Dissertations / Theses on the topic 'Fragmentation de l'ADN'

L'étude de l'ionisation de molécules biologiques, bases de l'ADN et de l'ARN, par impact de protons (20-150 keV/uma) a été l'enjeu de ce travail. Les expériences développées ont permis d'étudier la fragmentation de l'uracile, la thymine, l'adénine et la cytosine sous impact de protons, et de développer une méthode de mesure de section efficace absolue des processus d'ionisation mis en jeu au cours de l'interaction proton-molécule cible.<br />Le dispositif expérimental développé a permis de séparer les contributions des deux processus d'ionisation de la molécule cible : l'ionisation directe et l'ionisation par capture électronique. Les spectres de masse correspondants, analysés événement par événement, ont été mesurés. Pour l'uracile, les rapports de branchement de ces deux processus ont été mesurés en fonction de la vitesse du projectile.<br />Nous avons développé la mesure de sections efficaces absolues pour le processus de capture électronique. Le taux de production d'atomes neutres par rapport au nombre de protons incidents a été mesuré pour les quatre molécules étudiées : uracile, cytosine, thymine et adénine, et ceci, pour différentes températures d'évaporation. Ce taux varie avec l'épaisseur de cible traversée par le faisceau de protons. Un dispositif de dépôt a été développé pour caractériser la densité moléculaire du jet gazeux des bases étudiées. L'étude théorique et expérimentale du débit total d'effusion et du profil du jet gazeux a permis de déduire l'épaisseur de cible traversée par le faisceau de protons. Ainsi, la section efficace absolue d'ionisation des quatre molécules biologiques isolées sous impact de protons d'énergie de 80 keV/uma a été déterminée.

Les rayonnements ionisants (RI) traversent les tissus humains, y déposent de l'énergie et la dissipent en fragmentant des molécules. Les fragments obtenus peuvent être mis en évidence par spectrométrie de masse. Malgré la quantité d'informations obtenue expérimentalement à partir du spectre de masse, l'expérience seule ne peut pas répondre à toutes les questions concernant les mécanismes de fragmentation des bases de l'ADN/ARN, et l'étude issue des méthodes quantiques est un complément précieux à ces informations. L'étude théorique permet de connaître les liaisons moléculaires rendues faibles dans chaque base par ionisation et ainsi de prévoir les mécanismes de fragmentation et les fragments produits. Le but de ce travail est d'étudier l'ionisation et les mécanismes de fragmentation de bases de l'ADN/ARN (Uracile, Cytosine, Adénine et Guanine) et d'identifier les cations correspondants à chaque pic des spectres de masse. Nous avons effectué nos calculs en utilisant la DFT avec la fonctionnelle PBE. Dans cette thèse, pour toutes les bases d'ARN, la réaction de rétro Diels-Alder est une des voies principales de dissociation (élimination de HNCO ou de NCO*) à l'exception de l'adénine qui n'a pas d'atome d'oxygène. La perte d'une molécule NH3 (NH2*) est aussi un chemin commun à toutes les bases contenant un ou plusieurs groupes amine. Egalement, la possibilité de la perte d'un hydrogène à partir des cations est également envisagée, ainsi que la dissociation de ces cations déshydrogénés et des bases protonées, en se limitant à l'uracile. Ce travail montre tout l'intérêt de l'apport de calcul (DFT) à l'interprétation des spectres de masse de bases de l'ADN

La spermatogenèse chez l'homme et chez les autres mammifères nécessite une température inférieure à la température du corps. Ainsi, une augmentation de la température des testicules produit des effets délétères sur la fertilité masculine. Une réduction de la concentration spermatique, de la mobilité, de la vitalité et de la morphologie des spermatozoïdes a été rapportée chez les animaux et les hommes lorsque le scrotum ou le corps étaient exposés à des températures plus élevées. Dans les modèles animaux, des températures supérieures à la normale entraîneraient des altérations de l'intégrité de la chromatine des spermatozoïdes conduisant à un retard du développement embryonnaire précoce, à une réduction du taux de grossesse et à des fausses couches. Dans ce contexte, nous avons étudié les effets d'une légère augmentation (+2 °C) de la température des testicules et des épididymes sur l'intégrité de la chromatine des spermatozoïdes chez les hommes. Nous avons mené un protocole expérimental chez 5 hommes féconds volontaires induisant une augmentation modérée de la température des testicules et des épididymes en remontant les testicules en position supra scrotale et en les maintenant dans cette position durant 15 heures par jour, pendant 120 jours consécutifs. Les paramètres spermatiques classiques ont été évalués selon les recommandations de l'OMS. L'indice de fragmentation de l'ADN du spermatozoïde (DFI) et la haute colorabilité de l'ADN (HDS) ont été analysés par le test du " Sperm Chromatine Structure Assay " (SCSA) et le test du bleu d'aniline a été utilisé pour évaluer la maturité de la chromatine. Les résultats du SCSA ont montré une augmentation significative du pourcentage de DFI et du pourcentage de HDS du sperme respectivement dès 20 jours (J20) et J34 d'hyperthermie. Les taux de DFI et de HDS sont restés plus élevés pendant les 120 jours d'hyperthermie comparés aux valeurs avant augmentation de la température (valeurs contrôles). Le test du bleu d'aniline a montré une augmentation non significative du pourcentage de spermatozoïdes avec une chromatine immature à J34 d'hyperthermie, atteignant une valeur significative à J73. Cette augmentation est demeurée constante pendant toute la durée d'hyperthermie traduisant un pourcentage de spermatozoïdes avec une chromatine immature supérieur à celui évalué avant hyperthermie. Après l'arrêt de l'hyperthermie, le DFI et le HDS sont revenus à leurs valeurs pré-exposition plus précocement (J73) que le pourcentage de spermatozoïdes avec une chromatine immature (J180). L'indice d'anomalies multiples (IAM) des spermatozoïdes est augmenté dès J9. La mobilité, la numération et la vitalité des spermatozoïdes ont été significativement diminuées par rapport aux valeurs avant hyperthermie, respectivement à partir de J20, J34 et J34 et sont restées diminuées pendant toute la durée de l'hyperthermie. Après l'arrêt de l'hyperthermie, tous les paramètres spermatiques sont revenus aux valeurs contrôles à partir de J73. Nous avons montré, pour la première fois chez l'homme, qu'une légère augmentation de la température des testicules et des épididymes a un effet sur l'intégrité de la chromatine du spermatozoïde avant même la baisse de la numération des spermatozoïdes. Compte tenu des résultats obtenus dans les modèles animaux, les résultats de ce protocole expérimental pose la question des conséquences possibles de l'altération de la chromatine sur le développement embryonnaire alors que les paramètres du sperme ne sont pas incompatibles avec une fécondation au cours de la contraception masculine, durant les phases de récupération et d'inhibition. De plus, nos résultats pourraient être d'intérêt en infertilité masculine, en assistance médicale à la procréation et dans les fausses couches à répétition<br>In man and other mammals, spermatogenesis is ensured at a temperature lower to body temperature. An increase in temperature has deleterious effects on male fertility. Reduced sperm out put, motility, viability and morphology have been reported in animals and men at higher than normal scrotal or body temperatures. Increased temperature caused alterations in sperm chromatin integrity resulting in retarded early embryo development, reduced pregnancy rates and miscarriages in animal models. In this context, for the first time in men, we investigated the effects of a mild increase (+2 °C) in testes and epididymal temperature on sperm chromatin integrity. We designed an experimental protocol to induce mild testes and epididymal hyperthermia in five healthy fertile volunteers. Testes were lifted up and maintained at supra scrotal position 15 hours daily for 120 consecutive days. Classical sperm parameters were assessed according to World Health Organization (WHO) guidlines. Sperm DNA fragmentation index (DFI) and high DNA stainability (HDS) were analysed by "Sperm Chromatin Structure Assay" (SCSA) and acid aniline blue staining technique was used to assess the sperm chromatin maturity. The results of SCSA showed a significant increase in the percentage of sperm DFI and HDS as early as day 20 (D20) and D34 respectively during hyperthermia which remained higher compared with the values before hyperthermia (controls) during the entire period of hyperthermia. Aniline blue test showed a non-significant increase in the percentage of sperm with immature chromatin as early as D34 during hyperthermia reaching significance at D73 and remained higher than control during the entire period of hyperthermia. After cessation of hyperthermia sperm DFI and HDS returned to the respective control values earlier (D73) than the percentage of aniline blue positive sperm (D180). Multiple anomalies index (MAI) of spermaozoa was significantly increased, compared to control, as early as D9 of hyperthermia and remained increased throughout the entire period of hyperthermia. Sperm motility, count, and viability were significantly decreased compared with the respective controls as early as D20, D34 and D34 respectively during hyperthermia and remained decreased during the entire hyperthermia period. After cessation of hyperthermia all parameters returned to respective control values at D73. We report, for the first time in men, that a mild increase in testes and epididymal temperature largely impaired sperm chromatin integrity before any drop in sperm count. Based on the results from animal models the findings of present experimental protocol raise the question of possible consequences of altered sperm chromatin integrity on embryo development when sperm parameters were compatible with natural fertilization during male contraception particularly during inhibition and recovery phases of spermatogenesis. Moreover, our results may have clinical implications in male infertility, repeated miscarriages as well as assisted reproductive technologies

L'actine est une protéine abondante dans le cytosquelette des eucaryotes qui se polymérise pour former des filaments. Ces filaments jouent un rôle fondamental dans de nombreux processus biologiques (contraction musculaire, division et motilité cellulaire, etc...). La dynamique d'assemblage et de désassemblage des filaments est sous le contrôle de plusieurs protéines associées à l'actine, en particulier l'ADF/cofiline. Cette protéine s'associe aux filaments et les fragmente, accélérant ainsi le désassemblage du cytosquelette d'actine. Au cours de cette thèse, nous avons développé des modèles mathématiques pour étudier l'effet de l'ADF/cofiline sur le cytosquelette d'actine. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la cinétique d'assemblage des filaments en présence d'ADF/Cofiline. Des simulations basées sur l'algorithme de Gillespie ont mis en évidence un équilibre dynamique dans lequel la polymérisation des filaments est contrebalancée par la fragmentation. Nous avons pu caractériser cet équilibre et comparer nos prédictions à des données in vitro obtenues dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Laurent Blanchoin (CEA/iRTSV/LPCV, Grenoble). Dans un second temps, nous nous sommes penchés sur la mécanique des polymères d'actine pour expliquer les bases physiques de la fragmentation. Un modèle mésoscopique du filament a permis de prouver l'existence d'un couplage entre les déformations en flexion et en torsion dans le filament. Ce couplage permet de convertir les fluctuations thermiques en un effort qui cisaille la section du filament, entraînant ainsi la fragmentation. Les résultats extraits de ces modèles ont donc permis d'améliorer notre compréhension de l'action d'ADF/cofiline sur le cytosquelette d'actine.

La revue de la littérature montre que la pulpe dentaire est une source utile pour le diagnostic des bactériémies, y compris en paléomicrobiologie. Les précédents travaux en paléomicrobiologie réalisés dans le laboratoire ont tous mis en évidence une amplification possible de courts ou très courts fragments d'ADN bactérien partant de l'hypothèse que l'ADN ancien est fragmenté. Dans le premier travail, le modèle expérimental de dégradation de l'ADN des macrophages murins J774 et de Mycobacterium smegmatis par la chaleur sèche à 90°C a montré une différence statistiquement significative (p &lt; 0.05) entre la vitesse de fragmentation de l'ADN bactérien et eucaryote. Ces résultats suggèrent que les diagnostics paléomicrobiologiques peuvent détecter des fragments plus longs d'ADN bactérien à partir des échantillons anciens. Dans un deuxième travail, un système de détection rapide de 7 agents pathogènes par PCR multiplex en temps réel a été utilisé pour détecter ces pathogènes suspectés à partir de la pulpe dentaire de 1192 dents anciennes collectées dans 12 charniers dont un localisé à Douai (1710 – 1712). Après la détection de Bartonella quintana dans ce charnier, les PCRs en temps réel emboîtées ultra-sensibles et la «PCR suicide» ont été utilisées pour confirmer la présence de Rickettsia prowazekii souche Madrid E génotype B dans 6/55 pulpes dentaires (11%) collectées de 6/21 squelettes (28.6%) de soldats à Douai. Ces résultats supportent l'hypothèse que le typhus a été introduit en Europe par les soldats espagnols au retour des conquêtes en Amérique<br>Reviewing the literature shows that dental pulp is a useful source for bacteremic and paleomicrobiological diagnoses. In the first work, an experimental model of DNA degradation of the murine macrophage cell line J774 and Mycobacterium smegmatis by exposure to 90°C dry heat showed a statistically significant difference (p &lt; 0.05) of fragmentation level between bacterial and eukaryotic DNA. These results suggest that paleomicrobiological diagnosis can detect more large fragments of bacterial DNA from ancient buried specimens. In the second work, a system of rapid detection of seven pathogens by multiplex real-time PCR was used for detecting suspected pathogens from dental pulp of 1192 ancient teeth collected from 12 multiple burials including a mass grave in Douai, 1710 – 1712. After the Bartonella quintana detection in this site, real-time nested PCR and ultra-sensitive “suicide PCR” were used to confirm the presence of Rickettsia prowazekii strain Madrid E genotype B in 6/55 dental pulp specimens collected from 6/21 (29%) skeletons of soldiers buried in Douai.These results support the hypothesis that typhus was imported into Europe by Spanish soldiers from America. In the last work, DNA extracted from 5 dental pulp specimens collected from multiple burials at Issoudun, 17th – 18th centuries, was analyzed by pyrosequencing which detected Yersinia pestis sequences in the metagenome. For paleomicrobiology, pyrosequencing is a sensitive technic which can be used as baseline test to detect both suspected and unexpected pathogens from ancient specimens. We named this new approach «paleometagenomics»

La toxine stable à la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) impliquée dans le développement de la diarrhée. Une étude antérieure par Goncalves et al. (2009) a démontré que les cellules ayant internalisé la toxine STb démontraient une morphologie qui rappelle l’apoptose. Le changement du potentiel membranaire observé par Goncalves et al. (2009) nous a incité à vérifier la capacité de la toxine STb à induire l’apoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsèque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont été traitées avec de la toxine purifiée pour une durée de 24 heures puis ells ont été récoltées et examinées pour des caratéristiques de l’apoptose. L’activation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a été observée dans les deux lignées cellulaires à l’aide des substrats fluorescents spécifiques pour chaque caspase. L’ADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a révélé une fragmentation lorsque migré sur gel d’agarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont été observées en microscopie à fluorescence suite à une coloration de l’ADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traitées avec des quantités croissantes de STb montrent une dose-réponse pour les deux lignées. L’activation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsèque de l’apoptose est activée dans les cellules HRT-18 et IEC-18. L’absence de l’activation de la caspase-8 démontre que la voie extrinsèque n’est pas impliquée dans la mort cellulaire médiée par STb.<br>Heat-stable toxin b (STb) is one of the toxins produced by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains implicated in the development of diarrhea. A previous study conducted by Goncalves et al. (2009) showed that cells having internalized STb toxin demonstrated apoptotic-like morphology. The change in the mitochondrial membrane potential observed by Goncalves et al. (2009) prompted us to verify the ability of STb toxin to induce apoptosis via the intrinsic pathway in HRT-18 and IEC-18 cells. Both cell lines were treated with purified STb toxin for a period of 24 hours, harvested, and examined for apoptotic features. Activation of caspases-9 and -3, but not -8, was observed in HRT-18 and IEC-18 cells as determined with the use of fluorescent substrates specific to each caspase. Extracted DNA revealed DNA laddering when migrated on agarose gels. Nuclear condensation and fragmentation of Hoechst 33342 stained DNA of HRT-18 and IEC-18 cells were visualized by fluorescence microscopy. Apoptotic indexes of HRT-18 and IEC-18 cells treated with increasing amounts of STb toxin revealed dose-dependent responses in both cell lines. The activation of caspase-9 is an indication of the intrinsic pathway being activated in HRT-18 and IEC-18 cells by STb toxin. The lack of caspase-8 activation demonstrates that the extrinsic pathway of apoptosis is not involved in the programmed cell death mediated by STb.