Dissertations / Theses on the topic 'Plasmide F'

La ségrégation de l'ADN, appelée partition chez les procaryotes, permet à tout organisme de transmettre son patrimoine génétique au cours des générations. Il existe des systèmes actifs de partition présents sur la majorité des plasmides et des chromosomes bactériens. Ces systèmes sont essentiels pour la ségrégation active des plasmides à bas nombre de copies tel que le plasmide F d'Escherichia coli, étudié au sein de notre équipe. Son système de partition, appelé sop, est composé de deux gènes, sopA et sopB et d'une séquence centromérique sopC. SopB se fixe à sopC pour former le complexe de partition, reconnu par l'ATPase SopA. SopA polymérise en présence d'ATP. Ce comportement pourrait être le " moteur " de la ségrégation des réplicons. Les travaux de notre équipe ont démontré que SopA se fixe de manière ATP-dépendante à l'ADN non spécifique. Cette fixation inhibe la polymérisation de SopA. SopB, de par sa capacité à se fixer à l'ADN non spécifique, contrebalance ainsi cette inhibition. Nous proposons un modèle dans lequel la polymérisation de SopA serait régulée dans la cellule par l'ADN du nucléoïde. En présence du plasmide, SopB, présent à forte concentration autour du complexe de partition, masquerait l'ADN, créant un environnement dans lequel SopA initierait sa polymérisation. Cette régulation de la dynamique de SopA serait nécessaire au processus de partition. Afin d'étayer notre modèle, nous avons recherché un domaine d'interaction à l'ADN dans SopA. Nous avons identifié un mutant ayant perdu sa fixation ATP-dépendante à l'ADN. Seules les activités de SopA dépendante de cette reconnaissance de l'ADN ont été affectées : l'inhibition de la polymérisation, la stimulation de l'activité ATPase basale et la localisation intracellulaire. Cette mutation entraîne aussi une perte majeure de stabilité du plasmide F correspondant. Ceci confirme l'implication de l'ADN du nucléoïde dans la régulation du comportement dynamique de SopA nécessaire à la partition du plasmide F<br>The segregation of the DNA, also called partition for procaryotes, is the process allowing any organisms to transmit its genetic heritage to next generation. In bacteria, mitotic stability of plasmids and many chromosomes depends on replicon-specific systems which comprise a centromere, a centromere-binding protein and an ATPase. We have taken as a model, the low-copy number plasmid F of Escherichia coli. Centromere-binding protein SopB binds to sopC centromere and forms the partition complex. This nucleoproteic complex is recognized by the SopA "Walker-box" ATPase. SopA shares with other partition ATPase the capacity of self assembly in presence of ATP. This dynamic self-assembly would allow active partition during bacterial division. Previous work in our team showed SopA is also able to bind to non specific DNA in an ATP-dependant manner whereby polymerization is inhibited. Indeed, DNA inhibited this polymerization and cause breakdown of pre-formed polymers. SopB counteracted this DNA effect by binding itself to and masking DNA. We had proposed a model in which the polymerization is spacially regulated. Nucleoid DNA prevent inappropriate SopA polymerization but when SopB is present in high concentration, it create a DNA-depleted zone within SopA can initiate polymerization. The regulation of the dynamic behaviour of the "driving" protein of the system would be necessary for the process of partition. To support our model, we looked for a DNA binding domain in SopA. We have found a SopA mutant, defective for ATP dependent DNA binding. Only the activities of SopA dependent on this binding were affected: the inhibition of the polymerisation is abolished, as the stimulation of the ATPase activity and the intracellular localization. Moreover, this mutant is defective for plasmid stabilization. This last result confirms the implication of the nucleoïd DNA in regulation of the dynamic behavior of SopA, which is necessary for the partition of the plasmide F

Chez les bacteries, la fonction qui assure la distribution equitable des genomes dans chacune des cellules filles issues de la division cellulaire est appelee partition. Les acteurs et les mecanismes de ce processus analogue a la mitose eucaryote sont encore mal connus. Pour etudier la partition, notre modele est le plasmide f d'escherichia coli. Present a bas nombre de copies dans la cellule, il porte ses propres determinants de partition sous forme de deux genes codant pour les proteines sopa et sopb, et d'une sequence centromerique, sopc, avec laquelle sopb forme un complexe qui pourrait etre reconnu par des facteurs cellulaires au moment de la partition. La nature de ces facteurs, et le role de sopa dans la partition sont encore inconnus. Nous avons recherche les facteurs cellulaires impliques dans la partition de f par une approche dite d'interference peptidique visant a isoler des sequences du chromosome d'escherichia coli qui, exprimees sous forme de peptides, rendent le plasmide f instable. La sequence destabilisatrice dopl, un fragment interne a un nouveau gene, ldc, a ainsi ete identifiee. Nous montrons que ldc est une deuxieme lysine decarboxylase d'escherichia coli. Le peptide dop 1 pourrait interferer avec la replication du plasmide f, mais son implication et celle de ldc dans la partition de f est incertaine. Par la meme approche, et afin de comprendre le role de sopa dans la partition, nous avons recherche les peptides issus de la proteine sopa capables de perturber la partition du plasmide f. Nous montrons que la surexpression d'un domaine central de sopa destabilise f. Ce peptide n'altere pas la superhelicite du plasmide, ni l'expression de l'operon sopabc, et pourrait contenir une helice transmembranaire. L'interference du peptide avec l'hypothetique ancrage de sopa dans la membrane est discutee. Enfin, nous observons que la surexpression du gene sopa destabilise le plasmide f, induit une condensation des nucleoides et inhibe la division cellulaire. La toxicite de sopa serait dependante de mukb, un gene implique dans la partition des chromosomes. Un exces de sopa provoque une augmentation de la superhelicite du plasmide f. En absence de la topoisomerase i d'e. Coli, un plasmide exprimant sopa montre une superhelicite accrue. L'implication de sopa dans le controle de la superhelicite du plasmide f est discutee.

La ségrégation du matériel génétique est une étape fondamentale du cycle cellulaire permettant la transmission du patrimoine génétique au cours des générations. Dans les cellules eucaryotes, la mitose est l'étape qui permet la répartition des chromosomes dupliqués dans chaque cellule fille. Des systèmes actifs, dédiés à la ségrégation de l'ADN sont retrouvés sur la majorité des plasmides et chromosomes bactériens. Ces systèmes ParABS, dits "de partition", sont constitués de deux protéines, ParA et ParB, et d'une séquence centromérique, parS. La protéine ParA est une ATPase capable de positionner les plasmides dans le cytoplasme tout au long du cycle cellulaire. Son comportement dynamique fait d'elle le moteur de la partition. La protéine ParB, l'autre acteur de la partition est une protéine adaptatrice entre la molécule d'ADN et la protéine motrice. ParB se fixe sur le centromère parS pour former une complexe nucléoprotéique appelée "complexe de partition". En utilisant différents modes de fixation à l'ADN et en établissant des interactions protéine-protéine multiples, ParB est aussi capable de s'organiser en complexe de partition dit "étendu" qui est le substrat de la réaction de ségrégation. La formation du complexe de partition "étendu" est la première étape du mécanisme de partition et est essentielle au processus de ségrégation. L'architecture de ce complexe n'est connue pour aucun des systèmes de partition parABS. L'un des systèmes modèles majeurs du mécanisme de ségrégation de l'ADN chez les bactéries est le système sopABC du plasmide F d'E. Coli. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai initié plusieurs projets en parallèle, visant à caractériser à la fois in vivo et in vitro, les différentes interactions impliquées dans l'organisation du complexe de partition et du complexe de partition "étendu" de ce plasmide. En collaboration avec l'équipe du Dr Véronique Le Berre au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP-INSA) de Toulouse, j'ai contribué à la validation des déterminants nucléiques impliqués dans l'interaction de notre séquence centromérique modèle, parS, avec le motif hélice-tour-hélice (HTH) de ParB. Ensuite, nous avons identifié un nouveau motif en dehors du motif HTH et montré qu'une arginine de ce motif est essentielle à l'interaction spécifique avec le centromère. Ces résultats ont révélé une caractéristique conservée dans le règne bactérien : les protéines ParB contiennent un domaine de liaison au centromère, composé de deux motifs séparés et essentiels. Le cœur de mes travaux de thèse a été de comprendre l'organisation du complexe de partition "étendu" et son rôle dans la partition. Par une combinaison d'approche moléculaire in vivo et in vitro, j'ai montré que l'architecture de ce complexe étendu en dehors des sites parS, nécessitait deux types d'interaction, des interactions protéine/protéine mais également ADN/protéine. Afin d'étudier le mode d'interaction de ParB avec des séquences nucléiques non spécifiques avoisinant le complexe de partition, j'ai mis en œuvre une technique d'immunoprécipitation de chromatine, couplée à des techniques de hautes détections (qPCR ou ChIPseq). Cette technique nous a permis de montrer que ParB est capable de s'étendre sur une distance d'environ vingt kilobases de part et d'autre du centromère. Nos résultats semblent incompatibles avec le précédent modèle dans lequel ParB serait capable de polymériser sur l'ADN, à la manière d'un protéo-nucléofilament qui s'initierait au niveau du centromère. Ainsi ces travaux, nous ont permis de proposer un nouveau modèle dans lequel le complexe de partition "étendu" serait une structure concentrée, dynamique et résultant d'interactions stochastiques entre ParB et l'ADN avoisinant ParS<br>Segregation of genetic material over generations is an essential process ensuring that every daughter cell receives a copy of each DNA molecule. Similarly to Eukaryotes, Prokaryotes possess cytoskeletal machineries, named Par, responsible for DNA segregation. Bacterial Par systems, found on chromosomes as well as on various low copy number plasmids, are composed of three elements: a ParA protein, a ParB protein and a centromere site, parS. ParA ATPase is able to position plasmids in the cytoplasm during the cell cycle. Its dynamic pattern make it the motor of the partition. The centromere binding protein (CBP) ParB, binds the centromere to form a nucleoprotein assembly called the "partition complex". Using different mode of DNA binding and multiple protein-protein interactions, ParB is also capable of organizing into higher order complexes called the "extended" partition complex. This complex is the substrate for the partitioning process. Formation of the extended partition represents the first step in partition and is essential to segregation. The architecture of this complex is not known for any partition system parABS. Here, we focus on the assembly of the F partition complex. During my PhD, I initiated several projects in parallel to characterize the different interactions involved in the organization of the partition complex and the extended partition complex of this plasmid with in vivo and in vitro approaches. In collaboration with the laboratory of Dr. Veronique Le Berre in Toulouse (LISBP -INSA), we determined sopC basis involved in specific SopB-sopC interactions. Then, we identified a new ParB determinant, outside of the helix-turn-helix DNA binding motif, responsible for specific DNA binding to the centromere. These findings reveal that ParB have an extended DNA binding domain, composed of two separate DNA binding motifs. We extended our analysis to chromosomal ParB and show that this second centromere binding motif is highly conserved in a wide range of bacteria. Using in vivo and in vitro approaches, we show that the extended partition complex architecture requires both protein-protein and protein-DNA interactions. To investigate the overall organization of the SopB-sopC extended partition complex, we use chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled with high throughput sequencing. This technique allowed us to visualize that SopB is able to extend around sopC over ~20 Kb. Our results are thus inconsistent with previous models suggesting that SopB polymerize side by side in a proteo-nucleofilament emanating from the centromere. So, we propose a new model in which the extended partition complex of F plasmid assembles in a nucleoprotein complex from stochastic binding of SopB on neighboring sopC DNA