Dissertations / Theses on the topic 'Expansão celular'

As células estromais mesenquimais (CMMs) se tornaram de grande interesse para a terapia celular devido ao seu potencial de se diferenciar e reconstituir tecidos especializados. Mais recentemente, este interesse tem aumentado significativamente devido à descoberta de que as CMMs são capazes de secretar uma infinidade de mediadores para estimular a regeneração in situ de tecidos lesados. Dessa forma, CMMs podem ser consideradas tanto como um produto terapêutico em si, quanto uma biofábrica de diversas proteínas relevantes do ponto de vista terapêutico. Para atender a estas crescentes demandas, ambas as aplicações requerem o desenvolvimento de processos de expansão celular com alto rendimento, sob condições de cultivo definidas, reprodutíveis, escalonáveis, permitindo a obtenção de produtos com adequada identidade, potência, pureza, segurança e viáveis economicamente. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivos principais o estabelecimento de um processo de expansão de CMMs baseado em biorreatores e a caracterização do secretoma destas células visando aplicações terapêuticas. Para isto, a expansão de CMMs do cordão umbilical (MCUs) foi realizada em frascos multicamadas (MC) e nos biorreatores de leito fixo (LF), tanque agitado com microcarregadores (TA) e fibrasocas (FO). Os resultados mostraram que a taxa de proliferação específica das células foi maior (< tempo de duplicação) no biorreator de FO (36,8 ± 1,7 horas), bem como o fator de expansão (9,8 ± 1,0) e a eficiência na recuperação celular (100%). Um nível similar de produção celular foi observado para o TA, MC e LF com elevado fator de expansão celular (8,8 ± 0,39, 8,7 ± 0,90, 6,9 ± 1,3, respectivamente). No entanto, em termos de eficiência na recuperação celular (%), LF apresentou a menor taxa de recuperação dentre todos os sistemas (18% (± 0,77)), acompanhado pelo TA (61% (± 15,7)). As células mantiveram suas características imunofenotípicas e o potencial de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos em todos os sistemas de cultivo avaliados. Foi também realizada a análise de custos (COG) e avaliação da viabilidade econômica para produção de CMMs visando tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) em escala comercial, utilizando os sistemas de cultivo avaliados experimentalmente sob diferentes estratégias de reembolso. Apesar dos resultados experimentais satisfatórios para o biorreator FO, o COG revelou que este sistema tem o maior custo devido aos elevados custos dos consumíveis requeridos e do custo do equipamento. O frasco MC foi considerado como a tecnologia mais rentável e robusta no cenário avaliado e o biorreator TA obteve a segunda posição. O biorreator TA foi escolhido como o mais adequado analisando de maneira conjunta os dados experimentais obtidos, a análise dos custos dos diferentes sistemas de cultivo e a escalonabilidade de cada sistema. Assim, esse biorreator foi eficientemente utilizado para o cultivo de MCUs em condições isentas de SFB e xenoantígenos, sendo possível a produção de uma grande quantidade de células, representando um passo importante no desenvolvimento de um bioprocesso em conformidade com as normas das agências regulatórias. Por fim, com a análise do secretoma das CMMs por espectrometria de massas foi possível a identificação de uma gama enorme de proteínas interessantes (aprox. 2400) envolvidas em importantes processos biológicos. O futuro monitoramento dessas proteínas em biorreatores poderá representar um método inovador e original de produção de produtos livres de células para uso na terapia celular.<br>Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) have become of great interest for cell therapy because of its potential to differentiate and reconstitute specialized tissues. More recently, such interest has significantly increased due to the discovery that MSC are capable of secreting a plethora of mediators to stimulate the in situ regeneration of injured tissues. Thus, MSC can be considered as a therapeutic product itself and as a biofactory of various relevant therapeutic proteins. To meet these increasing demands, both applications require the development of high-yield, reproducible, scalable and cost-effective bioprocesses under defined culture conditions, obtaining products with proper identity, purity and safety. Based on these, the main goal of this work was the establishment of a MSC expansion process based on bioreactors and secretome characterization of these cells targeting therapeutic applications. The MSC expansion was performed using multi-layered flasks (ML) and fixed bed (PB), stirred tank (STR) and hollow fiber (HF) bioreactors. The results showed that the proliferation rate of the cells was higher (< doubling time) in the HF bioreactor (36.8 ± 1.7 hours), as well as the expansion fold-increase (9.8±1.0) and harvesting efficiency (100%). A similar level of cell production was observed for STR, ML and PB with high fold-increase (8.8±0.39, 8.7±0.90, 6.9±1.3, respectively). However, in terms of harvesting efficiency (%), PB bioreactor presented the lowest retrieval rate across all the technologies (18% (±0.77)), followed by STR (61% (±15.7)). The cells retained their functional properties after culture in all the culture systems evaluated. This study was then extended through the use of a bioprocess economics tool for the evaluation of the economic feasibility of producing MSC-based treatment for acute graft vs. host disease (aGvHD) at commercial scale, using the culture systems experimentally evaluated under different reimbursement strategies. Despite the advantageous experimental results of HF bioreactors, the COG analysis has revealed that this is the least cost effective cell culture system to be used, due to its high consumable and equipment costs. ML flasks ranked first as the most cost effective and robust technology in this scenario and microcarrier-based technologies (STR) ranked in second position. The STR bioreactor was chosen as the most suitable for MSC expansion analyzing the experimental data, COG analysis and scalability of each culture system. Thus, STR bioreactor was efficiently tested for MSC expansion under serum and xeno-free conditions and it was possible to produce a large amount of cells. The development of a scalable microcarrier-based stirred culture system using xeno-free culture medium that suits the intrinsic features of UCM-derived MSC represents an important step towards a GMP compliant large-scale production platform for these promising cell therapy candidates. Finally, with the MSC secretome analysis by mass spectrometry it was possible to identify a wide range of interesting proteins (approx. 2400) involved in important biological processes. The future monitoring of these proteins in bioreactors may represent a novel and unique method of producing cell-free products for use in cellular therapy.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DAIANA MILENA BRONOSKI DE FREITAS.pdf: 2016794 bytes, checksum: 8e2142b92df2ebbcad8ab16140dd6d3b (MD5) Previous issue date: 2014-06-10<br>The mesenchymal stem cells ( MSCs ) are a population of tissue -resident adult cells that have the capacity for self-renewal and differentiation into different cell types of mesenchymal origin with great potential for application in cell therapies. Thus the work proposed to obtain, expand and cultivation of MSCs from subcutaneous adipose tissue, visceral mesenteric and omental visceral taken from the same individual . The technique of mechanical dissociation was used, in order to investigate new sources for obtaining MSCs by this simple and cheap method. The samples were collected from patients undergoing bariatric surgery, between 30 to 45 years old, obese patients with associated diseases. Among 10 collected samples it was possible to measure cell viability from 4 patients. The tissue showed higher cell rate was the visceral tissue of omentum. In tests cryopreservation, the substance showed cryoprotectant capacity was 81% dimethylformamide at a concentration of 5% DMSO solution in a concentration of 5% 49% success was obtained.<br>As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população residente em tecidos como medula óssea e tecido adiposo. Devido á baixa porcentagem destas células presentes em medula (0,01 – 0,001%), a fonte de maior utilização, se faz necessária à busca de novas fontes para utilização em terapia celular. Desta forma o trabalho propôs-se a obtenção, expansão, cultivo e criopreservação das CTMs a partir de tecido adiposo subcutâneo, visceral mesentérico e visceral de omento retirados de um mesmo indivíduo. Utilizou-se a técnica de dissociação mecânica, a fim de investigar novas fontes de obtenção de CTMs por essa metodologia simples e barata. As amostras foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia bariátrica, entre 30 a 45 anos, pacientes obesos e com doenças associadas. De 10 amostras coletadas foi possível o isolamento e expansão celular de 40% dos pacientes. O tecido que apresentou maior taxa celular foi o tecido visceral de omento. Nos ensaios de criopreservação, a substância que apresentou capacidade crioprotetora de 81% foi a Dimetilformamida em concentração de 5%, a solução de DMSO em concentração 5% obteve 49% de sucesso.

Orientador: Rafael Dias Loyola<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-23T15:32:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sant'Anna_ClaraLuzBraga_M.pdf: 15999631 bytes, checksum: d43098e998277d4decc83772d68234c2 (MD5) Previous issue date: 2013<br>Resumo: O processo de invasão biológica por espécies exóticas pode levar a substituição de espécies nativas. Este processo é crítico quando ocorre no interior de Unidades de Conservação (UC). Para entender a dinâmica de invasão e expansão das espécies invasoras é necessário levar em conta as características da espécie invasora associadas às características abióticas e bióticas dos ecossistemas invadidos, o fator temporal e mecanismos específicos a cada sistema. Estudamos através de análises exploratórias e modelos de simulação em Autômato Celular, o processo de expansão da Brachiaria spp. no Parque Nacional das Emas (Parna Emas), uma das mais importantes Unidades de Conservação do Cerrado. Utilizamos dados da distribuição espaço-temporal da gramínea dos anos de 2002 e 2012, em 80 Km das estradas internas do parque (25% das estradas) para associar a expansão às variáveis ambientais: distância relativa à margem das estradas internas do parque, categoria de zoneamento, tipo de fitofisionomia de Cerrado e declividade. Os fatores ambientais mais relevantes no processo de expansão da Brachiaria spp. foram: as estradas internas do Parna Emas, cuja presença e alta freqüência de uso influenciam positivamente a expansão da gramínea, e em áreas com intenso tráfego de veículos a abundância da Brachiaria spp. foi dez vezes maior que em áreas onde o acesso é restrito; a disponibilidade de luz e espaço foram fatores limitantes à expansão, áreas de fitofisionomias abertas de Cerrado, como Campo Limpo, mostraram ser mais susceptíveis a invasão, com expansão até vinte vezes maior que áreas florestais; e a declividade, mesmo sutil, pareceu direcionar a expansão da gramínea para regiões de menor altitude. Assim indicamos algumas medidas de manejo: restringir ao máximo o uso das estradas internas do Parna Emas, aplicar medidas fitossanitárias nos veículos, botas e vestimentas de funcionários e visitantes, a fim de inviabilizar as sementes dispersadas por estes, priorizar o manejo em áreas de Campo Limpo, em especial uma região no centro do Parna Emas que pode estar funcionando como fonte interna de sementes, e recomendamos atenção aos locais em declividade, de modo a prever a direção da expansão e assim tomar as medidas preventivas cabíveis. Esperamos assim que nosso estudo contribua para o desenvolvimento de melhores políticas e ações de monitoramento, manejo e controle de Brachiaria spp. em Unidades de Conservação, em geral, e no Parque Nacional das Emas, em particular<br>Abstract: The process of biological invasion by exotic species may lead to replacement of native species. This process is critical when it occurs within Protected Areas (PA). To understand the dynamics of invasion and spread of invasive species is necessary to take into account the characteristics of invasive species associated with abiotic and biotic characteristics of invaded ecosystems, the temporal issue and specific mechanisms to each system. We study by exploratory analyzes and Cellular Automaton simulation models, the expansion process of Brachiaria spp. in Emas National Park (Parna Emas), one of the most important Protected Areas of the Cerrado. We used data from spatial-temporal distribution of this species with a time lag of 10 years among them (2002 and 2012), over 80 km of internal roads of the Parna Emas (25% of the roads) to link the expansion of this invasive grass to environmental variables such as: relative distance along the sideroads inside the park, category of zonation, type of Cerrado vegetation and slope. The results indicate that the most important environmental factors in the expansion process of Brachiaria spp. where: the internal roads of the Parna Emas, whose presence and high frequency of use positively affect the growth of the grass, and in areas with intense vehicle traffic the abundance of Brachiaria spp. was ten times higher than in areas where access is restricted; light availability was the limiting factor to expansion, so that areas of open Cerrado physiognomies as Campo Limpo, proved to be more susceptible to invasion, with expansion up to twenty times greater than forested areas; and the slope, even subtle (about 1 degree), seemed drive the expansion of grass to the lower areas. From these results we point out some management measures such as: restricting the most the use of internal roads of Parna Emas and apply phytosanitary measures in vehicles, boots and clothing of staff and visitors in order to make impracticable the seeds dispersed by them; prioritize management in areas of Campo Limpo, one in particular placed in the center of Parna Emas that may be functioning as internal source of seeds; and we recommend paying attention to the places in declivity, in order to predict the direction of expansion and thus take the necessary preventive measures. We thus hope that our study will contribute to the development of better policies and actions of monitoring, management and control of Brachiaria spp. in Protected Areas, in general, and in Emas National Park in particular<br>Mestrado<br>Ecologia<br>Mestra em Ecologia

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal.<br>RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.

Anexos fetais como cordão umbilical, membrana amniótica e líquido amniótico foram recentemente sugeridos como fontes ideais de diferentes linhagens de células-tronco, devido à natureza não invasiva do procedimento de isolamento, a grande massa de tecido para colheita de células com alta eficiência e os potenciais de diferenciação. Portanto, o presente estudo teve como objetivo analisar morfologicamente as membranas extraembrionárias através de microscopia de luz e imunohistoquímica e analisar as células oriundas do saco vitelino suíno visando caracterizar qual seu potencial como possível fonte de células-tronco pluripotentes, para futuro uso na terapia regenerativa. Para a imunohistoquímica das membranas, as membranas foram processadas pelas técnicas rotineiras de histologia e em seguida os blocos foram cortados sequencialmente e colocados em laminas previamente silanizadas, o protocolo de imunohistoquímica foi o convencional utilizando os seguintes anti-corpos: Citoqueratina e VEGF. Foram feitos ensaios de concentração e viabilidade celular, avaliação do crescimento celular, caracterização por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos (CD105, NANOG, CD45 e Oct-3/4) e caracterização por imunohistoquímica utilizando os seguintes anti-corpo: CD90, CD105, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina e PCNA. O saco vitelino situava-se na porção ventral do embrião, próximo ao cordão umbilical, se mostrando como uma estrutura pequena, contendo poucos vasos e com coloração amarelada, este também apresentou como uma estrutura trilaminar (endoderma, mesênquima e mesotélio), onde a endoderme possuía um epitélio simples cubico, o mesênquima possuindo uma grande quantidade de tecido conjuntivo e o mesotélio contendo células achatadas. O amnio mostrou-se ligado intimamente ao embrião, sendo a primeira membrana fetal considerando a ordem embrião/útero, possuía forma oval e coloração transparente, histologicamente esta membrana é composta por 2 camadas distintas, um epitélio simples pavimentoso e um mesênquima contendo uma substancia amorfa com pouca quantidade de células. A membrana coriônica mostrou-se pouco rugosa e a membrana alantóidea como uma estrutura em forma de meia lua, possuindo uma intensa vascularização, conforme a evolução da gestação fica quase impossível à percepção das duas, formando a membrana córioalantoidea. O córion é constituído por uma camada de células arredondadas, dispostas em formato linear, já o alantoide é caracterizado por seu mesênquima amorfo com uma quantidade pequena de células. Em relação a imunohistoquima todas as membranas expressaram os marcadores VEGF e Citoqueratina. As celulas do saco vitelino mostraram aderência ao plástico e possuindo uma morfologia fusiforme, semelhante a fibroblastos, estas atingiram a confluência de 70% em aproximadamente 20 dias, estas celulas foram mantidas ate a passagem 4, onde posteriormente ocorreu morte celular. Estas celulas possuíam imunofenoipagem semelhante as celulas-tronco mesênquimais e hematopoiéticas, expressando marcadores como CD105, CD90, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina, Nanog e PCNA. Do estudo realizado pode-se concluir que: existem células especificas em cada membrana extraembrionária, e que as celulas oriundas do saco vitelino possuem características semelhantes as celulas-tronco mesênquimais e embrionárias, sendo considerada uma ferramenta importante para futuros estudos experimentais de terapia celular na medicina veterinária regenerativa.<br>Fetal attachments as umbilical cord, amnion and amniotic fluid have recently been suggested as ideal sources of different strains of stem cells, due to the noninvasive nature of the isolation procedure, the large mass of tissue to harvest cells with high efficiency and potential differentiation. Therefore, this study aimed to analyze morphologically membranes extraembryonic by light microscopy and immunohistochemistry and analyze the cells from the yolk sac to characterize this cells as to potential as a possible source of pluripotent stem cells for future use in regenerative therapy. For immunohistochemistry, the membranes were processed by routine histological techniques, and then the blocks were cut sequentially and placed on silanized slides previously, the protocol was the immunohistochemistry conventional using the following antibodies: Cytokeratin and VEGF. Trials were made for concentration and cell viability, cell growth evaluation, and the characterization by flow cytometry using specific antibodies (CD105, NANOG, CD45 and Oct-3/4) and characterization by immunohistochemistry using the following antibody: CD90, CD105, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, beta tubulin, Cytokeratin and PCNA. The yolk sac stood in the ventral portion of the embryo near the umbilical cord, proving how a structure small, few vessels and with yellowed, this also presented as a trilaminar structure (endoderm, mesenchyme and mesothelium), where the endoderm had a simple cubic epithelium, the mesenchyme with a large amount of connective tissue and the mesothelium with flattened cells. The amnio shown to be deeply linked to the embryo, being the first membrane fetal considering the order embryo/uterus, and had oval-shaped transparent coloring, histologically this membrane is composed of two distinct layers, a simple squamous epithelium and mesenchyme containing an amorphous substance with a small amount of cells. The chorionic membrane showed little wrinkles and alantoic membrane structure as a crescent-shaped, having an intense vascularization, and the evolution of the pregnancy is almost impossible the perception of the two, forming the membrane chorioallantoid. The corium is constituted by a layer of round cells, arranged in linear format, as the allantois is characterized by its mesenchyme amorphous with a small amount of cells. Relative to immunohistochemical all membranes expressing VEGF and cytokeratin markers. The yolk sac cells showed adherence to plastic and a spindle-like morphology, similar to fibroblasts, they reached confluence of 70% in about 20 days, these cells were maintained until passage 4, where later cell death occurred. These cells had similar imunofenoipagem the mesenchymal stem cells and hematopoietic cells expressing markers such as CD105, CD90, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulin, Cytokeratin, Nanog and PCNA. From the study it can be concluded that: there are specific cells in each extraembrionária membrane, and that the cells derived from the yolk sac have characteristics similar to mesenchymal stem cells and embryonic, and being considered an important tool for future experimental studies of cell therapy in medicine veterinary regenerative.

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros<br>Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1.<br>The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.

INTRODUÇÃO: As células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue do cordão umbilical (SCU) têm sido utilizadas com sucesso para o tratamento de doenças malignas e não malignas. No entanto, algumas unidades de SCU podem apresentar baixa quantidade de células nucleadas totais (CNT). Algumas abordagens têm sido sugeridas para evitar problemas em relação à baixa concentração de CTH no transplante, como a administração de duas unidades de SCU para o paciente e a expansão ex vivo de CTH. OBJETIVO: Avaliar as taxas de proliferação celular na expansão ex vivo do SCU em sistema de cocultura com células-tronco mesenquimais (CTM) obtidos a partir de diferentes fontes com alta e baixa confluência e adicionando-se ou não coquetel de citocinas no meio de cultura. MÉTODOS: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. A coleta do SCU (n =10) foi realizada após o nascimento do bebê e expulsão da placenta. O processamento foi realizado utilizando o método de redução de volume, o qual consiste em depleção de eritrócitos. As amostras de CTM provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical foram obtidas de doadores diferentes (n=3) e o tecido adiposo (n=3) do inventário do LIM-31. A expansão das CNT e das células com expressão de marcadores CD133+/CD34+ foram observados depois de sete dias de cultura. Além disso, o ensaio para análise de unidades de formadoras de colônias (UFC) foi realizado em todas as amostras antes e depois da expansão do SCU. Para a expansão em sistema de cocultura foi separado dois grupos para ambas as fontes de CTM (Grupo I - cocultura com adição de coquetel de citocinas vs. Grupo II - cocultura sem citocinas). RESULTADOS: Após sete dias, no grupo I com cocultura confluente, a taxa de proliferação de CNT foi duas vezes maior ao comparar com cocultura subconfluente (35 vs. 16 vezes). No mesmo grupo também foi possível evidenciar elevada taxa de proliferação de células CD133+/CD34+. O índice de proliferação das UFC no grupo I aumentou até oito vezes. A cocultura subconfluente tanto do endotélio vascular do cordão umbilical como do tecido adiposo apresentou menor rendimento em comparação as CTM confluentes. A expansão das células na presença de citocinas apresentou maior proliferação celular ao comparar às coculturas sem adição de citocinas. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou que para alto rendimento de células do SCU, o sistema de cocultura requer adição de coquetel de citocinas e CTM confluente independentemente da fonte utilizada<br>INTRODUCTION: Umbilical cord blood (UCB) hematopoietic stem cells have been successfully used for the treatment of both malignant and non-malignant diseases. Nevertheless, some UCB units could have low total nucleated cells (TNC) dose. Several approaches have been suggested to avoid inadequacy problems of hematopoietic stem cells (HSC) number for transplantation, such as administration of two UCB units to the patient and HSC ex vivo expansion. OBJECTIVE: Evaluate UCB ex vivo expansion proliferative rates in a high and low mesenchymal stem cells (MSC) confluence feeder layer obtained from different MSC sources and by adding or not cytokines cocktail into the medium. METHODS: This study was approved by the Research Ethic Committee (CAPPESQ) of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. The collection of UCB (n=10) was made after delivery of the infant and the expulsion of placenta. Processing was performed using volume reduction method which consists in red blood depletion. MSC samples from umbilical cord endothelium were obtained from three different donors and adipose tissue (n=3) obtained from LIM31\'s pattern inventory. The total nucleated cell (TNC), expression of hematopoietic surface markers such as CD133+/CD34+ were observed after seven days of culture. Beyond that, colony forming unit assay (CFU) was performed before and after UCB expansion. The expansion by coculture method was observed in two groups (Group I - coculture with cytokines cocktail added vs. Group II- coculture without cytokines cocktail) for both MSCs sources. RESULTS: After seven days, analysis of confluent coculture showed that TNC proliferation rate ware almost 2 times higher than in subconfluent coculture (35 vs. 16-fold) in Group I and also revealed higher proliferative rate in CD133+/CD34+ cells considering. CFU showed similar increase after seven days of culture in comparison of day 0 (up to 8-fold). Subconfluent coculture for both umbilical cord endothelium and adipose tissue showed lower yield compared with those with high MSC confluence. The expansion in the presence of cytokines showed higher cell proliferation compared to the cocultures without addition of cytokines. CONCLUSION: This study showed that coculture system may require the addition of cytokines cocktail in the media and confluent MSC regardless of source for high yield of UCB cells

Submitted by JOSÉ AUGUSTO RODRIGUES MASSABKI null (gutomassabki@hotmail.com) on 2018-03-08T14:58:18Z No. of bitstreams: 1 MASSABKI_JAR_DISSERTAÇÃO.pdf: 7122424 bytes, checksum: c08644632b83238ac437413218505331 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Maria Marlene Zaniboni null (zaniboni@bauru.unesp.br) on 2018-03-09T16:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 massabki_jar_me_bauru.pdf: 7023665 bytes, checksum: fcbeb68c217f697d59d1fb24a1c507b9 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2018-03-09T16:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 massabki_jar_me_bauru.pdf: 7023665 bytes, checksum: fcbeb68c217f697d59d1fb24a1c507b9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-01<br>O objetivo deste trabalho foi analisar os impactos da resolução espacial na modelagem da expansão urbana da Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) por meio de autômatos celulares (CA, do inglês: Cellular Automata) combinados com redes neurais artificiais. Para tanto, foram utilizados dados do perímetro urbanizado referentes aos períodos de 1881, 1905, 1929, 1949, 1974 e 2005 para a construção de uma série de modelos espaciais. Uma estrutura de células regulares (grid) foi concebida para se representar a área de estudo, cuja resolução espacial se baseou em células de 1.000 por 1.000 metros, 800 por 800 metros e 600 por 600 metros. Os modelos também levaram em consideração a combinação de variáveis representando o estado inicial da célula (urbana ou não urbana), o número de células vizinhas classificadas como urbanas e o número de células vizinhas classificadas como não urbanas. Os resultados mostraram que a variação da resolução espacial não proporcionou impacto significativo no desempenho das modelagens desenvolvidas, visto que os desempenhos obtidos a partir das diferentes estruturas e tamanhos de grid foram bastante similares. Há os destaques para o Grid de 1000 por 1000 metros, baseado no estado e no número de vizinhos urbanos, com 90,09% de acertos global; para o Grid de 800 por 800 metros, baseado no estado, no número de vizinhos urbanos e no número de vizinhos não urbanos, com 90,25% de acertos global; e finalmente, para o Grid de 600 por 600 metros, baseado no estado e no número de vizinhos urbanos, com 90,14% de acertos global. Na sequência, uma previsão de ocupação do território para 2030 foi avaliada para esses modelos em destaque, observando-se tanto padrões de expansão urbana orientados por infraestruturas, como processos de ocupação urbana em áreas impróprias. Em síntese, esse estudo demonstrou que um aparente aumento na resolução espacial do grid não produz efeitos positivos em relação a um aumento no desempenho dos modelos espaciais desenvolvidos neste trabalho. Dessa forma, o Grid de 1000 por 1000 metros pode servir como ferramenta nos processos de planejamento urbano conforme a metodologia empregada. Cabe ressaltar ainda que esse grid acaba tornando o processamento computacional mais leve, em função da menor quantidade de dados envolvidos.<br>The objective of this work was to analyze the impacts of the spatial resolution related to the urban expansion modeling of the Metropolitan Region of São Paulo (MRSP) by means of Cellular Automata (CA) combined with Artificial Neural Networks. Data regarding the urbanized perimeter in the periods of 1881, 1905, 1929, 1949, 1974 and 2005 were used for the construction of a series of spatial models. A grid of regular cells was conceived to represent the study area, whose spatial resolution was based on cells of 1,000 by 1,000 meters, 800 by 800 meters and 600 by 600 meters. The models also took into account the combination of variables representing the initial state of the cell (urban or non-urban), the number of neighboring cells classified as urban, and the number of neighboring cells classified as non-urban. The results showed that the variation on the spatial resolution did not result in a significant impact on the performance of the developed models, since they were quite similar across the different structures and grid sizes explored. There were some highlights, for example, the Grid of 1000 by 1000 meters, based on the state of the cell and the number of urban neighbors, with 90.09% of global correct predictions; the Grid of 800 by 800 meters, based on the state of the cell, the number of urban neighbors and the number of non-urban neighbors, with 90.25% of global correct predictions; and finally, the Grid of 600 by 600 meters, based on the state of the cell and number of urban neighbors, with 90.14% of global correct predictions. In the sequence, a forecast of the territorial occupation was simulated for year 2030 considering those highlighted models. The results showed some patterns of urban expansion oriented by infrastructures, as well as processes of urban occupation in inappropriate areas. In sum, this study demonstrated that an apparent increase in the spatial resolution of the grid does not produce positive effects in relation to an increase in the performance of the spatial models developed in this work. Therefore, the Grid of 1000 by 1000 meters can serve as a tool for urban planning processes according to the methodology used. It should also be noted that this grid ends up making the computational processing lighter, due to the smaller amount of data involved.

Nos últimos anos, o planeamento regional e urbano tem vindo a recorrer cada vez mais aos modelos dinâmicos de base técnica cada vez mais sofisticada para gerar cenários múltiplos de apoio à decisão no domínio do planeamento e gestão do território, permitindo antecipar cenários, minimizar problemas e maximizar ganhos. Com o desenvolvimento da geocomputação, verificou-se um acréscimo na disseminação das metodologias de análise espacial, que combinam abordagens recorrentes dos Sistemas de Informação Geográfica com outras emergentes, como o recurso à modelação com autómatos celulares. Estes modelos têm assumido um papel relevante no contributo para a leitura e interpretação das dinâmicas espaciais, permitindo, modelar e simular “comportamentos” de evolução e reacção dos territórios, ou seja, pode constituir uma ferramenta crucial para o apuramento das interpretações, explicações e prospecções territoriais. Nesta base, esta investigação tem dois objectivos fundamentais: o primeiro incide sobre questões de avaliação (intervenção versus resultantes) do planeamento territorial no concelho de Cabeceiras de Basto (Norte de Portugal) e a sua influência no crescimento urbano; o segundo, associado a este, passa pelo ensaio de metodologias de avaliação de tendências, através da simulação de cenários de expansão urbana, com recurso à modelação com autómatos celulares através do modelo SLEUTH, que permite a aferição de tendências de alterações do uso e ocupação do solo tendo em vista o contributo para uma melhor definição de instrumentos intervenção territorial.

Nos últimos anos, o planeamento regional e urbano tem vindo a recorrer cada vez mais aos modelos dinâmicos de base técnica cada vez mais sofisticada para gerar cenários múltiplos de apoio à decisão no domínio do planeamento e gestão do território, permitindo antecipar cenários, minimizar problemas e maximizar ganhos. Com o desenvolvimento da geocomputação, verificou-se um acréscimo na disseminação das metodologias de análise espacial, que combinam abordagens recorrentes dos Sistemas de Informação Geográfica com outras emergentes, como o recurso à modelação com autómatos celulares. Estes modelos têm assumido um papel relevante no contributo para a leitura e interpretação das dinâmicas espaciais, permitindo, modelar e simular “comportamentos” de evolução e reacção dos territórios, ou seja, pode constituir uma ferramenta crucial para o apuramento das interpretações, explicações e prospecções territoriais. Nesta base, esta investigação tem dois objectivos fundamentais: o primeiro incide sobre questões de avaliação (intervenção versus resultantes) do planeamento territorial no concelho de Cabeceiras de Basto (Norte de Portugal) e a sua influência no crescimento urbano; o segundo, associado a este, passa pelo ensaio de metodologias de avaliação de tendências, através da simulação de cenários de expansão urbana, com recurso à modelação com autómatos celulares através do modelo SLEUTH, que permite a aferição de tendências de alterações do uso e ocupação do solo tendo em vista o contributo para uma melhor definição de instrumentos intervenção territorial.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-27Bitstream added on 2014-06-13T19:22:36Z : No. of bitstreams: 1 rabelo_rn_dr_jabo.pdf: 419029 bytes, checksum: 56edeae338cf6c261ac2c73378a0f5ac (MD5)<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)<br>A contagem de células somáticas (CCS) do leite de tanques de expansão está relacionada com os índices de mastite no rebanho, enquanto a contagem bacteriana total (CBT) demonstra a higiene de ordenha e do ambiente em que os animais são alojados, além dos procedimentos de limpeza dos equipamentos de ordenha. Partindo dessa premissa, foram caracterizadas as qualidades celulares, microbiológicas, físicas e químicas de leites procedentes de tanques de expansão individuais no período de 2007 a 2011. Os resultados mostraram que para o ano de 2007, das 850 amostras analisadas, as CCS variaram de 5,3x105 céls.mL-1 (maio) a 1,1x106 céls.mL-1 (novembro) e para CBT variaram de 5,2x105 UFC.mL-1 (abril) a 1.,6x106 UFC.mL-1. Para 2008, das 892 amostras analisadas, as CCS variaram de 7,0x105 céls.mL-1 (abril) a 1,1x106 céls.mL-1 (outubro) e, para CBT variaram de 9,0x105 UFC.mL-1 (junho) a 1,8x106 UFC.mL-1 (abril). No ano de 2009 as CCS variaram de 6,7x105 céls.mL-1 (março) a 1,0x106 céls.mL-1 (fevereiro) e, para CBT variaram de 3,8x105 UFC.mL-1 (abril) a 1,7x106 UFC.mL-1 (janeiro). Para o ano de 2010, as CCS variaram de 5,6x105 céls.mL-1 (setembro) a 8,8x105 céls.mL-1 (novembro) e para CBT, variaram de 5,0x105 UFC.mL-1 (agosto) a 1,4x106 UFC.mL-1 (fevereiro). No ano de 2011, as variações foram de 5,1x105 céls.mL-1 (agosto) a 8,7x105 céls.mL-1 (janeiro) para CCS e para CBT essas variações foram de 4,6x105 UFC.mL-1 (maio) a 1,2x106 UFC.mL-1 (fevereiro). As CCS e CBT variaram na série histórica, com tendência à redução; o período de chuvas influenciou a incidência de CCS e CBT fora dos padrões da IN 51 e o período de chuvas e seca não interferiu nos parâmetros físicos e químicos em todos os anos pesquisados, com variações mínimas, mas dentro dos padrões estabelecidos pela legislação...<br>Bulk tank somatic cell count (SCC), milk tanks expansion is related to the indices of mastitis in the herd, while the total bacterial count (CBT) demonstrates the hygiene of milking and the environment in which animals are housed, in addition to procedures for cleaning of the equipment of milking. From this premise, we characterized the cellular, microbiological and physical-chemical quality properties of milk coming from individual bulk tanks in the period 2008 to 2010. The results showed that for the year 2007, the 850 samples analyzed, the CCS ranged from 526x10³ cels.mL-1 (May) to 1,065x10³ cels.mL-1 (November) and CBT varied from 517x10³ UFC.mL-1 (April) to 1,643x10³ UFC.mL-1. The results showed that for the year 2008, of 892 samples analyzed, SCC ranged from 696x10³ cells.mL-1 (April) to 1,102x10³ cells.mL-1 (october), and for TBC varied from 896x10³ CUF.mL-1 (June) to 1,781x10³ CUF.mL-1 (april). In 2009 the SCC ranged from 667x10³ cells.mL-1 (march) the 1,026x10³ cells.mL-1 (February) and for TBC ranging from 377x10³ CUF/ mL (april) to 1,746x10³ CUF.mL-1 (january). For the year 2010, the SCC ranged from 561x10³ cells.mL-1 (september) to 883x10³ cells.mL-1 (november) and TBC, ranged from 503x10³ UFC.mL-1 (august) 1,395x10³ CUF.mL-1 (february). In the year 2011, the variations were 5.1 x105 cels.mL-1 (August) the 8.7x105 cels.mL-1 (January) to SCC and for TBC these variations were 4.6x105 CFU.ml-1 (may) the 1.2x106 CFU.ml-1 (February). The SCC and TBC varied in historical series, with a tendency toward reduction; the rainy period influenced the incidence of SCC and TBC outside of the patterns of IN 51, and rain and dry period did not interfere with physical and chemical parameters in all the years surveyed, with minimal changes, but within the standards established by current legislation. The individual results... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Antonio Nader Filho<br>Coorientador: Iucif Abrão Nascif Júnior<br>Banca: Luciano Menezes Ferreira<br>Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago<br>Banca: Luiz Augusto do Amaral<br>Banca: Luiz Francisco Zafalon<br>Resumo: A contagem de células somáticas (CCS) do leite de tanques de expansão está relacionada com os índices de mastite no rebanho, enquanto a contagem bacteriana total (CBT) demonstra a higiene de ordenha e do ambiente em que os animais são alojados, além dos procedimentos de limpeza dos equipamentos de ordenha. Partindo dessa premissa, foram caracterizadas as qualidades celulares, microbiológicas, físicas e químicas de leites procedentes de tanques de expansão individuais no período de 2007 a 2011. Os resultados mostraram que para o ano de 2007, das 850 amostras analisadas, as CCS variaram de 5,3x105 céls.mL-1 (maio) a 1,1x106 céls.mL-1 (novembro) e para CBT variaram de 5,2x105 UFC.mL-1 (abril) a 1.,6x106 UFC.mL-1. Para 2008, das 892 amostras analisadas, as CCS variaram de 7,0x105 céls.mL-1 (abril) a 1,1x106 céls.mL-1 (outubro) e, para CBT variaram de 9,0x105 UFC.mL-1 (junho) a 1,8x106 UFC.mL-1 (abril). No ano de 2009 as CCS variaram de 6,7x105 céls.mL-1 (março) a 1,0x106 céls.mL-1 (fevereiro) e, para CBT variaram de 3,8x105 UFC.mL-1 (abril) a 1,7x106 UFC.mL-1 (janeiro). Para o ano de 2010, as CCS variaram de 5,6x105 céls.mL-1 (setembro) a 8,8x105 céls.mL-1 (novembro) e para CBT, variaram de 5,0x105 UFC.mL-1 (agosto) a 1,4x106 UFC.mL-1 (fevereiro). No ano de 2011, as variações foram de 5,1x105 céls.mL-1 (agosto) a 8,7x105 céls.mL-1 (janeiro) para CCS e para CBT essas variações foram de 4,6x105 UFC.mL-1 (maio) a 1,2x106 UFC.mL-1 (fevereiro). As CCS e CBT variaram na série histórica, com tendência à redução; o período de chuvas influenciou a incidência de CCS e CBT fora dos padrões da IN 51 e o período de chuvas e seca não interferiu nos parâmetros físicos e químicos em todos os anos pesquisados, com variações mínimas, mas dentro dos padrões estabelecidos pela legislação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: Bulk tank somatic cell count (SCC), milk tanks expansion is related to the indices of mastitis in the herd, while the total bacterial count (CBT) demonstrates the hygiene of milking and the environment in which animals are housed, in addition to procedures for cleaning of the equipment of milking. From this premise, we characterized the cellular, microbiological and physical-chemical quality properties of milk coming from individual bulk tanks in the period 2008 to 2010. The results showed that for the year 2007, the 850 samples analyzed, the CCS ranged from 526x10³ cels.mL-1 (May) to 1,065x10³ cels.mL-1 (November) and CBT varied from 517x10³ UFC.mL-1 (April) to 1,643x10³ UFC.mL-1. The results showed that for the year 2008, of 892 samples analyzed, SCC ranged from 696x10³ cells.mL-1 (April) to 1,102x10³ cells.mL-1 (october), and for TBC varied from 896x10³ CUF.mL-1 (June) to 1,781x10³ CUF.mL-1 (april). In 2009 the SCC ranged from 667x10³ cells.mL-1 (march) the 1,026x10³ cells.mL-1 (February) and for TBC ranging from 377x10³ CUF/ mL (april) to 1,746x10³ CUF.mL-1 (january). For the year 2010, the SCC ranged from 561x10³ cells.mL-1 (september) to 883x10³ cells.mL-1 (november) and TBC, ranged from 503x10³ UFC.mL-1 (august) 1,395x10³ CUF.mL-1 (february). In the year 2011, the variations were 5.1 x105 cels.mL-1 (August) the 8.7x105 cels.mL-1 (January) to SCC and for TBC these variations were 4.6x105 CFU.ml-1 (may) the 1.2x106 CFU.ml-1 (February). The SCC and TBC varied in historical series, with a tendency toward reduction; the rainy period influenced the incidence of SCC and TBC outside of the patterns of IN 51, and rain and dry period did not interfere with physical and chemical parameters in all the years surveyed, with minimal changes, but within the standards established by current legislation. The individual results... (Complete abstract click electronic access below)<br>Doutor

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T17:52:45Z No. of bitstreams: 1 luiz-antonio-da-cunha.pdf: 2013128 bytes, checksum: 0e5dc52de1e8d6ce612c04c856313ff7 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2012-11-14T17:52:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luiz-antonio-da-cunha.pdf: 2013128 bytes, checksum: 0e5dc52de1e8d6ce612c04c856313ff7 (MD5) Previous issue date: 2007<br>Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.<br>Um acordo internacional de transferência de tecnologia, firmado em 2003, entre a FIOCRUZ e a GlaxoSmithKline permitiu o acesso de Bio-Manguinhos a um moderno processo produtivo da vacina tríplice viral (TVV) contra o sarampo, a caxumba e a rubéola. A produção dessa vacina é parte do compromisso de Bio-Manguinhos com o programa nacional de auto-suficiência em imunobiológicos, tido como uma meta prioritária da política de saúde pública do governobrasileiro. A tecnologia aplicada para a produção da TVV envolve o uso de células MRC-5 como substrato celular para a produção de vírus vacinais da rubéola, particularmente da cepa Wistar RA27/3. A estirpe MRC-5 é reconhecida como um dos mais importantes substratos celulares para a produção de vacinas virais, e também tem sido adotada como modelo de estudo para senescência celular in vitro. A senescência celular é um estágio fisiológico complexo pelo qual, invariavelmente, qualquer população de células somáticas normais passa após atingir um determinado número de mitoses. Esseestágio fisiológico é caracterizado nas células diplóides pela contenção da capacidade de se multiplicar e pelo desenvolvimento de alterações morfológicas peculiares, especialmente quando cultivadas in vitro. Com o objetivo de aprimorar omonitoramento de estirpes de células diplóides humanas (HDCS – do inglês Human Diplóide Cells Strains) e contribuir para o estabelecimento da base de conhecimento necessário para a futura aplicação no processo de produção de TVV em Bio-Manguinhos, nós avaliamos culturas de células MRC-5 condicionadas com carnosina, em três diferentes aspectos: cinética de crescimento, propagação da cepa vacinal, Wistar RA27/3, do vírus da rubéola e a expressão do marcador biológico de senescência, a enzima β-galactosidase AS (β-gal AS). A avaliação do potencial antioxidante e antisenescente atribuído a carnosina, um dipeptídeo ubíquo à fisiologia de todos os animais superiores, sobre as células MRC-5 pode contribuir para aprimorar os procedimentos de qualificação e controle de células diplóides associados à produção de vacinas, e aindaservir para o desenvolvimento de novos produtos e a pesquisa científica. Aspectos dacinética de crescimento da cultura de células condicionadas com carnosina, observados neste estudo, são discutidos sob o ponto de vista da teoria do compromisso celular com a senescência. Todas as culturas de células MRC-5 avaliadas demonstraram a expressão da β-gal AS através do uso de X-Gal ou ONPG como substrato. Não encontramos variações no perfil de propagação de cepas vacinais do vírus da rubéola que possam ser associadas ao condicionamento das células MRC-5 com carnosina, nas condições testadas.<br>An international technology transfer agreement established between FIOCRUZ and GlaxoSmithKline in 2003, will provide Bio-Manguinhos with access to a modern manufacturing process for the production of the triple viral vaccine against measles, mumps and rubella (TVV). The production of TVV forms part of the Bio-Manguinhos commitment to the self-sufficiency national programin immunobiologicals, within the Brazilian government public health prioritized policies. The TVV technology employs diploid cells derived from normal human lung tissue(MRC-5) as the substrate for production of the attenuated rubella vaccine virus,Wistar RA27/3. The MRC-5 strain is one of the most important cellular substrates for viral vaccine manufacturing and in addition is widely used as a model for in vitrostudies of cell senescence. Cellular senescence is a physiological stage which normal somatic cells beyond certain duplication level go through, invariably. Such physiological stage is characterized by growth arrest and specific morphological changes, commonly, observed in diploid cells under in vitroculture environment. Aiming to contribute with the human diploid cells strains (HDCS) monitoring study and line up with the establishment of the necessaryknowledge base for the conduction of the TVV production process in Bio-Manguinhos, weevaluated MRC-5 cell cultures conditioned with carnosine under three different aspects: growth kinetics, propagation of the attenuated strain of rubella virus Wistar RA27/3 and the expression of the senescence bio-marker, SA β-Galactosidase. An evaluation of the antioxidant and antisenescence features attributed to carnosine, a dipeptide, ubiquitous to the physiology of all superior animals, over MRC-5 may contribute to the improvement of the qualification and control procedures in production of vaccines, product development and scientific research. Aspects of the growth kineticsof MRC-5 cells conditioned with carnosine observed in this study are discussed in relation to the cellular commitment theory. All MRC-5 tested demonstrated SA β-Galactosidase activity, as verified by enzyme processing of X-Gal or ONPG used as substrate. Additionally, no variations in the propagation profile of the attenuated rubella virus by treating cells with carnosine could be characterized in this study.

Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.<br>O estudo do endotélio corneano constitui uma importante plataforma para a evolução do tratamento das endoteliopatias oculares. As disfunções do endotélio corneano são a principal indicação para o transplante de córnea. O número reduzido de córneas disponíveis para transplante, bem como as dificuldades inerentes à quantidade de células e às suas condições de preservação em banco de olhos dificultam o processo de tratamento de doentes com perda de acuidade visual de origem corneana. Apesar dos largos anos de estudo do endotélio corneano, os avanços na compreensão deste tecido e das suas células são ainda restritos, acentuando a importância do seu estudo. Estes assuntos são detalhados no capítulo I no qual é realizada a contextualização teórica deste trabalho. No capítulo II, são descritos os objetivos do estudo exposto nesta dissertação sendo o objetivo primordial a expansão ex vivo das células de endotélio corneano, que se sabe, não apresentarem capacidade proliferativa, in vivo. Deste modo e com base na literatura, os trabalhos precedentes à presente dissertação passaram, inicialmente, pela otimização das condições de cultura celular até se obter um protocolo de cultura reprodutível, seguida de estudos de imunocitoquímica para análise das células das culturas obtidas. Considerando a natureza deste trabalho e com o propósito de facilitar a sistematização e a compreensão optou-se por descrever no capítulo IV as metodologias adotadas para o estabelecimento das culturas primárias e os respetivos resultados obtidos para cada procedimento. No capítulo V são descritos os estudos de imunocitoquímica que foram realizados com vista a caracterizar as culturas primárias obtidas, apresentando métodos e respetivos resultados. Este trabalho permitiu o estabelecimento de um protocolo reprodutível de obtenção de culturas primárias de células de endotélio corneano, sendo no capítulo 6 discutidos os aspetos mais relevantes e no capítulo VII enumeradas as principais conclusões. No futuro, perspetiva-se que este trabalho possa contribuir para a realização de estudos morfológicos e fisiológicos que poderão garantir melhor conhecimento das características das células de endotélio corneano, das suas funções enquanto tecido e potencial de aplicação em medicina regenerativa.