Dissertations / Theses on the topic 'Jajniki'

Polibromowane difenyloetery (PBDE) to związki zmniejszające palność, które ze względu na swoje właściwości fizyko-chemiczne są zaliczane do grupy trwałych zanieczyszczeń organicznych. Charakteryzują się one dużą trwałością w środowisku i znaczną lipofilnością, co może stanowić istotne zagrożenie dla zdrowia człowieka. W 2004 r. Unia Europejska, w 2006 r. Stany Zjednoczone, a w 2007 r. także Chiny wprowadziły zakaz produkcji dwóch z trzech powszechnie stosowanych mieszanin PBDE, a mianowicie Penta- oraz Octa-BDE. Pomimo tego zakazu, pozostałości tych związków stwierdza się obecnie we wszystkich elementach środowiska, w tym również w tkankach pochodzących od człowieka, na całym świecie. Ponadto, PBDE wykazują zdolność do uwalniania się do środowiska z produktów, do których celowo zostały użyte, stanowiąc bezpośrednie zagrożenie dla zdrowia człowieka (z uwagi na ich działanie polegające na zaburzaniu równowagi hormonalnej). Badania prowadzone w Zakładzie Fizjologii i Toksykologii Rozrodu Uniwersytetu Jagiellońskiego wykazały, że jajnik jest docelową tkanką dla polibromowanych difenyloeterów. Dlatego celem niniejszej pracy doktorskiej było wyjaśnienie mechanizmu działania polibromowanych difenyloeterów w jajniku. Do badań wybrano wskaźnikowy kongener PBDE - BDE-47 i jego dwa hydroksylowane metabolity (5-OH-BDE-47 i 6-OHBDE-47). Modelem do badań były pęcherzyki jajnikowe pobrane z jajników dojrzałych płciowo świń. Prowadzono dwa typy hodowli: całych pęcherzyków oraz kokultur komórek warstwy ziarnistej oraz osłonki wewnętrznej pęcherzyka. Stosując metody immunoenzymatyczne (ELISA) określono wpływ badanych związków na sekrecję hormonów steroidowych oraz poziom enzymów II fazy metabolizmu. W obu przypadkach stosowano komercyjnie dostępne zestawy. Do pomiaru aktywności CYP1A1 oraz CYP2B1/2 zastosowano metody fluorescencyjne, natomiast do oznaczenia aktywności SULT1A i COMT zastosowano metody kolorymetryczne. Ekspresję genów szlaku steroidogenezy (HSD17B i CYP19A1), a także receptorów hormonów steroidowych (ESR1, ESR2 i AR) oraz receptorów związanych z metabolizmem zarówno hormonów steroidowych jak i ksenobiotyków (CAR i PXR (NR1/2)) oznaczono metodą real-time PCR. Zmiany w poziomie białka zostały natomiast oznaczone przy użyciu metody Western blot. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej przy pomocy testu t-Studenta oraz jedno- lub dwuczynnikowej analizie wariancji z użyciem testu Tukeya lub Bonferroniego. Wykazano stymulacyjny wpływ BDE-47 na ekspresję białka oraz na aktywność enzymu 17β-HSD i w konsekwencji stymulację sekrecji testosteronu przez komórki pęcherzykowe. Wykazano ponadto aktywację CYP2B1/2 po 1 godz., SULT1A po 6 godz. i COMT po 24 i 48 godz. ekspozycji, co wskazuje na możliwość lokalnego metabolizmu tego związku, a tym samym możliwość działania powstających w jajniku hydroksylowanych metabolitów PBDE. Określając działania dwóch najczęściej oznaczanych w krwi ludzkiej metabolitów BDE-47, 5-OH-BDE-47 i 6-OH-BDE-47, wykazano stymulujący wpływ na sekrecję estradiolu poprzez zwiększenie ekspresji genu, białka oraz aktywności aromatazy. Tym samym wskazano odmienne w stosunku do związku wyjściowego działanie metabolitów. W dalszej części, stwierdzono brak wpływu BDE-47 i jego hydroksylowanych metabolitów na ekspresję receptora androgenowego, zarówno na poziomie genu, jak i białka. Wykazano natomiast różnice we wpływie BDE-47 i jego metabolitów na ekspresję receptorów ERα i ERβ. Odnotowano hamujący wpływ BDE-47 na ekspresję genu i białka dla ERβ i brak wpływu na ekspresję genu i białka dla ERα. Zauważono natomiast stymulację ekspresji genów i białek dla obu receptorów estrogenowych pod wpływem badanych metabolitów. Po raz pierwszy wykazano brak ekspresji genu dla receptorów CAR i PXR w kokulturach komórek pęcherzyka jajnikowego świni. Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na lokalny, pozawątrobowy metabolizm PBDE. Różnice w działaniu powstających metabolitów w stosunku do związku wyjściowego i ich większa aktywność biologiczna wskazują na konieczność oznaczania metabolitów ksenobiotyków przy monitorowaniu zanieczyszczenia środowiska. Ponadto, wyniki badań przeprowadzonych w ramach tej pracy doktorskiej przyczyniły się do uzupełnienia luki w wiedzy dotyczącej mechanizmu działania PBDE i ich metabolitów w jajniku na poziomie genów, białek oraz aktywności enzymów związanych z procesem steroidogenezy.<br>Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are flame retardants, which due to their physicochemical properties are classified as persistent organic pollutants. These compounds present high persistence in the environment and lipophilic nature and thus may pose a serious threat to human health. The European Union, the United States and China (in 2004, 2006 and 2007, respectively) have banned the production of two of the three commonly used mixtures of PBDEs, namely Penta-and Octa-BDE. Despite this fact, PBDEs are still found in all parts of the environment, including tissues derived from human. Furthermore, products in which PBDEs are intentionally used can release it into the environment, acting in a direct threat to human health due to the disrupting the hormone balance. Research conducted in the Department of Physiology and Toxicology of Reproduction of the Jagiellonian University showed that the ovary is a target tissue for polybrominated diphenyl ethers. Therefore, the aim of this doctoral dissertation was to clarify the mechanism of action of polybrominated diphenyl ethers in the ovary. The congeners selected to the study are most abundant PBDE congener found in wildlife and in humans - BDE-47 and its two hydroxylated metabolites (5-OH-BDE-47 and 6-OH-BDE-47). Model to study were ovarian follicles collected from the ovaries of sexually mature pigs. Two types of culture were carried: whole follicles and co-culture of granulosa and theca cells. The concentration of steroid hormones and the level of phase II enzymes of metabolism were determined by enzyme immunoassay (EIA) using commercial ELISA kits. To measure the activity of CYP1A1 and CYP2B1/2 fluorescence methods were used. To determine the activity of COMT and SULT1A colorimetric methods were used. Gene expression of steroidogenic pathway (HSD17B and CYP19A1), steroid hormone receptors (ESR1, ESR2 and AR) and receptors associated with the metabolism of both xenobiotics and steroid hormones (PXR and CAR (NR 1/2)) was determined by real-time PCR, whereas changes in protein level was determined using Western blot. The data were analyzed statistically by Student's t-test and one- or two-way analysis of variance with Tukey or Bonferroni test. The researches showed the stimulating effect of BDE-47 on 17β-HSD protein expression and activity and consequently the stimulation of testosterone secretion by the follicles. It was also determined that BDE-47 exposure activates CYP2B1/2 after 1 h, SULT1A after 6 h, and then COMT after 24 and 48 h of exposure, which indicates the possibility of local metabolism of the testing compound and thus possible action of locally produced hydroxylated metabolites of PBDE in ovary. Determining the action of two most abundant metabolites of the parent BDE-47 in human blood, 5-OH-BDE-47 and 6-OH-BDE-47, proved stimulating effect on the estradiol secretion by increasing the aromatase gene and protein expression and activity, thus showing differences between the activity of parent compounds and that of their metabolites. While no effect of BDE-47 and its hydroxylated metabolites has been found on the expression of the androgen receptor, either at the gene or protein level, there are significant differences in the impact of BDE-47 and its metabolites on ERα and ERβ expression. It was observed that BDE-47 has inhibitory effect on ERβ gene and protein expression and no effect on ERα, while tested metabolites have stimulating effect on gene and protein expression for both estrogen receptors. It has been showed for the first time that no gene expression for CAR and PXR in co-culture of porcine follicular cells occurs. These results clearly show the local, extrahepatic metabolism of PBDEs. Differences in the action of metabolites relative to the parent compound and its greater biological activity indicates the need for determining xenobiotic metabolites during monitoring environmental pollution. In addition, the results of studies conducted under this doctoral dissertation helped to fill the gap in knowledge on the mechanism of action of PBDEs and their metabolites in the ovary at the level of genes, proteins and enzymes associated with the process of steroidogenesis.

Androgeny to kluczowe związki biorące udział w regulacji procesów rozrodczych u samicy, działające głównie przez receptor androgenowy (AR), należący do nadrodziny receptorów jądrowych. Androgeny są jednymi z ważniejszych związków wpływających na proces folikulogenezy. Z jednej strony modulują funkcje pęcherzyka poprzez interakcje z różnymi czynnikami i wspierają różnicowanie komórek ziarnistych. Z drugiej strony, mogą hamować rozwój pęcherzyka poprzez indukcję procesu apoptozy komórek ziarnistych, co w konsekwencji może prowadzić do atrezji pęcherzyka jajnikowego. W jajnikach ssaków większość pęcherzyków ulega atrezji przed owulacją. Coraz częściej mówi się, że substancje występujące w środowisku, mogą w sposób zasadniczy wpływać na procesy życiowe wielu organizmów, w tym na różnicowanie płci u ssaków. Związki te, to Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs), czyli m. in. związki powstające w wyniku działalności człowieka, przedostające się do środowiska i w efekcie zaburzające regulację hormonalną poprzez interakcje z receptorami hormonów steroidowych. Taki mechanizm działania negatywnie wpływa na szereg procesów zachodzących w układzie rozrodczym samicy. Celem prezentowanej pracy było określenie wpływu androgenów, testosteronu (T) i dihydrotestoseronu (DHT) oraz fungicydu o właściwościach antyandrogennych, winklozoliny (Vnz) na ekspresję AR na poziomie mRNA i białka, aktywność steroidogenną i mechanizm apoptozy zarówno w komórkach ziarnistych jak całych pęcherzykach jajnikowych świni (Ø 4-6mm). Komórki ziarniste izolowane z pęcherzyków jajnikowych hodowano przez 24 godziny i następnie dodawano: T (10-7M), DHT (10-7M) i Vnz (1,4×10-5M) osobno lub w kombinacji: T i Vnz lub DHT i Vnz na kolejne 24 godziny. Całe pęcherzyki jajnikowe hodowano narządowo przez 24 godziny, stosując warianty hodowli takie jak w przypadku hodowli pierwotnych. Androgeny (T, DHT) i antyandrogen środowiskowy winkolzolina (Vnz) wpływają na ekspresję AR na poziomie mRNA i białka w komórkach ziarnistych pęcherzyków jajnikowych świni. Wykazano lokalizację cytoplazmatyczną i około jądrową AR w komórkach ziarnistych traktowanych Vnz. Stwierdzono wzrost ekspresji AR na poziomie mRNA i białka w komórkach ziarnistych pod wpływem Vnz oraz kombinacji T+Vnz lub DHT+Vnz. W przypadku pęcherzyków jajnikowych hodowanych w obecności androgenów i antyandrogenu jednocześnie (T+Vnz i DHT+Vnz) obserwowano wzrost ekspresji mRNA AR z jednoczesnym spadkiem ekspresji na poziomie białka. W komórkach ziarnistych i pęcherzykach jajnikowych świni androgeny (T i DHT) oraz antyandrogen (Vnz) wpływają na aktywność steroidogenną. Zmiany poziomu hormonów steroidowych, tak w medium hodowlanym jak w płynie pęcherzykowym, świadczą o zaburzonym przebiegu steroidogenezy w komórkach ziarnistych i całych pęcherzykach jajnikowych świni. Androgeny (T, DHT) i antyandrogen środowiskowy winkolzolina (Vnz) wpływają w sposób znaczący na mechanizm apoptozy. Obserwowano zmiany morfologii komórek ziarnistych i całych pęcherzyków jajnikowych świni, co świadczy o destrukcyjnym wpływie tych związków na prawidłową strukturę komórki i pęcherzyka. Vnz powoduje nekrozę hodowanych komórek ziarnistych oraz indukuje apoptozę komórek ziarnistych w całych pęcherzykach jajnikowych. Wykazano, że dodanie T, DHT lub Vnz do medium hodowlanego komórek ziarnistych lub pęcherzyków powoduje uruchomienie procesu programowanej śmierci komórki, ponieważ obserwowano wzrost ekspresji i aktywności kaspazy-3. Vnz zakłóca klasyczny receptorowy oraz mitochondrialny szlak apoptozy. Ponadto wykazano, że traktowanie komórek ziarnistych Vnz powoduje spadek ekspresji białek antyapoptotycznych, z jednoczesnym brakiem wzrostu ekspresji białek proapoptotycznych. Prawdopodobnie stosowanie Vnz wpływa na prawidłowe podziały komórki (zatrzymuje cykl komórkowy), gdyż obserwowano spadek ekspresji białka p53 i surwiwiny. Co więcej, dodanie Vnz do medium hodowlanego komórek ziarnistych skutkuje wzrostem fosforylacji kinazy ERK1/2 i Akt. Sugeruje to pozagenomowy mechanizm działania Vnz. Co ważniejsze, prezentowane badania wykazały zdecydowanie antyapoptotyczne działanie wysokiego stężenia androgenów stosowanych jednocześnie z Vnz, o czym m. in. świadczy spadek ilości komórek apoptotycznych i aktywności kaspazy-3. Podsumowując uzyskane wyniki, można stwierdzić, że winklozolina może zaburzać prawidłowe funkcje jajnika, ponieważ działając za pośrednictwem AR uruchamia niegenomowe szlaki przekazywania sygnału i zakłóca fizjologiczne procesy programowanej śmierci komórkowej. W konsekwencji może to prowadzić do obniżenia potencjału rozrodczego samicy.<br>Androgens are the key regulators in female reproductive physiology. They act primarily via the androgen receptor (AR), a member of the nuclear receptor superfamily, which operates as ligand-regulated transcription factor. Androgens are one of the most important agents influencing folliculogenesis. They can modulate follicular function by interactions with various factors and promote granulosa cells differentiation. On the other hand, androgens can antagonize follicular development by inducing apoptosis in granulosa cells and in this way they can promote follicular atresia. In mammalian ovaries the majority of follicles are lost at various stages before ovulation by atresia. Recently, there has been an increasing concern about potential for Environmental Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to alter sexual differentiation in mammals. They originate as a result of human industrial activities, enter the natural environment and then disturb hormonal regulation by interaction with steroid hormone receptors. Such a mechanism of action negatively influences on many process taking place in the reproductive tract of a female. The aim of this study was to investigate whether the androgens testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT) and the antiandrogenic fungicide vinclozolin (Vnz) influence AR expression on mRNA and protein level, steroidogenic activity, and mechanism of apoptosis both in granulosa cells and in whole porcine ovarian follicles (Ø 4-6mm). Granulosa cells isolated from pig follicles were cultured for 24 hours, and then were exposed to T (10-7M), DHT (10-7M), Vnz (1,4×10-5M) or the equivalent concentrations of T and Vnz or DHT and Vnz for further 24 hours. Whole porcine follicles were also exposed to the same compounds and combinations of compounds for 24 hours. Androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) influence on AR mRNA and protein expression in porcine ovarian granulosa cells and whole follicles. The immunostaining for AR was detected mainly in the cytoplasm and assembled in the perinuclear region after exposure to Vnz. Treatment with Vnz and combinations of T+Vnz and DHT+Vnz, granulosa cells resulted in an increase in the expression of AR on both mRNA and protein levels. In the whole follicles treatment with T+Vnz and DHT+Vnz resulted in an increased expression of mRNA for AR with simultaneous decrease of AR protein. In porcine granulosa cells and whole ovarian follicles androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) affected their steroidogenic activity. Incorrect or disturbed process of steroidogenesis was observed in all experimental groups of cells and follicles. Besides all compounds tested caused the disturbance of hormonal balance in the follicular fluid. Androgens (T and DHT) and an antiandrogen (Vnz) in a significant manner influenced on the mechanism of apoptosis. Morphological changes in granulosa cells and ovarian follicles indicated destructive effects of this agents. Vnz caused massive necrosis of granulosa cells and induced apoptosis of granulosa cells in whole follicles. Androgens induced apoptosis in granulosa cells of ovarian follicles . It was found out that the addition of T, DHT or Vnz to the culture media of granulosa cells or follicles caused the induction of the process of programmed cell death, because an increased caspase-3 expression and activity have been observed. It seems that Vnz disrupted classical receptor and mitochondrial signaling pathways of apoptosis. Also, it was shown that Vnz treatment caused a decrease in the expression of antiapoptotic proteins, but without an increase in that of proapoptotic ones. Probably supplementation with Vnz altered normal cell division (cell-cycle arrest), because a decrease in p53 and survivin proteins expression has been observed. Moreover, the addition of Vnz to the culture media of granulosa cells increased phosphorylation of ERK1/2 and Akt kinases. It is suggested that Vnz may interfere with the nongenomic pathway of androgens signaling. What is more important, the presented data clearly showed that Vnz applied together with high concentration of androgens (T and DHT) exerted an antiapoptotic effect, as evidenced by the decreased number of apoptotic cells and caspase-3 activity. In conclusion, these results suggest that normal function of the ovary may be destroyed by the environmental antiandrogenic fungicide vinclozolin. It can activate the nongenomic signaling pathway used by androgens or act through the AR. This mechanism of action disturbs the physiological process of programmed cell death. It seems that selective destruction of porcine follicles is a serious consequence of their exposure to vinclozolin leading to premature ovarian failure in the affected organism.

Niewątpliwym ograniczeniem w stosowaniu doksorubicyny jest wysoka kardiotoksyczność oraz zjawisko oporności wielolekowej (MDR). Obecność wolnej grupy –NH2 daunozaminy uważana była przez wiele lat jako kluczowy element dla aktywności przeciwnowotworowej antracyklin. Liczne badania naukowe dowodzą, że korzystne rezultaty dają modyfikacje grupy aminowej daunozaminy w pozycji C-3’. Wśród badanych w ramach pracy doktorskiej analogów znalazły się takie, w których dokonano zamiany grupy –NH2 znajdującej się przy atomie węgla C-3’ daunozaminy na trójpodstawioną grupę amidynową zawierającą reszty cyklicznych amin drugorzędowych (–NRR) takich jak piperydyna (DOX-F PIP), pirolidyna (DOX-F PYR), morfolina (DOX-F MOR), heksametylenoimina (DOX-F HEX) iN-metylopiperazyna (DOX-F PAZ) oraz pierścień oksazolinowy (O-DOX). Badane analogi wykazują lepsze właściwości cytotoksyczne w porównaniu z macierzystą doksorubicyną w komórkach raka jajnika opornych na związek referencyjny. Wykazano ponadto zwiększoną zdolność do indukcji apoptozy i wysoką genotoksyczność. Co ważne, dostępne dane literaturowe dowodzą także, że zmodyfikowane związki wykazują niższą niż związek referencyjny toksyczność ogólnoustrojową, w szczególności kardiotoksyczność. Ponadto, badane pochodne doksorubicyny posiadają zdolność do przełamywania oporności wielolekowej in vitro, w przeciwieństwie do leków macierzystych. Biorąc pod uwagę wyniki przeprowadzonych badań można stwierdzić, że zastosowana modyfikacja chemiczna w pozycji C-3’ jest skuteczną metodą dla otrzymania związków o wyższej niż doksorubicyna aktywności biologicznej.<br>Indywidualne stypendia stanowiące dofinansowanie badań mieszczących się w temacie Wpływ wybranych pochodnych doksorubicyny na komórki raka jajnika (Rozporządzenie MNiSW z 5 listopada 2010 r.)

Androgeny regulują ekspresję genów w komórkach docelowych poprzez interakcje z receptorami androgenowymi. Dotychczasowe badania wykazały obecność receptora androgenowego oraz cytochromu P450c17 w płodowym jajniku świni, co świadczy, że jest on tkanką docelową dla androgenów lub ich antagonistów, ale także potencjalnym miejscem syntezy tych steroidów. Celem niniejszej pracy było określenie roli androgenów w regulacji funkcji jajnika świni w okresie neonatalnym i postnatalnym po zastosowaniu antyandrogenu, flutamidu, w odniesieniu do wybranych genów androgenozależnych (FSHR, Cx43, AQP5), które są istotne dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania jajnika. Przeprowadzone doświadczenie polegało na nastrzykiwaniu flutamidem (50 mg/kg masy ciała) ciężarnych świń w krytycznych dniach ciąży: od 20 do 28 lub od 80 do 88 dnia po zapłodnieniu, oraz prosiąt od 2 do 10 dnia po urodzeniu. Materiał do badań stanowiły jajniki pobrane od prosiąt w 2 dniu po urodzeniu oraz jajniki dojrzałych płciowo świń. Analiza morfologiczna jajników zwierząt nowonarodzonych wykazała obecność mniej zawansowanych w rozwoju struktur jajnikowych (gniazda komórek płciowych, pęcherzyki pierwotne) w stosunku do kontroli. W oparciu o analizę Real-time PCR, stwierdzono obniżoną ekspresję genów FSHR i Cx43 na poziomie mRNA, wskazując na działanie androgenów we wczesnych etapach rozwoju jajnika i folikulogenezy u świni. W pęcherzykach przedantralnych wyizolowanych z jajników dojrzałych płciowo świń stwierdzono obniżoną immunoekspresję białka Ki-67 świadczącą o ograniczeniu aktywności proliferacyjnej komórek ziarnistych. Przeprowadzona reakcja TUNEL nie potwierdziła natomiast ich apoptozy. Zmniejszona ilość transkryptu dla Cx43 oraz spadek ekspresji białka Cx43 w wyniku iniekcji flutamidu od 80 dnia ciąży i od 2 dnia po urodzeniu wskazują, że obniżony indeks proliferacji komórek ziarnistych jest ściśle związany z zaburzeniem komunikacji międzykomórkowej w pęcherzyku przedantralnym. W pęcherzykach antralnych wyizolowanych z jajników dojrzałych płciowo świń obserwowano znaczny wzrost immunoekspresji białka Ki-67, zarówno w komórkach ziarnistych, jak i komórkach osłonki wewnętrznej, we wszystkich badanych grupach. Wysoka aktywność proliferacyjna korelowała z zahamowaniem apoptozy komórek ziarnistych. Wyraźny wzrost ilości transkryptu i białka FSHR dowodzi zwiększonej stymulacji przez FSH. Wyjaśnia to podwyższoną ekspresję genu CYP19A1 oraz wzrost stężenia estradiolu w homogenatach pęcherzyków antralnych po ekspozycji na flutamid od 2 dnia po urodzeniu. Przewaga proliferacji nad apoptozą może być także wynikiem zwiększonej ekspresji mRNA i białka Cx43 po podaniu flutamidu od 80 dnia ciąży i od 2 dnia po urodzeniu. Za pomocą testu „swelling assay” stwierdzono pozytywny wpływ testosteronu na aktywność akwaporyn w komórkach ziarnistych pęcherzyków jajnikowych świni. Zaobserwowano także obniżenie ilości transkryptu i białka AQP5 w pęcherzykach antralnych po zastosowaniu flutamidu. Uzyskane wyniki dowodzą, że androgeny mogą być ważnymi regulatorami formowania antrum i płynu pęcherzykowego w pęcherzyku jajnikowym świni, poprzez wpływ na ekspresję akwaporyn. W jajniku dojrzałej płciowo świni, obok prawidłowo zbudowanych ciałek żółtych, obserwowano ciałka żółte o charakterze cyst. Neonatalne zastosowanie flutamidu spowodowało obniżenie ekspresji Cx43, 3b-HSD oraz spadek stężenia progesteronu w homogenatach ciałek żółtych. Prezentowane badania dowodzą, że komunikacja pomiędzy komórkami lutealnymi odpowiada za ich funkcje steroidogenne. Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że zablokowanie receptora androgenowego poprzez prenatalne lub neonatalne iniekcje flutamidu wpływa na rozwój i funkcjonowanie pęcherzyków jajnikowych i ciałka żółtego u dorosłych świń.<br>Androgens acting via androgen receptors (ARs) govern expression of various genes in target tissues. Recently, we have demonstrated the presence of ARs in the porcine fetal ovary at different days of gestation, which suggests a capacity to respond to androgens and/or antiandrogenic factors during that period. Moreover, P450c17 localized in the fetal porcine ovary indicates the potential sites of androgens synthesis. The current study was conducted to determine whether gestational or neonatal exposure to the antiandrogen flutamide influeces FSHR, Cx43 and AQP5 gene expression in the neonatal and adult porcine ovary. The androgen deficiency during the prenatal and neonatal windows may alter FSHR, Cx43 and AQP5 expression, leading to the abnormal folliculogenesis in adult pig ovaries and disturbed corpus luteum (CL) function. Flutamide (50 mg/kg body weight) was injected into pregnant gilts between days 20 and 28 or days 80 and 88 of gestation, and into female piglets between days 2 and 10 postnatally. The ovaries were collected from 2-day-old piglets or sexually mature pigs, treated and non-treated (control) ones. Following flutamide exposure during pregnancy we observed less advanced ovarian stuctures (oocyte nests, primordial follicles) in the neonatal ovaries when compared to the controls. Additionally, FSHR and Cx43 mRNA were down-regulated after flutamide exposure. These results confirm the notion that androgens play a crucial role at the early stages of porcine folliculogenesis. The diminished expression of FSHR and Cx43 in the primary follicles following late gestational flutamide treatment suggests their role in the activation of follicular development in pigs and may result in delayed folliculogenesis. In preantral follicles from adult pig ovaries, Ki-67 immunoexpression was decreased after flutamide administration. On the other hand, TUNEL reaction did not reveal any apoptotic granulosa cells. Cx43 mRNA was down-regulated and Western-blot analysis showed a decreased expression of Cx43 protein in preantral follicles. Thus, we assume a close relationship between low proliferative activity and diminished Cx43 expression. In large antral follicles from adult pig ovaries, isolated from animals following maternal and neonatal flutamide administration Ki-67 immunoexpression in granulosa and theca cells was significantly higher than in the controls. High proliferative activity correlated with a low number of apoptotic granulosa cells. Moreover, an increased mRNA and protein FSHR levels and CYP19A1 gene expression led to the elevated estradiol concentration observed following neonatal flutamide exposure. The increase in Cx43 mRNA and protein expression after late gestational and neonatal flutamide administration may also induce raised proliferative activity of granulosa cells. Furthermore, the swelling assay revealed that testosterone produced a swelling of granulosa cells in hypotonic solution, which was abolished by the anti-androgen hydroxyflutamide. In large antral follicles isolated from ovaries of animals postnatally exposed to flutamide we showed a decline of AQP5 mRNA and protein. In addition to properly formed CLs in each examined ovary, we found the cysts of corpus luteum following neonatal flutamide administration. In luteal tissues, Cx43 and 3b-HSD expression, and progesterone concentration were lower than in the controls. Overall, these results suggest substantial involvement of androgens in the regulation of pig ovarian development. This manifests by alterations of FSHR, Cx43 and AQP5 gene expression induced by administration of flutamide during particular prenatal and neonatal periods what entails disturbed porcine follicle development, as well as CL formation and function.

Rozprawę doktorską stanowi cykl 5 powiązanych tematycznie publikacji.<br>Nowotwór jajnika charakteryzuje się najwyższą śmiertelnością spośród wszystkich nowotworów ginekologicznych. Tak złe statystyki związane są z trudnościami z postawieniem prawidłowej diagnozy oraz częstym rozwojem lekooporności. Czynniki te sprawiają, że choroba wykrywana jest najczęściej w III i IV stopniu zaawansowania, kiedy występują już przerzuty do innych narządów, a dostępne obecnie metody leczenia są nieskuteczne. Z tego względu poszukiwanie nowych i efektywniejszych metod terapeutycznych jest wyzwaniem dla współczesnej onkologii. W niniejszej rozprawie doktorskiej oceniano skuteczność kombinacji WP 631 i epotilonu B (Epo B) w komórkach SKOV-3. WP 631 jest bisantracykliną złożoną z dwóch cząsteczek daunorubicyny połączonych łącznikiem p-ksylenowym, wykazującą plejotropowy mechanizm działania, obejmujący przede wszystkim interkalację do DNA. Jej efektywność w komórkach raka jajnika jest dobrze udokumentowana. Epo B z kolei wykazuje działanie zbliżone do taksanów: stabilizuje mikrotubule i hamuje ich depolimeryzację. Wykazano, że w komórkach raka jajnika epotilony przejawiają wyższą aktywność niż paklitaksel, najczęściej stosowany przedstawiciel taksanów. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było stwierdzenie, czy WP 631 i Epo B, zastosowane łącznie, będą działały skuteczniej niż w przypadku ich pojedynczego podania w komórkach raka jajnika SKOV-3, oraz poznanie molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków. Badania te podjęto w oparciu o dane literaturowe, wskazujące na znaczną przewagę terapii skojarzonej nad monoterapią w leczeniu nowotworu jajnika. Wykazano, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach raka jajnika, a najbardziej optymalnym połączeniem jest to, w którym stosunek bisantracykliny do Epo B wynosi 1 : 1. Tę kombinację związków stosowano w kolejnych eksperymentach, w których oceniano jej właściwości proapoptotyczne, prooksydacyjne i genotoksyczne. Stwierdzono, że kombinacja WP 631 i Epo B, w większym stopniu niż związki stosowane pojedynczo, indukuje apoptozę w komórkach SKOV-3. Na podstawie analizy aktywności kaspaz -9, -8 oraz -3 wykazano, że połączone działanie związków aktywuje zarówno mitochondrialną, jak i receptorową ścieżkę programowanej śmierci komórki. Udowodniono też, że kombinacja przejawia silne działanie prooksydacyjne, a reaktywne formy tlenu zaangażowane są w jej mechanizm działania. WP 631 i Epo B stosowane w połączeniu generowały również uszkodzenia DNA, znacznie silniejsze niż w przypadku działania związków pojedynczych. Co istotne, genotoksyczne działanie kombinacji okazało się w minimalnym stopniu odwracalne. Uszkodzenia materiału genetycznego powstałe w wyniku działania samego WP 631 czy Epo B były mniej trwałe. Przedstawione wyniki dowodzą, że kombinacja WP 631 i Epo B wykazuje w komórkach SKOV-3 wyższą efektywność niż związki stosowane pojedynczo. W celu poznania molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków przeanalizowano ich wpływ na cykl komórkowy oraz regulujące go białka. Wykazano, że WP 631 nie powoduje zmian w rozkładzie faz cyklu, Epo B działa proapoptotycznie oraz zatrzymuje cykl w fazie G2/M, natomiast kombinacja związków prowadzi do poślizgu mitotycznego, czyli wyjścia komórek z bloku G2/M, oraz ich śmierci na drodze apoptozy. Zahamowanie aktywności białek regulujących cykl komórkowy: cykliny B, cyklinozależnej kinazy 1 (CDK1), EpCAM i HMGB1 za pomocą specyficznych inhibitorów pozwoliło ustalić, że białka HMGB1 i EpCAM nie są zaangażowane w mechanizm działania żadnego ze związków, a kompleks cyklina B/ cyklinozależna kinaza 1 pośredniczy w mechanizmie działania Epo B. Na podstawie analizy PCR stwierdzono ponadto, że kombinacja związków istotnie wpływała także na poziom ekspresji mRNA kodujących analizowane białka. Pod wpływem jej działania ekspresja mRNA kodujących cyklinę B i CDK1 istotnie spadła, co stanowi dowód na wystąpienie poślizgu mitotycznego. Kombinacja związków, w odróżnieniu od WP 631 i Epo B stosowanych pojedynczo, obniżała także ekspresję mRNA kodujących dwie pozostałe proteiny: EpCAM i HMGB1. Są one czynnikami prognostycznymi, których wysoka ekspresja koreluje ze stopniem zaawansowania choroby i złymi rokowaniami. Dlatego też obniżanie ich ekspresji może się przełożyć na lepsze rezultaty terapii. Przeprowadzone eksperymenty dowiodły, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach SKOV-3, a najefektywniejszym połączeniem jest to, w którym stosunek WP 631 do Epo B wynosi 1 : 1. Wytłumaczeniem wyższego potencjału kombinacji związków jest jej wpływ na białka EpCAM i HMGB1, które pośredniczą w mechanizmie skojarzonego działania WP 631 i Epo B.<br>Praca była finansowana z grantu MNiSW Nr N N405 100939 pt. Indukcja apoptozy przez epotilon B i analog doksorubicyny WP 631 w komórkach raka jajnika wrażliwych i opornych na leki przeciwnowotworowe, realizowanego w latach 2010–2013 (kierownik: dr hab. Agnieszka Marczak, prof. nadzw. UŁ), projektu Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych Naukowców nauk przyrodniczych i technologicznych – Akronim – D-RIM BIO, realizowanego przez Uniwersytet Łódzki, współfinansowanego przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytet VIII Regionalne Kadry Gospodarki, Poddziałanie 8.2.1 Wsparcie dla współpracy sfery nauki i przedsiębiorstw oraz z indywidualnych stypendiów stanowiących dofinansowanie badań mieszczących się w temacie Molekularne mechanizmy interakcji WP 631 i epotilonu B w komórkach raka jajnika.

Wyniki pomiarów chemicznych są wykorzystywane w wielu obszarach, między innymi: w przemyśle, przy ocenie składu surowców, półproduktów i produktów czy w kontroli zanieczyszczeń środowiska. Analiza chemiczna jest również doskonałym narzędziem wspomagającym poszukiwania surowców geologicznych, badania materiałów związanych z rozwojem atomistyki czy badania związane z dziedzictwem kulturowym. Warto podkreślić, że ogromny rozwój technik pomiarowych w dziedzinie analizy chemicznej jaki nastąpił w XX wieku, przyczynił się do dużego zainteresowania ich zastosowaniem w badaniach medycznych. Z jednej strony jest to związane z ulepszeniem rutynowych testów pozwalających na ocenę stanu zdrowia człowieka, ale również z rozwojem badań ukierunkowanych na poszukiwanie nowych wskaźników stanów chorobowych. Pomiary chemiczne mają również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, zarówno przy rutynowej kontroli jakości produkcji, jak również w badaniach związanych z opracowywaniem nowych leków i sposobów ich wytwarzania. Niewątpliwie, rozwój nowych technik pomiarowych i wyposażenie przyrządów w komputerowe systemy do ich obsługi, pozwalają na usprawnienie procedur pomiarowych. Warto przy tym podkreślić, że wbrew mylnemu często przekonaniu, że automatyzacja rozwiązuje wszelkie problemy, to uzyskiwanie miarodajnych wyników oraz ich właściwa interpretacja wymagają dużej wiedzy, doświadczenia oraz współpracy interdyscyplinarnej. Niewątpliwie chemik analityk musi posiadać umiejętność obsługi najnowocześniejszych urządzeń pomiarowych, ale przede wszystkim rozumieć procesy fizyko-chemiczne zachodzące podczas pomiaru, aby móc w sposób wiarygodny określić potencjalne źródła błędów. Dodatkowo, aby właściwie wybrać procedurę pomiarową, musi znać cel badań i mieć pełną świadomość każdego etapu prowadzonych badań. Badania poświęcone kontroli stanu zdrowia człowieka warunkują potrzebę oznaczania stężenia pierwiastków na poziomie śladowym, co jest możliwe tylko dzięki wykorzystaniu bardzo precyzyjnych i czułych urządzeń pomiarowych. Poznanie poziomu na jakim wstępują pierwiastki w organizmie ludzkim czy ich rozmieszczenia w tkankach oraz poznanie procesów biochemicznych występujących w organizmie żywym wyznaczają kierunek rozwoju współczesnej chemii analitycznej, w tym analizy klinicznej. W rozprawie doktorskiej została przedstawiona istota szeroko rozumianych badań interdyscyplinarnych poprzez przedstawienie trzech różnych historii, trzech różnych problemów i trzech różnych podejść chemika analityka, które pozwoliły odpowiedzieć na część pytań z zakresu medycyny i tym samym przyczynić się do lepszego poznania wybranych jednostek chorobowych czy zaburzeń organizmu. W części literaturowej niniejszej pracy przedstawione zostały zagadnienia dotyczące analizy klinicznej oraz przybliżona została charakterystyka analityczna procedur pomiarowych. W pierwszej części opisane zostały zarówno rutynowo stosowane metody diagnostyczne jak i najczęściej wykorzystywane do tych celów próbki kliniczne. Przedstawiono również jakie najważniejsze informacje dotyczące stanu zdrowia można otrzymać poprzez sprawdzenie wybranych parametrów krwi i moczu, podkreślając tym samym znaczenie rutynowych badań diagnostycznych. Przedstawiono także alternatywne próbki kliniczne wraz z informacjami, jakie można uzyskać poprzez ich analizę. Opisano również badania próbek klinicznych, które nie są stosowane rutynowo w laboratoriach klinicznych, jednak mogą dostarczać wielu informacji i stać się cennym narzędziem diagnostycznym w dziedzinie medycyny. Ostatnim poruszanym tematem była charakterystyka analityczna procedur i metod pomiarowych, w której przybliżono schemat postępowania analitycznego prowadzącego do uzyskania jak najbardziej rzetelnych, wiarygodnych i użytecznych wyników. W pracy eksperymentalnej opisano trzy projekty interdyscyplinarne, których głównym celem było stworzenie indywidualnych procedur analitycznych mających na celu znalezienie specyficznych wskaźników wybranych jednostek chorobowych w próbkach klinicznych Każdy ze zrealizowanych projektów zaczyna się krótkim wprowadzeniem i ogólnym przedstawieniem problemu. Zabieg ten miał na celu przybliżenie, jakie informacje przed przystąpieniem do realizacji projektu należało uzyskać z prowadzonych badań interdyscyplinarnych z lekarzami i naukowcami. Sprecyzowanie celu analitycznego pozwoliło na dobór odpowiedniej procedury analitycznej, takiej aby uzyskane wyniki były przydatne. Pierwszy projekt dotyczył stworzenia procedury oznaczania całkowitej zawartości ołowiu w próbkach krwi i osocza, która byłaby szybka oraz względnie tania z powodu możliwości analizy dużej liczby próbek. Dodatkowo procedura musiała uwzględniać nie tylko małe ilości próbek przeznaczonych do badań, ale również musiała być bardzo czuła ze względu na niskie stężenia oznaczanego pierwiastka w próbkach. Utrudnieniem była bardzo mała ilość dostarczonych do badań próbek. Prowadzone pomiary były etapem dużego projektu, w którym sprawdzano wpływ palenia papierosów na poziom ołowiu we krwi i w osoczu. Badaną grupą były kobiety w ciąży, które paliły papierosy przez cały okres trwania ciąży. Grupę kontrolną stanowiły ciężarne kobiety niepalące. Poziom pierwiastka sprawdzany był we wszystkich trymestrach ciąży. Otrzymane wyniki pozwoliły odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje korelacja pomiędzy zawartością ołowiu we krwi i w osoczu, a liczbą wypalanych dziennie papierosów i niską masą urodzeniową dziecka. Badania te miały na celu potwierdzenie negatywnego wpływu nadmiernej ekspozycji na ołów na rozwój prenatalny. Badania były prowadzone przy ścisłej współpracy z Instytutem Matki i Dziecka w Warszawie. Drugi projekt był częścią interdyscyplinarnych badań dotyczących rzadkiej choroby Wilsona. Celem prowadzonych badań w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie odpowiedniej procedury analitycznej pozwalającej na otrzymanie wiarygodnych wyników dotyczących zawartości miedzi, żelaza, cynku i manganu w tkankach pochodzących z wybranych rejonów mózgu osób chorych na chorobę Wilsona. Największa trudność przy opracowaniu procedury spowodowana była niewielkimi rozmiarami próbek, co uniemożliwiało na przykład mineralizację wspomaganą promieniowaniem mikrofalowym w systemie zamkniętym, którą zwykle stosuje się w przypadku rozkładu próbek biologicznych w tym klinicznych. Dodatkową trudnością brak dostępnego komercyjnie materiału odniesienia, którego matryca byłaby idealnie spójna z badaną. Badania były prowadzone przy współpracy z Instytutem Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie. Celem ostatniego projektu było opracowanie procedury pozwalającej na określenie rozmieszczenia wybranych pierwiastków (Mg, Cu, Zn, Mn, Fe) w tkankach jajników ludzkich. Taka procedura pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie, czy istnieją zależności pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w próbce pochodzącej od osoby zdrowej oraz w próbce pobranej od osoby u której stwierdzono obecność zmian nowotworowych i tym samym wzbogacić dotychczasową wiedzę na temat nowotworów jajnika. Największą trudność w opracowywaniu procedury analitycznej był dobór optymalnych warunków, w których prowadzona była ablacja laserowa, ze względu na złożoną i niejednorodną matrycę próbek i brak komercyjnie dostępnych materiałów odniesienia. Po optymalizacji procedury podjęto próbę znalezienia ewentualnych różnic i korelacji pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w tkankach zdrowych i objętych choroba nowotworową. Badania prowadzone były przy współpracy z Wojskowym Instytutem Medycznym w Warszawie. Niniejsza praca miała na celu pokazanie możliwości wykorzystania technik analitycznych do rozwiązywania problemów i odpowiedzi na pytania z zakresu medycyny, stworzenie procedur dedykowanych konkretnym badaniom, próbkom i problemom. Poprzez opisanie trzech różnych historii chciałam dodatkowo podkreślić jak duży wpływ na rozwój współczesnej medycyny mogą mieć badania interdyscyplinarne, jak ważna jest ścisła współpraca z innymi jednostkami i instytucjami oraz jak istotne jest indywidualne podejście do badań z pogranicza nauk. Rezultaty badań przedstawione w rozprawie doktorskiej zostały opublikowane w postaci sześciu publikacji oryginalnych 1. Dusek P., Bahn E., Litwin T., Jabłonka-Salach K., Łuciuk A., Huelnhagen T., Madai V.I., Dieringer M., Knauth M., Niendorf T., Sobesky J., Paul F., Schneider S.A., Czlonkowska A., Brück W., Wegner C., Wuerfel J., „Brain iron accumulation in Wilson disease: a post-mortem 7 Tesla MRI - histopathological study”, Annals of Neurology – w druku 2. Walter U., Skowrońska M., Litwin T., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Skoloudík D., Bulska E., Członkowska A., „Lenticular nucleus hyperechogenicity in Wilson’s disease reflects local copper but not iron accumulation”, Journal of Neural Transmission, 121 (2014) 1273-1279 3. Chełchowska M., Ambroszkiewicz J., Jabłonka-Salach K., Gajewska J., Maciejewski T.M., Bulska E., Laskowska-Klita T., Leibschang J., „Tobacco smoke exposure during pregnancy increases maternal blood lead levels affecting neonate birth weight”, Biol. Trace. Elem. Res., 155 (2013) 169-175; 4. Przybyłkowski A., Gromadzka G., Wawer A., Bulska E., Jabłonka-Salach K., Grygorowicz T., Schnejder-Pachołek A., Członkowski A., „Neurochemical and Behavioral Characteristics of Toxic Milk Mice: An Animal Model of Wilson's Disease”, Neurochem Res, 38 (2013) 2037-2045 5. Litwin T., Gromadzka G., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Bulska E., Członkowska A., „Brain metal accumulation in Wilson's disease”, Journal of the Neurological Sciences, 329 (2013) 55-58; 6. Chełchowska M., Jabłonka-Salach K., Ambroszkiewicz J., Maciejewski T., Gajewska J., Bulska E., Laskowska-Kalita T., Leibschang J., Barciszewski J., „Wpływ palenia tytoniu na poziom ołowiu we krwi kobiet ciężarnych”, Medycyna Wieku Rozwojowego, 3 (2012) 196-204<br>The aim of this work was to elaborate specific analytical procedures supporting the evaluation of novel disease’s markers. In the frame of human health control there is a need to monitor trace elements occurrence, which is possible only though the use of very precise and sensitive methods. In this work the possibilities of using the facilities of modern analytical instrumentation towards obtaining medically relevant information was described. Especially, the specific analytical procedures tailored with respect of fit for purposes approach was used in order to overcome the difficulties with sample preparation and calibration. In the work three study-cases were elaborated, as to demonstrate various kinds of problems arising whenever interdisciplinary research is conducted, here in the field of contemporary medicine. Furthermore, to illustrate how important close cooperation between other units and institutions is as well as to stress the significance of individual interdisciplinary approach. The first part of research was focused on the development of massive procedure enabling the determining of the content of lead in blood and plasma samples, which should be inexpensive (because of the large number of samples), relatively fast and sensitive (because of low level of lead in those samples). One should be also aware of the small quantity of the aliquot available for conducting measurements. The necessity to develop the reliable and fast screening procedure was part of a large project aiming to evaluate the influence of cigarette smoking on the content of lead in whole blood and plasma of selected group of patients. The group examined were pregnant women who were active smokers throughout pregnancy. The control group consisted of pregnant but non-smoking women. The concentration of the element was monitored in all trimesters of pregnancy. The results obtained answer the question about the correlation between the level of lead in whole blood and plasma, the number of cigarette smoked daily and the low weight of the newborn children. The research was to confirm the negative influence of excessive exposition to lead on the prenatal development. The research was carried out in cooperation with Mother and Child Institute in Warsaw. The second area of research was part of interdisciplinary approach to investigate the reason of Wilson`s Disease. It aimed at answering the question whether, and if so which, elements beside copper are responsible for the symptoms and development of the disease. The objective of this dissertation was to elaborate a non-routine novel analytical procedure which would allow us to receive reliable results on the concentration of copper, iron, zinc and manganese in the tissues from different parts of human brain; all originating from the patients with Wilson`s Disease. The biggest difficulty in working out the procedure resulted from small sample quantities. This made it impossible to apply? microwave digestion, which is commonly used in decomposing biological and clinical samples. Another difficulty was the lack of commercially available reference material whose matrix would be ideally consistent with the sample examined. The research was carried out in cooperation with the Institute Psychiatry and Neurology in Warsaw. The aim of the third part of research was to elaborate and validate fully novel procedure which would allow mapping selected elements distribution over the tissues of human ovaries. It was expected that with such a procedure it would be possible to evaluate the correlation between the distribution of selected elements over the ovaries cross sections. Moreover, the comparison of the distribution maps between healthy human tissues and those from a person with cancer would broaden our knowledge on ovaries cancer. The biggest difficulty in establishing the analytical procedure was optimisation of conditions of laser ablation for ovaries tissues. It was due to the complex and heterogeneous sample matrix and the lack of commercially available reference material. After optimising the procedure an attempt was made towards finding the possible differences and correlation between heathy and cancerous tissues. The research was carried out in cooperation with Military Institute of Medicine in Warsaw.