critique dans la biosynthèse des acides mycoliques chez la bactérie, a été choisie car elle n’a pas d’inhibiteur spécifique connu. Le criblage d’une chimiothèque de fragments sur cette enzyme a été réalisé par LC-MS-MS ce qui a conduit à l’identification de la première famille d’inhibiteurs de MabA. Cette série est articulée autour de l’acide anthranilique. Elle a pu être étudiée et 32 composés ont ainsi été synthétisés afin d’améliorer leur puissance sur l’enzyme et de mieux comprendre les relations structure-activité. Les propriétés physico-chimiques des composés ont également été mesurées. Le mécanisme d’action a été ensuite exploré afin de confirmer l’inhibition de la cible chez la bactérie par diverses techniques et notamment par CCM-14C qui permet d’étudier la biosynthèse des acides gras chez le pathogène.Dans une seconde partie, la stratégie des boosters a été explorée sur l’antituberculeux prétomanide ayant récemment obtenu une AMM dans le cadre du traitement des souches de tuberculose résistantes. Le prétomanide est une prodrogue activée in bacterio par la Ddn (Déazaflavine dépendante nitroréductase), ce qui conduit à la libération de monoxyde d’azote toxique pour la bactérie par son action sur la chaîne respiratoire. Un criblage phénotypique sur souches résistantes en présence ou non du prétomanide a été réalisé. Cela a conduit à l’identification d’une famille chimique, possédant un cycle norbornène, capable de potentialiser l’effet du prétomanide. Des études de relations structure-activité ont conduit à la synthèse de 55 composés et ont permis d’améliorer les connaissances autour de cette famille. Les propriétés ADME ont été mesurées et un composé a été sélectionné pour une preuve de concept in vivo. Afin de préparer cette expérience, ce composé a été formulé dans une solution aqueuse en présence de cyclodextrine-HP et les interactions conduisant à cette solubilisation ont été étudiées par RMN. Le mécanisme d’action est également à l’étude afin d’identifier la cible de ces composés dans la bactérie
In 2020, the fight against tuberculosis is still a major public health issue. Indeed, this infectious disease, caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of death by an infectious agent throughout the world. In addition to this mortality problem, another issue is the emergence of resistant strains which further complicates the management of this pathology. Therefore, new drugs are required to fight these resistant bacteria.Several strategies are currently being investigated to generate news drugs. Among these, the most classic one is the development of new drugs with an original mechanism of action. This involves the inhibition of a new target which must be essential for bacteria, to cause the death of the organism, but also specific to the bacteria in order to minimize the side effects. In addition, inhibiting such targets makes it possible to ensure an action against drug-resistant strains which are not sensitive anymore to drugs currently on the market.A second strategy consists of developing boosters, which are inactive molecules, capable of potentiating the action of already existing drugs. This potentiation can happen either by improving the effect on sensitive strains or by re-establishing their action on resistant strains, or both. In this thesis, the advantages and disadvantages of these two strategies are exposed.In a first part, the strategy consisting in inhibiting an innovative target is presented. The enzyme MabA, which catalyzes a critical step in the biosynthesis of mycolic acids in the bacteria, was chosen because it does not have any known specific inhibitor. The screening of a fragment chemical library on this enzyme was carried out by LC-MS-MS which led to the identification of the first family of MabA inhibitors. This series shares an anthranilic acid scaffold. 32 compounds were synthesized in order to improve potency on the enzyme and to better understand the structure-activity relationships. The physico-chemical properties of the compounds were also measured. The mechanism of action was then explored in order to confirm the inhibition of the target in the bacteria by various techniques and in particular by TLC-14C, which can be used to study the biosynthesis of fatty acids in the pathogen.In a second part, we searched for boosters of pretomanid, an anti-tuberculosis drug having recently obtained Marketing Authorization for the treatment of resistant tuberculosis strains. Pretomanid is a prodrug activated in bacterio by Ddn (Deazaflavin-dependent nitroreductase), leading to the release of nitric oxide which is toxic to the bacteria by its action on the respiratory chain. A phenotypic screening on resistant strains in the presence or absence of pretomanid was carried out. This has led to the identification of a chemical family, bearing a norbornene ring, capable of potentiating the effect of pretomanid. 55 compounds have been synthesized to explore structure-activity relationships. ADME properties were measured and a lead compound was selected for in vivo proof of concept. For oral administration, this compound was formulated in an aqueous solution in the presence of cyclodextrin-HP and the interactions leading to this solubilization were studied by NMR. The mechanism of action was also studied to identify the target of these compounds in the bacteria

Bases rationnelles: la tuberculose est à elle seule responsable d’environ 9 millions de nouveaux cas et de 1 à 2 millions de morts par an. Il existe pourtant un traitement antibiotique standard (recommandé par l’OMS) associant rifampicine, isoniazide, pyrazinamide et ethambutol (ou streptomycine), qui assure la guérison dans près de 95% des cas lorsqu’il est correctement suivi. Son efficacité est limité par sa longueur (au moins 6 mois), sa complexité (4 médicaments) et son inefficacité sur les souches multirésistantes. C’est pour outrepasser ces limites que de nouveaux antituberculeux sont nécessaires. R207910 est le chef de file d’une nouvelle famille d’antituberculeux, les diarylquinolines, au mécanisme d’action original : l’inhibition de l’ATP synthase. Objectif: nous avons évalué l’activité bactéricide et stérilisante de R207910 administré seul ou dans des combinaisons d’antibiotiques. Matériels et méthodes: Nous avons utilisé le modèle murin de tuberculose. Les souris étaient infectées par voie intra-veineuse par M. Tuberculosis H37Rv. Nous avons, selon les expériences, mesuré (a) la bactéricidie, c’est-à-dire la décroissance de la population bactérienne dans les poumons et/ou les rates après des durées variables de traitements et (b) l’activité stérilisante de combinaisons d’antibiotiques en mesurant les taux de rechutes après l’arrêt du traitement. Résultats: nous avons montré que le R207910 à 25 mg/kg est bactéricide après seulement 4 jours de traitement. Après 2 mois de traitement, le R207910 (25 mg/kg 5 jours sur 7, 50 mg/kg 2 jours sur 7, 100 mg/kg 1 jour sur 7) permet une décroissance de 5 log10 UFC de la charge bacillaire, activité qui n’est atteinte par aucun des antituberculeux existants. C’est donc la dose total hebdomadaire qui déterminait l’activité bactéricide et non le rythme d’administration ou la posologie unitaire. Du fait d’un action synergétique entre R207910 et pyrazinamide, deux mois de traitement par les double ou triples combinaisons (R207910+pyrazinamide±isoniazide ou rifampicine ou moxifloxacine) entraînait la négativation des cultures des poumons de 70 à 100% des souris alors que les combinaison contenant le R207910 mais pas le pyrazinamide ne rendaient pas plus de 30% des souris négatives en culture. Lorsque le R207910 était combiné aux antituberculeux de première ligne, il permettait de réduire significativement la durée minimale du traitement guérissant les souris et prévenant les rechutes. En effet, la quadruple combinaison R207910, isoniazide, rifampicine et pyrazinamide avait, en 4 mois, une activité équivalente à celle du traitement de référence par isoniazide rifampicine et pyrazinamide en 6 mois. L’ajout du R207910 aux régimes thérapeutiques administrés une fois par semaine, et comprenant la rifapentine et le pyrazinamide, permettait en 2 mois seulement de rendre négatifs en culture les organes de 9 souris sur 10. Une telle activité n’avait jamais été obtenu avec aucun traitement intermittent et s’avérait même être supérieure à celle du traitement quotidien de référence (isoniazide, rifampicine et pyrazinamide). Conclusion: dans le modèle murin de tuberculose, R207910 est actif dans les deux phases de traitement. Quatre mois de traitement avec certaines combinaisons contenant le R207910 étaient aussi efficaces que 6 mois de traitement standard
Rationale: tuberculosis is the second-ranked infectious disease leading to mortality after AIDS. There are 9. 2 million people develop new disease yearly, and 1. 7 million died from TB in 2006. The efficacy of TB treatment is limited by its length, complexity (4 drugs for 6 months) and by drug resistant tuberculosis. New drugs that are more active than those available today, and that allow shortening of the treatment duration are being developed. R207910 belongs to a new family of antituberculosis drug, the diarylquinolines, inhibiting ATP synthase. Objectives: we evaluated the bactericidal and sterilizing activity of R207910 alone and included in drug combinations. Materials and Methods: Swiss mice were infected by intravenous route with M. Tuberculosis H37Rv. Treatment efficacy was assessed by colony forming units (CFU) counts in lungs and/or spleens at the end of treatment (bactericidal activity) or after 3 months of follow-up period without treatment (sterilizing activity). Results: R207910 at a dose of 25 mg/kg demonstrated bactericidal activity after 4 days. After 2 months of treatment, R207910 (25 mg/kg 5 days/week, 50 mg/kg 2 days/week, 100 mg/kg 1 day/week) decreased bacillary load by 5 log10 CFU, and was more active than the currently available antituberculous drugs. Thus, R207910 could be given once weekly with a bactericidal activity equivalent to daily treatment given that total weekly dose was the same. Due to the synergism between R207910 and pyrazinamide, 2 months of treatment with double or triple combinations R207910+pyrazinamide±isoniazid or rifampin or moxifloxacin led to lung culture negativity 70 to 100% of mice. On the other hand only 30% of lungs were culture negative among mice treated with regimens containing R207910 but not pyrazinamide. When R207910 was combined with first line antituberculous drugs, the duration of treatment and relapse rate were reduced. The sterilizing activity of four drug combination containing R207910, isoniazid, rifampin and pyrazinamide was equivalent in 4 months to the sterilizing activity of isoniazid, rifampin and pyrazinamide in 6 months (6% vs 17% relapse rate). We also demonstrated that, when R207910 was combined with rifapentine and pyrazinamide, this combination given once weekly rendered 9 of 10 mice culture negative in only 2 month. Such activity was not obtained with any other intermittent regimen and was even superior to standard daily treatment (isoniazid, rifampin and pyrazinamide). Conclusion: in murine tuberculosis, R207910 demonstrated potent activity in both initial and continuation phase of treatment. Four months of treatment of certain combinations containing R207910 are as active as 6 months of standard treatment

Afin d'internaliser le fer, un micronutriment essentiel pour sa survie, Mycobacterium tuberculosis, la mycobactérie responsable de la tuberculose, biosynthétise des composés ayant une très grande affinité pour Fe3+ appelés les mycobactines. Ces sidérophores sont biosynthétisés par voie non­ ribosomale, la synthèse débutant par l'activation d'une molécule d'acide salicylique par l'enzyme d'adénylation mbtA sous la forme d'un dérivé ester d'adénosylmonophosphate (salicyl-AMP). Notre laboratoire a déjà préparé des analogues stables de salicyl-AMP, inhibiteurs potentiels de la biosynthèse des mycobactines. Durant la thèse, nous nous sommes attachés à la préparation de phosphonamidates et de sulfonamides porteurs d'un motif dioxyde de quinoxaline en tant qu'analogues de salicyl-AMP, qui devraient présenter une excellente affinité avec le site actif de l'enzyme mbtA. Nous avons développé une extension à la réaction de Beirut, permettant la préparation, pour la première fois, de phosphonates de dioxyde de quinoxaline, précurseurs de nos analogues phosphonamidates. Lorsque le dioxyde de quinoxaline était substitué par un groupement aryle en position 3, un réarrangement du phosphonate en phosphate de monoxyde de quinoxaline a été observé. Des études RMN ont permis de mettre en évidence le caractère intramoléculaire de ce réarrangement, inédit en série N-oxyde d'aryle. La suite de la synthèse pour accéder à nos analogues phosphonamidate s'est en revanche avérée difficile. D'autre part, afin d'accéder à nos analogues sulfonamides, nous avons développé une voie de synthèse utilisant des conditions douces, et qui nous a permis de préparer les premiers exemples de sulfonamide en série dioxyde de quinoxaline. Ces derniers devraient être testés afm d'évaluer l'influence du motif dioxyde de quinoxaline sur l'activité antituberculeuse, et ainsi confirmer le potentiel de nos analogues-cibles, dont la synthèse est à terminer. Enfin, en parallèle de la synthèse des analogues sulfonamides, nous avons développé avec succès une nouvelle préparation de dioxydes de quinoxaline 2,3-disubstituée via un couplage de type Liebeskind-Srogl, qui représente le premier exemple de couplage organométallique en série dioxyde de quinoxaline
In order to intemalize iron, a vital micronutriment, Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, biosynthesizes compounds with extremely Fe (III) affinity, called mycobactins. The biosynthesis of these compounds is a non ribosomal process initiated by the adenylation enzyme mbtA, which activates a molecule of salicylic acid to the corresponding adenosylmonophosphate ester (salicyl-AMP). Our laboratory has already prepared various hydrolytically-stable analogues of salicyl-AMP as potential inhibitors of mycobactin biosynthesis. Lately, we have been working on the preparation of phosphonamidate and sulfonamide analogues with a quinoxaline 1,4-dioxide moiety, which should display a very good affinity with the active site of the enzyme mbtA. We successfully developed an extension to the Beirut reaction to access the first phosphonates of quinoxaline 1,4-dioxides, precursors of our phosphonamidates analogues. When the phopshonylated quinoxaline 1,4-dioxide was substituted with an aryl group on position 3, a rearrangement of the phosphonate into a phosphate of quinoxaline 1-monoxide was observed. NMR studies of this rearrangement, new in the N-aryl oxide series, suggested that it was intramolecular. The end of the synthesis to get our phosphonamidate analogues, however, proved difficult. Also, in order to prepare our sulfonamide analogues, we developed a synthesis that uses mild conditions and allowed us to access the first examples of sulfonamide in the quinoxaline 1,4-dioxide series, which should be tested to evaluate the influence of the quinoxaline 1,4-dioxide moiety on the antitubercular activity and confirm the potency of our targeted sulfonamide analogues, which have yet to be synthesized. Finally, while working on the synthesis of our sulfonamide analogues, we successfully developed a new preparation of 2,3-disubstituted quinoxaline 1,4-dioxide via a Liebeskind-Srogl-like cross-coupling reaction, which represents the first example of organometallic cross-coupling reaction in the quinoxaline 1,4-dioxide series

L’un des défis actuels de la lutte contre la tuberculose est de développer un traitement plus court et plus efficace. La modélisation mathématique constitue une approche qui peut nous aider à comprendre les problèmes actuels et favoriser les innovations thérapeutiques. L’objectif de ce travail est de construire un modèle thérapeutique mathématique de la tuberculose pulmonaire basé sur des éléments pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et physiopathologiques. La mise en application du modèle pharmacodynamique a été précédée d’une étude théorique sur l’équation de Hill. Cette synthèse a permis de dégager les bases rationnelles de son utilisation en modélisation pharmacologique. En utilisant une approche de population, un modèle pharmacocinétique de diffusion pulmonaire a permis de décrire les concentrations en rifampicine dans le plasma et le poumon chez 34 sujets. Le modèle a ensuite été utilisé pour analyser la valeur d’indices pharmacodynamiques corrélés à l’effet chez 10 000 sujets fictifs, par simulation de Monte Carlo. Les résultats indiquent que la dose de standard de rifampicine conduit à des concentrations globalement peu efficaces et pouvant favoriser la résistance bactérienne. Un premier modèle mathématique du traitement de la tuberculose par la rifampicine, incluant un modèle physiopathologique formel, a enfin été construit. Il permet de simuler la dynamique bactérienne du premier jour de l’infection au dernier jour de traitement. L’ensemble des résultats conduit à une remise en question de la dose standard de rifampicine et suggère une nouvelle hypothèse sur les causes de la persistance de Mycobacterium tuberculosis au cours du traitement antituberculeux
There is a critical need for a shorter tuberculosis treatment to improve tuberculosis control. Mathematical models may be helpful to understand current problems associated with tuberculosis therapy and to suggest innovation resources. The objective of this study is to set up a full mathematical model of tuberculosis treatment by rifampin, based on pharmacokinetic, pharmacodynamic and physiological submodels. Prior to its application in the pharmacodynamic modeling framework, the Hill equation has been the focus of a theoretical study. The various properties of this equation have been reviewed and the rationale of its use in pharmacological modelling has been clarified. Rifampin pharmacokinetics in plasma and lungs was modelled in a population of 34 volunteers by use of a nonparametric population approach. Then, a 10,000 subject Monte Carlo simulation was performed to explore Mycobacterium tuberculosis killing effect and prevention of resistance by rifampin. The results suggest that rifampin pulmonary concentrations obtained with the standard dose are too low to be highly effective and prevent drug resistance in most subjects. Finally, a full mathematical model of tuberculosis treatment, including a physiological model, has been implemented. The model is able to simulate the time-course of bacterial counts from the first day of infection to the last day of treatment. Overall results of this modelling effort indicate that current dosage regimens of rifampin may be optimized. In addition, this work suggests a new hypothesis regarding the bacterial persistence during tuberculosis treatment

De nos jours la tuberculose est une des maladies les plus meurtrières au monde. Un problème majeur est que l’agent pathogène responsable de cette maladie (Mycobacterium tuberculosis) a développé des mécanismes de résistances envers les médicaments actuels. Il devient donc urgent de trouver d’autres cibles pour développer de nouveaux antituberculeux. La biosynthèse des isoprénoïdes pourrait en être une. Les précurseurs biologiques de tous les isoprénoïdes sont l’IPP et le DMAPP qui sont synthétisés selon deux voies. La voie du mévalonate, présente chez l’Homme et la voie du méthylérythritol phosphate (MEP) laquelle est présente chez M. tuberculosis et absente chez l’homme. La fosmidomycine et la fosfoxacine, deux inhibiteurs de la désoxyxylulose phosphate réductoisomérase (DXR), deuxième enzyme de la voie du MEP ne permet pas d’inhiber la croissance de la mycobactérie. Cela est dû à l’absence de pénétration de ces composés polaires au sein de la bactérie. Pour pallier à ces problèmes de biodisponibilité, nous avons synthétisé des prodrogues lipophiles de type cycloSaligényle et arylphosphoramidate d’inhibiteurs de la DXR. Certains composés sont inhibent la croissance d’une mycobactérie non-pathogène, Mycobacterium smegmatis
Today, tuberculosis is one of most murderous infectious diseases in the world. This disease is caused by the mycobacterium : Mycobacterium tuberculosis which is becoming more and more resistant towards antitubercular drugs. Therefore, it is urgent to find inovative targets for the development of new antitubercular drugs. The biosynthesis of isoprenoids represents such a target. The biological precursors of all isoprenoids are IPP and DMAPP which are synthesized via two pathways the mevalonate pathway, which is present in human and the methylerythritol phosphate (MEP) pathway which is present in M. tuberculosis. but absent in human. Fosmidomycin and fosfoxacine, two natural inhibitors of the deoxyxylulose phosphate reductoisomerase (DXR), the second enzyme of MEP pathway, but they do not affect the growth of Mycobacterium tuberculosis cells, due to a lack of uptake of the polar drugs by the bacteria. To overcome this absence of the mycobacterial cell watll crossing of these compounds, we synthesized lipophilic cycloSaligenyl and arylphosphoramidate prodrugs of DXR inhibitors. Some compounds inhibit the growth of Mycobacterium smegmatis, a non-pathogenic model of mycobacterium

La clofazimine, une base faible lipophile active contre la tuberculose, n'est pas utilisée à cause de ses effets secondaires (digestifs et coloration cutanée). La prévention de ces effets par la microencapsulation moléculaire, solubilisation de molécules hydrophobes dans des polymères synthétiques amphiphiles, a été étudiée. Un polymère non-dégradable, le poly(méthylvinyléther-alt-anhydride maléique), et des dérivés dégradables du poly(-acide malique) (PMLA) sont utilisés. L'alcool dodécylique estérifie partiellement les groupes carboxyliques de ces polyanions. Les préparations hydrophobisées solubilisent des molécules lipophiles. Cependant, étant ionisée, la clofazimine s'associe en plus grande quantité au polyanion, ce qui permet l'administration de doses thérapeutiques avec peu de polymère. Les préparations basées sur deux dérivés dodécylés du PMLA sont actives sur des souris infectées par des mycobactéries après injection parentérale

La recrudescence de la tuberculose et l'apparition des souches de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) résistantes aux antibiotiques souligne la nécessité de rechercher de nouveaux antituberculeux avec de nouveaux mécanismes d'action. Les mycobactéries possèdent une membrane externe (appelée aussi mycomembrane), très riche en lipides qui leur confère une imperméabilité remarquable. Les constituants majeurs de la mycomembrane sont des acides gras originaux et à très longue chaine, appelés acides mycoliques (AMs). La biosynthèse de ces AMs est essentielle à la croissance mycobactérienne et comporte des enzymes-clefs, dont nombreuses ont été validées comme des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antituberculeux. Parmi elles, FadD32, une Fatty-acyl AMP Ligase impliquée dans l'étape ultime de cette voie de biosynthèse. Si les propriétés physico-chimiques de l'enzyme ont été caractérisées, la régulation de l'activité de cette enzyme essentielle reste encore à découvrir. La première partie de cette thèse porte sur la mise en évidence de la régulation post-traductionnelle par phosphorylation de FadD32 par des Sérine/Thréonine Protéine Kinases (STPKs) de type eucaryote. Nous avons montré que FadD32 pouvait être phosphorylée in vitro par plusieurs STPKs de Mtb. Cette phosphorylation réversible module négativement l'activité de la protéine, comme démontré pour d'autres protéines de la voie de biosynthèse des AMs. Afin de mieux comprendre l'impact de la phosphorylation par STPK sur la production des AMs et sur la synthèse de la mycomembrane, nous avons surexprimé une STPK de Mtb chez M. smegmatis, espèce modèle des mycobactéries. Nous avons pu observer un changement significatif de la quantité des AMs. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons optimisé et réalisé le criblage biochimique d'une chimiothèque sur l'activité de FadD32 et avons identifié des touches qui devraient servir dans la recherche de nouveaux agents antituberculeux
The resurgence of tuberculosis (TB), together with the emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), highlights the need for new anti-TB drugs with novel mechanisms of action. Mycobacteria possess an outer membrane (also called mycomembrane), which confers to them a remarkably impermeable cell envelope. The major constituents of the mycomembrane are very long-chain fatty acids with original structures, the so-called mycolic acids (MAs). The biosynthesis of MAs is essential for mycobacterial growth and involves several key enzymes, many of which have been validated as promising anti-TB drug targets. Among them, FadD32, a Fatty-acyl AMP Ligase implicated in the last step of the biosynthesis pathway, has been characterized biochemically and its protein structure has been solved recently. However, the regulation aspect of the enzyme is still to be deciphered. The first part of the thesis focuses on the post-translational regulation by protein phosphorylation of FadD32 by eukaryotic-like Serine/Threonine Protein Kinases (STPKs). We showed that FadD32 is the substrate of several Mtb STPKs. The reversible phosphorylation negatively modulates the adenylation activity of the protein. In order to determine the impact of the post-translational regulation on MA production, we over-expressed a STPK of Mtb in M. smegmatis, a validated surrogate of Mtb. We observed a significant change in the amounts of MAs. In the second part of the thesis, we screened a chemical library against FadD32 and identified several hits that should help in the development of new anti-TB agents

La tuberculose (TB), maladie pulmonaire causée par le Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste la première cause de mortalité par un agent infectieux. La TB est responsable de près de 1,7 million de morts et de 10,4 millions de nouveaux cas par an dans le monde. L’émergence et la propagation de souches bactériennes multi-résistantes aux antibiotiques (MDR) représentent une menace majeure grandissante et reflètent l’efficacité partielle des thérapies actuelles. Le traitement des patients atteints de TB-MDR est constitué actuellement de combinaisons d’antibiotiques, souvent toxiques, administrés pendant une longue durée, avec une efficacité limitée. Il existe donc un besoin urgent de développer de nouveaux traitements antituberculeux. L’immunothérapie, dont l’objectif est d’améliorer la réponse immunitaire de l’hôte contre le Mtb, représente une approche complémentaire intéressante dans le but de diminuer la durée et d’augmenter l’efficacité des traitements actuels de la TB-MDR. Le premier objectif de cette thèse a été de caractériser un nouveau vaccin thérapeutique, basé sur le virus de la vaccine modifié d’Ankara (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA), le MVATG18598, qui exprime dix antigènes représentatifs des trois phases de l’infection par Mtb. En utilisant différentes lignées de souris, nous avons montré que la vaccination par MVATG18598 entraîne l'induction de réponses spécifiques cellulaires et humorales. Les cellules T produisent plusieurs cytokines de type Th1 et présentent une activité cytolytique. Dans des modèles murins d’efficacité, le MVATG18598, associé à un traitement antibiotique, réduit significativement la charge bactérienne dans les animaux infectés ainsi que le taux de rechute de la maladie après l’arrêt du traitement. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'analyser l'impact des antituberculeux sur l'immunogénicité du vaccin MVATG18598. Nous avons montré que les antibiotiques de première ligne, et principalement l’isoniazide, diminuent la réponse immunitaire Th1 induite par le MVATG18598. De plus, nous avons démontré que la réponse humorale induite par le candidat vaccin est modifiée et s’oriente vers une augmentation du rapport IgG1/IgG2a en présence d’antibiotiques. En conclusion, nous montrons qu'un vaccin immunothérapeutique, tel que le MVATG18598, a la capacité de contribuer au contrôle de la tuberculose en augmentant l'efficacité des traitements antituberculeux. De plus, nos résultats indiquent que les antibiotiques modulent la réponse immunitaire induite par le vaccin, données devant être prises en compte lors du développement des futures stratégies immunothérapeutiques
Tuberculosis (TB), a lung disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), remains the leading cause of death worldwide from an infectious disease. TB is responsible for an estimated 1,7 million of deaths and 10,4 million new cases annually. The emergence and spreading of multidrug resistance (MDR) Mtb strains represent a major global threat and reflect limitation of current treatments. Patients with MDR-TB are currently treated with multiple drug regimens, often toxic, given for long durations, with a limited efficacy. Therefore, developing novel TB therapies is urgently needed. Immunotherapy aiming at triggering specific immune response against Mtb represents an attractive approach to shorten the duration and increase the efficacy of current MDR-TB treatment. The first aim of this PhD project was to characterize a novel therapeutic vaccine, based on the Modified Vaccinia virus Ankara (MVA), MVATG18598, expressing ten antigens representative of the three phases of Mtb infection. Using different strains of mouse, we showed that MVATG18598 vaccination is able to trigger Mtb antigens-specific humoral and cellular responses. Both CD4 and CD8 T cells display the capacity to produce multiple Th1-cytokines together with cytolytic activity. In post-exposure mouse models, MVATG18598 combined with an antibiotic regimen decreases significantly the bacterial burden in lungs of infected mice as well as the disease relapse rate after treatment completion. The second aim of this project was to analyze the impact of TB antibiotics on the immunogenicity of the MVATG18598 vaccine. We showed that first-line antibiotic regimen, mostly isoniazid, decreases antigen-specific Th1 immune response triggered by MVATG18598 vaccination in mice. Moreover, we demonstrated that Mtb-specific antibody response induced by the vaccine candidate is modified and shifted towards an increase of IgG1/IgG2a ratio in presence of drugs. Altogether, these results illustrate that immunotherapeutic vaccine such as MVATG18598 has the capacity to contribute to the control of TB by improving efficiency of anti-TB drugs treatment. In addition, our results indicate that antibiotics are able to modulate vaccine-induced immune response, a feature to consider for the future development of immunotherapies

La thymidine monophosphate kinase de M. Tuberculosis (TMPKmt) est une cible potentielle pour le développement de nouveaux agents antituberculeux. Cette enzyme directement impliquée dans la croissance de M. Tuberculosis, catalyse la dernière étape spécifique de synthèse du dTTP. Le travail présenté a consisté en la synthèse et l’évaluation d’inhibiteurs spécifiques de la TMPKmt. Des analogues nucléosidiques ont été conçus à partir du modèle de l’Ap5T, inhibiteur connu des nucléoside monophosphate kinases. Pour cela, des analogues des deux substrats ont été reliès par un bras espaceur. Par ailleurs, une nouvelle famille de molécules de nature non nucléosidique a été définie à l'aide d'un programme de modélisation (LEA3D) et synthétisée. De même que pour les analogues nucléosidiques, l’affinité de cette nouvelle famille de molécules a été déterminée in vitro sur la TMPKmt et sur la TMPK humaine. Certains analogues ont révélé une activité inhibitrice sur des cultures de M. Bovis BCG
M. Tuberculosis thymidine monophosphate kinase (TMPKmt) is a potential target for the development of new antituberculous agents. This enzyme is directly implied in M. Tuberculosis growth and catalyses the last specific step of the dTTP synthesis i. E. The phosphorylation of the dTMP in dTDP by using ATP as preferred phosphate donor. This manuscript describes the synthesis and evaluation of TMPKmt specific inhibitors. Thus, nucleosidic analogues were synthesized using Ap5T as a well known inhibitor of the nucleoside monophosphate kinases model. Hence, analogues of the two substrates were linked by a spacer. In a second approach, a new family of non-nucleosidic molecules were designed using a modelling program (LEA3D) and were synthesized. The affinities of both families of molecules were determined in vitro on TMPKmt and the human TMPK. Moreover, some of the non-nucleosidic analogues also turned out to be active on M. Bovis BCG growth

Le cancer et la tuberculose demeurant deux des principales causes de mortalité mondiales, le développement de nouveaux traitements ciblant ces deux pathologies reste un enjeu de santé publique majeur. Dans ce cadre, l'objectif de ma thèse a été de réaliser la synthèse et l'évaluation antitumorale/antituberculeuse de deux séries originales de composés N-polyhétéroaromatiques fusionnés, l'une ayant pour base la granulatimide (1) et l'autre la triazolophthalazine (2). La granulatimide (1) est un alcaloïde naturel reconnu pour inhiber le checkpoint G2, élément clé du processus de réparation de l'ADN. Au cours de ce travail, nous avons optimisé la préparation de (1). La synthèse de plateformes de diversification de (1) et de son isomère synthétique l'isogranulatimide C (3) a été étudiée sur la base de travaux de modélisation antérieurs afin d'envisager l'accès à de nouveaux inhibiteurs du checkpoint G2 plus efficaces. Le motif triazolophthalazine (2) a été retenue car divers dérivés styryltriazolophthalazine (4) ont récemment montré des effets antituberculeux et anticancéreux prometteurs. Au cours de ce travail, nous avons synthétisé plusieurs séries de composés ayant comme base (2) grâce à une nouvelle voie de synthèse orientée vers la diversité et optimisée pour l'automatisation. Les composés ainsi synthétisés ont pu être testés pour leur activité antituberculeuse et/ou anticancéreuse, plusieurs composés ayant montré de très bons résultats à la fois vis-à-vis de souches de tuberculose sensibles et de souches multi-résistantes. Le mode d'action antituberculeux de ces composés est toujours en cours d'élucidation mais les résultats obtenus jusqu'à présent suggèrent un mode d'action totalement innovant
Cancer and tuberculosis being still two of the main death causes worldwide, the development of new treatments against these two pathologies remains a major public health stake. In this setting, the purpose of my PhD work was to conduct the synthesis and the antitumoral/antitubercular evaluation of two original series of fused N-polyheteroaromatic compounds, one based on granulatimide (1) and the other on triazolophthalazine (2). Granulatimide (1) is a natural alkaloid beknown for inhibiting checkpoint G2, a key-element in DNA repair processes. During this work, we optimized the preparation of (1). The synthesis of diversification plateforms of (1) and its synthetic isomer isogranulatimide C (3) have been studied on the basis of previous computational work in order to consider the access to new more effective inhibitor of the checkpoint G2. Triazolophthalazine (2) have been chosen as some styryltriazolophthalazine derivatives (4) recently displayed promising antitubercular and anticarcinogenic effects. During this work, we synthesized several series of (2)-based compounds thanks to a new diversity-oriented and automation-compatible route. Thus synthesized compounds have been tested for their antitubercular and/or anticarcinogenic activity, several compounds displaying very good results against both drug-sensitive and multidrug-resistant tuberculosis strains. The antitubercular mode of action of these compounds is still under investigation but results obtained so far tend to indicate a totally innovative mode of action

Le TMC207 est un nouvel antituberculeux appartenant à la famille des diarylquinolines qui inhibe très efficacement l'ATP synthase des mycobactéries. Dans le but de cartographier les interactions entre le TMC207 et sa cible et de comprendre le mécanisme d'action exact de cette nouvelle drogue, nous avons sélectionné in vitro des mutants résistants au TMC207 à partir de plusieurs espèces mycobactériennes. Six mutations distinctes ont été identifiées dans l'anneau c de l'ATP synthase: D28G, D28A, L59V, E61D, A63P et I66M. L'effet de ces mutations dans la résistance a été évalué en mesurant le niveau de résistance conféré dans les clones résistants, ainsi que dans un système de complémentation chez M. smegmatis. Les résultats ont été interprétés grâce à la construction d'un modèle structural de l'anneau c, utilisé pour faire des expériences de docking avec le TMC207. Nos résultats montrent que les résidus substitués dans les clones résistants définissent une poche localisée entre deux sous-unités c adjacentes dans l'anneau, englobant le site de fixation du proton, qui permet la stabilisation du TMC207. La drogue bloque ainsi le transfert des protons et la synthèse d'ATP. Pour finir, nous avons mis au point l'expression et la purification de l'ATP synthase mycobactérienne afin d'initier l'étude structurale de ce macro-complexe en microscopie électronique et en cristallographie des protéines. Les résultats obtenus en microscopie électronique en coloration négative nous ont permis d'obtenir les premières images de l'ATP synthase de M. smegmatis

Le TMC207 est un nouvel antituberculeux appartenant à la famille des diarylquinolines qui inhibe très efficacement l’ATP synthase des mycobactéries. Dans le but de cartographier les interactions entre le TMC207 et sa cible et de comprendre le mécanisme d’action exact de cette nouvelle drogue, nous avons sélectionné in vitro des mutants résistants au TMC207 à partir de plusieurs espèces mycobactériennes. Six mutations distinctes ont été identifiées dans l’anneau c de l’ATP synthase: D28G, D28A, L59V, E61D, A63P et I66M. L’effet de ces mutations dans la résistance a été évalué en mesurant le niveau de résistance conféré dans les clones résistants, ainsi que dans un système de complémentation chez M. Smegmatis. Les résultats ont été interprétés grâce à la construction d’un modèle structural de l’anneau c, utilisé pour faire des expériences de docking avec le TMC207. Nos résultats montrent que les résidus substitués dans les clones résistants définissent une poche localisée entre deux sous-unités c adjacentes dans l’anneau, englobant le site de fixation du proton, qui permet la stabilisation du TMC207. La drogue bloque ainsi le transfert des protons et la synthèse d’ATP. Pour finir, nous avons mis au point l’expression et la purification de l’ATP synthase mycobactérienne afin d’initier l’étude structurale de ce macro-complexe en microscopie électronique et en cristallographie des protéines. Les résultats obtenus en microscopie électronique en coloration négative nous ont permis d’obtenir les premières images de l’ATP synthase de M. Smegmatis
TMC207 is a new antituberculous drug, which inhibits very efficiently the ATP synthase of mycobacteria such as M. Tuberculosis, one of the most important pathogens in the world. In order to map the amino acid residues involved in the binding of the drug, we have selected in vitro TMC207-resistant mutants from M. Tuberculosis and diverse atypical mycobacteria. Six distinct mutations, D28G, D28A, L59V, E61D, A63P and I66M, have been identified in the subunit c forming a c-ring in the ATP synthase. They were studied by evaluating the levels of resistance they confer in the selected clones and in M. Smegmatis by using an isogenic complementation system. The rates of increase of TMC207 MIC values were interpreted by constructing by homology modeling a structure of the c-ring which was used for docking simulations with TMC207. Our results suggest that the residues found to be mutated in the resistant clones, together with a tyrosine specifically conserved at position 64, define a cleft located between two adjacent c subunits in the c-ring. This cleft, which encompasses the proton binding site, is well fitted to bind TMC207 at the level of the bromo-quinoline moiety, the drug being anchored by several bonds. Finally, we have expressed and purified the mycobacterial ATP synthase in order to begin the structural study of this enzyme by electron microscopy and x-ray diffraction. Our results of electron microscopy allow obtaining the first images of the ATP synthase of M. Smegmatis

Ce travail porte d’une part sur l’extraction, l’isolement et l’identification des alcaloïdes d’un pavot endémique de Turquie, Papaver arachnoïdeum Kadereit, d’autre part, sur la synthèse d’analogues de produits naturels de série benzothieno[3,2-f][1]benzopyrane, à potentialités antimicrobiennes et antifongiques, et de série benzo[c]phénanthrolines, à visée antitumorale. Dans la première partie, l’étude d’extraits alcaloïdiques de Papaver arachnoïdeum collectés dans deux régions différentes de Turquie est réalisée. Cinq alcaloides sont isolés. Il s’agit d’une aporphine, la roemerine, d’une oxoaporphine, la liriodénine et de trois proaporphines la mécambrine, la roemeronine et le déhydromecambrinol B. La configuration absolue de ces trois derniers dérivés est déterminée. Ces résultats sont discutés des points de vue biogénétique et chimiotaxonomique. La deuxième partie porte sur la synthèse de nouveaux dérivés de série benzothieno[3,2-f][1]benzopyrane, comportant un motif chromène rencontré dans de nombreuses substances naturelles fusionné avec un thiophène, pharmacophore connu comme support d’activités antifongiques et antibactériennes. L’étape clé de la synthèse est un réarrangement thermique de type Claisen d’un éther propargylique du 2-hydroxydibenzothiopène. La double liaison du cycle pyrannique a été fonctionnalisée par oxydation en diols et diacétates cis et trans. Les activités antibactérienne, antifongique et antiuberculeuse des composés ont été évaluées. La dernière partie traite de la synthèse de nouveaux composés de série benzo[c]phénanthroline. La structure de ces molécules s’inspire de celle d’alcaloïdes isolés de Rutaceae appartenant au genre Zanthoxylum, comme la nitidine et la fagaronine qui présentent des activités cytotoxiques intéressantes. La substitution des noyaux benzo[c][1,7] et [1,8] phénanthroline par différentes chaînes de type dialkylaminoalkyle permet d’accroître la solubilité dans des solvants biocompatibles et d’améliorer l’activité cytotoxique par rapport aux composés
This work describes the extraction, the isolation and the identification of the alkaloids of Papaver arachnoïdeum Kadereit, a poppy species endemic from Turkey, on the one hand, and the synthesis of natural products analogues in the benzothieno[3,2-f][1]benzopyran and benzo[c]phenanthroline series, with potential antimicrobial and anticancer activities, respectively, on the other hand. The alkaloid extracts of Papaver arachnoïdeum, collected in two different regions of Turkey, led to the isolation of five compounds. : an aporphine, roemerine, an oxoaporphine, liriodenine, and three proaporphines whose absolute configurations have been determined : mecambrine, roemeronine, dihydromecambrinol B. These results are discussed from both biogenetic and chemotaxonomic points of view. The second part deals with the synthesis of new benzothieno[3,2-f][1]benzopyran derivatives, whose structure include a chromene unit, encountered in numerous natural compounds, fused onto a thiophene present in several antifungal and antibacterial structures. The key-step of the synthesis of the lead compound was the thermal Claisen rearrangement of a propargyl ether derived from 2-hydroxydibenzothiopene. The pyran double bond was further converted into the corresponding cis and trans diols and diacetates. The compounds were tested in vitro for their antibacterial, antifungal, and antiubercular activities. In the last part, the syntheses of new benzo[c]phenanthroline derivatives are described. The structures of these novel compounds relate to those of antiproliferative alkaloids isolated from Rutaceae species belonging to the genus Zanthoxylum, such as nitidine and fagaronine. Substitution of the benzo[c][1,7] and [1,8]phenanthroline basic core by various dialkylaminoalkyl substituents gave access to new compounds exhibiting better cytotoxic activities associated with increased solubility in biocompatible solvents, when compared with the parent compounds

La tuberculose (TB) est encore aujourd’hui une cause majeure de morbidité et mortalité dans le monde. Sa maitrise a été rendue difficile par l’épidémie de VIH et la résistance au antituberculeux. La méningite tuberculose (MTB), est la forme la plus grave de TB et est un des indicateurs utilisés pour la politique vaccinale par le BCG. La multirésistance aux antituberculeux (MDR) qui pose des problèmes diagnostiques et thérapeutiques est surveillée depuis 1992 en France. En revanche, la mono-résistance à la Rifampicine (mono-RMP-R) qui représente une première étape vers la TB MDR est rarement étudiée et le devenir des malades est inconnu en France. Notre travail a été axé sur l’épidémiologie de la MTB et l’impact des modifications de stratégie vaccinale par le BCG. Nous avons pour cela utilisé deux systèmes de surveillance de la tuberculose en France : un réseau national de laboratoires coordonné par le centre national de référence des mycobactéries (CNR), et le système de la déclaration obligatoire (DO), coordonné par l’Institut de Veille Sanitaire (InVS). Nous avons également utilisé le réseau du CNR pour évaluer la monorésistance à la rifampicine dans la TB en France. Nous avons tout d’abord évalué le taux d’incidence de la tuberculose du système nerveux central à culture positive (TB SNC C+) en France en 2007 (année de modification de la politique vaccinale) et son évolution entre 1990 et 2007. En 2007, la TB SNC C+ représentait moins de 1% de tous les cas tuberculose à culture positive et son incidence était de 0,5/million d’habitants. La sensibilité du réseau du CNR était de 79,4%. Pour évaluer l’évolution de la TB SNC C+ entre 1990 et 2007, nous avons utilisé une sensibilité « moyenne » dérivée de la sensibilité du CNR pour l'année 2000 (75,6%) et celle pour l'année 2007 pour corriger le nombre de cas signalés dans chacune des 4 études (1990, 1995, 2000, 2007). Nous avons observé une diminution de 62% du nombre corrigé de TB SNC C+ en 17 ans (90 à 35 cas) et du taux d'incidence corrigé (de 1,6 à 0,55 cas par million d'habitants) (P < 0.001). Ensuite, nous avons mesuré l’impact des deux changements majeurs de la politique vaccinale par le BCG en 2006 (arrêt de la multipuncture) et 2007 (arrêt du BCG obligatoire), sur l’épidémiologie de la MTB chez les enfants <6 ans en France entre 2000 et 2011. Au total, 10 cas de MTB à culture positive et 17 cas de MTB possibles (culture négative ou inconnue) ont été identifiés, avec un taux d’incidence annuel variant de 0,16 à 0,66 cas/10 million habitants. En Ile de France où tous les enfants sont considérés « à risque » et donc devraient tous être vaccinés, ou dans les autres régions, où seuls les enfants à risque sont vaccinés depuis 2007, il n’existait aucune différence significative des taux d'incidence annuels pour chaque cohorte d’un an. Ces résultats renforcent la décision d'arrêter de la vaccination universelle par le BCG en 2007. Toutefois une surveillance étroite de la TB SNC dans les années à venir sera nécessaire pour évaluer l'impact long-terme de la nouvelle stratégie vaccinale. Finalement, nous avons mis en place par le biais du réseau des laboratoires du CNR une cohorte rétrospective des cas de TB mono-RMP-R diagnostiqués en France entre 2005 et 2010. Au total, 39 cas de TB mono-RMP-R (soit 0.12% des cas de TB) ont été recensés. Parmi tous ces patients, 19 cas (49%) avaient un antécédent de traitement de leur tuberculose, et 9 (23%) étaient infectés par le VIH. Les données sur le traitement et le devenir étaient disponibles pour 30 des 39 patients et seulement 20 (67%) ont été considérés guéris. Les traitements reçus tant en terme de drogues que de durée étaient hétérogènes. Ces résultats suggèrent qu’il faut améliorer la prise en charge des malades atteints de TB mono-RMP-R en France
Tuberculosis (TB) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide, partly because of drug resistance anf the HIV epidemics. Tuberculous meningitis (TBM) is the most severe form of the tuberculosis disease, and is one of the indicators used for the BCG vaccination policy. Multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB), which poses diagnostic and therapeutic problems, has been monitored since 1992 in France. On the opposite, rifampicin mono-resistance (RMR) tuberculosis (TB) which represents a first step toward MDR-TB is rarely studied and the impact of rifampicin mono-resistance on patient’s outcome is unknown in France. Our work was focused on the epidemiology of MTB and the impact of changes in the BCG vaccination strategy. We used two systems implemented for the surveillance of TB in France: a nationwide laboratory network coordinated by the National Reference Centre (NRC) for Mycobacteria and Resistance of Mycobacteria to Anti-tuberculosis Drugs and the mandatory notification system of TB (MNS) coordinated by the National Institute for Public Health Surveillance (Institut de Veille Sanitaire, InVS). The NRC network was also used to evaluate Rifampicin mono-resistant tuberculosis in France. First, we assessed the incidence rate of culture-positive (C+) central nervous system tuberculosis (CNS TB) in France in 2007 (the year of the changing policy on BCG vaccination) and its time trend between 1990 and 2007. In 2007, CNS TB represented less than 1% of all culture-positive TB cases and its incidence was around 0.50 per million inhabitants. The 2007 sensitivity of the NRC was 79.4%. To assess the evolution of C+ CNS TB between 1990 and 2007, we used an average sensitivity derived from the 2000 sensitivity of the NRC (75.6%) and the sensitivity for the year 2007. The average sensitivity was used to correct the number of C+ CNS TB reported in four surveys (1990, 1995, 2000, 2007). There was a major decrease of 62% in the extrapolated number of C+ CNS TB in seventeen years (from 90 to 35 cases), and in the extrapolated incidence rate (from 1.6 to 0.55 cases per million inhabitants) (P < 0.001). Then, we measured the impact of two major changes in BCG vaccination policy in 2006 (disappearance of the multipuncture device for BCG) and 2007 (end of compulsory BCG vaccination) on the epidemiology of TBM in children under 6 years in France between 2000 and 2011. Overall, 10 culture-positive and 17 possible (negative-culture or unknown microbiological result) cases of TBM were identified, with an annual incidence rate varying from 0.16 to 0.66 cases / 10 million inhabitants. In Ile-de-France, where all children are considered “at risk” and therefore should all be vaccinated, and in the other regions where only at-risk children are considered for vaccination since 2007, no statistically significant differences in the annual incidences rates for each one-year age-group cohort could be observed. These results reinforce the 2007 decision to stop universal BCG vaccination. However, a close monitoring of CNS TB in the coming years will be needed to assess the long-term impact of the new vaccination policy. Finally, we built, through the NRC national network of laboratories, a retrospective cohort of RMR TB cases diagnosed between 2005 and 2010. A total of 39 cases with RMR TB were identified (0.12% of all TB culture positive cases). Among all patients, 19 (49%) had a previous history of TB treatment, and 9 (23%) were HIV-coinfected. Data about treatment and outcome were available for 30 of 39 patients and only 20 (67%) were considered as cured. Treatments received both in terms of drugs and duration were heterogeneous. These results suggest the need to improve the management of patients with RMR TB in France

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose, est chaque année responsable de ≈ 9 millions de nouveaux cas d'infection et ≈ 1,4 millions de décès dans le monde. Le génome de Mtb comporte des régions codant pour 5 systèmes de sécrétion de type VII: ESX-1 à ESX-5. La plupart de ces régions comportent des gènes codant pour des protéines PE/PPE, nommées en raison de leurs motifs caractéristiques Proline-Acide Glutamique (PE) ou Proline-Proline-Acide Glutamique (PPE). Nous avons montré que les protéines PE/PPE associées à ESX-5 sont fortement immunogéniques pour les cellules T CD4+ et T CD8+. La sécrétion, et par conséquent l'immunogénicité, de ces protéines sont fortement contrôlées par le produit du gène eccD5, qui constitue le canal transmembranaire du système ESX-5. Nous avons montré que la souche de Mtb Δppe25-pe19, invalidée pour le segment pe/ppe d'esx-5, présente une virulence très atténuée chez la souris immunocompétente. De plus, nous avons établi que cette atténuation n'est pas due à une interférence avec l'expression des facteurs majeurs de virulence liés au ESX-1: ESAT-6 et CFP-10. Grâce à un canal EccD5 fonctionnel, la souche Δppe25-pel9 est capable d'induire des réponses Thl contre un large panel de protéines PE/PPE non-associées à esx-5, qui par leur forte réactivité croisée, reconnaissent les facteurs de virulence PE/PPE d'esx-5 absents de cette souche. Enfin, nous avons montré la capacité protectrice de la souche Δppe25-pel 9 contre l'infection par Mtb, qui est significativement supérieure à celle du BCG. Par conséquent, nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour la mise au point d'un vaccin vivant atténué contre la tuberculose
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis is responsible for ≈ 9 million new cases of infection and ≈ 1. 4 million deaths per year worldwide. The genome of Mtb encodes five potential type VII secretion systems, ESX-1 to ESX-5, most of which are associated with genes encoding PE/PPE proteins, named after their N-terminal Pro-Glu (PE) or Pro-Pro-Glu (PPE) motifs. Here, we have shown that the ESX-5-associated PE/PPE proteins are highly immunogenic for both CD4+ and CD8+ T cells. Indeed, we describe the strong T cell immunogenicity of the ESX-5-encoded PE/PPE proteins, which share a large panel of cross-reactive CD4+ T epitopes with substantial numbers of their ESX-5-nonassociated PE/PPE homologs. The immunogenicity of these numerous PE/PPE proteins is dependent on their export by a functional EccD5, the predicted trans-membrane channel of the ESX-5 secretion apparatus. The Mtb Δppe25-pe 19 mutant deleted for all ESX-5-associated pe and ppe genes, although highly attenuated in immunocompetent mice, remains able to induce immunity against the ESX-5-associated PE/PPE virulence factors, via cross-reactivity with their numerous homologs, and against the ESX-1 virulence factors ESAT-6/CFP-10. Moreover, the Mtb Δppe25-pe19 strain is as potent as WT Mtb of inducing phenotypic and functional maturation of innate immune cells. The Mtb Δppe25-pel9 strain is strongly protective against pathogenic Mtb infection in mice and represents a potential anti-tuberculosis vaccine candidate

La tuberculose est une infection humaine cosmopolite à transmission pulmonaire causée par Mycobactérium tuberculosis. Elle représente l'une des principales causes de mortalité dans le monde. La prise en charge thérapeutique de cette maladie est confrontée aujourd’hui à une forte pharmacorésistance des bacilles à la plupart des médicaments antituberculeux habituellement indiqués. Face à cette situation la recherche de nouvelles molécules plus efficaces échappant au phénomène de pharmacorésistance est encouragée par l'OMS. C'est dans ce contexte que nous avons conçu des dérivés de la 1,10-phénanthrolinone, analogues structuraux des quinolones connues pour leurs activités antituberculeuses. Ces dérivés ont été préparés par condensation de la 8-aminoquinoléine et de l'étoxyméthylènemalonate d'éthyle, suivit d'une cyclisation intramoléculaire pour conduire à la 1,10-phénanthrolinone-3-carboxylate d'éthyle. La modulation chimique de cette dernière a permis d'obtenir la plupart des dérivés de la 1,10-phénanthrolinone préparés. Les dérivés de la 1,10-phénanthrloninone synthétisés ont fait l'objet d'une évaluation de leurs activités antibacillaires. Parmi ceux-ci, certains dérivés 6-nitro-1,10-phénanthrolinones se sont particulièrement illustrés par leurs performances antibacillaires avec des CMI comprises entre 0,31 et 9,84 μM. Par ailleurs, cette activité est conservée sur les souches de mycobactéries sensibles et les souches résistantes aux quinolones ce qui fait penser à un probable mécanisme d'action différent. De plus, ces molécules se sont avérées non toxiques sur les cellules Vero avec des IC50> 100 μg/mL ( soit 16 à 64 fois leurs CMI). Notre approche pharmacochimique a conduit à l’élaboration de nouvelles molécules possédant une structure de type 1,10-phénantrolinone dont le profil chimique diffère de celui de toutes les classes chimiques d’antituberculeux existantes. Les résultats obtenus ouvrent de nouvelles voies d'investigations pour la recherche de nouveaux antituberculeux voire anti-infectieux en série chimique des 1,10-phénantrolinones
Tuberculosis is a cosmopolitan human lung infection caused by Mycobacterium tuberculosis. She represents one of the main reasons of mortality in the world. therapeutic management of this disease is confronted today with a strong pharmacoresistance of bacilli to most antituberculosis habitually used. Facing this situation the research of new more efficient molecules avoiding the phenomenon of pharmacoresistance is encouraged by the WHO. It is in this context that we conceived derivatives of the 1,10-phénanthrolinone, the structural analogues of quinolones known for their antituberculosis activity. These derivatives were prepared by condensation of 8-aminoquinoline and ethyl ethoxymethylenemalonate, followed by intramolecular cyclization to give the ethyl 1,10-phenanthrolinone-3-carboxylate. The chemical modulation of the latter have allowed to get most of the 1,10-phenanthrolinone derivatives. The 1,10-phenanthrloninone derivatives synthesized were evaluated for their antibacillary activities. Among these, some 6-nitro 1,10-phenanthrolinone derivatives are particularly illustrated by their antibacillary performance with MIC included between 0.31 and 9.84 μM. In addition, this activity is kept on susceptible strains of mycobacteria and the quinolone-resistant strains , suggesting a different mechanism of action. In addition, this activity is conserved on susceptible strains of mycobacteria and quinolone-resistant strains, suggesting a different mechanism of action. Moreover, these molecules proved to be not toxic on cells Vero with IC50> 100 μg / mL (16 to 64 times their MIC). Our pharmacochimique approach has led to the development of new molecules having a structure of type 1,10-phénantrolinone from which chemical profile differs from that of all chemical classes of antitubercular drugs existent. Got results open new ways of investigations for research of new anti-tuberculosis or anti-infectious drugs in the 1,10-phenantrolinone chemical series

L'isoniazide (INH) est un antibiotique très utilisé dans le traitement de la tuberculose, une maladie infectieuse causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis. Le mécanisme d'action de l'INH, pas encore entièrement élucidé, est expliqué par la formation d'adduits covalents entre l'INH activé par l'enzyme KatG, et le cofacteur NAD. Ces adduits INH-NAD sont des inhibiteurs de InhA, enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, constituants spécifiques de la paroi mycobactérienne. Le chapitre 1 est consacré à l'étude structurale des adduits INH-NAD. Dans le chapitre 2, plusieurs voies de synthèse vers de nouvelles molécules cibles inspirées de ces adduits sont mises au point. Dans le chapitre 3, les molécules synthétisées sont testées vis-à-vis des cibles biologiques (InhA et MabA). Les voies de synthèse mises au point et les informations de relation structure-activité obtenues devraient permettre l'accès à de nouvelles molécules à activité antituberculeuse potentielle
Isoniazid (INH) is an antibiotic frequently used in treatment of tuberculosis, an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. The action mecanism of this drug, up to now not completely elucidated, is explained by the formation of covalent adducts between INH activated by the catalase-peroxidase KatG and the NAD cofactor. These adducts are inhibitors of InhA, an other bacteria enzyme involved in the biosynthesis of mycolic acids (specific components of the mycobacterial cell wall). The first chapter descibes the NMR structural study of the INH-NAD adducts. In the second chapter, several synthetic pathways towards new molecules inspired by the INH-NAD model elucidated in the first chapter are elaborated. In the third chapter, the molecules previously obtained are tested towards biological targets (InhA and MabA enzymes). The synthetic pathways elaborated and the structure-activity relationships obtained should allow an access to new potential. .

La tuberculose est une maladie infectieuse et contagieuse, dont l'agent pathogène principal est l'espèce Mycobacterium tuberculosis. Cette thèse a pour objectif principal d'étudier la tuberculose par une approche d'épidémiologie génétique dans deux pays à forte incidence, Djibouti et le Burkina Faso, et une zone à faible incidence, Montpellier et sa région. Ce travail permet de mieux comprendre la propagation de cette maladie infectieuse dans ces régions et de donner des informations indispensables pour les services de santé publique. Pour chacune de ces régions, ce sont les premières études du genre et cette thèse représente donc un travail original et informatif. Les objectifs spécifiques sont : (i) d'étudier la diversité génétique, les relations phylogénétiques entre les souches et la structure des populations de M. Tuberculosis dans ces trois zones ; (ii) de comprendre la dynamique de transmission de la tuberculose dans ces trois régions ; (iii) de tenter d'identifier des facteurs de risque impliqués dans la transmission de la tuberculose ; (iv) enfin par une approche globale de comparer les résultats obtenus pour ces trois régions et de les confronter avec les données de la littérature. Les isolats ont été prélevés par les services de santé publique de chacun des pays concernés et ont été cultivés et/ou stockés au laboratoire de bactériologie du CHU de Montpellier (un total de 320 souches). La caractérisation génétique des échantillons est réalisée par 2 marqueurs moléculaires complémentaires reconnus pour le génotypage de M. Tuberculosis : le spoligotypage et les MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit Variable Number of Tandem Repeats). La caractérisation génétique a permis d'identifier 247 souches comme appartenant à des familles déjà décrites dans la littérature et 73 souches présentant des nouveaux génotypes. Une grande hétérogénéité génétique observée dans l'échantillon de Montpellier reflète le niveau endémique et le bon contrôle de cette maladie dans cette région de faible incidence (6,6 cas pour 100000 habitants). Cette étude permet d'identifier que la majorité des cas sont dus à des réactivations endogènes. Néanmoins, les données mettent en évidence des cas de transmission récente familiale et des cas de tuberculose importés. Au Burkina Faso, pays présentant une incidence élevée (163 cas pour 100000 habitants), les points importants sont : un faible nombre de cas résistants aux antituberculeux et non impliqués dans les cas de transmission récente ; une diversité génotypique relativement élevée reflétant l'existence d'une prise en charge de la maladie ; l'infection par le VIH ne constitue pas un facteur de risque de transmission récente malgré une incidence du VIH élevée ; on observe l'émergence de la famille LAM10 déjà décrite au Cameroun appelée famille Cameroun. Cette famille est responsable de la majorité des nouveaux cas de tuberculose au Burkina Faso. A Djibouti, pays présentant la plus forte incidence de tuberculose au niveau mondial (733 cas pour 100000 habitants), on observe une structuration remarquable de la population de M. Tuberculosis en 3 lignées bien individualisées, proches des familles EAI, T et CAS. La diversité génétique observée dans ce pays apparaît élevée en dépit d'un taux de transmission récente important. Ceci suggère l'ancienneté de ces lignées dans ce pays en accord avec les données de la littérature. Les études génétiques apportent non seulement des informations fondamentales pour l'épidémiologie de la tuberculose mais également sur la structure des populations, base indispensable pour appréhender la lutte et le contrôle d'un organisme pathogène. La comparaison des données obtenues dans ces trois pays d'incidences différentes et la mise en regard avec les données de la littérature permettent d'identifier des profils épidémiologiques et génétiques observés classiquement pour cette maladie infectieuse, mais également des caractéristiques spécifiques à chacun des pays d'étude. En conclusion, ces études réalisées à un niveau local mais également abordées d'un point de vue global permettent de définir quelles sont pour chacune des zones d'études les perspectives de recherche et les stratégies à développer pour le contrôle de la tuberculose.

La tuberculose humaine, due à un agent étiologique unique : Mycobacterium tuberculosis, reste l'une des principales causes de mortalité à travers le monde. Elle est encore responsable de 2 à 3 millions de décès par an parmi le milliard de personnes infectées. L'enveloppe des mycobactéries est très complexe et de composition originale, et cette singularité fait des enzymes impliquées dans sa biogénèse, des cibles idéales pour la recherche de nouveaux antibiotiques. Elle contient notamment les acides mycoliques, éléments essentiels à la survie des bacilles et spécifiques des genres Mycabacterium et apparentés. Leur biosynthèse constitue actuellement des cibles d'antituberculeux tels que l'isoniazide. Dans l'optique de la recherche de nouvelles stratégies de lutte contre la tuberculose, nous avons conçu et synthétisé des analogues de type cinnamique pouvant potentiellement intervenir dans le système FAS-II, voie de biosynthèse des acides mycoliques. Au cours de ce travail, nous avons développé différentes familles de molécules issues des systèmes cinnamiques et dont les modifications se situent à différents niveaux : * au niveau du 4-hydroxyphényl de l'acide cinnamique qui constitue la brique moléculaire de toutes les synthèses entreprises. Plusieurs groupements alkyles ont été introduits sur la position phénolique, * au niveau de la fonction carbonyle de l'acide. Différentes fonctionnalités ont été introduites : amines, hydrazines, hydrazides, * modification au niveau de la fonction éthylénique. L'isostère cyclopropyle a été introduit, conduisant à un ensemble de composés synthétisés (amides, hydrazides). Toutes les molécules synthétisées ont été testées par l'équipe du Dr. Mamadou Daffé à l'Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS) sur des cultures de M. Tuberculosis. De ces résultats, il en ressort un ensemble de molécules appartenant à des familles différentes : amides, hydrazinamides et triazolophthalazines qui présentent de bonnes activités antimycobactériennes se situant entre 0,1 et 0,5 µg/mL
Human tuberculosis, due to a single agent etiologic: Mycobacterium tuberculosis, remains one of the leading causes of mortality throughout the world. It is still responsible for 2 to 3 million of death per annum among the billion infected people. The mycobacteries cell wall are complex and possesses an original composition. So enzymes implicated in its biogenesis, the ideal targets in the way to discover new antibiotics. It contains in particular mycolic acids, essential components for the survival of the bacilli and specific of the Mycabacterium kinds and related. The current drug as isoniazid targets on specific enzyme implicated in the mycolic acid biosynthesis. In the aim to find new antituberculosis agents, we designed and synthesized cinnamic derivatives being able to play a role in the FAS-II, system involved in biosynthesis way of mycolic acids. In this work, we developed various families of molecules possessing the cinnamic moiety and different modifications are at various levels: * Several alkyls groups were introduced on the phenolic position of 4-alkoxyphenyl cinnamic acid, * Various functionalities like: amines, hydrazines, hydrazides were introduced on the carboxylic position, * the ethylene group was modified. The isosteric cyclopropyle was introduced, leading to a set of synthesized compounds (amides, hydrazides). All the synthesized molecules were tested by the team of Dr. Mamadou Daffé at the Institute de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS) on M. Tuberculosis (H37Rv strain) for their antitubercular efficiency. The biological results revealed that the series of cinnamic acid derivatives with amide, hydrazide, and triazolophthalazine functionalities are good antitubercular agents. Their MIC ranges from 0. 1-0. 5 µg/mL

Une trentaine de composés nouveaux, appartenant à deux séries différentes et ayant en commun le motif chromène, présent chez de nombreux composés naturels dotés de propriétés biologiques, ont été préparés. Ces composés appartiennent soit à la série pyranophénothiazine soit à la série aroylbenzopyrane. La série pyranophénothiazine associe les noyaux phénothiazine et benzopyrane. Les chefs de file de structures angulaire et linaire ont été synthétisés. Afin d'établir les relations structure – activité dans cette nouvelle série, les dérivés d’oxydation, les dérivés hydrogénés, les acétates de diols (sulfoxydés ou non) et les dérivés N-substitués de ces deux séries ont également été préparés. La cytotoxicité et l’activité antimycobactérienne de tous les composés ont été évaluées. La deuxième série de structure, aroylbenzopyranes, analogues de type hétéro- combrétastatine conservent la partie triméthoxyphénolique de la combrétastatine A4, l'autre partie étant constituée par le chromène. Leur cytotoxicité et leur effet sur la morphologie des cellules endothéliales, prédictif de l’activité antivasculaire in vivo, ont été déterminés
About thirty new compounds were synthesized. These compounds belong to two different series with chromene, which is present in many natural biologically active compounds, as common scaffold. The structure of pyranophenothiazine series associates a phenothiazine and a benzopyrane nucleus. The heads of both series, as well as the products of oxidation, hydrogenation, the acetates of their diol derivatives (sulfoxydes or not) and the N-substituted derivatives were prepared in order to study structure-activity relationships. Cytotoxicity and antimycobacterial activities of all compounds were tested. The second aroylbenzopyrane series, heterocombretastatin analogues, includes the trimethoxyphenyl part of combretastatine A4 combined with a chromene nucleus. The cytotoxicity and the effect on the morphology of modified endothelial cells predictive of in vivo antivascular activity were determined

Syndrome inflammatoire lié à la reconstitution immunitaire chez le patient coinfecté par le VIH et la tuberculose est une complication du traitement par des antirétroviraux, appelé TB-IRIS. Ce syndrome est souvent rencontré dans les pays en voie de développement. Son diagnostic se pose essentiellement sur la présentation clinique et nécessiter de se différentier des autres pathologies. Son évolution est souvent favorable ou sous corticoïde mais certaine forme est sévère et/ou mortelle. L'étude de leur mécanisme permettra d'identifier de marqueur prédictif, applicable à leur diagnostic précoce et à l'amélioration de leur prise en charge. Alors, nous avons proposés d'étudier le rôle de cellule NK et le rôle de lymphocyte T dans l'essai clinique de CAMELIA au Cambodge. Le résultat a montré l'élévation de la capacité de dégranulation de cellule NK est associé à la survenu de TB-IRIS et il peut être un marqueur prédictif. De plus, l'hyperactivation de cellule T effectrice et la diminution de cellule T régulatrice sont aussi observées. Le rôle de cellule T régulatrice n'est pas encore préciser. Le mécanisme régulateur de ce phénomène doit être ultérieurement exploré
Inflammatory syndrome associated with immune reconstitution in patients coinfected with HIV and TB is one complication of antiretroviral treatment, called TB-IRIS. This syndrome more often encountered in developing countries. Diagnosis of this syndrome is mainly based of clinical presentation and needs to differentiate from other diseases. Their evolution is usually favorable or under corticosteroids, but some cases are severe and / or fatal. The study of their mechanism could lead to identify predictive markers, applicable to their early diagnosis and improved their management. Thus, we proposed to study the role of NK cell and T cell in the CAMELIA clinical trials which have conducted in Cambodia. The result showed that higher increase of NK cell degranulation capacity was associated with the occurrence of TB-IRIS and it could be a predictive marker. Furthermore, the hyperactivation of effector T cell and decrease of regulatory T cell were also observed. The implication of the regulatory T cell in this syndrome was not clear yet. The regulatory mechanism of this phenomenon should be further explored

La tuberculose (TB) est, hors COVID, la première cause de décès lié à un agent infectieux. La détermination rapide du profil de résistance complet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est essentielle pour démarrer un traitement adapté dans les cas de TB multirésistante (MDR) et ainsi limiter l’acquisition de résistances supplémentaires, augmenter les chances de succès thérapeutique et réduire la transmission de ces souches. Il existe 9 lignées principales au sein du complexe M. tuberculosis, dont 2 sont largement répandues dans le monde (L2 et L4). Au sein de la lignée 2, le clone W148 (ou complexe clonal CC 100-32) a diffusé récemment en Europe et en Asie. Cette diffusion pourrait s'expliquer par des mutations spécifiques au sein du génome.En premier lieu, nous avons étudié la technologie Deeplex Myc-TB pour détecter rapidement le génotype et la résistance des souches cliniques de Mtb MDR. Cette technologie, basée sur une PCR multiplex et un séquençage haut débit, détermine à la fois l’espèce (hsp65), le génotype (spoligotype) et la résistance à 13 antituberculeux de première et seconde ligne (18 cibles). Le travail d’évaluation a inclus 112 prélèvements et 94 souches adressés au Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). Nous avons observé que le test Deeplex Myc-TB fonctionne sur prélèvement positif à l’examen microscopique et sur souche. Les profils de résistance obtenus sont concordants à 85,4% avec les résultats de la méthode phénotypique de référence. L'utilisation de Deeplex Myc-TB fournit des résultats en une dizaine de jours, soit environ 6 semaines avant ceux de l’antibiogramme phénotypique. Deeplex Myc-TB permet donc d’adapter l’antibiothérapie bien avant que ce qui était fait jusqu’à présent, pour le bénéfice des patients. Nous avons ainsi pu valider cet outil maintenant utilisé en routine au CNR MyRMA. Nous avons ensuite étudié les mutations spécifiques du CC 100-32 MDR. L’analyse du génome complet de 36 souches reçues au CNR MyRMA a permis d’identifier 30 mutations non synonymes et petites délétions spécifiques. Parmi elles, nous avons choisi d’étudier celles présentes dans kdpD et whiB6, car des données de la littérature semblent montrer un impact de ces gènes sur la virulence de la souche. KdpDE est un système à deux composants régulant l’expression du système de transport du potassium inductible KdpFABC. La mutation présente dans le complexe CC 100-32 MDR est une délétion de 2 nucléotides à la fin du gène kdpD entraînant une protéine de fusion KdpDE. Nous avons donc construit un tel mutant chez Mtb H37Rv en supprimant les deux gènes kdpD et kdpE avant de le complémenter avec la forme sauvage ou mutée de kdpDE. Nous n’avons pas observé de différence de croissance in vitro des différentes souches, y compris en l’absence de potassium, suggérant que KdpDE n’est pas essentiel pour le fitness de la bactérie en présence et absence de potassium. L’étude de l’impact de la délétion sur l’activité transcriptionnelle et la virulence est en cours. D’autre part, WhiB6 est un facteur de transcription qui régule le système ESX-1, nécessaire à la virulence. Des travaux du laboratoire ont permis d'obtenir le mutant ∆whiB6 et les souches complémentées WT et mutée (T51P) et leur ré-analyse indique que la souche mutée T51P entraîne une production d’ESAT-6 et de cytokines pro-inflammatoires plus faible que la souche sauvage ; nous réalisons actuellement une analyse du transcriptome. Les premiers résultats obtenus semblent indiquer que la mutation T51P dans WhiB6 entraîne moins de virulence et d’inflammation. Ce travail a permis de valider un outil maintenant indispensable au diagnostic des TB MDR en routine au CNR MyRMA et d’étudier la diffusion d’un clone MDR à travers les fonctions de deux facteurs de transcription impliqués dans la virulence
Tuberculosis (TB) is, excluding COVID, the leading cause of death linked to an infectious agent. Rapid determination of the full resistance profile of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is essential to initiate appropriate treatment of multidrug resistant (MDR) cases, thereby limiting the acquisition of additional resistance, increasing the chances of therapeutic success and reducing transmission of these strains. There are 9 main lineages within the M. tuberculosis complex, 2 of which are widespread throughout the world (L2 and L4). Within lineage 2, the clone W148 (or clonal complex CC 100-32) has recently spread to Europe and Asia. This spread could be explained by specific mutations within the genome.First, we investigated the Deeplex Myc-TB tool for rapid detection of genotype and resistance in clinical Mtb MDR strains. The Deeplex Myc-TB technology, based on multiplex PCR and high-throughput sequencing, determines species (hsp65), genotype (spoligotype) and resistance to 13 first- and second-line anti-tuberculosis drugs (18 targets). Our evaluation included 112 samples and 94 strains sent to the Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). We have observed that the Deeplex Myc-TB test is efficient on microscopically positive samples and strains. The resistance profiles obtained are 85.4% concordant with the results of the phenotypic reference method. The use of Deeplex Myc-TB provides results within ten days, and around 6 weeks before those of the phenotypic antibiogram. Deeplex Myc-TB can therefore be used to adapt antibiotic therapy much earlier than was previously possible, to the patient benefit. We were thus able to validate this tool, which is now routinely used at CNR MyRMA. We next studied mutations specific to CC 100-32 MDR. Genome-wide analysis of 36 strains received at CNR MyRMA identified 30 non-synonymous mutations and small deletions specific to CC 100-32 MDR strains. Among these, we chose to study mutations present in kdpD and whiB6, as data in the literature indicated an impact of these genes on the virulence of the strain. On the one hand, KdpDE is a two-component system regulating expression of the inducible potassium transport system KdpFABC. The mutation present in the CC 100-32 MDR complex is a 2-nucleotides deletion at the end of the kdpD gene, resulting in a KdpDE fusion protein. We therefore constructed such a mutant in Mtb H37Rv by deleting both the kdpD and kdpE genes before complementing it with the wild-type or mutated form of kdpDE. We observed no difference in the in vitro growth of the different strains, even in the absence of potassium, suggesting that KdpDE is not essential for bacterial fitness in presence or absence of potassium. The impact of the deletion on transcriptional activity and virulence is currently being studied. On the other hand, WhiB6 is a transcription factor that regulates the ESX-1 system, necessary for virulence. Work from the laboratory generated a ∆whiB6 mutant and the complemented WT and mutated (T51P) strains and their re-analysis indicated that T51P mutant strain produces less ESAT-6 and pro-inflammatory cytokines than the wild-type strain. Our transcriptome analysis of these strains is currently underway. Initial results suggest that the T51P mutation in WhiB6 results in less virulence and inflammation. This work has validated a tool that is now essential for routine diagnosis of MDR TB at CNR MyRMA, and to study the spread of an MDR clone through the function of two transcription factors involved in virulence

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent de la tuberculose humaine, possède une enveloppe cellulaire atypique contenant une grande variété de lipides spécifiques, certains d'entre eux étant essentiels pour la viabilité du bacille tuberculeux ou impliqués dans sa pathogénicité. La synthèse de ces lipides fait intervenir des enzymes multifonctionnelles qui doivent être activées par fixation covalente d'un groupement 4'-phosphopantethéïnyl (P-pant). Cette modification post-traductionnelle est catalysée par la 4'-phosphopantethéïnyl transférase PptT qui transfère le groupement P-pant du coenzyme A sur un des domaines de ces protéines. Au cours de ce travail, nous avons démontré que PptT constitue une cible pour le développement de nouveaux antituberculeux. La construction de souches recombinantes de M. Bovis BCG et de Mtb exprimant PptT de façon conditionnelle nous a permis d'établir que cette enzyme est requise pour la croissance et la survie mycobactérienne dans le macrophage et au cours des diverses phases de l'infection dans le modèle murin. Un test enzymatique in vitro basé sur l'activité catalytique de PptT a été développé et adapté au criblage haut-débit de chimiothèques, afin de chercher des inhibiteurs de la protéine. Nous avons également montré que l'activité de l'enzyme PptT peut être inhibée par des petites molécules. En conclusion, cette étude indique que PptT répond à toutes les exigences pour être une bonne cible pharmacologique et fournit de nouveaux outils pour la recherche d'inhibiteurs de cette enzyme. Ces travaux suggèrent également que certains lipides de l'enveloppe pourraient jouer un rôle pour la persistance de Mtb au sein de l'hôte
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the etiologic agent of human tuberculosis, displays an unusual cell envelope that contains a large variety of lipids with unusual structures, some of them essential for the bacterial viability and others important for pathogenicity. The synthesis of these lipids involves multifunctional enzymes that are only functional if converted from their inactive apo-forms to their active holo-forms by the covalent attachment of a 4'-phosphopantetheinyl (P-pant) group. This modification is achieved through the action of a 4'-phosphopantetheinyl transferase named PptT, which transfers the P-pant moiety of coenzyme A to a conserved domain of these proteins. In this study, we investigated whether PptT represents a novel drug target for treating tuberculosis. The construction of pptT conditional expression mutants of M. Bovis BCG and Mtb enabled us to demonstrate that PptT is required for mycobacterial growth and survival in several environments, including those encountered in macrophages, and during the various stages of infection in the mouse model. An in vitro enzymatic assay based on the catalytic activity of PptT has been developed and adapted to high throughput screening for the search of PptT inhibitors. Finally, we found that the enzyme PptT can be inhibited by small compounds. Altogether, our findings indicate that PptT meets all the requirements for a good drug target and provide tools for the search of inhibitors against this enzyme. Besides, these results suggest that some polyketide-derived lipids may be required for Mtb persistence within the host

La pharmacomodulation des molécules biologiquement actives par l’introduction d’une entité organométallique telle que le ferrocène constitue une alternative très intéressante pour pallier aux problèmes de recrudescence des résistances aux antipaludiques. Ce travail de thèse est centré sur la conception, la synthèse et l’activité antiplasmodiale de nouveaux composés ferrocéniques. Quatre familles de molécules ont été modifiées structuralement par l’introduction d’un motif ferrocénique. Ainsi, les aminohydroxynaphtoquinones (analogues de l’atovaquone), les hydrazones quinoléiques et acridiniques, les 4-aminoquinoléines (analogues de la chloroquine) et les benzodiazépines (dérivés du flurazepam) ferrocéniques ont été synthétisées. Les études biologiques d’inhibition de la croissance de P. falciparum sur des clones de laboratoire et des isolats cliniques gabonais ont abouti à des résultats très prometteurs, notamment pour la famille des 4-aminoquinoléines ferrocéniques. L’activité cytotoxique et l’indice de sélectivité de ces composés ont également été étudiés et ainsi permis de dégager des candidats médicaments pour un prochain développement
Pharmacomodulation of biologically active drugs by the introduction of an organometallic entity such as ferrocene constitutes a very interesting alternative to compensate the problematic increase of antimalarial drug resistances. This PhD work is focused on the design, the synthesis and the study of antiplasmodial activity of new ferrocenyl compounds. For this purpose, four families of drugs containing a ferrocenyl entity were synthesized and studied for the first time. Thus, several aminohydroxynaphthoquinones (Atovaquone analog), quinolinyl- and acridinylhydrazones, 4-aminoquinolines (Chloroquine analog) and benzodiazepines (Flurazepam analog) were designed and obtained in good conditions. The ferrocenyl derivatives were evaluated for their antimalarial activity in vitro upon Plasmodium falciparum strains and gabonese clinical isolates. Some of these synthesized compounds have displayed very promising results, in particular for the ferrocenyl 4-aminoquinolines derivatives. The cytotoxic activity and the selectivity index of these compounds have indicated some of them as promising candidates for further development