Dissertations / Theses on the topic 'Myopathes'

La myopathie myotubulaire est une maladie musculaire congénitale très sévère. Le laboratoire d’accueil a démontré que les échantillons de muscle de patients atteints de cette maladie ainsi que le modèle murin présentent une surexpression de DNM2, alors que sa réduction par croisement génétique améliore les signes cliniques et histologiques de la maladie. Le but de ce travail consistait à développer, tester et valider des composés injectables qui ciblent DNM2 et diminuent son niveau. Deux approches thérapeutiques ont été développées l’une basée sur l’utilisation de virus adéno-associés (AAV) exprimant des shRNA, l’autre sur les oligonucleotides antisens (ASO). L’injection des vecteurs AAV-shDnm2 ou bien les ASO-Dnm2 pouvait corriger les défauts histologiques et fonctionnels des muscles des souris myopathes.Les résultats obtenus montrent le potentiel thérapeutique de la réduction de DNM2, et présente une nouvelle approche pour le traitement de la myopathie myotubulaire<br>Myotubular myopathy is a severe muscle disease. We previously have shown that muscle specimens of both patients and the mouse model presented an overexpression of DNM2, while its genetic reduction prevents the development of the muscle phenotypes. The aim of this work was to develop, test and validate deliverable compounds. Two therapeutic approaches were used. Injection of antisense oligonucleotide or adeno-associated virus expressing shRNA restores a normal lifespan with improved muscle structure and function of the myopathic mice. These results demonstrate that therapeutic potential of reduction of DNM2 level and provides an attractive therapeutic strategy that could be applied to treat myotubular myopathy

La myopathie à agrégats tubulaire (MTA) est une maladie rare caractérisée par la présence, dans la biopsie musculaire, d’« agrégats tubulaires ». Nous avons retrouvé 15 cas de MTA parmi 13987 biopsies musculaires réalisées dans les 35 dernières années dans notre service. Parmi ces cas, se trouvait une famille de trois patients qui ne pouvaient être inclus dans aucun groupe clinique connu de myopathie à agrégats tubulaires, car ils étaient asymptomatiques avec une hyperCKémie isolée et un test de contracture positif.Nos travaux ont mis en évidence des mutations hétérozygotes du gène STIM1. Ces mutations localisées dans la partie du gène qui code le domaine intraluminal EF-hand, entrainent une activation constitutive de STIM1 avec exacerbation du mécanisme SOCE et en conséquence l’augmentation de l’influx de Ca2+, démontré dans des myoblastes transfectés. Nous avons également mis en évidence la mutation p.Arg304Trp du gène STIM1, comme cause du syndrome de Stormorken. Cela augmente le spectre phénotypique des mutations de ce gène.Nos résultats de l’analyse protéomique montrent que la protéostase dans la MTA est dérégulée, car le profil du protéome est différent chez les patients et dans les agrégats tubulaires microdisséqués par laser, en comparaison a des contrôles. Les protéines enrichies s’avèrent appartenir à des voies biologiques impliquées dans l’homéostase ionique, les systèmes de membranes de la triade et de l’exosome et dans le métabolisme mitochondrial.Nos travaux ouvrent des perspectives pour mieux comprendre la physiopathologie de la myopathie à agrégats tubulaires et ainsi pouvoir proposer des solutions thérapeutiques efficaces<br>Myopathy with tubular aggregates (MTA) is a rare disease characterized by the presence of tubular aggregates in muscle biopsy. We found 15 cases of MAT in our registry including 13987 muscle biopsies performed over 35 years. Among them, there was a family of three patients that did not fit any of the previously described clinical groups of MTA, since they were asymptomatic with isolated hyperCKemia and positive contracture test. Our works revealed heterozygous mutations in the gene STIM1. These mutations localized in the gene portion that codes for the intraluminal EF-hand domain, leads to a constitutive activation of STIM1 with SOCE mecanism enhancement and consequent increase of the Ca2+ entry which was demonstrated using transfected myoblasts. We also revealed the mutation p.Arg304Trp in the coding sequencing of the CC1 domain of STIM1, as the cause of Stormorken syndrome. This fact increases the phenotypical spectra of the mutations for this gene.The results of our proteomic analysis show that the proteostasis in MTA is disturbed, because the proteome profile is different in total muscle of the patients and in their tubular aggregates when compared to controls. The enriched proteins belong to the biological pathways linked to ionic homeostasis, membrane systems of the triads and the exosome, and to the mitochondrial metabolism.Our works bring perspectives for the continuation of our studies, in order to better understand the physiopathology of the myopathy with tubular aggregates and propose efficacious therapeutic solutions

Les myopathies auto-immunes (MAI), classiquement appelées myosites ou myopathies inflammatoires idiopathiques, représentent un groupe de maladies définies par des caractéristiques cliniques, histopathologiques et biologiques. Une des caractéristiques les plus notables est la présence d’auto-anticorps (aAc) chez environ 60% des patients. Les MAI regroupent : les dermatomyosites, les polymyosites, les myosites à inclusion, les myosites de chevauchement incluant le syndrome des anti-synthétases et les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI). Les MNAI ont été récemment individualisées parmi les MAI comme des maladies graves fréquemment associées à la présence d’aAc dirigés contre la Signal Recognition Particle (SRP) ou la 3-Hydroxy-3-MéthylGlutaryl-CoA Réductase (HMGCR). La localisation de SRP et HMGCR étant intracellulaire, le rôle des aAc dans la physiopathologie des MNAI reste mal compris. La pathogénicité des aAc anti-SRP et anti-HMGCR envers des cellules musculaires cultivées in vitro a récemment été mise en évidence mais leurs effets in vivo demeurent inconnus.Au cours de cette thèse, j’ai étudié le rôle physiopathologique des aAc anti-SRP et anti-HMGCR in vivo chez la souris. Le transfert passif d’IgG de patients atteints de MNAI, positifs pour les aAc anti-SRP ou anti-HMGCR, à la souris sauvage entraîne un déficit musculaire. Ce déficit était prolongé chez la souris immunodéficiente Rag2-/-, et limité chez la souris déficiente pour la fraction C3 du complément. Chez les souris recevant les IgG anti-SRP+, le déficit musculaire était important et accompagné de quelques signes de nécrose myocytaire. Les IgG anti-HMGCR+ induisaient une faiblesse musculaire moindre, et des signes histopathologiques rares ou absents. Ces résultats sont en accord avec l’observation chez l’homme d’une maladie plus grave chez les patients anti-SRP+ par rapport aux patients anti-HMGCR+. La supplémentation en complément humain des souris augmentait le déficit musculaire induit par les IgG anti-HMGCR+ et de façon moindre pour les IgG anti-SRP+. En collaboration avec l’INSERM UMRS974, nous avons montré que les cibles SRP et HMGCR peuvent être détectées à la surface des fibres musculaires in vitro, suggérant qu’elles puissent être accessibles aux aAc in vivo.Ces résultats démontrent pour la première fois le rôle pathogène des aAc anti-SRP et anti-HMGCR in vivo et l’implication du complément, contribuant à une avancée dans la compréhension de la physiopathologie des MNAI<br>Autoimmune myopathies (AIM), classically called myositis or idiopathic inflammatory myopathies, represent a group of diseases characterized by clinical, histopathologic and biologic properties. One of the most notable properties is the presence of autoantibodies (aAb) in approximately 60% of patients. AIM includes five principal entities: dermatomyositis, polymyositis, inclusion body myositis, overlap myositis including the anti-synthetase syndrome and immune-mediated necrotizing myopathies (IMNM). IMNM have recently been individualized among AIM as severe diseases frequently associated with aAb directed against Signal Recognition Particle (SRP) or 3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-CoA Reductase (HMGCR). Since SRP and HMGCR have an intracellular localization, the role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in the pathophysiology of IMNM remains unclear. Anti-SRP and anti-HMGCR aAb were recently shown to be pathogenic to muscle cells in vitro but in vivo effects remain unknown.During this thesis, I studied the pathophysiological role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in vivo in mice. Passive transfer of IgG purified from plasma of IMNM patients positive for anti-SRP and anti-HMGCR aAb to wild-type mice elicited a muscle weakness. Immune-deficient Rag2-/- mice presented a prolonged muscle deficit, whereas complement component C3 deficient mice had limited signs. Mice injected with anti-SRP+ IgG displayed a strong muscle weakness with mild myocytic necrosis. The muscle deficit was milder and histopathologic findings were not always present in mice receiving anti-HMGCR+ IgG. This is in accordance with clinical findings in anti-SRP+ patients which present a more severe disease than anti-HMGCR+ patients. When supplemented with human complement, mice receiving anti-HMGCR+ IgG showed a more severe muscle deficit. This supplementation increased the deficit induced by anti-SRP IgG in a milder way. In collaboration with INSERM UMRS974, we showed that the targets SRP and HMGCR can be detected on the surface of myofibres in vitro, suggesting that they could be accessible to aAb in vivo.Together, these results demonstrate for the first time the pathogenic role of anti-SRP and anti-HMGCR aAb in vivo and the implication of complement, contributing to a progress in the comprehension of MNAI pathophysiology

L’apport du séquençage à haut débit dans la recherche de nouvelles associations génotype-phénotype. Cas particulier des titinopathies.Les myopathies sont un groupe de pathologies hétérogènes sur le plan phénotypique et génétique, avec actuellement plus de 150 gènes identifiés. Compte tenu de cette grande hétérogénéité, de l’existence de gènes de grande taille et de l’absence d’une nette corrélation phénotype-génotype, l’approche classique d’étude gène par gène (technique Sanger) était très chronophage et d’une efficacité limitée. Le séquençage de nouvelle génération a révolutionné leur diagnostic en permettant de séquencer, en un seul temps, l'ensemble des séquences d'intérêt de plusieurs gènes, incluant les gènes de grande taille. La problématique actuelle est que la mise en place de la technique de NGS à visée diagnostique a confronté les laboratoires de diagnostic génétique à des difficultés dans l’interprétation des nombreux variants de séquence retrouvés pour chaque patient.Nous avons analysé par NGS une cohorte de 156 patients atteints d’une myopathie non étiquetée après avoir éliminé les principales hypothèses cliniques par des recherches d’un seul gène par la technique Sanger ou par de mini-panels de gènes. Des variants pathogènes ou probablement pathogènes ont été identifiés chez 74 des 156 patients (47,4%). Un des résultats les plus significatifs de notre étude est le pourcentage très élevé de diagnostics positifs chez les patients de moins d’un an présentant une hypotonie néonatale avec atteinte respiratoire. Notre approche a permis de confirmer le diagnostic chez 82% des cas. Une des conséquences du travail a été la proposition de faire un NGS en première intention chez ce type de patients ce qui permettra de pouvoir réaliser une prise en charge adaptée et un conseil génétique approprié aux parents.Un autre résultat très intéressant a été l'identification de nouvelles associations phénotypes/génotypes dans environ 10% des cas. Nous les avons classées en trois catégories : 1) Phénotype modéré par rapport à la sévérité clinique habituelle associée aux variants pathogènes dans le gène en cause. 2) Phénotype élargi si les symptômes n’avaient pas été décrits précédemment et 3) Variants dans un gène récemment impliqué dans les myopathies. La deuxième partie du travail concernait l’analyse de 13 familles par WES, (séquençage de toutes les régions codantes de l’ADN) pour lesquelles le NGS sur panel de gènes était négatif. Nous avons pu confirmer le diagnostic uniquement chez une famille. Ce résultat est en accord avec les données de la littérature, qui montrent que l’efficacité du WES n’est pas supérieure à celle du NGS sur panel de gènes. La troisième partie de la thèse était focalisée sur l’étude du gène TTN qui représente un exemple des difficultés d’interprétation des variants issus de l’analysé par NGS, étant donné la grande taille du gène avec 364 exons et la présence importante des variants dans la population générale. Nous avons mis en place dans le laboratoire un projet dont l’objectif général a été de développer une approche intégrée phénotype-hérédité-génotype-transcrits-protéine. Un des éléments principaux est l’étude des conséquences des variants TTN sur les transcrits et sur la quantité et la taille de la protéine par WB. Les études réalisées chez des patients atteints de formes de transmission récessive de titinopathie congénitale a montré des effets complexes, avec plusieurs populations de transcrits. Par ailleurs, nous avons pu établir une nouvelle corrélation génotype-phénotype chez une famille avec phénotype de myopathie distale à prédominance postérieure qui portaient une délétion hétérozygote des exons 11 à 18 du gène TTN. A notre connaissance, ce phénotype particulier n’a pas été rapporté jusqu’à présent dans la littérature<br>Unravelling new phenotype/genotype correlations in myopathies with next generation sequencing. TitinopathiesNext-generation sequencing (NGS) is a revolutionary technology that allows the simultaneous analysis of multiple genes. The main NGS challenge is the clinical interpretation of the molecular findings to differentiate pathogenic, likely pathogenic, and non-clinically significant DNA variants. The purpose of this study was the detection of gene variants that cause myopathy in a cohort of 156 pediatric and adult patients by targeted NGS. We identified a pathogenic variant in 74 of the 156 patients (47.4%). The highest rate of positive diagnosis was in patients with congenital myopathies. Particularly, 82% of patients with severe hypotonia at birth had a pathogenic variant, suggesting that NGS should be considered the first diagnostic tool in this group. The most interesting result was the identification in 10% of patients of new or unusual phenotype/genotype associations concerning several genes. In some cases, this contributed to expand the phenotype associated with a specific gene. In the others, the disease severity or the inheritance mode differed from the classical clinical descriptions. The stepwise diagnostic methodology used in this work and the selected patient population could explain the remarkably high percentage of expanded phenotype-genotype associations (more than 10% of cases). Indeed, in addition to the classical in silico predictions of the variant and familial segregation, the procedure for validating the association between atypical or incomplete phenotypes and a genetic variant included also deep phenotyping (i.e., detailed clinical examination, whole-body muscle MRI, and additional techniques for muscular biopsy analysis, such as electron microscopy), multidisciplinary concertation, exhaustive and continuous literature update and if necessary, advice from international laboratories that are experts in specific genes.Since the widespread use of Next Generation Sequencing (NGS), the exhaustive analysis of the 364 exons of the TTN gene revealed an increasingly number of reported TTN variants. However, it is often difficult to assess the pathogenicity of the identified variants, in particular missense ones, due to the clinical heterogeneity of the pathology, the large size of the gene, the frequency of TTN variants in the general population. The aim of the study is to develop a workflow for interpreting TTN variants. This workflow is based on deep phenotyping, evaluation of the effects of TTN variants predicted to affect transcription and/or splicing on skeletal muscle titin transcripts, and evaluation of the consequences of some variants on protein by Western Blot studies. Our study highlights the importance of analyzing the consequences of variants not only on protein, but also on transcripts, to have an exhaustive understanding of the consequences of variants at the transcriptional and protein level

This study was aimed at the investigation of the mechanisms by which mutations on proteins of the thin filaments could lead to cardiac and skeletal muscle diseases. The contractile properties of reconstituted thin filaments were assessed using the quantitative in vitro motility assay. The cardiac disease investigated was the dilated cardiomyopathy (DCM). Pilot work on 2 mutants indicated that, contrarily to what was believed in the past, the molecular phenotype generated by mutations on thin filament proteins linked to the disease was not a reduced absolute Ca2+-sensitivity and cross-bridge turnover rate, but an uncoupling between the phosphorylation level of troponin I and the Ca2+-sensitivity. In this thesis I will present the confirmation of the hypothesis with 7 DCM causing mutations. At least one mutation on each of the thin filaments subunits was tested and they all shared that molecular phenotype despite differences in the absolute Ca2+- sensitivity. Mutations on β- and γ-tropomyosin linked to 3 skeletal muscle diseases, Nemaline myopathy, Cap disease and congenital fibre type disproportion (CFTD), were taken into consideration. Some of these mutations were also reported to cause more than one of these diseases. The β-tropomyosin mutations indicated that there is not a clear correlation between molecular phenotype and disease, as different modifications of the contractile properties seem to lead to the same disease. One of the β-tropomyosin mutations (ΔK7), though, as another mutation on skeletal actin (K326N) that was investigated, showed a new hypercontractile phenotype connected to a gain-offunction molecular phenotype, which led to a change in the clinical diagnosis. The experiments performed with the γ-tropomyosin mutants encountered many technical issues but indicated that a common phenotype of decreased Ca2+-sensitivity might be connected to CFTD, observation supported also by a β-tropomyosin mutant connected only to that disease.

BIN1 est une protéine qui tubule les membranes. Elle est composée de plusieurs domaines : un domaine BAR, qui lie les membranes et possède une propriété de tubulation; un motif PI qui lie les phophoinositides et est uniquement exprimé dans le muscle squelettique; un domaine CLAP qui lie la clathrin et AP2 et qui n'est présent que dans les isoformes de BIN1 exprimées dans le cerveau; un domaine MBD impliqué dans la liaison à c-Myc; et un domaine SH3 impliqué dans les interactions avec les protéines riches en prolines. BIN1 est une protéine ubiquitaire, et l'organe où elle est le plus fortement exprimée est le muscle squelettique. Il a été montré que des mutations dans l'amphiphysine 2/BIN1 causent une myopathie centronucléaire récessive (ARCNM, OMIM 255200). Les mutations trouvées chez les patients sont réparties dans tous les domaines de la protéine, et deux d'entre elles aboutissent à un codon stop prémature dans l'exon 20, dernier exon de la protéine. Le motif PI, codé par l'exon 11, est régulé positivement pendant la myogenèse. Le but de cette recherche était de mieux comprendre le rôle de BIN1 dans le muscle sain et dans le cas de myopathie centronucléaire. Nous avons donc utilisé la technique de recombinaison homologue ciblée dans les cellules ES pour générer deux lignées de souris knockout: BIN1 exon 11 (délétion de l'exon 11) et BIN1 exon 20 (délétion de l'exon 20). La délétion de l'exon 20 détruit le domaine SH3, qui permet l'interaction de BIN1 avec différentes protéines, dont la dynamine 2, et induit une baisse considérable de l'expression de BIN1 au niveau protéique. Les délétions totales et spécifiques du muscle de l'exon 20 provoquent une létalité périnatale. Nous avons observé une perturbation de l'organisation des tubules T chez les souris KO, ce qui montre l'importance de BIN1 pendant la biogenèse des tubules T. Cependant, l'induction de la délétion chez la souris adulte n'a affecté ni la fonction ni l'organisation du muscle. Pour comprendre le rôle du motif PI, qui est spécifique du muscle, nous avons caractérisé les souris BIN1 KO exon 11. Même à 12 mois, la fonction du muscle n'était pas compromise chez ces souris. En revanche, nous avons observé des problèmes de régénération du muscle squelettique. Ce travail révèle, qu'in vivo, BIN1 est nécessaire pour la biogenèse des tubules T, mais pas indispensable pour le maintien du muscle. D'autre part, le domaine PI, spécifique du muscle, est impliqué dans la régénération musculaire. Sa function dans les muscles est régulée finement par l’expression de différentes isoformes et par des interactions intra-moléculaires. Comprendre ces caractéristiques nous aiderait à développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de ARCNM et de MD<br>BIN1 is a membrane tubulating protein and it consists of the BAR domain which binds membranes and has tubulating property; the PI motif which binds phosphoinositides and is expressed only in skeletal muscle; the CLAP domain binds clathrin and AP2 and is present exclusively in brain isoforms of BIN1; the MBD is involved in c-Myc binding and the SH3 domain is involved in interactions with prolin-rich proteins. BIN1 is an ubiquitously expressed protein with the highest expression in skeletal muscle. Mutations in amphiphysin 2 / BIN1 were found to cause autosomal recessive centronuclear myopathy (ARCNM, OMIM 255200). Mutations in patients were found in all the protein domains and include two mutations leading to a premature stop codon in the last exon 20. The PI motive, encoded by exon 11, is upregulated during myogenesis. The aim of this research was to better understand the role of BIN1 in healthy muscle and in the pathology of CNM. For this purpose, by using targeted homologous recombination in ES cells, we generated two knockout mouse models: BIN1 exon 11 and BIN1 exon 20, with exon 11 and 20 deleted, respectively. The deletion of exon 20 disrupts the SH3 domain, involved in interactions with different proteins, amongst which is dynamin 2 and induced a considerable loss of the total BIN1 protein expression. The total and muscle specific deletions of exon 20 were perinatally lethal. A disrupted T-tubules organization was observed in knockout mice, showing an importance of BIN1 during the T-tubule biogenesis. Interestingly, deletion induced in adult mice did not affect muscle function and organization. In order to understand the role of the muscle specific PI motif, we characterized the BIN1 exon 11 KO mice. Even at 12 months of age the muscle function in mice was not compromised by this deletion. However, further examination showed impairment of skeletal muscle regeneration. This work revealed that in vivo, BIN1 is necessary during the T-tubules biogenesis and dispensable for muscle maintenance, whereas the skeletal muscle specific PI motif of BIN1 is involved in muscle regeneration. Its function in muscle is tightly regulated by isoform switch and intramolecular binding. Understanding these features will help us step forward towards successful therapy in ARCNM and MD patients

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNM<br>Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNM

Aujourd’hui encore, le diagnostic des maladies génétiques et la compréhension des mécanismes pathologiques qui en découlent demeurent difficile. On dénombre à ce jour plus de deux cents formes de myopathies, en majorité d’origine génétique, mais dont les gènes ne sont pas toujours identifiés. Dans le cas où le gène causal est connu, il peut subsister des problèmes diagnostics. L'absence d’information génétique peut alors nuire à la prise en charge des malades ainsi qu’au développement d’outils thérapeutiques. Ma thèse a été conduite dans le but d’améliorer ces éléments : j’ai mis en évidence l’implication d’un nouveau gène dans la dystrophie facio-scapulo-humérale ; optimisé le diagnostic des calpaïnopathies en étudiant l’impact de mutations faux-sens sur l’épissage du gène responsable et analysé les interactions protéiques et ioniques mises en place lors de phénomènes d’entrée calcique. Enfin, j’ai participé au développement d’outils thérapeutiques dans le cadre des dysferlinopathies<br>Nowadays, diagnosis and pathomechanisms of genetic disorders remain difficult to explore. There are actually more than 200 forms of myopathies, mostly genetics, even if the culprit gene is not always identified. However, even when the causative gene is known, it often remains diagnostic issues because of clinical and genetic heterogeneity and wide mutational spectrum. The lack of genetic information affects patients cares and impairs the development of new therapeutic tools. My thesis was conducted in order to extend these elements: I have shown that a new gene may be involved in facio-scapulo-humeral dystrophy; I have improved calpainopathie’s diagnosis by studying the impact of missense mutations on RNA splicing; I have also analyzed how proteins contributed to calcium entry in the cell. Finally, I contributed with a new therapeutic tools for dysferlinopathies

Mitochondrial myopathies are a group of progressive muscle disorders caused by mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) for which there is no effective treatment. Culturing of myoblasts from patients with sporadically occurring mitochondrial diseases has suggested that mtDNA mutations may be lower or absent in muscle stem cells (satellite cells). The activation of muscle satellite cells and subsequent repair of muscle fibres may favourably shift the balance of delete to wild-type (WT) mtDNA, thereby decreasing mtDNA mutation load in affected muscle. This research has investigated muscle precursor cells from patients with mitochondrial myopathy due to sporadically occurring mtDNA deletions. This was to determine if they will benefit from attempts to “gene shift” the balance of WT and mutated mtDNA in their muscles using high intensity resistance training. Fluorescently Activated Cell Sorting (FACS) on the basis of CD56 (NCam) was used to isolate satellite cells and real time PCR to analyse them. In all eight patients investigated mtDNA deletions were detected in satellite cells at levels similar to mature muscle. In most of these patients the mtDNA deletions were lost during the culturing of their myoblasts. In some patients, however, the mutation was maintained, although there was a gradual decline in mutation load as the myoblasts headed towards differentiation. It was hypothesised that this difference between patients in the maintenance or loss of mutations in their myoblasts was attributable to an mtDNA bottleneck effect at the point of satellite cell activation. A second selection point occurred during the process of myoblast proliferation, possibly mediated by segregation of WT and delete mtDNA after cell division. Daughter cells that inherit large amounts of delete mtDNA will be unable to continue to proliferate. If efforts to “gene shift” in these patients will involve the activation of satellite cells to repair damaged muscle, it is paramount that this process does not exhaust the muscle stem cell pool. Satellite cell numbers have been determined in patients harbouring sporadically occurring mtDNA deletions, who will be considered potential beneficiaries of exercise based interventions. No significant difference was observed in satellite cell numbers when patients were compared to controls. In addition, a single patient was examined for satellite cell numbers over eleven years and no reduction in numbers was found. Given that the large majority of single deletion patients will lose their mtDNA mutation during the process of muscle regeneration and that they will not suffer from an exhaustion of the satellite cell pool, “gene shifting” remains a viable therapy in these patients. However, the mechanisms behind the process are somewhat different to what was originally hypothesised.

Les myopathies congénitales sont un groupe hétérogène de maladies musculaires héréditaires définies sur la base de lésions morphologiques caractéristiques observées dans la biopsie musculaire des patients atteints. Ces lésions histologiques peuvent être, en particulier, des agrégats protéiques, des ‘cores’ ou une augmentation du nombre de noyaux centralisés. Le phénotype clinique classique associe une hypotonie musculaire à début précoce et une faiblesse musculaire, associée parfois à d’autres signes cliniques comme par exemple une atteinte oculaire. Il n'existe aucun traitement spécifique pour ces maladies. Les myopathies congénitales avec agrégats protéiques sont un sous-groupe des myopathies congénitales caractérisées par la présence d’accumulations de protéines dans les fibres musculaires. L'analyse morphologique peut distinguer des agrégations non spécifiques des protéines et / ou des corps d’inclusions bien définis. Les mécanismes conduisant à l'agrégation protéique ne sont pas encore complètement élucidés. Une analyse morphologique fine et détaillée pourrait aider à éclaircir les événements responsables de ce phénomène. De nombreux ‘loci’ génétiques ou des mutations génétiques ont été identifiées dans plus de 20 formes de myopathies congénitales. Néanmoins, à l’heure actuelle une grande partie des patients atteints ne présente pas de mutations dans les gènes connus. Donc, plusieurs entités restent toujours à identifier. Pour remédier à cette lacune de connaissance, des nouvelles approches d’analyse génétique ont été élaborées. L'une des techniques la plus prometteuse est le séquençage d’exome ou séquençage à haut débit. Cette dernière consiste à l’analyse de séquençage multiple et ciblé de l'ensemble des séquences codantes du génome humain. Cet outil pourrait sûrement contribuer d’une façon déterminante à la découverte de nouveaux gènes responsables de ces maladies monogéniques rares. Mon travail porte sur l’analyse de patients atteints par trois différentes formes de myopathies congénitales avec des agrégats de protéines. Nous avons analysé à la fois des cohortes de patients avec un diagnostic moléculaire ainsi que des patients qui ne présentaient pas de mutations dans les gènes connus. Les trois pathologies étudiées sont : la myopathie à corps réducteurs ou ‘reducing body myopathy‘ (RBM), myopathie némaline ou ‘nemaline myopathy’ (NM) et, la myopathie avec structures cap ou ‘cap disease’(CD). Nous nous sommes concentrés sur trois axes principaux: 1 -. Analyse morphologique et étude des mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent l'apparition des agrégats de protéines chez les patients atteints RBM et autre phénotype associé à des mutations dans le gène FHL1. 2 -. Caractérisation clinique et morphologique des familles présentant des formes néonatales de NM et CD sans caractérisation génétique moléculaire. 3 -. Validation fonctionnelle de l'expression protéique de mutations dans des nouveaux gènes identifiés par séquençage d’exome chez des patients avec myopathie congénitale génétiquement non identifiée. Dans la première partie de cette étude, j'ai analysé un groupe de dix-huit patients présentant une RBM ou d’autres phénotypes associés à des mutations dans le gène FHL1. Les mutations dans ce gène ont été associées à des phénotypes hétérogènes, y compris la ‘reducing body myopathies’ (RBM), le ‘X-linked scapuloperoneal syndrome’ (X-SPM), la ‘X-linked muscular postural atrophy’ (XMPMA), la ‘Emery-Dreifuss-muscular dystrophy’ (EDMD), et une forme de myocardiopathie isolée (HCM), ainsi que des formes de chevauchements. J'ai mené une analyse immunohistochimique, ultrastructurale et en immunogold comparative détaillée chez 14 patients RBM (groupe 1), 3 patients EDMD, et un patient avec HCM et hypertrophie musculaire (groupe 2). L'analyse des biopsies musculaires pour le groupe 1 a montré des ‘reducing bodies’ (RBs) associés à des corps cytoplasmiques comme caractéristique récurrente. Les RBs présentaient une franche immunoréactivité avec l’anticorps FHL1. Du matériel réactif pour la desmin, alphaB-cristalline et la myotiline a été observée autour des RBs. En microscopie électronique (EM), les RBs étaient composés de matériel tubulofilamenteux dense qui se propage progressivement entre les myofibrilles et autour des noyaux musculaires. En utilisant des techniques d’immunogold, nous avons démontré que la protéine FHL1 se trouve uniquement à l'intérieur de RBs. Les échantillons du groupe 2 ont montré uniquement des anomalies dystrophiques légères, sans RBs. Avec la EM nous avons observé seulement des anomalies myofibrillaires aspécifiques. L'analyse moléculaire a révélé des mutations faux-sens dans le 2ème domaine LIM FHL1 chez les patients du groupe 1. Chez les patients du groupe 2 nous avons trouvé des mutations INS / DEL ou faux-sens dans le 4ème domaine LIM FHL1. Grâce à cette étude, j'ai pu analyser et décrire en détails les caractéristiques morphologiques des patients RBM, ainsi que démontrer clairement la localisation de la protéine FHL1 dans les RBs. J’ai pu également illustrer les différences morphologiques majeures entre différentes myopathies liées au gène FHL1 (Malfatti et al. , JNEN 2013). La deuxième partie du projet a porté sur l’analyse morphologique détaillée chez plus de 100 patients présentant une myopathie congénitale. Nous avons identifié des cohortes homogènes de patients sans diagnostic moléculaire qui présentaient des myopathies congénitales d’apparition prénatale ou néonatale avec agrégats protéiques. L’analyse d’exome d'un premier groupe de cinq patients a permis l'identification de mutations autosomique récessive dans le gène RYR1 chez trois patients ; les deux derniers patients ont été trouvés mutés dans le gène de la nebuline (NEB) Cette étude a permis de démontrer qu'une analyse morphologique détaillée de patients présentant des formes néonatales sévères de myopathies congénitales oriente vers un diagnostic génétique précis. Elle a également confirmé que les myopathies congénitales présentent une large hétérogénéité génétique et phénotypique et que le séquençage d’exome est un outil de diagnostic rapide et efficace, surtout pour l’analyse des grands gènes (Bohm, Vasli, Malfatti et al. , PlosONE 2013). L'analyse morphologique visant à l'identification des cohortes homogènes pour l’étude d’exome a permis de mettre en évidence certains patients présentant un tableau morphologique particulier. Un de ces patients présentait une association particulière de bâtonnets et de structures ‘caps’ dans sa biopsie musculaire. Cette association histologique n'avait jamais été signalée auparavant. L’analyse d’exome a révélé une mutation AD du gène TPM3. Le gène de l’'a-tropomyosine (TM) lente, TPM3, code pour une protéine des filaments fins exprimé uniquement dans les fibres musculaires de type I. Des mutations dans le gène TPM3 ont été associées à trois tableaux histologiques différents : la myopathie nemaline (NM), la myopathie congénitale identifiée avec disproportion de type de fibres (CFTD) et, plus récemment, la ‘Cap disease’ (CD). Ces derniers ont été décrits que séparément auparavant. L'identification d'un patient présentant une association unique de ‘Cap’ et bâtonnets dans sa biopsie musculaire nous a permis d'élargir le spectre morphologique de patients mutés TPM3, et d’affirmer la proximité histologique de différentes myopathies liées à des mutations du gène TPM3 (Malfatti et al. , Neuromuscular Disorders 2013). La troisième partie de ce deuxième axe a consisté à effectuer le séquençage d’exome d’un groupe de quatorze patients avec différentes formes cliniques de myopathie némaline. Cette analyse a mené à l’identification de mutations autosomiques récessives dans le gène nébuline (NEB). Afin de mieux caractériser ce groupe de patients nous avons effectué une analyse morphologique détaillée du muscle chez ces patients. Nos objectifs étaient la recherche de corrélations clinico-morphologiques et la constitution de groupes homogènes au point de vue histologique. Quatre groupes ont été identifiés en fonction de la sévérité clinique et de l'âge à la biopsie musculaire. Le Groupe 1 (n = 4) comprend des NM graves /lethales et une biopsie musculaire effectuée durant les premiers jours de vie. Le Groupe 2 (n = 5) comprend NM sévères et une biopsie après un mois de vie. Le Groupe 3 (n = 3) comprend NM typiques et une biopsie faite dans l'enfance, et le groupe 4 (n = 2) comprend des formes légères de NM et une biopsie faite à l'âge adulte. Les biopsies ont été analysées au point de vue histoenzymologique, immunohistochimique et ultrastructurale. La distribution des bâtonnets, leurs caractéristiques ainsi que la répartition des types des fibres ont été étudiés. Tous les patients présentaient des mutations NEB compatibles avec un mode de transmission AR. Chez le patients du G1 nous avons identifié une prédominance de type 2, contrairement à ce qui avait été décrit chez les patients avec myopathies congénitales ; Les bâtonnets étaient présents dans 1/3 de fibres musculaires et avaient une forme plutôt carré. L’analyse ultrastructurale a révélé un pourcentage élevé de fibres avec importante désorganisation sarcomérique. Le G2 a montré une predominance type allant jusqu’à une uniformité de type 1. Les bâtonnets présentaient une forme et une répartition variable au milieu de la fibre. L’analyse en ultrtastructure a montré la présence de rares fibres avec désorganisation sarcomérique. En revanche, le G3 et G4 ont présenté une uniformité de type 1 associé à des groupes bien délimité de bâtonnets sous-sarcolemmaux ayant une forme préférentiellement allongée. Il n’y avait pas de désorganisation sarcomérique majeure. En conclusions: 1) Nous avons observé la persistance de prédominance de type 2 dans la biopsie musculaire des nouveau-nés présentant des formes létales liées à des mutations NEB. 2) Nous avons démontré une corrélation directe entre la désorganisation sarcomérique et la sévérité clinique. La présence de groupement des bâtonnets bien délimités chez les patient moins sévères suggère une réponse musculaire d’autoprotection contre la diffusion / propagation des bâtonnets à l’intérieur de la fibre musculaire chez ces derniers patients. (Malfatti et al. , en préparation). La troisième partie de l'étude concerne l’analyse précise des lésions morphologiques particulières présentes dans la biopsie musculaire d’une famille dont les résultats de séquençage d’Exome effectuée par la équipe du Dr Nigel Clarke / Pr Kathrin North de l’Université de Sidney ont mis en évidence des mutations dans un nouveau gène. Dans ce cadre, j'ai effectué une analyse clinique, morphologique, en immunofluorescence (IF) et en microscopie électronique d’une cohorte de nouveau-nés (N = 20) présentant un phénotype clinique ou morphologique similaire. De plus, nous avons effectué une analyse en immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre la protéine codée par le nouveau gène. Cette étude a permis de démontrer une absence d’expression de cette protéine chez les patients mutés. En revanche, nous n’avons pas observé d’altération de l’expression protéique (expression absente ou réduction) chez les autres patients analysés. Les résultats de ces deux études représentent des données préliminaires et strictement confidentielles<br>Congenital myopathies are a heterogeneous group of inherited muscle disorders defined according to the characteristic morphologic lesions observed in the patient muscle biopsies. These lesions could be protein aggregates, cores, and an increased number of central nuclei. The clinical phenotype consists of hypotonia and muscle weakness from infancy, variably associated with other clinical characteristics. There is no specific treatment for these conditions. The congenital myopathies with protein aggregates are a subgroup of congenital myopathies characterized by aggregations of proteins in muscle. Morphological analysis of muscle can distinguish between nonspecific protein aggregations and/or well-defined inclusion bodies, patches or clusters. Mechanisms leading to protein aggregation still remain not completely elucidated. A deep morphological analysis could help in elucidating the events responsible for this phenomenon. Numerous gene loci or gene mutations have been identified in more than 20 forms of congenital myopathies. Nevertheless a large portion of affected patients is not mutated in the known genes. Several unknown entities remain to be discovered. To overcome this gap of knowledge novel approaches are being developed. One of the most promising is next generation or exome sequencing that consists in targeted re-sequencing of all coding sequences within the genome. This tool will surely help the discovery of new genes underlying these rare monogenic diseases. In this study we concentrated in affected by three different forms of congenital myopathies with protein aggregates with or without molecular diagnosis: Reducing Body Myopathy (RBM), Nemaline myopathy (NM) and Cap disease (CD). My activity was focused on three main axes: 1. - Morphological analysis and investigation of pathophysiological mechanisms underlying the appearance of the protein aggregates in patients with RBM and other phenotype associated with mutation in the FHL1 gene. 2. - Clinical and morphological characterisation of families affected by neonatal forms of NM and CD without a genetic characterization. 3. - Functional validation of protein expression of mutations in novel genes identified through next generation sequencing in families presenting with non-diagnosed congenital structural myopathy. In the first part of my study I analysed a group of eighteen patients presenting RBM and other phenotype associated with mutations in the FHL1 gene. FHL1 mutations have been associated with different disorders including reducing body myopathy (RBM), scapuloperoneal syndrome (X-SPM), X-linked myopathy with postural atrophy (XMPMA), Emery-Dreifuss-like muscular dystrophy (EDMD), isolated hypertrophic cardiomyopathy (HCM), and some overlapping conditions. I conducted a detailed histochemical, immunohistochemical, ultrastructural, and immunoelectron microscopy comparative analysis in 14 RBM (group 1), 3 EDMD, and one patient with HCM and muscular hypertrophy (group 2). The analysis of muscle biopsies in group 1 showed reducing bodies (RBs) associated with cytoplasmic bodies as a constant feature. RBs had a prominent FHL1 immunoreactivity. Desmin, alphaB-crystallin and myotilin immunoreactivity was observed surrounding RB. Under electron microscopy (EM), RBs were composed of electron dense tubulofilamentous material that progressively spreads between the myofibrils and around myonuclei. Using immunoelectron microscopy we demonstrated that FHL1 protein is found uniquely inside RBs. Samples from group 2 showed mild dystrophic abnormalities, without RBs. Only minor non-specific myofibrillar abnormalities were observed under EM. Molecular analysis revealed missense mutations in the 2nd FHL1 LIM domain in group 1 patients and ins/del or missense mutations within the 4th FHL1 LIM domain in patients from group 2. With this study I was able to expand the morphological features of RBM, clearly demonstrating the localization of FHL1 in RB, and further illustrating major morphological differences between different FHL1-related myopathies (Malfatti et al. , JNEN 2013). In the second part of the project we performed a deep morphological analysis in our cohort of more than 100 patients presenting a congenital myopathy and we identified homogeneous cohorts of patients presenting neonatal or antenatal onset congenital myopathies with protein aggregates. The exomes of a first group of five patients from four unrelated families presenting with different skeletal muscle pathologies, including a fatal nemaline myopathy with neonatal onset, arthrogryposis and severe respiratory failure, a severe congenital myopathy with internal nuclei and myofibrillar desorganization were sequenced (analysis conducted by Jocelyn Laporte group. ANR Programme Blanc Edition 2011: Identification of novel genes implicated in structural congenital myopathies by exome sequencing to Dr Jocelyn Laporte, IGBMC, UMR7104 INSERM, Illkirch, France, and Dr Norma Beatriz Romero, Unité de Morphologie Neuromusculaire, Institut de Myologie, CHU La Pitié-Salpêtrière). This analysis leads to the identification of autosomal recessive RYR1 mutations in in three patients with different clinical and histological features. RYR1 codes for the skeletal muscle ryanodine receptor, a key player in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The two other sporadic patients with fatal neonatal myopathy were found to harbor mutations in NEB, encoding the contractile unit scaffold protein nebulin. We therefore demonstrated that a deep morphological analysis of patients presenting severe neonatal forms of congenital myopathies could help in the orientation toward a specific genetic diagnosis. This study confirmed that congenital myopathies present with broad genetic and phenotypic heterogeneity and that Exome sequencing is a fast and efficient diagnostic tool, especially for large genes (Bohm, Vasli, Malfatti et al. PlosONE 2013). The deep morphological analysis conducted for the identification of homogenous cohorts to be screened by exome analysis allowed the identification of some peculiar and morphologically unique patients. One of this presented a striking combination of cap structures and typical nemaline bodies in his muscle biopsy. This histological association was never reported before. Exome sequencing analysis revealed a recurrent mutation of TPM3 gene. The a-tropomyosin (TM) slow gene, TPM3, codes for a thin filament protein expressed uniquely in type I muscle fibres. The latter belongs to a highly conserved family of actin-binding proteins (TM) that plays important roles in a wide range of cellular process. Tropomyosin is essential for the regulation of muscle contraction. A lack of or an abnormal tropomyosin could explain muscle atrophy and weakness. However the exact mechanisms leading to muscle weakness remains unclear. Mutations in TPM3 have been associated with three distinct and separate histological pattern: nemaline myopathy (NM), myopathy identified as congenital fibre-type disproportion (CFTD) and, more recently, cap disease. These extremely variable histological patterns spanning from protein inclusions (e. G. Rods and caps) to an isolated defect of type 1 fibres, have been encountered only separately. The identification of a patient presenting a unique association of caps and rods allowed us to enlarge the morphological spectrum TPM3 mutated patients, and tightens the histological boundaries of TPM3-related myopathies (Malfatti et al. , Neuromuscular Disorders 2013). The exomes sequencing, successively confirmed by dHPLC/Sanger-sequencing, in a group of fourteen patients with different clinical form of Nemaline myopathies lead to the identifications of autosomal recessive mutations in the nebulin (NEB) gene. To better characterize this group of patients we performed a detailed muscle morphological analysis of this cohort of fourteen NEB-mutated patients to define pathological patterns and clinical-morphological correlations. Four groups were identified according to clinical severity and age at biopsy. Group 1 (n=4) comprises severe/lethal NM and biopsy in first days. Group 2 (n=5) comprehends severe NM and biopsy after one month. Group 3 (n=3) comprises typical NM and biopsy in childhood, and group 4 (n=2) patients with mild NM and biopsy in adulthood. Biopsies underwent histoenzymological, immunohistochemical and ultrastructural analysis. Fiber type distribution, rod characteristics, distribution and localization were investigated. All patients presented NEB mutations consistent with AR inheritance. G1 failed to show type 1 fiber predominance and had scattered squared rods in 1/3 of fibers. Ultrastructural analysis revealed high percentage of fibers with sarcomeric disarray. G2 showed a variable pattern of fiber type distribution spanning from slight type 2 predominance to type 1 uniformity. Rods presented variable distribution and shape. Ultrastructural analysis revealed rare fibers with sarcomeric disarray. In contrast, G3 and G4 presented a homogeneous type 1 uniformity associated with well-delimited subsarcolemmal and/or cytoplasmic elongated rods without sarcomeric alterations. In conclusions we 1) identified an unreported absence of type 1 predominance in muscle biopsy of new-borns patients presenting severe NEB-related NM; 2) suggest a direct correlation between the association of sarcomeric disarray and clinical severity. The presence of well-delimited clusters of rods in milder affected subjects suggests a muscle self-protective response against rod diffusion/propagation (Malfatti et al. In preparation). The third part of the study concern the deep clinical and morphological analysis of family presenting mutations in a new gene identified through Exome sequencing effectuated by the team of Dr Nigel Clarke/Pr Kathrin North, University of Sidney. I performed a peer clinical, morphological, immunofluorescence (IF) and ultrastructural analysis of this family. Furthermore I proceeded to an IF screening using a panel of different antibodies raised against the protein coded by the newly identified gene on muscle biopsy from our cohort of patient (N=20) presenting similar phenotype/morphotype. IF analysis showed an absence of the protein expression on the muscle biospies from mutated patients. On the contrary we failed to show a reduced protein expression in the biopsied muscle of the other patients. The results of these two studies are preliminary confidential data

Die heterogene Gruppe der Myopathien kann sowohl die Funktion des Muskels beeinflussen, als auch andere Organsysteme. Erworbenen Muskelerkrankungen sind theoretisch behandelbar, jedoch stehen zumeist nur sehr unspezifische Behandlungsoptionen zur Verfügung, während für vererbte Formen bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten bekannt sind. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Muskelerkrankungen untersucht. Gemeinsam ist ihnen ein jeweils charakteristischer Einstrom von Entzündungszellen, wobei die Zusammensetzung des Zellinfiltrates (z.B. Lymphozyten oder Makrophagen) bei den verschieden Erkrankungen unterschiedlich war. Weiterhin unterscheidet sich das zugrunde liegende Zytokinmilieu für die einzelnen untersuchten Entitäten. Daher war es Ziel der Arbeit, die genauen Interaktionen zwischen den Immunzellen zu untersuchen, sowie die charakteristischen Phänomene der Erkrankungen (Hypoxie, Entzündung und Fibrose). Nekrotisierende Myopathien können sowohl durch eine immun-vermittelte Genese, als auch durch Kontakt mit toxischen Substanzen ausgelöst werden und beide Subgruppen können klar durch morphologische Kriterien, als auch durch spezielle Immunaspekte unterschieden werden. Makrophagen waren hier die vorherrschende Zellpopulation und im gesamten Muskel verteilt. Patienten mit Dermatomyositis dagegen zeigten ein typisches perifaszikuläres Atrophiemuster und hypoxische Effekte, wobei beide Phänomene deutlich ausgeprägter bei juvenilen, als bei adulten Patienten vorkamen. Erbliche Myopathien (z.B. Muskeldystrophie Duchenne) können ebenfalls entzündliche Infiltrate aufweisen und die Entwicklung von Fibrose in der Skelettmuskulatur ist dabei ein Hauptkriterium der Muskelfaserdegeneration. Ein neu entwickelter computer-basierter Algorithmus wurde genutzt, um diese Entwicklung zu quantifizieren. Die Menge an Bindegewebe steigt mit dem Alter der Patienten, während bei älteren Patienten außerdem ein fettgewebiger Umbau ein wichtiger Aspekt der Pathologie war.<br>The heterogeneous group of myopathies can affect the skeletal muscle or other organ systems and comprise a huge number of different entities. Acquired myopathies are potentially treatable, but there are often only unspecific treatment options, while there is no causative cure for inherited forms of myopathies. In this work, three different entities were analyzed, which all share common aspects of the immune response, but also feature distinct immunological aspects as well. They have an inflammatory part in common, which is mainly regulated by influx of immune cells. However, the composition of these cellular infiltrates (e.g. lymphocytes or macrophages) was varying between the diseases. In addition, the respective cytokine milieu was highly specific in the examined entities. Thus, the aim of the study was to precisely examine interactions between immune cells, and analyze characteristic pathological phenomena (hypoxia, inflammation and fibrosis). Necrotizing myopathies have an immune-mediated background or showed a toxic aetiology and both sub-groups can be distinguished by their morphological characteristics and certain immune aspects. Here macrophages are the predominant cell population and are spread throughout the muscle. Analyses of patients suffering from dermatomyositis showed a typical perifascicular pattern of atrophy, as well as effects of hypoxia and the described features are in general more pronounced in juvenile dermatomyositis than in the adult form. Inherited myopathies (e.g. Duchenne muscular dystrophy) harbor significant inflammatory infiltrates as well and development of fibrosis was a major feature of skeletal muscle degeneration. A computer-based algorithm was used to quantify fibrosis. The amount of connective tissue increased with the age of patients, while at late stage of disease fatty transformation was an additional important issue.

La myopathie centronucléaire (CNM) est un groupe de maladies génétiques caractérisées au niveau histologique par des noyaux au centre des myofibres au lieu de la périphérie. Des mutations dans trois gènes (MTM1, DNM2 et BIN1) sont associées à cette pathologie. Récemment, l’implication d’un nouveau gène a été révélée dans une myopathie congénitale, le gène PYROXD1. Cependant, la base moléculaire responsable du déséquilibre à l'intérieur de la cellule reste incertaine et la relation entre le niveau histologique et les symptômes chez les patients n'est pas comprise. De plus, aucun traitement n'est disponible pour ces maladies. Au cours de ma thèse, j'ai centré mon travail sur l'utilisation du modèle de levure S. cerevisiae pour comprendre trois protéines associées au CNM : la myotubularine Mtm1, l'oxydoréductase Pyroxd1 et la dynamine Dnm2. Ces données révèlent qu’il est possible d’utiliser une simple cellule eucaryote afin d'élucider certains aspects moléculaires de ces protéines impliquées dans des maladies humaines<br>Centronuclear myopathy (CNM) is a group of genetic disorders characterized at the histological level by nuclei at the center of the myofibers instead of the periphery. Mutations in three genes (MTM1, DNM2 and BIN1) are associated with this pathology. Recently the implication of a new gene has been revealed in a congenital myopathy, the PYROXD1 gene.However, the molecular basis responsible for the imbalance inside the cell remains unclear and the relation between the histological level and the symptoms in patients is not understood. Moreover, there is no treatment available for these diseases.During my thesis I have focused my work on using yeast S. cerevisiae model to understand three proteins associated to CNM: the myotubularin Mtm1, the oxidoreductase Pyroxd1 and the dynamin Dnm2. These data reveal that it is possible to use a single eukaryote cell to elucidate some molecular aspects of these proteins implicated in human disorders

Mitochondrial myopathies are a group of diverse neuromuscular disorders. Defects in electron transport chain (ETC) subunits have been implicated in pediatric and adult onset cases. Skin fibroblasts from four patients were studied to elucidate the biochemical defects.<br>Cells from two patients with ETC complex I deficiency, showed reduced oxidation of alanine with normal oxidation of succinate. Analysis of complex I subunits indicated deficient synthesis of the 20 kDa subunit in the severely affected patient. In the milder patient, subunit abnormalities were not detected.<br>Fibroblasts from a patient with facioscapulohumeral disease (FSHD), showed reduced oxidation of alanine and succinate through the ETC.<br>A fourth patient, with decreased activity in several complexes in muscle and liver, was found to have a heteroplasmic mtDNA population in fibroblasts.<br>These studies exemplify the heterogeneity of mitochondrial myopathies and demonstrate the utility of fibroblasts in the investigation of these disorders.

Les myopathies centro-nucléaires (CNM) sont un groupe de maladies musculaires sévères caractérisées par une faiblesse musculaire générale. La forme la plus sévère est la CNM liée à l’X (XLCNM), causée par des mutations de la Myotubularine (MTM1). D’autres formes autosomales existent et sont causées par des mutations de l’Amphiphysine2 (BIN1) et de la Dynamine2 (DNM2). Les mécanismes pathologiques menant aux CNMs restent à éclaircir et à ce jour aucune thérapie n’est disponible pour traiter les patients. Nous avons modulé les niveaux de protéines de MTM1, BIN1 et DNM2 dans des modèles murins de CNMs. Nous avons découvert que la sous-régulation de DNM2 sauvait le modèle murin de XLCNM et que la sur-expression de la protéine BIN1 humaine sauvait le modèle murin XLCNM ainsi que la forme autosomale causée par les mutations DNM2. Nous avons montré que MTM1 contrôlait l’adhésion cellulaire et le recyclage de l’intégrine dans les cellules musculaires. Nous avons observé que la sur-expression de BIN1 sauvait la dérégulation du recyclage de l’intégrine dans le modèle murin de XLCNM, ce qui suggère un lien fonctionnel entre BIN1 et MTM1 nécessaire pour l’adhésion focale au niveaux musculaire. Notre étude montre que MTM1, BIN1 et DNM2 participe à une voie de signalisation commune et que BIN1 et DNM2 représentent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CNM<br>Centronuclear myopathies (CNM) are a group of severe muscle disorder characterized by general muscle weakness. The most severe form is the X-linked CNM (XLCNM), caused by mutations in Myotubularin (MTM1). Others autosomal forms are caused by mutations in Amphiphysin 2 (BIN1) and Dynamin 2 (DNM2). The CNM pathomechanisms are still unclear and to date there are no therapies available to the disease. To investigate the pathways dysregulated in CNM and to identify new therapeutic strategies, we modulated MTM1, BIN1 and DNM2 protein levels in the CNM mouse models. We discovered that DNM2 downregulation rescued the XLCNM mouse model and that the overexpression of human BIN1 rescued the XLCNM and the autosomal dominant CNM form due to DNM2 mutations. We have also showed that MTM1 controls cell adhesion and integrin recycling in mammalian skeletal muscle and BIN1 overexpression rescued the integrin recycling alteration in XLCNM mouse model suggesting that MTM1 and BIN1 are functionally linked and necessary for focal adhesions in muscle. Therefore, our studies highlight that MTM1, BIN1 and DNM2 are in a common pathway and, BIN1 and DNM2 could be new therapeutic targets to treat the different CNM forms

Dans la fibre musculaire squelettique, le calcium activateur de la contraction musculaire provient du réticulum sarcoplasmique (RS). Parallèlement, un influx calcique est connu pour se développer à travers la membrane plasmique au repos et en activité, mais son rôle physiologique est méconnu. Le travail présenté vise par des approches électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires à caractériser les différentes voies d’influx de calcium et leurs mécanismes de régulation dans la fibre musculaire squelettique de souris adulte normale et pathologique. En combinant la technique de mesure d’extinction de fluorescence du Fura-2 par le manganèse à la technique de potentiel imposé, nos résultats démontrent dans une première partie que le calcium rentre au repos de manière passive selon son gradient électrochimique sans générer de courant détectable, tandis qu’en activité un influx activé par la déplétion du RS et un influx activé par la dépolarisation, tous deux électriquement silencieux, se développent en parallèle de l’entrée médiée par les canaux calciques voltage- dépendants de type L. La deuxième partie du travail s’intéresse à la protéine TRPC1 dont le rôle fonctionnel reste controversé dans la fibre musculaire. Contrairement aux résultats décrits dans la littérature, nos expériences de surexpression indiquent que TRPC1 s’exprime au niveau du RS longitudinal où il génère une fuite de calcium. Dans une dernière partie, il est décrit que l’amplitude des courants calciques voltage-dépendants de type L est réduite dans les fibres musculaires d’un modèle de souris présentant une myopathie centronucléaire liée à un déficit en une phosphatase lipidique, la myotubularine<br>In skeletal muscle, calcium in charge of activation of the contraction is released from the sarcoplasmic reticulum (SR). In parallel, a calcium influx is known to occur through the plasma membrane at rest and during activity, but its role remains elusive. The present work aims at characterizing the different calcium influx pathways and the mechanisms that regulate their activity in normal and pathological adult mouse skeletal muscle fiber using electrophysiological, cellular and molecular approaches. By combining the technique of manganese quenching of Fura-2 fluorescence and voltage clamp, our data first demonstrate that calcium enters muscle cell in a passive manner driven by the electro-chemical gradient without generating current, while during activity, a calcium influx activated by SR depletion and an influx evoked by depolarization, both electrically silent, occur in parallel with the calcium entry supported by voltage-dependent L-type calcium channels. The second part of the work investigates the properties of the TRPC1 protein whose functional role remains controversial in skeletal muscle. In contrast to data reported in the literature, our TRPC1 over- expression experiments indicate that TRPC1 is localized in the longitudinal SR where it operates as a calcium leak channel. In the last part of the work, we describe that the amplitude of the voltage-dependent L-type calcium channels is reduced in the muscle fiber from a murine model of centronuclear myopathy induced by a deficiency in the lipid phosphatasemyotubularin

L'adn mitochondrial (adn mt) code pour des proteines de la chaine respiratoire et de l'atp synthetase. Nous avons retrouve des deletions heteroplasmiques de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de myopathies oculaires et des mutations ponctuelles de l'adn mt dans les tissus de patients atteints de syndrome de merrf et de melas. Les deletions sont differentes d'un individu a l'autre (3 a 8,5 kb) et sont identiques dans les tissus d'un meme individu mais la quantite de molecules anormales est variable d'un tissu a l'autre. Elles amputent plusieurs genes codant pour les sous-unites des complexes i, iii, iv, et v et plusieurs genes d'arnt. Plus la quantite de genome mute est importante plus le deficit biochimique est detectable. Le mecanisme implique dans la formation des deletions demeure inconnu pourtant la presence de sequences repetees dans les 3/4 des cas suggere des mecanismes de recombinaison apres appariements de sequences homologues. Les mutations ponctuelles a la position 8344 et 3243 sont specifiques respectivement du syndrome de merrf et du syndrome de melas. Elles se situent dans les genes d'arn de transfert de la lysine au niveau de la boucle t pseudouridine c (8344) et de la leucine au niveau de la boucle dihydouracile (3243). Elles sont heteroplasmiques et se retrouvent a des taux variables suivants les tissus. Les mutations ponctuelles sont transmises selon les lois de l'heredite maternelle. Pour les deletions ce schema n'est pas retrouve: certains cas sont sporadiques, d'autres sont familiaux montrant une heredite autosomale dominante ce qui suggere l'intervention d'une proteine nucleaire dans le processus de formation des deletions

Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares touchant les muscles qui ne possèdent pour le moment pas de traitement curatif. Elles se manifestent par une hypotonie et une faiblesse musculaire généralisée pouvant entrainer le décès précoce des patients. Parmi elles, on retrouve la myopathie à némaline (NEM3) causée par des mutations dans le gène de l'alpha-actine (ACTA1) et la myopathie myotubulaire (XLMTM) liée à MTM1, qui se caractérisent respectivement du point de vue histopathologique par la présence d'agrégats protéiques et de noyaux en position centrale dans les fibres musculaires, et dont les mécanismes physiopathologiques sont encore mal connus.Dans ce projet de thèse, j'ai étudié la physiopathologie de la NEM3 grâce à l'analyse du transcriptome des muscles du modèle murin porteur de la mutation p.H40Y dans Acta1 (KI(Acta1)H40Y). Ainsi, plusieurs voies de signalisation ont été révélées comme étant dérégulées, notamment celles contrôlant la masse musculaire et la transmission synaptique. J'ai analysé la morphologie et fonction des jonctions neuromusculaires (JNM) et mis en évidence une fragmentation de celles-ci, associée à des altérations ultrastructurales et moléculaires, et une fatigabilité accrue du muscle mutant lors d'une stimulation nerveuse électrophysiologique répétée, ce qui pourrait ouvrir des perspectives de traitement pharmacologique. Parallèlement, j'ai aussi exploré des stratégies de thérapie génique pour cette myopathie. Mes résultats ont montré que l'administration intramusculaire et intraveineuse de virus adéno-associés recombinants (AAVr) exprimant le transgène ACTA1 sous le promoteur de la desmine ou du cytomégalovirus n'a pas permis d'améliorer le phénotype des souris KI(Acta1)H40Y. Ainsi, j'ai mis au point une autre approche consistant à réduire l'expression de l'ARN messager d'Acta1 et sélectionné in vitro des séquences siARN ayant la meilleure spécificité pour l'allèle muté. L'injection intramusculaire de vecteurs AAV exprimant des shARN ciblant le transcrit d'Acta1 muté chez le modèle murin n'a cependant pas montré de signes d'amélioration de la pathologie, mais plutôt une importante réaction immunitaire. Mes résultats indiquent donc qu'une optimisation de ces stratégies de thérapie génique sera nécessaire pour corriger la maladie.D'autre part, dans le contexte de la myopathie myotubulaire, j'ai participé au développement d'une approche thérapeutique visant à diminuer le niveau d'expression de la dynamine 2 dans les cellules musculaires en utilisant des oligonucléotides antisens (vivo-morpholinos). Des mutations dans le gène de la dynamine 2 (DNM2) sont responsables de la forme autosomique dominante de myopathie centronucléaire et la neuropathie de Charcot-Marie-Tooth de type DI-CMT2B; de plus, la surexpression de DNM2 est impliquée dans le mécanisme physiopathologique de la myopathie myotubulaire. Nous avons montré que l'administration intramusculaire de vivo-morpholinos chez le modèle murin de XLMTM (KO-Mtm1) permet d'améliorer la pathologie, avec une augmentation de la taille des fibres musculaires et de la force. Des vivo-morpholinos ciblant l'ARN pre-messager de DNM2 humain ont donc été générés pour une utilisation potentielle dans le cadre des maladies liées à la dynamine 2<br>Congenital myopathies are rare genetic disorders affecting muscles with no curative treatment currently available to patients. They are characterized by hypotonia and generalized muscle weakness often leading to premature death. This group of muscle diseases include a form of nemaline myopathy (NEM3) caused by mutations in the alpha-actin gene (ACTA1) and myotubular myopathy (XLMTM) linked to MTM1, which are associated with the presence of protein aggregates (rods) and centrally located nuclei in skeletal muscle fibers, respectively.During my thesis, I investigated the pathophysiology of NEM3 by analyzing the transcriptome of muscles from a knock-in mouse model of the disease harboring the p.H40Y mutation (KI(Acta1)H40Y). Several deregulated signalling pathways were identified, including pathways that control muscle mass or involved in synaptic transmission. I therefore analyzed the morphology and function of neuromuscular junctions (NMJ) in KI(Acta1)H40Y mice. I found the presence of fragmented NMJ in various muscles, associated with ultrastructural changes in the post-synaptic region, molecular changes and increased fatigability of the diaphragm upon repeated electrophysiological nerve stimulation. These results may pave the way for a pharmacological treatment of NEM3 based on increasing neuromuscular transmission. In parallel, I also explored gene therapy strategies for this disease. Results showed that either intramuscular or systemic administration of recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors expressing ACTA1 under the control of the desmin or cytomegalovirus promoter did not improve the phenotype of KI(Acta1)H40Y mice. Therefore, I developed an allele-specific silencing therapy and selected in vitro siRNA sequences that knock-down efficiently mutated Acta1 transcripts. Intramuscular delivery of rAAV vectors expressing shRNA that target Acta1 mRNA in mutant mice did not ameliorate the patholopical signs of the disease, but rather led to the presence of inflammatory inflitrates in muscles. My results suggest that these gene therapy strategies will have to be further optimized to correct the disease.Apart from that, in the context of myotubular myopathy, I participed to the development of a therapeutic approach aiming at reducing the level of dynamin 2 in muscle cells using antisense oligonucleotides (vivo-morpholinos). Mutations in the dynamin 2 gene (DNM2) have been involved in the autosomic dominant form of centronuclear myopathy and in Charcot-Marie-Tooth disease type DI-CMT2B; in addition, DNM2 overexpression has been implicated in the pathophysiology of myotubular myopathy. We administrated vivo-morpholinos targeting dynamin 2 pre-mRNA intramuscularly in a mouse model of myotubular myopathy (Mtm1-KO) and found that this treatment ameliorated the phenotype, with an increase in muscle fiber size and strength. Therefore, vivo-morpholinos that target human DNM2 pre-mRNA were also generated for potential use in diseases related to dynamin 2 dysfunction

MTM1 et MTMR2 sont 2 phosphatases de phosphoinositides appartenant à la famille des myotubularines, conservée pendant l’évolution. Bien qu’étant très similaires, des mutations dans MTM1 entraînent la sévère myopathie XLCNM alors que les mutations dans MTMR2 entraînent la neuropathie CMT4B. On ne comprend pas encore les bases moléculaires de cette spécificité de tissu, et il n’existe aucun traitement spécifique pour ces maladies. J’ai tout d’abord caractérisé l’activité des 2 isoformes endogènes de MTMR2, nommés MTMR2-L et MTMR2-S. J’ai démontré que la différence fonctionnelle entre MTM1 et MTMR2 s’explique principalement par l’extension N-terminale de MTMR2, et que l’isoforme MTMR2-S dépourvu de cette extension entraîne les mêmes phénotypes que MTM1. Ensuite, grâce à l’injection d’AAV dans les souris Mtm1 KO, j’ai démontré que l’expression exogène des isoformes de MTMR2, et surtout de MTMR2-S, améliore grandement l’atrophie musculaire, la force musculaire et les marqueurs histologiques de ces souris myopathiques. Ces résultats révèlent une première base moléculaire expliquant les spécificités fonctionnelles de MTM1 et MTMR2, et montrent que MTMR2 est une cible thérapeutique potentielle pour la myopathie XLCNM<br>MTM1 and MTMR2 are 2 phosphatases of phosphoinositides that belong to the myotubularin family conserved through evolution. Despite their high level of similarity, mutations in MTM1 lead to the severe XLCNM myopathy while mutations in MTMR2 lead to the CMT4B neuropathy. The molecular bases for the surprising tissue-specific functions of these ubiquitously expressed proteins was unclear. Moreover, there is no specific therapy for these diseases.I first characterized the activity of the two naturally occurring isoforms of MTMR2, that we named MTMR2-L (long) and MTMR2-S (short). I found that the functional differences between MTM1 and MTMR2 reside mostly in the N-terminal extension of MTMR2-L, and that the endogenous MTMR2-S isoform lacking this N-terminal extension behaves similarly as MTM1. Then, using the myopathic Mtm1 KO mouse and AAV-mediated expression, I showed that exogenous expression of MTMR2 isoforms, and specifically of MTMR2-S, strongly improved the muscle atrophy, muscle force and the histological hallmarks of the myopathic mice. These data reveal a first molecular basis for the functional specificities of MTM1 and MTMR2, and highlight MTMR2 as a therapeutic target for XLCNM myopathy

The congenital myopathies are a diverse group of inherited neuromuscular disorders that manifest as skeletal muscle weakness at birth or in infancy, and are classically defined by the predominant morphological features observed on muscle biopsy. The goals of this dissertation were to better understand the pathophysiology behind these devastating diseases and to identify new therapeutic approaches through the use of faithful vertebrate models. Due to their proliferative capacity, transparency, and well-characterized genome, zebrafish represent a robust vertebrate model system to study muscle development. In the first part of this work, we created and characterized a novel zebrafish model of centronuclear myopathy using antisense morpholinos targeting the bridging integrator 1 (bin1) gene. Bin1 morphant skeletal muscles revealed structural defects reported in human biopsies, and live calcium imaging offered new mechanistic insights linking abnormal triads to impairments in intracellular signaling. Later studies focused on two forms of core myopathy, and utilized stable zebrafish models to guide development of targeted and effective therapies. We began by using TALE nucleases to generate germ line mutations in the zebrafish selenoprotein N (sepn1) gene, and in doing so created the first vertebrate to accurately model human SEPN1-related myopathy (SEPN1-RM). Sepn1 zebrafish mutants exhibited morphological abnormalities, reduced contractile strength, and skeletal muscle “cores” under electron microscopy. We then showed that the sepn1 phenotype could be ameliorated by pharmacological inhibition of a thiol oxidase localized at the sarcoplasmic reticulum. These data served as the first in vivo evidence to indicate that reactive oxygen species significantly contribute to SEPN1-RM, and may do so by impairing calcium re-uptake following muscle contraction. Finally, we performed a medium-throughput chemical screen on the closely related relatively relaxed (ryr1b) zebrafish, and identified JAK-STAT cytokine signaling as a druggable molecular pathway relevant to these pathologies. In summary, these studies increase our knowledge of the affected systems in both centronuclear and core myopathies, and provide strong in vivo support that these conditions arise from defects in skeletal muscle excitation-contraction coupling. This work also further establishes zebrafish-based small molecule screens as a powerful tool for lead compound identification and drug development in human genetic disease.<br>Medical Sciences

Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques sévères caractérisées par une faiblesse musculaire très invalidante de début infantile. Afin d’identifier de nouvelles causes génétiques, nous avons séquencé les exomes de patients myopathes qui ne disposaient pas de diagnostic moléculaire et leur analyse a mis en évidence deux nouveaux gènes de myopathie. MYPN et ACTN2 codent pour deux protéines structurales du sarcomères appelées myopalladine et alphaactinine-2. Afin d’étudier l’impact des mutations sur la fonction de la protéine et sur la physiologie du muscle, des analyses moléculaires et fonctionnelles ont été réalisées en modèles cellulaires et animaux. Les mutations dans MYPN induisent une perte de la protéine, et dans les muscles de souris, l’alpha-actinine-2 mutée conduit à une faiblesse musculaire et génère des défauts structuraux similaires à ceux retrouvés chez les patients. Ces résultats ont un impact direct sur la prise en charge des patients et sur le conseil génétique, sur la compréhension de voies de signalisation fondamentales pour la physiologie musculaire, et mettent en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques<br>Congenital myopathies are severe genetic muscle diseases characterized by a disabling early-onset muscle weakness. In order to identify new genetic causes, we sequenced the exomes of molecularly undiagnosed congenital myopathy patients, and their analysis highlighted two novel myopathy genes. MYPN and ACTN2 encode two structural sarcomeric proteins called myopalladin and alphaactinin-2. To evaluate the impact of the mutations on the protein function and on muscle physiology, molecular and functional analyses were performed in cell and animal models. The MYPN mutations resulted in loss of myopalladin expression, and in mouse muscles, mutated alpha-actinin-2 led to muscle weakness and structural defects similar to those observed in the patient muscles. These results have a direct impact on the disease management of the patients and on genetic counselling, provide a better understanding of the signaling pathways required for muscle physiology, and highlight novel therapeutic targets

Ce travail se divise en deux parties : la première partie consiste à développer et valider une technique d’exploration de la fonction respiratoire à l’aide d’outils de capture du mouvement de la cage thoracique et de l’abdomen en trois dimensions. L’innovation consiste en l’application d’une méthode de calcul des volumes pulmonaires mobilisables non encore utilisée avec cette technique. La deuxième partie consiste à mettre en évidence l’intérêt médical de cette technique par son utilisation clinique sur des pathologies respiratoires ciblées et/ou dans des conditions médicales spécifiques. Dans un premier temps et suite à une analyse de la littérature des méthodes d’exploration de la fonction respiratoire par mesure optoélectronique,nous avons proposé une nouvelle méthode de calcul des volumes respiratoires à partir de capture de mouvement de la paroi thoracoabdominale.Cette méthode prend en compte les déplacements de la surface de la paroi thoracoabdominale. Une comparaison entre cette nouvelle méthode,la méthode optoélectronique habituellement utilisée et la spirométrie(méthode de référence) montre que cette nouvelle méthode permet une évaluation précise des volumes respiratoires. Dans un second temps,une fois la question métrologique de mesure suffisamment précise des volumes validés, nous nous sommes intéressés à l’intérêt clinique d’apprécier la contribution des différents compartiments de la paroi thoracoabdominaleà la ventilation des patients myopathes et des sujets sous ventilationmécanique. Une première étude sur une population de patients présentant une déficience en maltase acide, visant l’identification du dysfonctionnement diaphragmatique a été réalisée. Ainsi nous avons pu démontrer que la contribution de la région abdominale à la ventilation est corrélée avec les indices invasifs évaluant la fonction diaphtragmatique. Cela nous permet maintenant de suivre l’évolution de la fonction diaphragmatique de ces patients de manière non invasive. Une seconde étude visait l’analyse de la contribution abdominale de la ventilation lorsque cette dernière est assistée mécaniquement. Ainsi nous avons pu observer que la ventilation mécanique diminuait la contribution abdominale, quel que soit le mode d’assistance ventilatoire utilisé, ce qui suggère une diminution de l’activité diaphragmatique sous ventilation mécanique et donc de confirmer une efficacité de ventilation mécanique. Une troisième étude sur le patient atteint de la myopathie de Duchenne de Boulogne a permis de quantifier les effets à court terme des manoeuvres d’insufflation et d’exsufflation sur la mobilité non assistée de la cage thoracique. Ainsi nous avons observé, immédiatement après ces manoeuvres, une meilleure expansion et une symétrisation de cette expansion thoracoabdominale lors d’inspirations et d’expirations maximales. Cela plaide pour une utilisation plus systématique de ces techniques au quotidien lors de la prise en charge de cette population, en particulier pour ceux qui présentent une dysharmonie du mouvement thoracoabdominal.Ce travail nous permet de proposer cette nouvelle exploration pour suivre des maladies chroniques évolutives affectant la mécanique respiratoire et l’effet des traitements spécifiques et d’envisager une application industrielle de ce nouvel outil de mesure<br>This work is divided into two parts : the first part is to developand validate a technical exploration of respiratory function using motioncapturetools of the chest and abdomen in three dimensions. Innovation isthe application of a method of calculation of underlying lung volumes notyet used with this technique. The second part is to highlight the medicalinterest of this technique for clinical use in targeted respiratory pathologiesand/or specific medical conditions.First and following a literature review of methods of exploration of respiratoryfunction by optoelectronics measure we have proposed a new methodto compute respiratory volumes of motion capture of thoracoabdominalwall. This method takes into account the movements of the thoracoabdominalsurface of the wall. A comparison between this new method, optoelectronicstandard approach and spirometry (Reference method) showsthat this new method allows an accurate assessment of respiratory volumes.Secondly, once the issue of metrological sufficiently accurate measurementof volumes validated, we looked at the clinical interest of enhancing thecontribution of the different compartments of the thoracoabdominal wallin the breakdown of muscular dystrophy patients and mechanically ventilatedsubjects. An initial study on a population of patients with acid maltasedeficiency, for the identification of the diaphragmatic dysfunction was performed.Thus we have demonstrated that the contribution of the abdominalarea for ventilation is correlated with invasive indices transdiaphragmaticpressures. This now allows us to follow the evolution of diaphragmaticfunction of these patients noninvasively. A second study was the analysis ofthe abdominal contribution to the ventilation when the latter is mechanicallyassisted. Thus we have seen that mechanical ventilation decreased abdominalcontribution, whatever the method of ventilatory assistance used,suggesting a decrease in diaphragmatic activity under mechanical ventilationand thus confirm a mechanical ventilation efficiency. A third studyon the patient with Duchenne de Boulogne has quantified the short-termeffects of blowing maneuvers and exsufflation on unassisted mobility ofthe rib cage. Thus we observed immediately after these maneuvers, betterexpansion and balancing this thoracoabdominal expansion during inspirationand maximum expiration. This calls for a more systematic use of thesetechniques every day in the care of this population, particularly for thosewith disharmony of thoracoabdominal movement.This work allows us to offer this new exploration to follow evolving diseasesaffecting the respiratory mechanics and impact of specific treatmentsand to envisage an industrial application of this new measurementtool

Background: The idiopathic inflammatory myopathies (IIM) are a heterogeneous group of rare autoimmune diseases comprising of polymyositis (PM), dermatomyositis (DM), and inclusion body myositis (IBM). They are characterised primarily by muscle weakness, and can present with extramuscular manifestations such as skin rashes, interstitial lung disease and malignancy. Aims: This aim of this study was to identify novel genetic risk factors in IIM and to further elucidate the relationship between genotype and serotype. Methods: 2,566 IIM samples were collected from 14 countries through the Myositis Genetics Consortium (MYOGEN) and genotyped on the Immunochip, a custom array covering 186 established autoimmune susceptibility loci. SNP2HLA was used to impute classical HLA alleles and constituent amino acids. Results: In a combined IIM analysis, the HLA region and PTPN22 reached genome-wide significance (p<5x10-8). A further nine regions reached suggestive significance (p<2.25x10-5) including UBE2L3, STAT4 and CD28 that have been implicated in autoimmune disease previously. Independent effects were seen within the STAT4 region. In a PM subgroup analysis (n=931), the HLA region and PTPN22 reached genome-wide significance. A further seven regions reached suggestive significance including SLC26A1/IDUA and RGS1. In an adult and juvenile DM analysis (n=1,360), only the HLA region reached genome wide significance. Three loci reached suggestive significance including GSDMB. In the IBM analysis (n=252), only the HLA region reached genome wide significance and 3 loci reached suggestive significance, including the CCR2 locus. Identification of exonic and eQTL SNPs has localised association signals to several potential causal variants. HLA imputation on the combined dataset confirmed that alleles of the 8.1 ancestral haplotype (AH) are most strongly associated with IIM. The cohort was stratified in to clinical subgroups. In PM the strongest effect was found with HLA-DRB1*03:01 with an independent effect with HLA-B*08:01. Amino acid position 74 lies within the peptide binding groove and may explain the risk in HLA-DRB1. HLA-B*08:01 was the most associated variant in both DM and JDM, with independent effects of amino acid position 57 of HLA-DQB1 in DM and HLA-C*02:02 in JDM. In IBM, the strongest associations were with amino acids positions 26 and 11 of HLA-DRB1.HLA imputation was conducted on antibody subgroups. The most associated variant for anti-Jo-1 and anti-PM/Scl antibodies was with amino acid 74 of HLA-DRB1. Alleles of the 8.1 AH were most associated with anti-TIF1-γ, anti-SAE and anti-cN1A antibodies. Alleles independent of the 8.1 AH were replicated such as anti-Mi-2 antibodies and HLA-DRB1*07:01, and anti-HMGCR antibodies and HLA-DRB1*11. Conclusions: This represents the largest study to date in IIM and has considerably expanded our knowledge about the genetic architecture of this rare disease. This study has identified novel disease susceptibility genes for IIM and independent associations with PM and DM, IBM and antibody subgroups that show that stratifying patients in to more homogenous cohorts is important to expand our knowledge of IIM. Ongoing sample collection is required to identify additional genes and environmental risk factors that lead to the development of IIM, and to expand our limited understanding of the pathogenesis of this disease.

La dystrophine est une protéine filamenteuse qui contribue à la structuration des cellules musculaires en créant un lien entre le cytosquelette et le sarcolemme. Avec l’actine du cytosquelette et les lipides membranaires, la dystrophine représente l’un des éléments d’un complexe macromoléculaire, localisé sous la membrane plasmique, dont le rôle est la prévention des dommages qui pourraient être induits à force de contractions-relâchements répétés. De tels dommages, notamment des ruptures du sarcolemme, sont observés chez des personnes atteintes de myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD), des maladies causées par des mutations qui altèrent l’expression ou la fonction de la dystrophine. Ces myopathies sont actuellement incurables et une connaissance approfondie de la relation structure-fonction de la dystrophine et de ses interactions avec ses partenaires s’avère absolument nécessaire à la mise au point de nouvelles stratégies de thérapies géniques. Cette protéine se compose de quatre domaines fonctionnels, dont un domaine central filamentaire, constitué de 24 répétitions successives d’un même motif structural, un faisceau de trois hélices alpha ou « coiled-coil ». Or, il a été récemment montré que la structure de ce domaine central n’est pas strictement linéaire et que certaines régions inter-répétitions (linker) forment des coudes, délimitant ainsi des sous-domaines d’interaction spécifiques. Cette thèse a pour objectif de comprendre l’origine de cette diversité de conformations inter-répétition dans un domaine structuralement homogène, et d’explorer comment elle permet à certaines régions de se différencier afin d’interagir avec l’actine et/ou les lipides membranaires<br>Dystrophin is a filamentous protein involved in muscular cells structure which links the cytoskeleton to the sarcolemma. Together with cytoskeletal actin and membrane lipids, dystrophin is a part of a macromolecular complex, located under the sarcolemma, which prevents damages induced during repeated muscle contractions and relaxations. Such damages, including sarcolemma disruption, are found in people with Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD), diseases caused by mutations altering dystrophin expression or function. There is currently no treatment to cure these myopathies, and a deep understanding of the structure-function of the dystrophin and its interactions with its partners is necessary to the development of gene therapy strategies. Structuraly, this protein is composed of four functionnal domains, including a long filamentous central domain, composed of 24 successive coiled-coil repeats. It was recently showed that the central domain is not rod shaped and some inter-repeats regions (linker) are kinked, delimiting specific interaction sub-domains. This thesis aims to bring knowledge about the basis of the conformationnal diversity of linkers in a structuraly homogenous domain in human dystrophin. We explore how dystrophin delimits some regions that interact with f-actin and/or membrane lipids

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie génétique qui se caractérise par la présence d’agrégats tubulaires dans les biopsies musculaires de patients. Notre équipe a identifié pour la première fois des mutations dans STIM1 comme étant à l’origine de cette maladie. STIM1 (stromal interaction molecule 1) est le senseur calcique du réticulum sarco/endoplasmique (RE/RS). En effet, en cas de diminution du calcium (Ca2+) dans le RE/RS, STIM1 se déplie, oligomérise et migre à proximité de la membrane plasmique (MP) pour activer le canal calcique ORAI1 et permettre le remplissage des stocks. Ce mécanisme est le «store-operated Ca2+ entry» (SOCE). D’autres équipes ont rapporté une mutation dans STIM1 (p.R304W) conduisant à une TAM associée à d’autres symptômes, ou encore syndrome de Stormorken. Ainsi, ce travail a eu pour but d’étudier et de comparer l’impact des mutations TAM et Stormorken à différents niveaux du SOCE. Nous avons ainsi montré que les mutations TAM et Stormorken conduisent à une augmentation de l’expression de STIM1, à la formation de clusters constitutifs de STIM1 à proximité de la MP, ainsi qu’au recrutement du canal ORAI1 et à l’activation de la voie du NFAT, dépendante du Ca2+<br>Tubular aggregate myopathy (TAM) is a genetic disorder characterized by tubular aggregates in muscle biopsies of patients. Our team identified for the first time mutations in STIM1 as causative of this disease. STIM1 (stromal interaction molecule 1) is the main calcium (Ca2+) sensor of the endo/sarcoplasmic reticulum (ER/SR). Following Ca2+ depletion of the ER/SR, STIM1 unfolds, oligomerizes and migrates close to the plasma membrane (PM) to activate the Ca2+ channel ORAI1, leading to Ca2+ entry. This mechanism is the «store-operated Ca2+ entry» (SOCE). Several teams report a mutation in STIM1 (p.R304W) leading to TAM associated with other symptoms, described as Stormorken syndrome. Therefore, this work aims to assess and compare the impact of TAM and Stormorken mutations at different stages of the SOCE pathway. We show that TAM and Stormorken mutations lead to an increase expression of the protein, a constitutive STIM1 clustering near the PM, to ORAI1 constitutive recruitment and to the activation of a Ca2+ -dependent pathway: the NFAT pathway