Tesis sobre el tema "Anticorps monoclonaux (mAbs)"

Les protéines de cellule hôte (HCPs) sont des impuretés indésirables dans la production d’anticorps monoclonaux (mAbs), pouvant compromettre la sécurité, l’efficacité et la stabilité des traitements. Bien que l’ELISA soit couramment utilisée, elle présente des limites de couverture. Cette thèse explore des méthodes complémentaires basées sur la spectrométrie de masse. Une approche d’immuno-capture permet de détecter les HCPs non immune-réactifs, tandis que des workflows LC-MS/MS avancés avec des peptide standards offrent une quantification plus précise. Ces stratégies visent à améliorer le contrôle qualité dans la fabrication des mAbs
Host cell proteins (HCPs) are unwanted by-products in the production of monoclonal antibodies (mAbs), and even at low levels, they can affect the safety, efficacy, and stability of biopharmaceuticals. While ELISA is widely used for HCP detection, it lacks full impurity coverage. This work explores complementary mass spectrometry-based methods to address these limitations. An immune-capture MS approach targets non-immunoreactive HCPs missed by ELISA, while advanced LC-MS/MS workflows using peptide standards enable more accurate and flexible quantification. These tools aim to improve impurity profiling and strengthen quality control in mAb manufacturing

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif
Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions

Le marché des anticorps monoclonaux représente actuellement la majorité des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique. Les difficultés liées à la production de tels anticorps dans des cellules de mammifères, ont poussé la communauté scientifique à envisager des organismes alternatifs pour leur production. Récemment, les microalgues ont montré leur capacité à produire des anticorps monoclonaux fonctionnels. Il est cependant nécessaire de modifier la glycosylation naturelle de ces microalgues afin qu’elles produisent des anticorps pouvant être utilisés pour certaines applications thérapeutiques chez l’Homme. Dans ce contexte, l’étude de la N-glycosylation de la diatomée Phaeodactylum tricornutum a été réalisée. Cette étude a consisté dans un premier temps à déterminer la structure du précurseur oligosaccharidique des N-glycannes des protéines formées dans le réticulum endoplasmique. Les résultats ont permis de montrer la synthèse par la diatomée d’un précurseur tronqué d’un glucose comparé à la majorité des eucaryotes. Dans un second temps, il a été nécessaire de déterminer la structure détaillée des N-glycannes oligomannosidiques. Ces résultats ont permis d’établir que les structures Man9GlcNAc2 et Man5GlcNAc2 synthétisées sont similaires à celles retrouvées chez les mammifères. De plus, le Man5GlcNAc2 synthétisé est l’isomère substrat accepteur de la N-acétylglucosaminyltransférase I (GnT I) qui catalyse l’étape primordiale initiant la synthèse des glycannes complexes. Cette étude a donc permis d’initier l’humanisation de la voie de la Nglycosylation par la sur-expression de la GnT I chez la diatomée afin d’amplifier les proportions en Nglycannes complexes portant des résidus N-acétylglucosamine en position terminale
Currently, monoclonal antibodies represent the major class of recombinant proteins used for therapeutical applications in humans. The constraints due to the production of these monoclonal antibodies in mammalian cells led scientists to develop alternative expression system for the production of monoclonal antibodies. Recently, microalgae have been shown to be able to produce functional monoclonal antibodies. However, the engineering of the N-glycosylation pathway in these microalgae is required in order to optimize the effector functions of the algae-made antibody for some therapeutic applications. In this context, this PhD thesis focused on the study of the N-glycosylation of the diatom Phaeodactylum tricornutum. Initially, we focused on the structural analysis of the oligosaccharide precursor synthesized in the endoplasmic reticulum. The results showed that P.tricornutum synthesizes a truncated precursor as compared to the other eukaryotes. Then, I have investigated the detailed structure of the oligomannosidic N-glycans and demonstrated that the Man9GlcNAc2 and Man5GlcNAc2 synthesized were similar to those found in mammals. In addition, the Man5GlcNAc2 synthesized is the acceptor isomer for the N-cetylglucosaminyltransferase I (GnT I) which initiates in eukaryotes the synthesis of complex-type N-glycans. Humanization of the N-glycosylation pathway was finally iinitiated by over-expression of the GnT I in the diatom in order to increase the amounts of complex N-glycans carrying N-acetylglucosamine residues in the terminal position

La quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) dans le plasma est un pré-requis essentiel pour les études PK/PD. Les méthodes de références pour quantifier actuellement les mAbs sont de type ELISA mais les difficultés rencontrées notamment lorsque l’analyse porte sur des mAbs dont la cible pharmacologique est circulante, suggèrent que la spectrométrie de masse serait une alternative intéressante. Appliquée au bevacizumab, la stratégie développée fait appel à la spectrométrie de masse en tandem utilisée en mode MRM (HPLC-ESI-QqQ) et porte sur l’analyse des peptides spécifiques du bevacizumab obtenus à l’issu d’une protéolyse trypsique. La quantification absolue est réalisée à l’aide d’une droite de calibration obtenue à partir du ratio des aires des peptides du bevacizumab et de l’étalon interne. Afin de proposer une méthodologie de quantification de référence, nous avons définie les points clés du développement pour la transposition à d’autre mAbs et comparé les deux stratégies d’étalonnage interne les plus employées : l’une utilisant une protéine analogue et l’autre un peptide marqué par des isotopes stables (SIL-peptide). A travers ce développement la stratégie proposée présente un caractère universel vis-à-vis des anticorps monoclonaux de type IgG dont le traitement des échantillons repose sur une purification par protéine A suivit d’une concentration par ultrafiltration et dont la quantification fait appel à l’approche d’étalonnage interne SIL-peptide. Validée selon les recommandations de la FDA, notre méthode présente les performances analytiques attendues en termes de sensibilité, répétabilité et spécificité pour être appliquée à des études cliniques
The quantification in plasma of monoclonal antibodies (mAbs) is an essential prerequisite to any PK/PD preclinical and clinical study. To date, reference techniques used to quantify mAbs, rely on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) but the difficulties encountered in particular when the analysis focuses on the mAbs whose pharmacological target is circulating, suggest that mass spectrometry would be an interesting alternative. Applied to bevacizumab, the quantification developed strategy involves tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-QqQ) used in MRM mode and focuses on the analysis of specific peptides bevacizumab obtained after tryptic proteolysis. Absolute quantification is achieved through calibration curve obtained from peak area ratios of bevacizumab surrogate peptide and internal standard. To propose a reference quantification methodology, we have identified the key points of development for transposition to other mAbs and compared the two most commonly used internal calibration approaches: one using protein analogue and the other a stable isotope labeled surrogate peptide (SIL-peptide). Through this development, the proposed strategy has a universal character with respect to IgG monoclonal antibodies subclasses which is based on sample processing purification using protein A followed by concentration by ultra filtration and whose quantification involves the internal calibration approach SIL-peptide. Validated according to FDA guidelines, our method shows the expected analytical performance in terms of sensitivity, specificity and repeatability for application in clinical studies

Les récents progrès instrumentaux en spectrométrie de masse, notamment en terme de- rapidité de balayage et de résolution, ont permis l'émergence de l'approche « data independent acquisition» (DIA). Cette approche promet de combiner les points forts des approches « shotgun » et ciblées,mais aujourd'hui l'analyse des données DIA reste compliquée. L'objectif de cette thèse a été de développer des méthodes innovantes de spectrométrie de masse, et en particulier d'améliorer l'analyse des données DIA. De plus, nous avons développé une approche originale Top 3-ID-DIA, permettant à la fois un profilage complet des protéines de la cellule hôte (HCP) ainsi qu'une quantification absolue d'HCP clés dans les échantillons d'anticorps monoclonaux (mAb), au sein d'une même analyse.Cette méthode est prête à être implémentée en industrie, et pourrait fournir un support en temps réel aux développements du procédé de production de mAb, ainsi que pour évaluer la pureté des biomédicaments
Recent instrumental developments in mass spectrometry, notably in terms of scan speed and resolution, allowed the emergence of “data independent acquisition” (DIA) approach. This approach promises to combine the strengths of both shotgun and targeted proteomics, but today DIA data analysis remains challenging. The objective of my PhD was to develop innovative mass spectrometry approaches, and in particular to improve DIA data analysis. Moreover, we developed an original Top 3-ID-DIA approach, allowing both a global profiling of host cell proteins (HCP) and an absolute quantification of key HCP in monoclonal antibodies samples, within a single analysis. This method is ready to be transferred to industry, and could provide a real time support for mAb manufacturing process development, as well as for product purity assessment

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des biomolécules complexes utilisées pour traiter divers cancers et autres pathologies. Ce sont des glycoprotéines qui possèdent de nombreuses micro hétérogénéités pouvant altérer l'efficacité des traitements. De ce fait, l'analyse de ces variants nécessite le développement de méthodes analytiques rapides et précises afin d'élucider la structure des mAbs. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur le développement du couplage électrophorèse capillaire - spectrométrie de masse (CE-MS) afin d'obtenir une caractérisation des variants de mAbs à différents niveaux. D'abord, une validation de la méthode CE-MS au niveau bottom-up a été réalisée pour caractériser les structures des glycosylations et les quantifier relativement. Afin d'éviter les modifications artéfactuelles produites lors des étapes de préparation d' échantillon, des analyses ont été réalisées à des niveaux plus complexes de ces molécules. Pour cela, des méthodes ont été développées afin d'analyser les mAbs partiellement digérés via une enzyme spécifique pour confirmer les résultats et obtenir une répartition des modifications post traductionnelles. Enfin, des séparations des mAbs intacts ont été effectuées afin d'avoir une représentation la plus proche possible de la répartition des variants dans les échantillons. La caractérisation fine des variants permettra alors d'orienter les processus de fabrication des mAbs afin d'optimiser les traitements
Monoclonal antibodies (mAbs) are therapeutic biomolecules employed as treatment against cancer and other pathologies. These glycoproteins are subject to numerous micro-heterogeneities which cou Id affect treatment efficiency. Hence, mAbs variants analysis requires powerful, rapid and accurate analytical methods to elucidate their structure. ln this thesis, works have been done to develop methods leaning on a capillary electrophoresis - mass spectrometry coupling (CE-MS) to get a multi-level mAbs isoforms analysis. First, method assessment and validation of glycosylation forms analysis by CE-MS have been done to characterize and set up a relative quantitation of these modifications. ln order to avoid potential artifactual modifications due to the sample preparation process, higher order analyses have been performed at tougher analytical levels. For that purpose, methods involving partial and total enzymatic digestion have been developed and optimized to assess the plenty of post-translational modification linked to the protein structure. Finally, whole protein analyses have been completed to get a more accurate illustration from variants heterogeneity of the medication administered. The comprehensive analysis of mAbs and their variants should help to guide the manufacturing process and go a step further in treatment optimization

Besnoitia (B.) besnoiti is a cyst-forming apicomplexan parasite responsible for bovine besnoitiosis, a re-emerging disease in Europe with both cutaneous and systemic manifestations. The significant morbidity, lack of treatment and production losses associated make specific, sensitive, rapid and economic diagnosis imperative. Thirteen monoclonal antibodies (mAbs) were previously produced against a membrane-enriched extracts of B. besnoiti tachyzoites (Apure-BbELISA Ag) and now characterized by Immunoblot assay and Indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA). Hence, in order to meet the needs for a diagnostic method that would be accurate and easy to apply in the area of animal health, a study was undertaken to develop the first mAb-based competitive ELISA (Bb-cELISA1) at Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) in Germany. A total of 948 cattle sera were used to evaluate the Bb-cELISA1. The results were compared with previous iELISA results and revealed 99 per cent sensibility and 99.7 per cent specificity; Resumo: O primeiro ELISA de competição para um diagnóstico sensível e específico de besnoitiose utilizando um anticorpo monoclonal contra Besnoitia besnoiti Besnoitia (B.) besnoiti é um parasita apicomplexa formador de quistos, responsável pela besnoitiose bovina, uma doença re-emergente na Europa com manifestações cutâneas e sistémicas. A morbilidade, inexistência de tratamento e perdas produtivas associadas, tornam imperativo um diagnóstico específico, sensível, rápido e económico. Treze anticorpos monoclonais (mAbs) anteriormente produzidos face a um extrato de membrana enriquecida de taquizoítos de B. besnoiti (Apure-BbELISA Ag) foram agora caracterizados através de Immunoblot e Indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA). Consequentemente, com o objetivo de encontrar um método diagnóstico que seja exato e fácil de aplicar na área da saúde animal, o trabalho foi realizado para desenvolver o primeiro mAb-based ELISA competitivo (Bb-cELISA1) no Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) na Alemanha. Foram utilizados 948 soros de bovino para avaliar o Bb-cELISA1. Os resultados foram comparados com resultados anteriores de iELISA e reveladas sensibilidade de 99,1 por cento e especificidade de 99,7 por cento.

La manipulation des anticorps monoclonaux thérapeutiques (Acm) reconstitués avant administration aux patients est susceptible d’entraîner leurs dégradations physiques (e.g. dénaturation, agrégation). Ceci peut avoir un impact sur leur efficacité et sécurité. Afin d’étudier la conformation et la stabilité des Acms reconstitués, nous avons développé des méthodes séparatives couplées avec la spectrométrie de masse (MS) en conditions non-dénaturantes (« native »). Une méthode de CZE-native MS utilisant un revêtement constitué d’une triple-couche ionique a été développée pour séparer et détecter les différentes conformations (monomère natifs, dénaturés, dimères) d’Infliximab. Une étude approfondie réalisée en analysant de l’infliximab digéré a permis d’établir que la formation du dimère était liée à la dénaturation du fragment Fab. L’intérêt des revêtements statiques (commerciaux et préparés in situ) ont été étudiés pour analyser les Acms par CZE-UV et CZE-MS. Nos résultats ont montré l’intérêt d’un nouveau revêtement monolithique. Un couplage simultané de la SEC avec la MS et un détecteur de fluorescence a été développé. Nous avons ainsi identifié les conditions expérimentales qui entraînaient des dénaturations et des dimérisations artificielles. Cette méthode a ensuite été également appliquée avec succès pour la caractérisation d’un échantillon de Trastuzumab stressé. Une méthode orthogonale en utilisant la SEC-mobilité ionique-MS a été employé pour évaluer la proportion de monomères dénaturés par rapport aux monomères natifs. La méthodologie ainsi développée permettra la détection de très faibles taux d'anticorps dégradés dans des poches d'infusion. Ceci permettra de définir les paramètres critiques à maîtriser lors de la reconstitution et la manipulation d’anticorps à usage hospitalier
Manufacturing and manipulation of therapeutic monoclonal antibodies (mAb) in the hospital before administration to patient is prone to induce their physical degradations (e.g., denaturation, aggregation). This may impact their efficacy and safety. To study the stability of mAbs, capillary zone electrophoresis (CZE) and size exclusion chromatography (SEC), coupled to native mass spectrometry (MS) have been developed. CZE-native MS method using a triple-layer coating was developed to detect and separate different conformational states (unfolded monomer, dimer) of Infliximab in a single analysis. In-depth study with digested infliximab confirmed that dimer formation was related to the Fab fragment. We also focused on covalent coatings in order to find the more adapted coating to analyze mAbs by CZE-UV and CZE-MS. We also developed for SEC a simultaneous coupling with MS and a fluorescence detector to detect the degraded mAbs. We have identified the biases inducing conformational changes (e.g. dimerization, denaturation) that may arise during native MS. We also successfully characterized aggregates and denatured monomer in stressed Trastuzumab sample. In addition, the orthogonal method SEC-ion mobility-MS has been employed to separate and measure the denatured monomers compared to their related native conformations. Moreover, the developed system enables the detection of a very low levels of degraded mAbs in infusion bags. It allows to define the critical parameters to be controlled during the reconstitution and manipulation of therapeutic mAbs in hospital

Immunotoxins (ITs), which consist of antibodies conjugated to toxins, have been proposed as a treatment for cancer and chronic infections. To develop and improve the ITs, different toxins such as ricin, have been used, aiming for higher efficacy against target cells. The toxin pulchellin, isolated from the Abrus pulchellus plant, has similar structure and function as ricin. Here we have compared two plant toxins, recombinant A chains from ricin (RAC) and pulchellin (PAC) toxins, for their ability to kill HIV Env-expressing cells. Briefly, RAC and PAC were produced in E. coli, and chromatographically purified, then chemically conjugated to two different anti-HIV monoclonal antibodies (MAbs), anti-gp120 MAb 924 or anti-gp41 MAb 7B2. These conjugates were characterized biochemically by microcapillary electrophoresis and BCA assay and immunologically by a variety of ELISA tests. We performed a side-by-side comparison of their ability to bind, enter and kill HIV infected cells (H9/NL4-3) or Env-transfected 293T cells, as well as their non-specific toxicity on uninfected or non-transfected parental cells. Cell binding and internalization were studied by flow cytometry and confocal microscopy. Results showed that PAC can function within an effective IT. The ITs demonstrated specific binding against native antigens on persistently HIV-infected cells and recombinant antigens on Env-transfected cells. An irrelevant antibody conjugated to either RAC or PAC had no effect. PAC cytotoxicity appears somewhat less than RAC, the standard for comparison. This is the first report that PAC may have utility for the design and construction of therapeutic ITs, highlighting the potential role for specific cell targeting not only for AIDS also for cancer therapy.
As toxinas imunológicas (TIs), que consistem em anticorpos conjugados com toxinas, foram propostas como tratamento para câncer e infecções crônicas. Para desenvolver e melhorar as TI, diferentes toxinas, como a ricina, foram usadas, visando uma maior eficácia contra células alvo. A toxina pulchellina, isolada da planta de Abrus Pulchellus, tem estrutura e função semelhantes à da ricina. Aqui, comparamos duas toxinas de plantas, cadeias A recombinantes de toxinas de ricina (RAC) e pulchellina (PAC), por sua capacidade de matar células que expressam HIV. Resumidamente, RAC e PAC foram produzidos em E. coli e purificados por cromatografia, depois conjugados quimicamente com dois anticorpos monoclonais anti corpo-HIV diferentes (MAcs), MAc 924 anti-gp120 ou MAc 7B2 anti-gp41. Estes conjugados foram caracterizados bioquimicamente por eletroforese microcapilar e teste BCA e imunologicamente por uma variedade de testes ELISA. Realizamos uma comparação lado-a-lado de sua capacidade de ligar, entrar e matar células infectadas pelo HIV (H9 / NL4-3) ou células 293T transfectadas com Env, bem como a sua toxicidade não específica em parentes não infectados ou não transfectados Células. A ligação celular e a internalização foram estudadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os resultados mostraram que PAC pode funcionar dentro de uma TI efetiva. As TI demonstraram ligação específica contra antígenos nativos em células persistentemente infectadas pelo HIV e antígenos recombinantes em células transfectadas com Env. Um anticorpo irrelevante conjugado com RAC ou PAC não teve efeito. A citotoxicidade de PAC aparece um pouco menor que o RAC, o padrão de comparação. Este é o primeiro relatório que o PAC pode ter utilidade para o projeto e a construção de TI terapêuticas, destacando o papel potencial para o direcionamento celular específico, não apenas para a AIDS, também para a terapia do câncer.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des protéines complexes qui doivent être caractérisées de façon exhaustive en respectant la réglementation dictée par les autorités de santé pour assurer la sécurité et l'efficacité du produit. Les mAbs présentent une micro-hétérogénéité structurale principalement liée à des modifications post- traductionnelles mais également à des dégradations physiques et chimiques. L’instabilité des protéines peut être causée par une exposition à différents stress notamment pendant le processus de fabrication, de stockage et de transport. Parmi ces dégradations, l’agrégation, qui est fréquente, peut diminuer l’activité fonctionnelle de la protéine et générer des réponses immunes. Généralement, les premières étapes conduisant à la formation d'agrégats sont la dénaturation de la protéine et la formation de dimères. L'objectif de ma thèse était d'étudier la structure et la fonction des dimères formés à partir d'un anticorps thérapeutique spécifique, le roledumab. Plusieurs études réalisées sur différents mAbs ont révélé la présence de dimères covalents et non covalents ainsi que différents types d'association, en fonction des domaines impliqués dans cette dimérisation.Tout d'abord, les dimères présents en très faible quantité dans roledumab (<1%) ont été purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Des analyses d'électrophorèse capillaire et de SDS-PAGE ont été réalisées dans des conditions non réductrices afin d’estimer la proportion de dimères liés de manière covalente et non covalente. Ces expériences ainsi que des analyses en LC-MS en conditions natives ont révélé pour la première fois la présence de trois formes de dimères, les complexes covalents etant associés par des ponts disulfures.La SEC couplée à la MS à haute résolution a été utilisée, par approche middle-up, pour déterminer les domaines impliqués dans la dimérisation. Les résultats ont révélé que les dimères de roledumab étaient associés par le domaine Fab pour former des complexes de type Fab-Fab. Par ailleurs, une analyse par cartographie peptidique réalisée dans des conditions non réductrices a révélé la présence d'un nouveau pont disulfure, Cys23LC-Cys96HC, spécifique des dimères du roledumab. Enfin, l'impact de cette dimérisation sur la fonctionnalité a été étudié par la mesure de l’affinité des dimères aux récepteurs FcγRIII et par des tests cellulaires spécifiques. Les résultats ont montré que les dimères avaient une affinité plus élevée pour les récepteurs FcγRIII et une activité également plus élevée par rapport aux monomères
Abstract : Therapeutics monoclonal antibodies (mAbs) are complex proteins that must be exhaustively characterized according to regulatory authorities requirements to ensure safety and efficiency of the product. MAbs display structural microheterogeneity mainly due to their post-translational modifications, but also to their susceptibility to chemical and physical degradations. Their instability can be caused from their exposure to different stresses during the manufacturing process, handling, and storage. Among these degradations, aggregation, which occurs quite frequently, can reduce therapeutic efficiency, and generate immunogenic responses. Commonly, the first steps leading to aggregation are protein denaturation and the formation of dimers. The objective of this thesis was to investigate the structure and function of the dimers present in a specific therapeutic mAb, roledumab. Several studies have shown, for different mAbs, the presence of both covalently and non-covalently bound dimers as well as different types of association, depending on the domains implicated in the dimerisation. The small amount of dimeric species (<1%) present in the unstressed roledumab product has been purified through a preparative Size Exclusion Chromatography (SEC). Capillary Electrophoresis and SDS-PAGE performed under non-reducing conditions have been used to estimate the proportion of non-covalently and covalently bound dimers. From these experiments, three different dimers were identified. SEC hyphenated to mass spectrometry was employed as a high-resolution middle-up approach to determine the mAb domains implicated in the dimerisation. Our results revealed that the roledumab dimers were associated by a single arm-bound Fab-to-Fab association. Furthermore, a peptide mapping analysis performed under non reducing conditions revealed the presence of a new disulphide bond, Cys23LC-Cys96HC, specific of the roledumab dimers. Finally, the impact of this dimerisation on the activity has been investigated measuring the affinity of the dimers to the Fc receptors and using specific bioassays. The purified dimers showed higher affinity for the Fc receptors and higher activity compare to the monomers

Au cours de ce travail, nous avons mis au point une nouvelle interface CE/MALDI-MS automatisée, équipée d’une cellule UV/visible déportée, et d’une distribution automatique de matrice intégrée. Ce nouveau système a été évalué sur des mélanges différents de protéines entières, de digestats de protéines et d’anticorps monoclonaux (mAbs). Les résultats obtenus lors de cette évaluation ont montré la complémentarité de la nouvelle interface avec les systèmes analytiques classiques. De plus, nous avons montré la première séparation et analyse de mAbs entier par CE/MALDI-MS. Dans un second travail, la nouvelle interface a été utilisée pour effectuer la première analyse Top Down de proteine entière et de mAbs par collecte et enrichissement de fraction. Cette stratégie a montré la répétabilité du système permettant de séparer des analytes d’intérêt et d’enrichir les dépôts MALDI jusqu'à de très hautes quantités d’analytes permettant l’obtention de spectre Top Down. Au cours du troisième travail, le nouveau système CE/MALDI-MS a été utilisé dans une stratégie originale à 2 dimensions de séparation et de collecte d’isoformes de mAbs entiers ou partiellement digérés suivi d’infusions et analyses à l’aide du nanosprayer CESI. Pour cela, nous avons mis au point des conditions électrophorétiques dit « asymétriques » séparant les mAbs dans des conditions très salées mais collectés dans un milieu compatible avec l’ESI-MS. Cette stratégie inédite a permis d’effectuer la première séparation et caractérisation de mAbs par CE-MS. Parallèlement, nous avons mis au point le premier dosage plasmatique d’ITPP par MALDI-TOF MS et surtout la création de CEToolbox, une application Androïd gratuite pour smartphone et tablette permettant le calcul des principales grandeurs mathématiques pour la caractérisation et l’optimisation des séparations par électrophorèse capillaire
In this work, we developed a new interface CE/MALDI-MS automated, equipped with a UV/visible cell remote, and integrated automatic distribution of matrix. This new system has been evaluated on different mixtures of intact protein, digested protein and monoclonal antibodies (mAbs). The results obtained during this evaluation showed the complementarity of the new interface with conventional analytical systems. Furthermore, we have shown the first separation and analysis of mAbs by CE/MALDI-MS. In a second work, the new interface was used to perform the first Top Down analysis for intact protein and mAbs by fraction collection and enrichment. This strategy has shown the repeatability of the system for separating analytes and the enrichissment the MALDI deposits up to very high amounts compatible for Top Down approach. In the third work, the new system CE/MALDI-MS has been used in an original 2-dimensional strategy of separating and collecting intact mAbs isoforms or partially digested followed by infusions and analyzes with CESI nanosprayer. For this, we have developed electrophoretic condition so-called "asymmetric" allowing the separation of mAbs under very salty conditions but collected in a totally compatible solution with ESI-MS. This novel strategy allowed for the first separation and characterization of mAbs by CE-MS. Meanwhile, we have developed the first plasma level of ITPP by MALDI-TOF-MS and particularly the creation of CEToolbox as a Free Android application for smartphone and tablet enabling the calculation of the main mathematical quantities for characterization and optimization of CE separations

Ce travail de thèse porte sur des développements méthodologiques en spectrométrie de masse (MS) structurale, principalement par échange hydrogène/deutérium couplé à la MS (HDX-MS), en MS native couplée ou non à la mobilité ionique (IM-MS) et plus récemment en photométrie de masse, pour la caractérisation de différentes protéines d’intérêt thérapeutique. Ce travail a notamment permis de montrer l’apport d’une combinaison d’approches en MS structurale pour la caractérisation approfondie des protéines membranaires, de l’analyse des protéines entières jusqu’à leur dynamique conformationnelle. La mise en place de nouvelles stratégies analytiques en IM-MS et en HDX-MS a également pu être évaluée pour la caractérisation structurale fine d’anticorps thérapeutiques. Enfin, l’intérêt de l’approche HDX-MS a été illustré pour le screening conformationnel et dynamique de ligands dans le cadre de l’étude d’interactions protéine/ligand impliquant des récepteurs nucléaires
This PhD work focuses on methodological developments in structural mass spectrometry (MS), especially by hydrogen/deuterium exchange coupled to MS (HDX-MS), by native MS coupled or not to ion mobility (IM-MS) and more recently mass photometry, for the characterization of various proteins of therapeutic interest. In particular, this work has demonstrated the contribution of a combination of structural MS approaches to the in-depth characterization of membrane proteins, from the analysis of intact proteins to their conformational dynamics. The implementation of new analytical strategies in IM-MS and HDX-MS has also been evaluated for the detailed structural characterization of therapeutic antibodies. Finally, the benefits of HDX-MS approach was illustrated for the conformational and dynamic screening of ligands in the context of the study of protein/ligand interactions involving nuclear receptors

Les interfaces permettant le couplage entre l'électrophorèse capillaire (CE) et la spectrométrie de masse (MS) à source ESI souffrent actuellement d'un manque de robustesse ou de sensibilité. Les travaux présentés décrivent la mise en oeuvre d'un nouveau type d'interface CE-ESl-MS â haute sensibilité CESl-MS. La caractérisation du spray généré par CESl-MS a montré la production d'un nanoESI induisant une augmentation importante de la sensibilité par rapport au régime ESI classique. Le système CESl-MS a pu ainsi être mis en oeuvre comme plateforme d'infusion nanoESI et utilisé pour l'étude de complexes non-covalents de haut poids moléculaires en MS native. Une méthodologie par CESl-MS/MS a également été développée pour la caractérisation complète de la structure primaire d'anticorps monoclonaux (mAbs). Les résultats montrent la possibilité en une unique injection de caractériser l'ensemble de la séquence d'acides aminés, un nombre significatif de glycosylations et l'ensemble des modifications d'intérêts. Cette méthodologie a pu être appliquée pour déterminer la similarité entre des mAbs commerciaux et leur candidat biosimilaire respectif
Interfacings allowing the hyphenation of capillary electrophoresis (CE) to ESI mass spectrometry(MS) currently suffer from lack of robustness and sensitivity. This work describes the application of a new design of CE-ESl-MS coupling referred as the CESl-MS. Characterization of the ESI generated through the CESl-MS system showed the production of a nanoESI allowing to increase drastically the sensitivity compared to conventional ESI. The CESl-MS was used as a nanoESI infusion platform allowing to study high molecular masses noncovalent complexes in native MS. A CESl-MS/MS method was developed enabling the complete primary structure characterization o fmonoclonal antibodies (mAbs). Results showed the ability of the methodology in a single injection to simultaneously characterize the entire amino acid sequence, a significant number of glycosylation and all the posttranslational modifications of interest. Finally the methodotogy was applied to assess the similarity between marketed mAbs and their respective biosimilar candidate

Les virus sont considérés comme l'un des problèmes majeurs de la production du mais en Afrique Tropicale, en particulier le maize streak virus ( M. S. V. ) et dans une moindre mesure, le maize stripe virus et le maize mosaic virus. Après purification d'isolats réunionnais et production de sérum, une méthode de diagnostic fiable et rapide des 3 maladies virales a été mise au point, pour les besoins de la sélection, à l'aide d'une technique ELISA. Trois sérotypes de M. S. V. Ont été identifiés avec 5 anticorps monoclonaux un sérotype a été mis en évidence sur tous les échantillons de mais analysés, originaires de 11 pays, et sur certains de canne à sucre et poacées. Les 2 autres ont été détectés sur canne à sucre mais non sur mais. Le sérotype trouvé sur mais est transmis par Cicadulina mbila. Cette cicadelle peut être vectrice à des taux de virus inférieurs à 0,15 ng par insecte. Elle est capable d'en accumuler plus de 6 ng en un mois d'alimentation sur plante virosée. Par contre, après acquisition, la dégradation du virus est lente. Ces résultats permettent d’expliquer la bonne persistance du pouvoir infectieux en absence de multiplication virale. La tolérance de la variété composite IRAT 297 est liée à une résistance à la multiplication du virus et on à la limitation de son déplacement dans la plante. La progression de la maladie dans les feuilles est directement liée à la croissance foliaire. Par ailleurs, le virus n'est jamais détecté dans les limbes inoculés. Ces résultats suggèrent le développement d'une résistance des cellules des feuilles après leur différenciation. Plus une plante n’est âgée au moment de son infection, Moins elle en sera affectée. I 1 a été démontré que le suivi des symptômes de la virose sur feuille permet de sélectionner la résistance à la multiplication virale. Une relation a été établie entre cette résistance et une échelle de notation qui permet de cribler les variétés tolérantes d'après leurs symptômes. Cette tolérance peut être précisée par des dosages d'antigènes viraux mais la relation entre taux de virus et rendement reste à établir.

Ce travail de thèse repose sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d’intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques. L’optimisation fine et conséquente de la préparation d’échantillon et des conditions analytiques ont permis la caractérisation de protéines membranaires solubilisées en milieu détergent, protéines hydrophobes habituellement réfractaires à l’analyse par MS. D’autre part, une nouvelle approche de mobilité ionique appelée Collision Induced Unfolding a été évaluée et mise en place au laboratoire. Elle a permis une caractérisation conformationnelle approfondie et originale de plusieurs formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques. Enfin, les techniques de MS native et de mobilité ionique ont été utilisées pour caractériser des complexes multiprotéiques d’hétérogénéité variable mettant ainsi en lumière leurs avantages et les progrès réalisés dans le domaine de la MS structurale
This PhD work focuses on developments in native mass spectrometry and ion mobility methods for the structural characterization of therapeutic proteins and multiprotein complexes. First, careful optimizations of sample preparation and analytical conditions allowed the characterization of membrane proteins, which are hydrophobic proteins difficult to analyze by MS approaches in detergent environment. Then, a new ion mobility-based activation approach called Collision Induced Unfolding has been set up and evaluated. CIU allowed extensive and original conformational characterization of several therapeutic monoclonal antibody formats. Finally, native MS and ion mobility techniques were used for the characterization of heterogeneous multiprotein complexes depicting their benefit when combined to other biophysical techniques for the structural characterization of multiprotein complexes

Ce travail de thèse porte sur développement de méthodes en spectrométrie de masse structurale pour l’analyse de protéines recombinantes et de leurs complexes associés. L’objectif central s’est porté sur des développements méthodologiques en échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX-MS). Les techniques biophysiques de caractérisation structurale à haute résolution comme la cristallographie ou la RMN se heurtent régulièrement à des problèmes de productions de cristaux, de taille de complexes analysables ou encore de quantité de matériel nécessaire importante. Le développement de méthodes spécifiques HDX-MS a permis de réaliser une caractérisation structurale de systèmes protéiques variés, et réfractaires aux approches haute résolution. La combinaison de cette approche à différents outils de MS structurale est aussi illustrée, et montre tout son intérêt pour l’obtention d’informations à résolution augmentée
This thesis work focuses on development of structural mass spectrometry methods for the analysis of recombinant proteins and their associated complex. The central objective has focused on the development of hydrogen/deuterium exchange coupled to mass spectrometry approaches (HDX-MS). The high resolution biophysical techniques for structural characterization such as crystallography or NMR regularly face problems of crystal productions, size analyzable complex or quantity of material required. The development of specific HDX-MS methods allowed the characterization of various, and refractory protein systems to high resolution approaches. The combination of this approach with complementary structural MS tools is also illustrated, and shows its interest to obtain increased resolution information

Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse (MS) et mobilité ionique (IM-MS) supramoléculaires pour la caractérisation fine de complexes protéine-ligand et d’assemblages protéiques hétérogènes de hauts poids moléculaires. L’optimisation instrumentale apportée à l’étude de ces systèmes, permet d’étendre le potentiel de ces deux approches en biologie structurale. Le criblage de complexes protéine-ligand permet ici une détermination de leurs propriétés d’interaction et la mise en évidence de subtils changements de conformation induits, pouvant être suivis au cours du temps. L’application de ce couplage à l’analyse de complexes multi-protéiques, réfractaires aux techniques conventionnelles, donne accès à la topologie de ces assemblages, facilitant la proposition de modèles structuraux. Enfin, l’apport récent de la haute résolution en MS native est ici illustré à travers l’étude de protéines complexes et hétérogènes : les anticorps thérapeutiques et leurs conjugués. Ces développements permettent de repousser certaines limites en MS native et IM-MS native, élargissant leurs perspectives d’application dans la recherche et l’industrie pharmaceutique
This PhD thesis aims at developing methods in native mass spectrometry (MS) combined with ion mobility (IM-MS) to characterize protein-ligand complexes and large protein assemblies. Fine-tuning of instrumental settings allowed expanding the scope of these approaches in structural biology. Real-time monitoring of protein-ligand complexes by native MS and IM-MS enabled to screen their binding properties while depicting subtle conformational changes induced upon binding. Applying these methods to refractory multi-protein complexes provided insights about their topology, making structural modeling easier. Finally, benefits from high-resolution native MS were highlighted through the characterization of heterogeneous systems, including monoclonal antibodies and their drug conjugates. Here, these developments enable to push some technical limits one step forward, increasing the potential of native MS and IM-MS both in academic research and pharmaceutical industry