Tesis sobre el tema "Alcaloides - Análisis"

La cafeína es un alcaloide que se encuentra comunmente en el café o en el té. El café contiene de 1 a 2% de cafeína; el té contiene de 2 a 3%. Se sabe que la cafeína tiene capacidad estimulante, el mecanismo fisiológico a través del cual actúa aún no se comprende por completo, se sabe que este compuesto actúa sobre el sistema nervioso central, estimulándolo. Hoy en día son muchos los productos en el mercado que contienen cafeína, por ejemplo las bebidas gaseosas, cuyo consumo es masivo.La presente práctica describe en su primera parte, el procedimiento de extracción y purificación, para concluir con una técnica para su identificación y cuantificación por dos métodos, uno de valoración en medio no acuoso y el otro por espectrofotometría ultravioleta (UV).

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Desarrolla una técnica analítica basada en espectrofotometría visible para cuantificar alcaloides totales en materia prima vegetal. Dicha técnica está basada en la cuantificación indirecta de bismuto del reactivo de Dragendorff, el cual forma un complejo con los alcaloides. Se evaluaron las condiciones óptimas para la precipitación de los alcaloides con el mencionado reactivo, los agentes para el aislamiento del bismuto de dicho precipitado, el reactivo cromogénico para cuantificar el bismuto y sus parámetros de medición (longitud de onda óptima y pH). La técnica fue monitoreada y evaluada en función a estándares secundarios de alcaloides (Hioscina- N- butilbromuro, Cincocaína y Brucina) y a materia prima vegetal (extracto hidroalcohólico de uña de gato 5%, Atropa belladona L. y corteza de Cinchona pubescens Vahl. en polvo), respectivamente. El método fue comparado con la metodología clásica para alcaloides totales (método titrimétrico) aplicada en las materias primas vegetales. Se obtuvieron buenos valores de recuperación de alcaloides y de repetibilidad de resultados (RSD) con los estándares secundarios. Asimismo, los resultados obtenidos con el método clásico para la valoración de alcaloides y el método propuesto son semejantes. Se concluyó que el método propuesto es confiable, pudiendo ser validado e implementado en laboratorios de control de calidad.
Tesis

El tocosh de “papa” (Solanum tuberosum L.) es utilizado con fines alimentarios y curativos en la medicina tradicional peruana. En la presente investigación se realizó la identificación de los constituyentes fitoquímicos (screening fitoquímico preliminar) y luego se determinaron los alcaloides contenidos en la fracción alcaloidal de la harina de tocosh de “papa” utilizando la Cromatografía de Gases / Espectrometría de Masas (GCMS). La evaluación de la toxicidad se determinó mediante dos metodologías: Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD) Nº 407 y Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD) Nº 420; en el primero se administró la solución de tocosh de “papa” por vía oral en ratas de ambos sexos por 28 días a la dosis de 1000 mg/kg y en el segundo en ratones de ambos sexos a la dosis fija de 2000 mg/kg y 5000 mg/kg. En el análisis fitoquímico preliminar se determinó la presencia de grupos aminos libres, taninos, compuestos fenólicos, alcaloides, flavonoides, triterpeno, esteroides y saponinas, por GC-MS el alcaloide esteroidal α-solanina, en la OECD Nº 420 se observó durante los 14 días que duró el ensayo, que la dosis letal 50 (DL50) del tocosh de “papa” es superior a 2000 mg/kg, pero inferior a 5000 mg/kg en ratones. Y en la OECD Nº 407 no se observaron niveles de efectos adversos observables (NOAEL) en la dosis de 1000 mg/kg en las ratas. Se concluye que el tocosh de “papa” a la dosis de 1000 mg/kg es seguro a nivel preclínico.

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Determina la presencia de alcaloides y flavonoides, así como caracterizar sus correspondientes estructuras; la extracción se lleva a cabo por el método de maceración en metanol, a partir de las hojas en polvo. El aislamiento es monitoreado mediante cromatografía en capa delgada de silicagel 60, paro lo cual el extracto metanólico se fracciona en una columna cromatografica de exclusión en Sephadex LH-20. La purificación de los alcaloides y flavonoides se realiza por cromatografía líquida de alta performance (HPLC).
Tesis

Orientador: Rogerio Custodio
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica
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Doutorado

Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2016-01-06T18:26:59Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Sabrina Schumacker Zanca.pdf: 5039439 bytes, checksum: 5efe72ddb5b05b30355272db0d78ee68 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
The Amazon species Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) produces triterpenes and alkaloids with activity against Mycobacterium tuberculosis and an indole alkaloid active against tumoral cell lines. Previous studies showed that different plant extracts had difference on the chemical composition. So, the present study aim to assess the seasonal production of secondary metabolites in Duroia macrophylla extracts, in two specimens for one year. Also, callus in vitro were obtained for phytochemical extraction and secondary metabolites production analysis. For the two plants phytochemical analysis, leaves were collected monthly from April/2013 to March/2014. Plant material was grounded and extracted with hexane and methanol, with ultrasound bath. The concentrated extracts were analyzed by thin layer chromatography (TLC) and 1H-nuclear magnetic resonance (1H-NMR). The NMR spectra were compared by principal component analysis (PCA). The in vitro tissue cultures were established from young leaves with 50% of asepsis after several assays and with different immersion times of the chemical reagents: 70% etanol, 2% sodium hypochlorite and biocide solution. In vitro explants were induced to callus formation process by adding the growth regulators kinetin and 2,4-D, on Murashige & Skoog media, and then extracted with hexane and methanol. The production of secondary metabolites was analysed by TLC and 1H-NMR. All hexane and methanol extracts of two Duroia macrophylla individuals showed evidence of the presence of alkaloids and terpenes during a year. The PCA analysis showed seasonal variation on the chemical composition of the hexane extracts of Duroia macrophylla’s leaves, where the production of alkaloids increased during the rainy season. Regarding the methanol extracts of the leaves, the extract from November showed a lower alkaloid content. Being November the flowering species period, we can infer that the plant is redirecting its biosynthetic route for the production of less polar indole alkaloids or other metabolites. D. macrophylla callus extracts showed terpenes but not alkaloids production, and showed no antioxidant, toxic and antibacterial activities in the performed assays.
A espécie amazônica Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae) é produtora de triterpenos e alcaloides com atividades sobre Mycobacterium tuberculosis e um alcaloide com atividade tumoral. Entretanto, coletas realizadas em épocas diferentes mostraram diferença na composição química de diferentes indivíduos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a sazonalidade da produção de metabólitos secundários em extratos de Duroia macrophylla, durante um ano, em dois espécimes. Também foram obtidos calos in vitro da espécie para extrações fitoquímicas e análise da produção dos metabólitos secundários. Para as análises fitoquímicas dos dois indivíduos foram utilizadas folhas coletadas mensalmente de abril/2013 a março/2014. O material vegetal foi submetido à extração com hexano e metanol, em banho de ultrassom. Os extratos foram concentrados e posteriormente analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H. Os espectros foram comparados por meio de uma análise de componentes principais. As culturas de tecidos in vitro foram estabelecidas com 50% de assepsia, após vários testes, a partir de explantes provindos de folhas jovens e com diferentes tempos de imersão dos reagentes químicos: etanol 70%, hipoclorito de sódio 2% e solução biocida. Depois de estabelecidos, os explantes in vitro foram induzidos ao processo de calogênese através da adição dos reguladores de crescimento cinetina e 2,4-D, em meio Murashige & Skoog. Os calos foram posteriormente extraídos com hexano e metanol e a produção dos metabólitos secundários foi avaliada por análise em CCDC e RMN de 1H. Os extratos hexânicos e extratos metanólicos obtidos dos dois indivíduos de Duroia macrophylla apresentaram indícios da presença de alcaloides e terpenos em todos os meses, durante um ano. A análise de componentes principais demonstrou que há uma variação sazonal na composição química dos extratos hexânicos de folhas de Duroia macrophylla, onde o teor de alcaloides indólicos foi maior na época mais chuvosa. Nos extratos metanólicos das folhas, o mês de novembro apresentou teores significativamente menores de alcaloides indólicos em relação aos outros meses, para os dois indivíduos estudados. Sendo o mês de novembro a época de floração da espécie, pode-se inferir que a planta está redirecionando a sua rota biossintética para a produção de alcaloides indólicos menos polares e também para a produção de outros metabólitos. Os extratos dos calos de D. macrophylla apresentaram terpenos, mas não alcaloides, e não apresentaram atividades antioxidante, tóxica e antibacteriana nos ensaios realizados.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-04T17:11:51Z No. of bitstreams: 1 LIARA MERLUGO.pdf: 1163654 bytes, checksum: 112650b0950a34ee9e23411aa8adcab1 (MD5)
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O gênero Erythrina está presente mundialmente nas regiões tropicais e subtropicais. Estudos fitoquímicos utilizando vários órgãos dessas plantas, demostraram a presença de alcaloides, flavonoides, pterocarpanos e triterpenóides. Várias espécies são encontradas no Brasil, dentre elas Erythrina falcata e Erythrina crista-galli, conhecidas popularmente como “corticeira” e utilizadas medicinalmente devido à ação sedativa, ansiolítica, anti-inflamatória e antihipertensiva. Este trabalho objetivou estudar a composição química de extratos vegetais obtidos de folhas de E. falcata e E. crista-galli e ainda, avaliar o potencial hipotensor in vivo de extratos de E. falcata. Inicialmente, após coleta do material, as folhas foram selecionadas, submetidas à secagem e trituradas. Então, foram submetidas à extração por maceração exaustiva utilizando etanol 40% (v/v) e por infusão utilizando água a 100 °C. Para a caracterização em termos de fenólicos totais e conteúdo de flavonoides, os extratos foram quantificados por espectrofotometria. Para o ensaio cromatográfico, os extratos foram analisados por CLAE em sistema de fase reversa, com fase móvel consistindo de acetonitrila:água em eluição por gradiente e fluxo de 1,0 mL/min. Para a análise por CLUEESI- MS, a fase móvel foi composta de mistura de acetonitrila:metanol (4:1) e ácido fórmico pH 3,0, com eluição por gradiente e fluxo de 0,2 mL/min. A detecção por espectrometria de massas foi conduzida a partir das seguintes condições: N2 como nebulizante; energia de colição 4.0 eV; temperatura da fonte do eletrospray e do gás de solvatação 100°C e 120°C, respectivamente; voltagem do capilar 3000V; voltagem do cone 40V. Os espectros de massas foram obtidos na faixa de m/z 200-800. A avaliação dos efeitos hemodinâmicos foi realizadaem ratos wistar normotensos, anestesiados com uretana (1,4 mg/Kg), via canulação da artéria carótida (para a verificação da PAS, PAD e FC) e veia jugular (para administração do extratose drogas). A avaliação do potencial hipotensor da E. falcata foi investigada através da realização de uma curva crescente de administração dos extratos e os possíveis mecanismos de ação envolvidos foram analisados através da administração de diferentes drogas sendo elas: L-NAME (30 mg/kg); losartana (10 mg/Kg); hexametônio (20mg/Kg) e propranolol (5mg/kg). Os teores de fenólicos totais para E. falcata e E. crista-galli estiveram na faixa de 1,3193 – 1,4989 mgEAG/mL para os extratos obtidos por maceração e de 0,8771 – 0,9506 mgEAG/mL para as infusões. Em flavonoides totais, os conteúdos estiveram na faixa de 7,7829 – 8,1976 ER mg/g para os extratos obtidos por maceração e 9,3471 – 10,4765 ER mg/g para as infusões. Na determinação por CLUE-MS, os dados de íon molecular e fragmentos de massa indicaram a composição predominante em alcaloides, sugerindo-se os componentes erythristemine, 11β-methoxyglucoerysodine, erysothiopine, 11β- hydroxyerysodine–glicose e 11-hydroxyerysotinone-ramnosídeo. O extrato aquoso da E. falcata mostrou-se um potente hipotensor dose-dependente, causando uma queda na PAS de 23 a 35% e na PAD de 32 a 49% para ambos os extratos estudados, sem influenciar a FC, podendo este efeito estar relacionado com a via dos receptores β-adrenérgicos.
The genus Erythrina is present worldwide in tropical and subtropical regions. Phytochemical studies using various organs of these plants demonstrated the presence of alkaloids, flavonoids, pterocarpans and triterpenoids. Several species are found in Brazil, among them Erythrina falcata and Erythrina crista-galli, which are popularly known as “corticeira” and. used medicinally due to it action as sedative, anxiolytic, anti-inflammatory and antihypertensive. The present study aimed to investigate the chemical composition of extracts obtained from leaves of E. falcata and E. crista-galli, and still, to evaluate the hypotensive potential in vivo of E. falcata extracts. Initially, after collection of material plant, the leaves were selected, submitted to dryness and powdered. Then, submitted to extration by exhaustive maceration using ethanol 40% (v/v) and by infusion using water at 100 °C. For characterization in terms of phenolics and flavonoid content, the extracts were quantified by spectrophotometry. For chromatographic assay, the extracts were analysed by HPLC in reversed phase system, with a mobile phase consisting of acetonitrile:water in gradient elution and flow rate of 1.0 mL/min. For analysis by UPLC-ESI-MS, the mobile phase consisted in a mixture of acetonitrile:methanol (4:1) and 0.1% formic acid pH 3.0, with a elution by gradient and flow rate of 0.2 mL/min. The MS detection was performed following the conditions: N2 as nebulizing; collision energy 4.0 eV; temperature of electrospray source and desolvation gas 100°C and 120°C, respectively; capillary voltage 3000V; sample cone 40V. Mass spectra were recorded in the range of m/z 200-800. The evaluation of the hemodynamic effects was performed in normotensive Wistar rats, anesthetized with urethane (1.4 mg/kg) by cannulation of the carotid artery (for verification of SBP, DBP and HR) and jugular vein (for administration of the extracts and drugs). The hypotensive potential of E. falcata was investigated by conducting a growing curve administration of the extracts and the possible mechanisms involved were analyzed by administering different drugs such as: L-NAME (30 mg/kg); losartan (10 mg/kg); hexamethonium (20 mg/kg) and propranolol (5 mg/kg). The total phenolics content for E. falcata and E. crista-galli was from 1.3193 to 1.4989 mgGAE/mL for maceration and 0.8771 to 0.9506 mgGAE/mL for infusions. In total flavonoid, the content was from 7.7829 to 8.1976 mg RE/g for maceration and 9.3471 to 10.4765 RE mg/g for infusions. The molecular ions and mass fragments obtained by UPLCMS indicated the predominant composition in alkaloids, suggesting the components erythristemine, 11β-methoxyglucoerysodine, erysothiopine, 11β-hydroxyerysodine-glucose and 11-hydroxyerysotinone-rhamnoside. The aqueous extract of E. falcata showed to be a potent dose-dependent hypotensive, decreasing the SBP in 23 to 35% and DBP in 32 to 49% for both extracts, without influence in HR, and this effect may be due to the route of β- adrenergic receptors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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Estudos vêm sendo realizados visando correlacionar a composição química e a atividade biológica de diversos alimentos inseridos na dieta humana, entre eles o café e o cacau. O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de café, caracterizando-se também como um grande consumidor (70% da população consomem esta bebida). Com relação ao cacau, o Brasil ocupa o 5º lugar como produtor e consumidor mundial, sendo o estado da Bahia seu maior produtor (95%). São os compostos biologicamente ativos produzidos por estas espécies, usualmente oriundos do metabolismo secundário, que têm despertado o interesse das indústrias alimentícia, química e farmacêutica. Entre estes compostos destacam-se os (poli)fenóis e os alcalóides, sendo que diversos ensaios in vitro e in vivo vêm comprovando uma ampla variedade de efeitos biológicos associados aqueles metabólitos, com destaque para suas atividades antioxidante, antiinflamatória e antitumoral. A busca por compostos biologicamente ativos benéficos à saúde e que estejam inseridos em biomassas presentes na dieta humana como o café e o cacau, por exemplo, é uma estratégia que corrobora na prevenção de certas enfermidades que acometem o homem, notadamente aquelas relacionadas ao sistema cardiovascular e de natureza neoplásica. No presente trabalho, observou-se a capacidade dos extratos de café in natura (cru) e cacau em pó no seqüestro dos íons superóxido e hidroxil, com maior efeito sobre este último radical livre. Também constatou-se a atividade pró-vasculogênica do extrato aquoso de café in natura, enquanto o cacau apresentou ação antivasculogênica em modelos de embriões de galinha. Sugere-se uma continuidade destes estudos para que estas biomassas possam ser utilizadas como alternativas na prevenção de determinados distúrbios da saúde humana.

A família Amaryllidaceae é reconhecida como fonte de compostos bioativos, sendo o isolamento e elucidação estrutural de seus alcaloides, aliado às avaliações farmacológicas, um tema importante. Estudos mostram que o mecanismo de ação da citotoxicidade desses alcaloides é seletivo e depende da linhagem celular. Trichomonas vaginalis é um protozoário parasita que causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível de origem não viral mais comum no mundo. Além de ser considerado um importante organismo patogênico, suas características bioquímicas peculiares, como a ausência de mitocôndrias, torna o tricomonas um adequado modelo para estudos de vias metabólicas de morte celular. A atividade anti-T. vaginalis dos alcaloides de Amaryllidaceae licorina e candimina, assim como o potencial citotóxico de diaminas sintéticas, foram investigados. Estudos de semi-síntese com a licorina também foram desenvolvidos. Nossos resultados mostraram que a licorina e candimina induzem importantes alterações na ultraestrutura dos parasitos e nenhum marcador morfológico clássico de apoptose, como corpos apoptóticos, foi observado. Além disso, nem a fragmentação do DNA genômico nem a exposição de resíduos de fosfatidilserina foram detectadas. Por outro lado, ambos os alcaloides atrasaram o ciclo celular do parasito e inibiram a atividade das enzimas NTPDase e ecto-5`- nucleotidase, importantes na manutenção da relação parasito/hospedeiro. O alcaloide pró-apoptótico licorina e a candimina induziram morte celular no parasito amitocondriado T. vaginalis por um mecanismo de ação que não cumpre as características morfológicas de apoptose. Entretanto, similaridades com a morte celular denominada paraptose foram observadas: intensa vacuolização citoplasmática periférica aliada à integridade nuclear. Considerando que a citotoxicidade dos alcaloides pode ser considerada moderada (250 μM), derivados de poliaminas foram escolhidos para desenvolver estudos de semi-síntese com a licorina e aperfeiçoar a atividade do alcalóide. Poliaminas são moléculas catiônicas de estruturas simples, essenciais para a diferenciação celular e regulação do ciclo celular. Neste trabalho demonstrou-se a síntese e avaliação da atividade anti-T. vaginalis de uma série de derivados de diaminas, dos quais N-hexadecil-1,4-butanodiamina apresentou CIM igual a 2,5 μg/ml, duas vezes mais ativo em comparação ao metronidazol, utilizado como composto de referência. A hibridização molecular da licorina com as diaminas foi prejudicada pela instabilidade da licorina mesilada, intermediário chave para prosseguir a rota sintética. No entanto, seis derivados inéditos da licorina, todos ésteres, aromáticos ou alifáticos, foram sintetizados.
Amaryllidaceae family has proven to be plentiful sources for therapeutic agents. Hence, the isolation, biology and chemistry of the Amaryllidaceae alkaloids make an important subject. Investigations on cytotoxic mechanisms of these alkaloids indicate a promising selective cell-type-dependent cytotoxicity. Trichomonas vaginalis is a parasite that causes trichomonosis, the number one non-viral sexually-transmitted disease in the world. However, whilst T. vaginalis is a prime pathogenic target, its lack of mitochondria makes it a suitable biochemical model to study cell death-related mechanisms. Anti-T. vaginalis activity of lycorine and candimine alkaloids were investigated, as well as the cytotoxic potential of diamine analogs. Finally, studies on lycorine semi-synthesis were developed. Our results showed that, after lycorine and candimine treatment, no hallmark suggestive of apoptosis were observed, such as apoptotic bodies, but instead several important ultrastructural alterations, assessed by electronic microscopy. Additionally, DNA fragmentation and membrane phosphatidylserine exposure were not detected. Analysis showed that lycorine and candimine arrested T. vaginalis cell cycle and inhibited the NTPDase and ecto-5`- nucleotidase activities, important enzymes on parasite/host relationship. The proapoptotic alkaloid, lycorine, and the lactone alkaloid, candimine, caused cell death in the amitochondriate T. vaginalis by a mechanism of action that fails to completely fulfill the criteria for apoptosis. However, some similarities were observed to paraptotic cell death, like intense cytoplasmic periferic vacuolization and nuclear integrity. Since the cytotoxic potential of the alkaloids was moderated (250 μM), the polyamines analogs were chosen to investigate the anti-T. vaginalis activity and to develop semi-synthesis studies with lycorine in order to improve the alkaloid cytotoxicity. Polyamines are simple structured aliphatic amines essential for cell proliferation and differentiation and it has been shown that interfering with their function or biosynthesis the cellular growth can be blocked. Our results showed the synthesis of a series of diamine derivatives, and N-hexadecil-1,4-butanediamine was found to be the most active compound in vitro against T. vaginalis with MIC of 2.5 μg/mL, twice more active in comparison to the reference drug metronidazole. The molecular hybridization of lycorine with diamines was impaired by the unsuccessful synthesis of the lycorine mesilate, a key intermediary on the synthetic route. However, six new lycorine ester derivatives were synthesized.

Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T17:34:01Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5)
Made available in DSpace on 2016-09-08T17:34:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31
Cissampelos sympodialis Eichl., (Menispermaceae) is popularly known as “milona". This species has shown potential to interfere with the pathophysiology of asthma by exerting multiple synergistic effects. Warifteine, a bisbenzilsioquinoline alkaloid has been considered as the main bioactive substance present in the leaves and roots of this species. The present work used a metabolomics approach combined with multivariate data analysis to study quantitative and qualitative chemical variations in the leaf extracts during the phenological development of the plant (between 60 and 210 days after seedling, and the corresponding extracts were coded as CsL60, CsL90, CsL120, CsL150, CsL180 e CsL210) and its relation with the relaxing effect using in vitro guinea pig tracheal. 1H-NMR data from extracts were submitted to PCA analysis and the concentration of the identified compounds was quantified by 1H qNMR. The contents of warifteine and methylwarifteine were determined by HPLC and the total phenolic content of extracts was determined using the Folin-Ciocalteu method, using galic acid as standard. Extracts submitted to 1H-NMR spectroscopy were simultaneously screened to determine their potency in relaxing in vitro guinea-pig tracheal pre-contracted with carbachol. To investigate the relationship between chemical profile and pharmacological activity we used PLS regression. The method was able to identify and to quantitate 20 primary and secondary metabolites in the extracts. The concentration of the major alkaloids decrease from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL for methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. Phenolic compounds and derivatives of the flavonols quercetin and kaempferol behave in na opposite fashion, increasing its levels towards fructification (from 0.1 ± 0.05 to 1.0 ± 0.12 mmol/L for quercetin and from 0.4 ± 0.12 to 1.0 ± 0.16 mmol/L for kaempferol). The metabolomics study based on 1H-NMR spectroscopy with PCA was able to discriminate all extracts demonstrating that the phenological cycle is associated with clear differences in chemical composition, mainly due to variations in the concentration of sugars and quinic acid derivatives. The extract obtained during fructification (CsL210) was the most distinctive amongst all samples mainly due to signals from quinic acid derivatives, kaempferol and quercein derivatives. The content of major alkaloids decreased from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL to methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. The phenolic compounds and flavonoids quercetin (0.1 ± 0.05 a 1.0 ± 0.12 mmol/L) and kaempferol (0.4 ± 0.12 a 1.0 ± 0.16 mmol/L) behaved in an opposite fashion, increasing its concentration towards fructification. The six extracts relaxed the trachea pre-contracted with carbachol guinea pig, and the CsF210 extract (EC50 = 74.6 ± 7.9 μg/mL) more potent compared to CsL90 extracts (EC50 = 231.6 ± 38.9 μg/ml) and CsL180 (EC50 = 239.7 ± 15.1 μg/ml) in the presence of functional epithelium. There was no correlation between the content of alkaloids as determined by HPLC and the spasmolytic activity of the extracts. PLS analysis revealed a moderate correlation between 1H-NMR signals for quercetin and kaempferol derivatives and the spasmolytic activity of extracts. Taken together our results demonstrate for the first time that bisbenzylisoquinoline alkaloids warifteine and methylwarifteine do not seem to participate in the spasmolytic actions of polar Cissampelos sympodialis extracts.
Cissampelos sympodialis Eichler, pertence a família Menispermaceae, sendo conhecida popularmente como “milona". A espécie tem demonstrado por meio de testes pré-clínicos, potencial de interferir em processos relacionados com a fisiopatologia da asma, exercendo múltiplos efeitos sinérgicos. A warifteína, um alcaloide bisbenzilisoquinolínico, tem sido apontada como a principal substância bioativa presente nas folhas e nas raízes desta espécie. O presente estudo utilizou metodologia metabolômica baseada em RMN e combinação com análise multivariada para analisar a variação química qualitativa e quantitativa dos constituintes presentes nos extratos hidroalcoólicos das folhas durante o desenvolvimento da planta (entre 60 a 210 dias após o plantio, codificados como CsF60, CsF90, CsF120, CsF150, CsF180 e CsF210) e a relação com o efeito in vitro sobre traqueia isolada de cobaia. Os dados de RMN-1H dos seis extratos das folhas foram submetidos à análise por PCA e os teores dos compostos identificados foram quantificados por RMNq-1H. O teor de warifteína e metilwarifteína foram determinados por CLAE e o teor de fenólicos totais determinado pelo método de Folin-Ciocalteu, utilizando ácido gálico como o composto fenólico padrão. Os extratos submetidos à análise por RMN-1H foram simultaneamente testados quanto à sua potência em relaxar in vitro a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol. Para estudar a relação entre o perfil químico e a atividade farmacológica foi empregada a técnica de PLS (Partial Least Squares). O estudo foi capaz de identificar e quantificar vinte substâncias dentre metabólitos primários e secundários presentes em todos os extratos das folhas. Os teores dos alcaloides majoritários decaem de 2,0 ± 0,32 μg/mL para warifteína e 1,0 ± 0,14 μg/mL para metilwarifteína a níveis não detectáveis, a partir de 90 dias após o plantio para a warifteína e a partir de 120 dias para metilwarifteína. Os compostos fenólicos e os flavonóis quercetina (0,1 ± 0,05 a 1,0 ± 0,12 mmol/L) e caempferol (0,4 ± 0,12 a 1,0 ± 0,16 mmol/L) se comportam de forma contrária, aumentando os seus níveis no sentido da frutificação. Através da análise de PCA foi possível diferenciar todos os extratos, demonstrando que o ciclo vegetativo está associado com diferenças claras na composição química, principalmente devido a variações na concentração de açúcares, compostos fenólicos e derivados do ácido quínico. O extrato (CsF210) originado das folhas no período da frutificação foi o mais distinto entre as amostras, sendo os sinais atribuídos aos derivados do ácido quínico, quercetina e caempferol responsáveis por esta discriminação. Os seis extratos foram capazes de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol, sendo o extrato CsF210 (CE50 = 74,6 ± 7,9 μg/mL) mais potente em relação aos extratos CsF90 (CE50 = 231,6 ± 38,9 μg/mL) e CsF180 (CE50 = 239,7 ± 15,1 μg/mL) na presença de epitélio funcional. Não houve correlação entre o teor de alcaloides determinados por CLAE e a atividade espasmolítica dos extratos. Por outro lado, a análise por PLS demonstrou correlação entre os sinais de derivados dos flavonóis quercetina e caempferol e a potência espasmolítica dos extratos. Em conjunto nossos resultados demonstram pela primeira vez que os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos warifteína e metilwarifteína não parecem estar envolvidos nas ações espasmolíticas dos extratos polares de Cissampelos sympodialis.

A espécie endêmica G. elliptica R. E. Fries não apresentava estudos fitoquímicos e biológicos detalhados na literatura. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a composição química e as propriedades biológicas dos óleos essenciais, extratos brutos, alcaloides totais, tortas, frações das tortas, amostras isoladas dessa espécie. O material vegetal foi coletado em Paranapiacaba (Santo André, SP, Brasil). O óleo essencial extraído das folhas por destilação à vapor apresentou um rendimento de 0,2%. A análise histológica das folhas encontrou óleo em células oleíferas localizadas no parênquima esponjoso. A composição do óleo (CG-EM) indicou espatulenol e óxido de cariofileno como compostos majoritários. Os alcaloides totais foram obtidos dos extratos brutos das folhas e dos galhos e analisados por CG-EM, identificando quatro aporfinas (nornuciferina, estefarina, corituberina e asimilobina) e duas protoberberinas (discretamina e caseadina). Os alcaloides totais foram fracionados em coluna cromatográfica ou por Extração em Fase Sólida e purificados por cromatografia em camada preparativa, originando duas amostras (Amostra 9 e 10). Na Amostra 9, foram identificados dois alcaloides aporfinicos nornuciferina e asimilobina (CG-EM e RMN-1H). Na Amostra 10, foram identificados (LC-EM/EM) cinco alcaloides aporfínicos (desidronantenina, glaunidina, liriodenina, N-óxido de oliverina e telikovina) e um alcaloide protoberberínico (caseadina). Caseadina, glaunidina, N-óxido de oliverina e telikovina não foram previamente identificados em Guatteria. Os resíduos dos extratos brutos livres de alcaloides foram fracionados pelo método de partição com solventes de polaridade crescente. Os extratos brutos e as frações acetato de etila e butanólicas de folhas e galhos apresentaram flavonoides (NP-PEG). Nos ensaios biológicos, a melhor atividade antioxidante (sequestro do radical DPPH) foi encontrada para a fração clorofórmica dos galhos (EC50=24,25±1,14 µg/mL) e a torta dos galhos (EC50=26,23±4,20 µg/mL). No ensaio antimicrobiano pelo método turbidimétrico a atividade mais importante foi obtida contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538) para os alcaloides totais dos galhos (CIM/CBM=0,12±0,01/0,26 mg/mL) e das folhas (CIM/CBM=0,21±0,01/0,28 mg/mL), e fração hexânica das folhas (CIM/CBM=0,24±0,02/>1 mg/mL). Uma alta atividade antitumoral foi observada frente a células humanas de mama (MCF-7) para Amostra 10 (IC50=2,28±0,18 µg/mL), fração de acetato de etila das folhas (IC50=4,47±0,40 µg/mL), óleo essencial (IC50=7,01±0,23 µg/mL) e os alcaloides totais das folhas (IC50=9,32±0,36 µg/mL). Para as células de próstata (PC-3), foi encontrada atividade para a Amostra 10 (IC50=1,37±0,36 µg/mL) e o óleo essencial (IC50=5,32±0,35 µg/mL). A futura aplicação dos extratos e frações de G. elliptica como um agente antitumoral parece ser segura, pois mantiveram uma viabilidade celular maior do que 90% no ensaio de citotoxicidade com culturas de fibroblasto murino (BALB/c 3T3, ATCC CCL-163) nas concentrações onde a atividade antitumoral foi promissora (<30 µg/mL) contra MCF-7 e/ou PC-3.
The endemic species G. elliptica R. E. Fries had not yet been thouroughly investigated phytochemically and biologically. Therefore, the objective of this work was to evaluated the chemical and biological properties of the G. elliptica essential oils, crude extracts, alcaloid-free extracts, total alcaloids, fractions and isolated samples. The plant material was collected in Paranapiacaba (Santo Andre, SP, Brazil). The leaves essential oil, was obtained by hydrodestillation with a yield of 0.2%. In the leaves, the oil was found in secretory cells, located in the spongy parenchyma. The oil analysis (GC-MS) identified spathulenol and caryophyllene oxide as major compounds. The total alkaloids were extracted from the leaves and branches crude extracts and analysed by GC-MS, identifying four aporphines (nornuciferine, stepharine, corytuberine, assimilobine) and two protoberberines (discretamine and caseadine). Total alkaloids were fractionated by column chromatography or solid phase extraction and purified by preparative thin layer chromatography affording two samples (Sample 9 and 10). In Sample 9, two aporphin alkaloids were found and identified (GC-MS and 1H-NMR) as nornurciferine and assimilobine. In Sample 10, were identified (LC-MS/MS) five aporphin alkaloids (dehydronantenine, glaunidine, liriodenine, N-oliverine oxide and telikovine) and one protoberberine alkaloid (caseadine). Caseadine, glaunidine, oliverine N-oxide and telkovine were not previously reported for Guatteria. The alkaloids-free extracts were fractionated using the increasing polarity solvents. Concerning the biological activities, the highest antioxidant activity (DPPH scavenging) was reported for the branches chloroform fraction (EC50=24.25±1.14 µg/mL) and (EC50=26.23±4.20 µg/mL) alkaloid-free extract. In the turbimetric antimicrobial assay against, the most important activity was found against Staphylococcus aureus (ATCC 6538) for the total alkaloids from branches (MIC/MBC=0.12±0.01/0.26 mg/mL) and leaves (MIC/MBC=0.21±0.01/0.28 mg/mL) and for the leaves hexane fraction (MIC/MBC=0.24±0.02/>1 mg/mL). The highest antitumor activity against human breast cancer cell line (MCF-7) was observed for Sample 10 (IC50=2.28±0.18 µg/mL), leaves ethyl acetate fraction (IC50=4.47±0.40 µg/mL), essential oil (IC50=7.01±0.23 µg/mL) and leaves total alkaloids (IC50=9.32±0.36 µg/mL). For the prostate cancer cell line (PC-3), the most active samples were Sample 10 (IC50=1.37±0.36 µg/mL) and the essential oil (IC50=5.32±0.35 µg/mL). The future application of G. elliptica extracts and fractions as an antitumor agent appears to be safe, because cell viability remained higher than 90% in the cytotoxicity assay with murine fibroblast cultures (BALB/c 3T3, ATCC CCL-163), in the concentration range where the best antitumor activity (<30 µg/mL) against MCF-7 and PC-3 was found.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5040357 bytes, checksum: d112d16462e653eb7f528351d768dc3f (MD5) Previous issue date: 2014-02-26
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) is a plant commonly found in semi-arid regions of Brazil. Its roots and leaves are used in folk medicine to treat arthritis, rheumatism and respiratory disorders. Studies have shown its anti-inflammatory, immunomodulatory and anti-asthmatic effects. The aim of this study was: 1) to evaluate the effect of administration, intranasally (i.n.) of the leave extract (AFL) and its alkaloids warifteine (WAR), methylwarifteine (MWA) and milonine (MIL) in the lungs of BALB/c mice sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) and 2) to analyze the effects of alkaloids on inflammatory cells and their molecules related to inflammation. The parameters evaluated in vivo were: the cell migration into bronchoalveolar lavage (BAL), histopathological changes in the lung tissue and analysis of IgE levels on the serum. In vitro assays, were evaluated the phosphorylation of JNK kinase enzyme and expression of COX-2 on cultured macrophage and mast cells. The results showed that the AFL and the alkaloids were able to inhibit the migration of inflammatory cells, mainly eosinophils to the lung. However the AFL and milonine induced neutrophil migration to the lung. Treatment with the extract and the alkaloids inhibited the production of mucus by goblet cells present in the bronchial epithelium and the migration of TCD4+ and TCD8+ into the lung tissue, except warfteine that increased the TCD8+ subpopulation,. Only the AFL treatment was able to decrease serum IgE concentration and, among the alkaloids, MWA was able to inhibit the production of interleukin-13 (IL-13) by cells from the BAL. In vitro tests showed that the alkaloids presented no toxicity for macrophage and mast cells at all concentrations tested 0.1, 1.0 and 10 μM. However, only milonine was able to inhibit degranulation of mast cells via inhibition of histamine release. The inhibition of JNK phosphorylation was observed with MWA and MIL independent of COX-2 activation. These results indicate that the extract, when administered intranasally, has antiasthmatic effect by decreasing the eosinophil migration into the lung and the mucus production and, MWA is one of the important compounds present into the extract due to decreasing the JNK phosphorylation. In addition, these data provide additional information to produce an herbal plant for the treatment of intranasal airway inflammatory disorders and the MWA may be the molecular marker for the quality and effect of the herbal medicine.
Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae) é uma planta comumente encontrada em regiões semiáridas do Brasil. Suas raízes e folhas são usadas na medicina popular no tratamento de artrite, reumatismo e doenças respiratórias. Estudos têm demonstrado seu efeito anti-inflamatório, antiasmático e imunomodulador. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar o efeito da administração, por instilação nasal (i.n.), do extrato das folhas de Cissampelos sympodialis (AFL) e de seus alcaloides warifteina (WAR), metilwarifteina (MWA) e milonina (MIL) em pulmões de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA) e 2) analisar o efeito destes alcaloides sobre células inflamatórias e suas moléculas relacionadas com a inflamação. Os parâmetros avaliados in vivo foram: padrão de migração de células no lavado bronco alveolar (BAL), alterações histopatológicas no tecido pulmonar e análise dos níveis de IgE no soro. Nas análises in vitro, em cultura de macrófagos e mastócitos, foram avaliados a fosforilação das enzimas JNK quinase e a expressão da COX-2. Os resultados demonstraram que o AFL e os alcaloides foram capazes de inibir a migração das células da inflamação, em especial, os eosinófilos no pulmão. Entretanto, o AFL e a milonina induziram aumento no número de neutrófilos no pulmão. Os tratamentos com o extrato e os alcaloides inibiram a produção de muco pelas células caliciformes presentes no epitélio brônquico e a migração de linfócitos T CD4+ e TCD8+ da cavidade pulmonar, com exceção da warifteina que aumentou a subpopulação T CD8+. Apenas o tratamento com AFL foi capaz de diminuir a concentração de IgE sérica e, entre os alcaloides, somente a MWA foi capaz de inibir a produção da interleucina-13 (IL-13) pelas células do BAL. Nos ensaios in vitro, observou-se que os alcaloides não apresentaram toxicidade para mastócitos e macrófagos em todas as concentrações testadas 0.1, 1.0 e 10 μM. Entretanto, apenas a milonina foi capaz de inibir degranulação de mastócitos via inibição da liberação da histamina. A inibição da fosforilação da JNK foi observada com a MWA e a MIL independentes da expressão da enzima COX-2. Estes resultados indicam que o extrato, quando administrado por instilação nasal, apresenta efeito antiasmático principalmente pela diminuição da migração de eosinófilos para o pulmão e pela produção de muco e que a MWA é um dos compostos presentes no extrato importante para o efeito antiasmático da planta devido á diminuição da fosforilação da JNK. Em adição, estes dados fornecem informações para a produção de um fitoterápico da planta para o tratamento intranasal de doenças inflamatórias das vias aéreas e a MWA pode ser o marcador molecular de qualidade e efeito do fitoterápico.

As espécies Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. e Aspidosperma cylindrocarpon Muell. Arg. pertencentes à família Apocynaceae, de ocorrência natural no estado de São Paulo, foram objeto de investigação química e estabelecimento de culturas in vitro. Como não havia relatos da composição dos alcalóides presentes nas folhas de ambas as espécies, nossos estudos foram concentrados nessa parte do vegetal. Adicionalmente, foi analisado a composição dos óleos voláteis destas espécies. Como são descritas diversas atividades biológicas para os alcaloides indólicos, foram analisados as atividades antitumoral, antimicrobiana e antimalárica dos extratos de alcalóides totais. Os alcalóides das folhas de A. polyneuron foram obtidos através de partição ácido-base com solventes orgânicos e foram isolados por técnicas cromatográficas de adsorção, sendo analisadas por CG/MS. Na espécie A. polyneuron foram identificados 5 alcalóides indólicos do tipo aspidospermatano: aspidospermina, desmetil-aspidospermina, desmetóxi-aspidospermina, cilindrocarina e pirifolidina. O estudo químico das folhas de A. cylindrocarpon, através de técnicas cromatográficas e CG/MS permitiu a identificação de alcalóides indólico do tipo aspidospermatano (aspidospermina, N-benzoíl-cilindrocarina, N-benzoíl-20-hidróxi-cilindrocarina, N-cinamoíl-20-hidróxi-cilindrocarina) do tipo erbunano (16-epi-vincamina) e do tipo hetero-ioimbano (tetra-hidro-alstonina). Os óleos voláteis foram obtidos das folhas por destilação por arraste a vapor. O óleo de A. polyneuron apresentou um constituinte majoritário, o diterpeno caureno (73,7%), e aldeídos de cadeia longa. No óleo volátil das folhas de A cylindrocarpon foram identificados 25 constituintes que correspondem a 96,1 % do óleo bruto. Principalmente sesquiterpenos hidrocarbonados (germacreno-D, β-cariofileno) e sesquiterpenos oxigenados (espatulenol, epi-globulol e globulol), além de monoterpenos hidrocarbonados (α-pineno) e oxigenado (linalol) e aldeídos de cadeia longa. Na cultura de células in vitro de A. polyneuron, foi possível apenas a indução de calos friávies. A cultura de células da A. cylindrocarpon foi estabelecida desde as células não diferenciadas. Dos calos até as suspensões celulares. As culturas apresentram fase lag com aproximadamente 4 dias, seguida de uma fase de crescimento exponencial e de uma fase com crescimento linear, com duração de 15 dias. Após essa fase as células entram numa fase estacionária de crescimento. Nos ensaios de autobiografia para determinação da atividade antifúngica frente aos fungos Clasdosporium cladosporiodes e Clasdosporium sphaerospermum, ambos extratos de alcalóides totais apresentaram respostas positivas. A atividade antimalárica foi avaliada em cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae deficientes em sistema de reparo do DNA (RS321, Rad 52Y). Neste ensaio, apenas os alcalóides das folhas de A. cylindrocarpon apresentaram atividade. A atividade antitumoral foi determinada in vitro com isolados de Plasmodium falciparum sensíveis a cloroquina (K1) e resistentes (Palo Alto). Como havia relato dessa atividade para A. polyneuron foram feitos testes apenas para A. cylindrocarpon (folhas e ramos). Os extratos alcaloídicos apresentaram uma forte inibição do desenvolvimento dos parasitas. A Cl50 para o isolado K1 foi de 9,0µg/ml para os ramos e folhas 8,0µg/ml e para o isolado Palo Alto, ramos foi de 13,3µg/ml e folhas 10,5µg/ml.
Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. and Aspidosperma cylindrocarpon Muell. Arg. belong to Apocynaceae and naturally occur in São Paulo State (Brazil). Both species were chemically investigated and in vitro cultures established. As there were no previous studies concerning the alkaloid composition from the leaves, our studies were focused on this plant part. Moreover, the volatile oil composition was determined for both species. As several biological activities have been described for indole alkaloids, the antimicrobial, antitumor and antimalarial activities were assayed for the total alkaloids. The leaf alkaloids were extracted by acid/base partitioning with organic solvents and isolated by adsorption chromatography techniques. The isolated alkaloids were analysed by GC-MS. A. polyneuron leaves afforded 5 aspidospermatane alkaloids: aspidospermine, demethoxy-aspidospermine, demethylaspidospermine cylindrocarine and pyrifolidine. In A. cylindrocarpon leaves different indole alkaloid skeletons were identified, 4 aspidospermatanes (aspidospermine, N-benzoyl-cylindrocarine, N-benzoyl-20-hydroxy-cylindrocarine, N-cynamoyl-20-hydroxy-cylindrocarine), 1 eburnane (16-epi-vincamine) and 1 heteroyohimbane (tetrahydroalstonine). The volatile oils were extracted from the leaves by steam distillation. A. polyneuron oil consisted of one single major compound, the diterpene kaurene (73,7%), and several long chain aldehydes. On the other hand, from the A. cylindrocarpon oil 25 constituents could be identified corresponding to 96.1 % of the crude oil. The major components were sesquiterpene hydrocarbons (germacreno-D, β-caryophyllene), oxygenated sesquiterpenes (spathulenol, epi-globulol, globulol), a monoterpene hydrocarbon (α-pinene), an oxygenated monoterpene (linalool) and also several long chain aldehydes. For A. polyneuron, callus cultures were induced, while for A. cylindrocarpon was also possible the establishment of cell suspension cultures. A. cylindrocarpon cell suspension cultures showed a lag phase of growth for approximately 4 days. The lag phase was followed by a growth phase for 15 days. After 20 days of culture the cells showed a stationary growth. Alkaloid extract from both species showed a antifungal activity in the bioautography assay with Clasdosporium cladosporiodes and C. sphaerospermum. The antitumor activity was evaluated with mutant Saccharomyces cerevisiae strains deficient in the DNA repair system (RS321 and Rad 52Y). In this assay, only the leaf alkaloids of A. cylindrocarpon presented activity. In vitro antimalarial assay were performed with Plasmodium falciparum chloroquine sensitive (K1) and resistant (Palo Alto). As such an activity was previously reported for A. polyneuron, only A. cylindrocarpon alkaloid extracts from leaves and stems were tested. Both alkaloid extracts showed strong inhibition of the parasite development. The IC50 for the K1 isolate were 9.0 µg/ml for the leaves and 8,0 µg/ml for the stems. The Palo Alto isolated presented a higher IC50, 13,3 µg/ml stems and 10,5 µg/ml.

Cleome dendroides é uma espécie endêmica da Mata Atlântica dos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, bioma alterado por intensa atividade antrópica, o que constitui uma ameaça à preservação de suas populações. Não existem estudos dos pontos de vista fisiológico, biotecnológico, fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. Considerando-se o perfil fitoquímico e o potencial medicinal do gênero, torna-se relevante definirem-se protocolos para a produção de plantas e metabólitos de C. dendroides utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro. No presente trabalho, foram realizados estudos sobre a germinação in vivo da espécie, avaliando-se a influência do substrato, temperatura e luz. Não se observou qualquer tipo de dormência, sendo as temperaturas de 20, 25 e 20-30C, em areia ou vermiculita, apropriadas para a germinação in vivo. Definiu-se também uma metodologia eficiente de germinação sob condições in vitro, e as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes para os estudos de propagação in vitro. A resposta morfogênica foi avaliada considerando-se a origem e tipo do explante, tipos e concentrações de reguladores de crescimento e número de subculturas. A metodologia empregada mostrou-se eficiente para a produção de brotos e manutenção de estoques de plantas in vitro que serviram como fonte de explantes. A melhor condição para a propagação in vitro foi definida em meio solidificado contendo BA, independentemente do tipo de explante e da origem. Os brotos obtidos foram alongados, enraizados e aclimatizados. Também foi estabelecida a cultura de raízes e a regeneração de brotos a partir destas culturas. Avaliou-se o efeito da origem do explante, assim como dos tipos e concentrações de fitorreguladores sobre a proliferação de raízes e a regeneração de brotos. O fitorregulador AIB propiciou maior multiplicação das raízes, enquanto BA mostrou-se eficiente na regeneração de brotos a partir das raízes recém-formadas. Foi estabelecido ainda um protocolo de cultura de calos e de suspensões celulares. Avaliou-se o efeito da origem e do tipo de explante, dos tipos e das concentrações de fitorreguladores sobre a calogênese. A combinação de PIC com KIN foi a mais eficiente para a indução de calos em explantes de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro, produzindo calos que foram mantidos por pelo menos dois anos. As suspensões celulares também foram estabelecidas em meio contendo PIC + KIN, mantendo uma produção de biomassa de cerca de cinco vezes o peso fresco inicial por três sucessivas subculturas. Análises histoquímicas e fitoquímicas revelaram a presença de alcaloides nos calos e nas suspensões celulares. Foram realizadas análises fitoquímicas de plantas de campo, plantas aclimatizadas, plantas mantidas em estoque in vitro e culturas de raízes, as quais indicaram a presença de derivados de glicosinolatos. Os resultados demonstraram a viabilidade de produção de material vegetal de C. dendroides por meio de métodos biotecnológicos e a produção in vitro de metabólitos de importância medicinal
Cleome dendroides is an endemic species of the Atlantic Forest of Rio de Janeiro and Espírito Santo states, biome changed by intense human activities that threaten its populations. There are no physiological, biotechnological, phytochemical or pharmacological studies of this specie. Considering the phytochemical profile and the medical potential of the genus, it becomes relevant to establish protocols for the production of plants and metabolites of C. dendroides using different in vitro culture systems. In this work, studies were performed on the in vivo germination of the species evaluating the influence of the substrate, temperature and light. There was no dormancy, and germination was achieved at 20, 25 and 20-30C, on sand or vermiculite substrates. An efficient methodology of germination under in vitro conditions was defined by comparing the different stages of post-seminal development with seedlings from germination under in vivo conditions. The plantlets obtained from the in vitro germination were used as a source of explants for in vitro propagation system. The morphogenic response was evaluated considering the source and type of explant, types and concentrations of growth regulators and number of subcultures. The methodology was efficient for the production of shoots and maintenance of in vitro plants. The best condition for in vitro propagation was using solidified medium supplemented with BA, regardless of the tested explants. The shoots were efficiently elongated, rooted and acclimatized. It was also established an efficient protocol for root culture and shoots regeneration from these cultures. The effect of source of explant, the types and growth regulator concentrations on the proliferation of roots and shoot regeneration was evaluated. IBA provided higher multiplication rates of the roots, whereas BA was effective in the regeneration of shoots from the newly formed roots. A protocol of callus culture and cell suspension culture was established. The effect of the origin and type of explant, the types and concentrations of growth regulators on callus formation was evaluated. PIC + KIN was the most efficient combination for callus induction from explants derived from in vitro germinated seedlings. Callus cultures were maitained for at least two years. Cell suspension cultures were established with the same combination of growth regulators (PIC + KIN), maintaining a biomass of about five times the initial fresh weight of three successive subcultures. Histochemical and phytochemical analysis revealed the presence of alkaloids in callus and suspension cell cultures. Phytochemical analyses of field plants, acclimatization in vitro plant and culture roots were performed, which indicated the presence of glucosinolate derivatives. The results demonstrated the possibility of producing medicinal important metabolites from C. dendroides by biotechnological methods

Los analitos de interés biológico utilizados fueron una familia de alcaloides b-carbolínicos denominados Harmanos, entre ellos podemos destacar al Harmano, Norharmano, Harmol, Harmalol, Harmina y Harmalina. Todos estos alcaloides son estructuralmente muy similares y de pesos moleculares muy cercanos (en algunos casos de 1 Da) con lo cual la separación de los mismos constituye un interesante desafío. El interés de su análisis radica en que estos alcaloides están presentes en cantidades variables en varias especies vegetales y que, a su vez, a ciertas concentraciones poseen efectos psicotrópicos y alucinógenos en seres humanos, así como se presume que son cancerígenos según estudios recientes. Los mismos en concentraciones elevadas en alimentos los harían no aptos para el consumo humano. Por otra parte se estudiaron péptidos opiáceos que están relacionados con enfermedades como el dolor crónico, alzheimer, entre otras. Su determinación a concentraciones extremadamente bajas en plasma humano sería de mucha utilidad al momento de realizar diagnósticos precoces. Mediante técnicas electroforéticas de preconcentración en línea y mediante el uso de distintos sistemas de detección se intenta alcanzar los límites de detección deseados para cada muestra en particular. Además se desarrollan nuevos métodos de concentración utilizando a la temperatura como variable.

Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química
Uncaria tomentosa (Willd) DC., conhecida como unha de gato, é uma liana tropical nativa da Amazónia brasileira e peruana. A espécie é reconhecida pelas suas propriedades antiinflamatória, imunoestimulante, antioxidante e antiviral, geralmente atribuídas aos polifenóis e, principalmente aos alcaloides oxindólicos pentacíclicos. Essa espécie enfrenta ultimamente uma diminuição alarmante no seu habitat nativo, devido principalmente à sua colheita indiscriminada, dado o alto grau de comercialização das cascas para uso medicinal. Nesse âmbito, o possível aproveitamento das folhas para fins terapêuticos ganha relevância para a sobrevivência da espécie e a sustentabilidade do mercado. Contudo, as folhas ainda não são suficientemente conhecidas do ponto de vista do conteúdo alcaloídico, e até o momento, não existem estudos sobre seu conteúdo fenólico. Este trabalho teve como objetivo analisar o perfil químico e determinar o teor de alcaloides (quantificados pelo marcador mitrafilina) e polifenóis (quantificados pelo ácido clorogênico) por HPLC em fase reversa, complementado com informações obtidas por TLC, em cinco amostras de folhas de Uncaria tomentosa colhidas em diferentes localidades do Brasil. Foram comparados os produtos da extração das folhas secas com metanol puro e com etanol/água 1:1; obtendo-se para cada um deles, frações enriquecidas em alcaloides e fenóis, mediante procedimentos de partição. A quantificação da mitrafilina e do ácido clorogênico nas amostras foi realizada através do método HPLC-DAD, utilizando retas de calibração externa com seus respetivos padrões. Em ambos os casos, foram avaliados os parâmetros de linearidade, limite de deteção e quantificação e foram efetuados ensaios de recuperação. Três amostras da fração sob partição básica apresentaram conteúdos de mitrafilina entre 0,88-2,15 mg/g de folhas secas. As cinco amostras indicaram, na partição ácida, um conteúdo de ácido clorogênico de 0,14-1,71 mg/g de folhas secas. Uma das amostras apresentou o flavonoide campferitrina como um sinal proeminente no cromatograma, sugerindo que provavelmente esta amostra não provém da U. tomentosa, ainda que as folhas sejam morfologicamente similares. Estes resultados destacam a adequabilidade da técnica HPLC aplicada ao controle de qualidade de matéria-prima vegetal com fins medicinais. A análise por UPLC-DAD-MS corroborou a presença dos marcadores químicos (mitrafilina, ácido clorogênico e campferitrina) nos extratos de U. tomentosa analisados.
Uncaria tomentosa (Willd) DC., known as cat´s claw is a vine native to tropical Brazilian and Peruvian Amazon. The species is known for its anti-inflammatory, immunostimulant, antioxidant and antiviral properties, generally attributed to polyphenols, and especially to the pentacyclic oxindole alkaloids. This species is lately facing alarming decrease in its native habitat, mainly due to the indiscriminate harvesting, given the high degree of commercialization of the bark for medicinal use. In this context, the possible use of the leaves for therapeutic use gains relevance for the survival of the species and the sustainability of the market. However, the leaves are not yet sufficiently known from the point of view of alkaloid content, and so far, there are no studies on its phenolic content. This study aimed to analyze the chemical profile and determine the content of alkaloids (quantified by mitraphylline marker) and polyphenols (quantified by chlorogenic acid) by reversed phase HPLC, supplemented with information obtained by TLC in five samples of leaves of Uncaria tomentosa harvested in different Brazilian locations. The products of the extraction of dried leaves with pure methanol and with ethanol / water 1:1 were compared, for each one of them, fractions enriched in alkaloids and phenols by partition procedures were obtained. The quantification of mitraphylline and chlorogenic acid in the samples was performed though the HPLC-DAD method using external calibration curves with their respective standards. In both cases the parameters evaluated were: linearity, limit of detection and quantification and recovery experiments were also performed. Three samples of the fraction under basic partition showed mitraphylline content between 0.88 and 2.15 mg / g of dried leaves. The five samples indicated in the acidic partition a chlorogenic acid content from 0.14 to 1.71 mg / g of dried leaves. One of the samples showed the kaempferitrin flavonoid as a prominent sign on the chromatogram, suggesting that this sample is probably not from U. tomentosa, even if the thorns are morphologically similar. These results highlight the suitability of the HPLC technique applied to quality control of plant material for medicinal purposes. The analysis by UPLC-DAD-MS confirmed the presence of chemical markers (mitraphylline, chlorogenic acid and kaempferitrin) in the extracts of U. tomentosa analyzed.