Literatura académica sobre el tema "Antioxidante dirigido à mitocôndria"

O estresse oxidativo decorre de um desequilíbrio entre a geração de compostos oxidantes e a atuação dos sistemas de defesa antioxidante. A geração de radicais livres e/ou espécies reativas não radicais é resultante do metabolismo de oxigênio. A mitocôndria, por meio da cadeia transportadora de elétrons, é a principal fonte geradora. O sistema de defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou reduzir os danos causados pela ação deletéria dos radicais livres e/ou espécies reativas não radicais. Esse sistema, usualmente, é dividido em enzimático (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e não-enzimático. No último caso, é constituído por grande variedade de substâncias antioxidantes, que podem ter origem endógena ou dietética. Objetivou-se revisar os principais mecanismos de geração de radicais livres, bem como a ação dos agentes mais relevantes do sistema de defesa antioxidante, ressaltando suas implicações sobre os marcadores do estresse oxidativo. Também serão abordados os principais fatores exógenos moduladores do estresse oxidativo.

Introducción: el desarrollo del proceso autoinmune durante la diabetes tipo 1 (DM1) contribuye a la insulitis; en este contexto, el estrés de las células-ß y su posterior deficiencia en la secreción de insulina preceden a los signos clínicos de la enfermedad. La hiperglucemia desencadena la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales que superan la capacidad antioxidante de las células-ß conduciendo al estrés oxidativo. El microambiente inflamatorio del islote contribuye a la activación del estrés oxidativo y del retículo endoplásmico (RE) resultando en la disfunción y muerte de las células-ß. El factor de transcripción Nrf2 regula la expresión de genes citoprotectores en respuesta al estrés oxidativo, su inducción es necesaria para la fisiología normal de la célula-ß. Hemos reportado que el CpdA regula células inmunes clave en la respuesta inmune e inflamatoria y en la insulitis, linfocitos T y células dendríticas. Tambiénobservamos que el CpdA disminuye el estrés de RE inducido por citoquinas inflamatorias (IL-1ß+IFN-g; CYT) en células-ß y que la administración in vivodel CpdA retarda la aparición de hiperglucemia en un modelo murino de diabetes autoinmune. El desarrollo de nuevos agentes con acción antiinflamatoria e inmunomoduladora y potencial protector dirigido a la señalización disfuncional de las células-ß posee interés clínico en la diabetes.Objetivos: explorar el efecto del CpdA sobre la vía de señalización de Nrf2 y el estrés oxidativo inducido por CYT en las células-ß.Materiales y métodos: como modelo experimental utilizamos la línea celular de insulinoma de rata (INS-1E). Fórmula química del CpdA: cloruro de 2-(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio. Se utilizó un plásmido reportero (ARE-LUC) para la evaluación de la actividad transcripcional de Nrf2 (luminometría), RT-qPCR (Sybr Green) para el análisis de la expresión de ARNm, WB para el análisis de la expresión de proteínas, kit comercial basado en DCFDA para evaluar ROS (fluorometría), análisis de viabilidad celular por MTT y ELISA para insulina.

Introducción: el desarrollo del proceso autoinmune durante la diabetes tipo 1 (DM1) contribuye a la insulitis; en este contexto, el estrés de las células-ß y su posterior deficiencia en la secreción de insulina preceden a los signos clínicos de la enfermedad. La hiperglucemia desencadena la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales que superan la capacidad antioxidante de las células-ß conduciendo al estrés oxidativo. El microambiente inflamatorio del islote contribuye a la activación del estrés oxidativo y del retículo endoplásmico (RE) resultando en la disfunción y muerte de las células-ß. El factor de transcripción Nrf2 regula la expresión de genes citoprotectores en respuesta al estrés oxidativo, su inducción es necesaria para la fisiología normal de la célula-ß. Hemos reportado que el CpdA regula células inmunes clave en la respuesta inmune e inflamatoria y en la insulitis, linfocitos T y células dendríticas. También observamos que el CpdA disminuye el estrés de RE inducido por citoquinas inflamatorias (IL-1ß+IFN-g; CYT) en células-ß y que la administración in vivo del CpdA retarda la aparición de hiperglucemia en un modelo murino de diabetes autoinmune. El desarrollo de nuevos agentes con acción antiinflamatoria e inmunomoduladora y potencial protector dirigido a la señalización disfuncional de las células-ß posee interés clínico en la diabetes.Objetivos: explorar el efecto del CpdA sobre la vía de señalización de Nrf2 y el estrés oxidativo inducido por CYT en las células-ß.Materiales y métodos: como modelo experimental utilizamos la línea celular de insulinoma de rata (INS-1E). Fórmula química del CpdA: cloruro de 2-(4-acetoxifenil)-2- cloro-N-metil-etilamonio. Se utilizó un plásmido reportero (ARE-LUC) para la evaluación de la actividad transcripcional de Nrf2 (luminometría), RT-qPCR (Sybr Green) para el análisis de la expresión de ARNm, WB para el análisis de la expresión de proteínas, kit comercial basado en DCFDA para evaluar ROS (fluorometría), análisis de viabilidad celular por MTT y ELISA para insulina.

Astrocitomas são gliomas derivados de astrócitos e sua fisiopatogênese envolve alterações gênicas e metabólicas. Recentemente, foi descrita a mutação R132H no gene da isoforma 1 da isocitrato desidrogenase (IDH-1) que altera o funcionamento desta enzima levando a ganho de função, passando a sintetizar um metabólito oncogênico e diminui sua capacidade de regenerar o antioxidante NADPH. A transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida (NNT), localizada na membrana mitocondrial, participa de mecanismos de prevenção do estresse oxidativo também através da produção de NADPH. As enzimas málicas (MEs) também têm sido estudadas por sua relação com crescimento e proliferação celular em diferentes neoplasias e influenciam o processo de invasão celular em astrocitomas de alto grau (glioblastomas). As isoformas 2 e 3 da ME (ME2 e ME3) são localizadas na mitocôndria e apresentam atividade de conversão de malato a piruvato e produção de NADPH por mecanismo de redução. No presente estudo, foi avaliada a distribuição tecidual da ME2 e ME3 em cortes histológicos de astrocitomas de baixo (n=7) e alto (n=24) grau de espécimes cirúrgicos obtidos de pacientes acompanhados em hospital universitário. Não se observaram diferenças qualitativas e semi-quantitativas nas características de imunomarcação destas enzimas nas células neoplásicas gliais. Não encontramos, portanto, aumento ou diminuição da expressão da ME2 e/ou ME3 nestes tumores, seja na ausência ou presença de mutação no gene da IDH-1.

O cobre é um metal pesado essencial ao organismo, atuando nas células em numerosos processos biológicos essenciais, como respiração celular, síntese de melanina, metabolismo do ferro, antioxidante e biossíntese de neurotransmissor. No organismo, o cobre sérico está ligado à ceruloplasmina, e o cobre hepático é ligado à metalotioneína e armazenado em lisossomos. O excesso de cobre leva à produção de radicais livres, que inicia reações de peroxidação lipídica destrutivas que afetam a mitocôndria e outras membranas celulares (STALKER & HAYES, 2007). As manifestações clínicas caracterizam-se por dor abdominal, diarreia, icterícia, anorexia, desidratação e choque. Elevados níveis de cobre sérico pode levar a hemólise intravascular (CULLEN & BROWN, 2013). Relata-se um caso de intoxicação aguda por cobre em um ovino diagnosticado pelo Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina. Um ovino, Santa Inês, fêmea, de três anos, proveniente de propriedade cujo animais passaram a receber ração de suíno. O proprietário relatou que após 10 dias de do inicio da alimentação cerca de 17% dos animais foram a óbito. Na macroscopia, observou-se fígado difuso e acentuadamente pálido com moderada hepatomegalia, moderada esplenomegalia, hemoglobinúria e rins de cor vermelho escura. Na microscopia, no rim observou-se no interstício hemorragia multifocal a coalescente acentuada principalmente em região de medular. Nos túbulos renais havia aumento da eosinofilia citoplasmática com picnose e carriorexia nuclear multifocal a coalescente acentuada, com desprendimento de algumas células para o lúmen (necrose tubular aguda). No interior de túbulos multifocais havia moderada presença de material amorfo, avermelhado, homogêneo que tendiam a formar cilindros (cilindros hemoglobinicos). No fígado, havia necrose individual de hepatócitos e nas tríades portais observava-se moderado infiltrado inflamatório linfohistiocitário e neutrofílico (hepatite) e moderada presença de fibroblastos com formação de pequenas pontes de tecido conjuntivo fibroso (fibrose). Os cortes histológicos de fígado e rim foram moderadamente positivos para a coloração de rodanina. Esta coloração é utilizada para evidenciar depósitos de cobre em cortes histológicos. Diante do presenta caso, o histórico clínico e os achados anatopatológicos corroboram para o diagnóstico de intoxicação crônica por cobre. Logo, por se tratar de uma afecção que acarreta a grandes prejuízos econômicos culminando em diminuição da produtividade devido seu comprometimento sistêmico, ressalta-se a importância deste levantamento epidemiológico, contribuindo na prevenção da doença.

Orientador: Lucia Pereira da Silva
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-24T21:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mamede_MariaEugeniadeOliveira_M.pdf: 3815005 bytes, checksum: 9cd7800aa3a8a08dac8e767c681a7efd (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: O Dipiridamol (DIP) é um vasodilatador coronário, antiplaquetário que atua de maneira sinergística com várias drogas antitumorais, além de possuir atividade antioxidante em diferentes sistemas de membrana, interagindo com micelas, monocamadas de fosfolipídios, vesículas e membranas biológicas. O efeito antioxidante do DIP sobre a lipoperoxidação mitocondrial induzida por Fé2+ já foi estudado, observando-se boa correlacão com sua característica lipofílica (Nepomuceno et alii, 1997). Neste trabalho, utilizando mitocôndrias e mitoplastos o papel do DIP como inibidor da peroxidação lipídica induzida por Fé2+, foi melhor estudado. A utilização de baixas concentrações de DIP não provocou mudanças no estado respiratório 4 nem no estado respiratório 3 e portanto, a interação do DIP com os receptores periféricos de benzodiazepínicos foi descartada. A constante de associação do DIP com mitoplastos foi estimada em torno de 1,1 ± 0,2 (mg/mL)-1. Este valor é ligeiramente superior ao obtido para mitocôndrias, 0,8 ± 0,1 (mg/mL)-1. Observou-se para os mitoplastos que o DIP não foi totalmente recuperado após incubação com essas membranas, provavelmente devido à metabolização da droga formando um produto não fluorescente. Os estudos de consumo de oxigênio na presença de FeSO4 mostraram que o efeito antioxidante do DIP não provocou mudanças na oxidação do Fé2+. Nossos dados permitem-nos sugerir que o efeito antioxidante do DIP está relacionado com a sua partição na membrana e não à sua ligação específica a proteínas de membrana. A proteção contra a peroxidação lipídica pode ser devida à inibição direta das reações de propagação ou à ação do DIP em sequestrar as espécies radicalares que poderiam iniciar o processo peroxidativo
Abstract: Dipyridamole (DIP), a coronary vasodilator, presents activity for a number of antitumor drugs as well as antioxidant activity in membrane systems. DIP and derivatives interact with membrane systems such as micelles, phospholipid monolayers, vesicles and biological membranes. The antioxidant effect of DIP upon iron induced lipoperoxidation on mitochondria has been reported and a good correlation between the hydrophobicity and its protective effect was found (Nepomuceno et alii, 1997). In the present work an effort is made to betler understand the role of DIP as inhibitor of Fe2+induced lipid peroxidation in mitochondria and mitoplasts. At low concentration, no significant effect on either state IV or state III respiration was found, discarding a possible direct interaction of DIP with the peripheral benzodiazepine receptor. The association constants for DIP in mitoplasts were estimated, being 1.1 ± 0.2 (mg/mL)-1. This value is slight1y higher than that obtained for mitochondria, 0.8 ± 0.1 (mg/mL)-1. It was observed that under mitoplast was used, some of the drug was not recovered, probably due to DIP metabolization into a no fluorescent species. Oxygen consumption studies in the presence of FeSO4 showed that the antioxidant effect of DIP did not involved the initial step of Fé2+ oxidation. Our data strongly support the hypothesis that the antioxidant effect of DIP is related to its partition in the lipid phase of the mitochondrial or mitoplast membrane and not to a specific interaction with membrane proteins. This protection may be due either to a direct inhibition of the propagation steps or a scavenger effect, removing the radicalar species that would trigger the peroxidative process
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Denise Vaz de Macedo, Rodrigo Hohl
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-17T09:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraresso_RodrigoLuizPerroni_M.pdf: 3766463 bytes, checksum: 4e6cf849a52ef6607e6e4aec1bcbae01 (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: O overtraining e um processo continuo de treinamento intenso que pode gerar um declínio curto no desempenho, denominado de overreaching funcional (FOR), o qual conduz eventualmente a uma melhoria no desempenho apos um breve período de recuperação (dias-semanas); ou um declínio mais prolongado no desempenho, caracterizado como overreaching nao funcional (NFOR), que somente e revertido por um período regenerativo mais longo (semanas-meses). Nos desenvolvemos um protocolo de treino-overtraining para ratos que induz aos estados FOR e NFOR apos um período de adaptação ao treinamento e aumento de desempenho (Tr). O desempenho dos animais foi avaliado através de 6 testes ao longo do protocolo, testes estes que serviram para separarmos nossos grupos experimentais. Nosso objetivo foi investigar a hipótese do estresse oxidativo, relacionado com alterações na atividade mitocondrial, como uma das possíveis causas desencadeadoras da queda de desempenho durante a instalação do overtraining. Para isso analisamos a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa redutase (GR) e superóxido dismutase (SOD), dos marcadores de produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), xantina oxidase (XO) e ataque oxidativo por meio da analise das substâncias que reagem ao acido tiubarbiturico (TBARs), alem da atividade da enzima citrato sintase (CS) e dos complexos mitocondriais da cadeia de transporte de elétrons, complexo I e IV. Analisamos ainda, em busca de possíveis biomarcadores, a capacidade antioxidante sanguínea por meio das analises do FRAP (ferric reducing ability of plasma), albumina e acido úrico. A peroxidação lipídica no plasma foi obtida por meio da analise do malondialdeido (MDA) e o marcador de lesão muscular utilizado foi a creatina quinase sanguínea (CK). Os resultados estão apresentados por meio de boxplots com seus respectivos intervalos de confiança (95%) que dão a significância ou não de diferenças entre as analises. Os resultados encontrados apontaram para diminuições significativas na atividade do complexo IV e CS somada a atividades aumentadas das enzimas antioxidantes CAT e SOD no grupo NFOR, quando em comparação aos grupos Tr e FOR, respectivamente. Alem disso, os marcadores de peroxidação lipídica TBARs e MDA encontraram-se significativamente aumentados no grupo NFOR quando em comparação aos grupos CO, Tr e FOR. Estes dados sugerem, que a queda de desempenho no estado NFOR pode estar relacionada a diminuição da capacidade oxidativa devido a instalação de um quadro de estresse oxidativo mitocondrial, entretanto os mecanismos que causam este processo ainda precisam ser esclarecidos.
Abstract Overtraining is a continuous process with possible outcomes of functional-overreaching (FOR) and nonfunctional-overreaching (NFOR). FOR is characterized by a short-term decline in performance that leads eventually to an improvement in performance after a short recovery (daysweeks). NFOR is a decline in performance that can be reversed by a longer regenerative period (weeks-months). We developed an animal model of training-overtraining that led Wistar rats to FOR and NFOR states after a training adaptation period where they achieved increased performance (Tr group). The animal performance was evaluated through six tests during the protocol. These tests have served to separate our experimental groups. Our objective was to investigate the oxidative stress-related changes in mitochondrial activity hypothesis as a possible cause of the performance drop during the overtraining installation. We analyzed the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione reductase (GR) activity, ROS generator xanthine oxidase (XO) activity and oxidative damage indicator through the analysis of substances which react to thiubarbituric acid (TBARS) production. In addiction we analyzed citrate syntase (CS) enzyme activity and mitochondrial complexes of the electron transport chain (complex I and IV) activity. We also analyzed, for potencial biomarkers, the antioxidant capacity of blood through the FRAP (ferric reducing ability of plasma), albumin and uric acid analysis. Lipid peroxidation in plasma was obtained by malondialdehyde (MDA) and the muscle damage marker used was blood creatine kinase (CK). The results are presented by boxplots with their respective confidence intervals (95%) giving a significance or not of differences between analysis. The results pointed to significant decreases in complex IV and CS activity plus an increased of antioxidant enzymes SOD and CAT activities in NFOR group when compared to Tr and FOR groups respectively. Furthermore, the lipid peroxidation TBARS and MDA markers were found significantly increased in NFOR group when compared to CO, Tr and FOR. These data suggest that the performance drop in the NFOR state may be related to decreased oxidative capacity due to a mitochondrial oxidative stress installation. However the mechanisms involved in this process yet to be clarified.
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Os espermatozóides são particularmente vulneráveis às espécies reativas de oxigénio nas diferentes fases do processo reprodutivo (maturação, capacitação, hiperativação, reação acrossomal). Por esta razão, este trabalho teve como objetivo o estudo do efeito de um inovador antioxidante dirigido às mitocôndrias (AntiOxBEN2) na função espermática e no desenvolvimento embrionário in vitro bovino. Este antioxidante foi adicionado ao meio de capacitação espermática (CAP), durante o processo de swim-up, e ao meio de fertilização (FERT), durante a co-incubação dos oócitos maturados com o sémen capacitado, nas concentrações de 0 (controlo), 1 e 10 μM. Foram assim constituídos 7 grupos: (1): CAPcontrolo x FERTcontrolo; (2): CAPcontrolo x FERT1; (3): CAPcontrolo x FERT10; (4): CAP1 x FERTcontrolo; (5): CAP1 x FERT1; (6): CAP10 x FERTcontrolo; (7): CAP10 x FERT 10. Após o swim-up foi avaliada a motilidade espermática (CASA e análise visual), a vitalidade (eosina-negrosina), o potencial de membrana mitocondrial (JC1) e o metabolismo basal (Seahorse Xfe96) dos espermatozoides. Foi igualmente avaliado o desenvolvimento e a qualidade dos embriões produzidos. O grupo CAP1 x FERT1 apresentou a maior taxa de clivagem, comparativamente ao grupo controlo (p<0.04). Foi identificado um efeito positivo do AntiOxBEN2 no potencial de membrana mitocondrial (p≤0.003) e, consequentemente, na qualidade espermática, enquanto que a concentração mais elevada prejudicou a motilidade progressiva e o número de embriões produzidos. Os resultados demonstraram um efeito benéfico do AntiOxBEN2 (na concentração de 1 μM) nos processos de capacitação espermática e na fertilização, melhorando o desenvolvimento embrionário.
Sperm cells are particularly vulnerable to reactive oxygen species at different stages of the reproductive process (maturation, capacitation, hyperactivation and acrosomal reaction). For this reason, our objective was to study the effect of a novel mitochondrial-directed antioxidant, AntiOxBEN2, on bovine sperm function and in vitro embryo development. This antioxidant was added to the semen capacitation medium (CAP), during the swim-up, and to the fertilization medium (FERT) during the co-incubation of matured oocytes and capacitated spermatozoa, in concentrations of 0 (control), 1 and 10 μM. Thus, 7 groups were constituted: (1): CAPcontrol x FERTcontrol; (2): CAPcontrol x FERT1; (3): CAPcontrol x FERT10; (4): CAP1 x FERTcontrol; (5): CAP1 x FERT1; (6): CAP10 x FERTcontrol; (7): CAP10 x FERT 10. After the swim-up, sperm motility (CASA and visual analysis), vitality (eosin-nigrosin), mitochondrial membrane potential (JC1) and basal metabolism (Seahorse Xfe96) were evaluated. Embryonic development and quality of produced embryos were assessed. Higher cleavage rate was obtained in CAP1 x FERT1 compared to control (p<0.04). A positive effect of AntiOxBEN2 on the mitochondrial membrane potential (p≤0.003) and, consequently, on the sperm quality was identified, although the highest dose impaired progressive motility and the number of produced embryos. The results demonstrate a beneficial effect of AntiOxBEN2 (1 μM) on sperm capacitation and fertilization processes, thus improving embryonic development.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
O cancro é uma das doenças mais disseminada e fatal das últimas décadas. Devido ao seu carácter multifatorial, esta doença tem sido extremamente difícil de controlar. Os fármacos existentes para o tratamento desta doença são extremamente tóxicos para o tecido saudável, uma vez que possuem mecanismos de ação muito pouco específicos, podendo interagir tanto com células tumorais como com células saudáveis. Para além disso, as células tumorais podem desenvolver resistência aos fármacos usados na quimioterapia. Por esse motivo, a investigação clínica tem vindo a aumentar no sentido de desenvolver um fármaco, algo que podemos denominar como a “bala mágica”, que seria capaz de se ligar especificamente a um potencial alvo terapêutico. Os compostos usados neste trabalho foram desenvolvidos de modo a ter a mitocôndria como alvo, dada a importância desta para o funcionamento normal de células eucarióticas. A mitocôndria é um organelo importante para a homeostasia celular pois controla a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Relativamente a este a processo, a fuga de eletrões através dos complexos I e III pode levar à formação de espécies reativas de oxigénio (ERO), como é o caso do anião superóxido. Geralmente, as células tumorais produzem mais ERO do que as células saudáveis, o que justifica a consideração desta como um potencial alvo para o tratamento de cancros. Com esse propósito em mente, foram desenvolvidos na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, dois compostos derivados do ácido cafeico e da vitamina K, MitoXT1 e MitoXT2, respetivamente. Estes compostos possuem um grupo tetrafenifosfónio capaz de aumentar o redireccionamento destes compostos para o interior da mitocôndria, tendo-se demonstrado em ensaios preliminares que possuem atividade antioxidante. O presente trabalho tem dois objetivo principais: a) investigar se os compostos MitoXT1 ou MitoXT2 irão aumentar a citotoxicidade de anticancerígenos clássicos como doxorrubicina (DOX), cisplatina (CIS) e etoposídeo em células do cancro do pulmão A549 e b) investigar se os mesmos compostos irão proteger os fibroblastos do pulmão MRC-5 dos efeitos tóxicos dos efeitos tóxicos dos anticancerígenos mencionados acima. O estudo foi realizado com um pré-tratamento de 24h com os antioxidantes seguido de uma incubação de 24 ou 48h com as correspondentes drogas. A viabilidade celular, a atividade de caspases, a produção de superóxido e o ciclo celular foram avaliados de modo a tirar conclusões sobre o efeito destes antioxidantes dirigidos para a mitocôndria nas duas linhas celulares em estudo na presença ou ausência dos agentes anticancerígenos. Os resultados obtidos sugerem que o composto MitoXT2 protege as células MRC-5 da morte celular resultante de toxicidade de DOX enquanto, em células A549, causa citotoxicidade quando combinado com esse agente anticancerígeno. A conjugação do mesmo antioxidante com CIS aumentou significativamente a toxicidade contra as células A549 enquanto em células MRC-5 mostra pouca ou nenhuma toxicidade. Curiosamente, MitoXT2 diminui pouco mas significativamente a toxicidade induzida por DOX em cardiomioblastos H9c2. Quanto aos efeitos de MitoXT1, são menores do que MitoXT2 com nenhum aumento na citotoxicidade resultando do tratamento conjunto de MitoXT1 com etoposídeo e CIS. Ao medir as atividades das caspases 3 e 9, verifica-se que MitoXT2 aumenta a atividade da caspase 3 quando adicionado antes de DOX mas, interessantemente, decresce a mesma atividade em células MRC-5, sugerindo novamente alguma proteção para a linha celular não tumoral. Surpreendentemente, a combinação de MitoXT1 com CIS aumentou a atividade das caspases 3 e 9, na linha celular tumoral, enquanto diminui essa atividade na linha celular não tumoral. O ensaio de Live/Dead realizado por citometria de fluxo, embora menos robusto em termos de diferenças, mostra um pequeno aumento aparente na quantidade de células mortas quando o antioxidante foi usado em combinação nas células tumorais, verificando-se o oposto nas células não tumorais. Utilizando sondas vitais nucleares e mitocondriais, verificou-se por microscopia de epifluorescência uma despolarização mitocondrial e condensação da cromatina, estando estes dois processos associados à citotoxicidade apresentado pelas moléculas de diferença, sozinhas ou em combinação. Em relação à análise dos dados obtidos para o ensaio do ciclo celular, estes parecem depender do tipo de célula e do tipo de composto mas o reduzido número de experiências não permitiu tirar nenhuma conclusão. Finalmente, os resultados obtidos usando a sonda MitoSOX específica para o anião superóxido mitocondrial sugerem que a combinação de agentes pode contribuir na produção de espécies reativas de oxigénio. Em conclusão, embora preliminar, o presente trabalho demonstra que novas moléculas dirigidas à mitocôndria podem ser usadas para aumentar a citotoxicidade de agentes anticancerígenos, tal como foi verificado no modelo de células do cancro de pulmão. Curiosamente, algumas das avaliações dos dados obtidos pela mesma abordagem resultaram numa menor toxicidade para as células não tumorais. Além disso, o presente trabalho demonstra a existência de uma característica até então desconhecida das duas novas moléculas; a sua capacidade para aumentar a sua produção de anião superóxido mitocondrial, o que pode contribuir para um efeito do tipo hormese. Mais trabalho deve ser realizado de modo a identificar os mecanismos envolvidos nestas e noutras linhas celulares tumorais.
Cancer is one of the most widespread and fatal diseases of the past decades. Due to its multifactorial character, this disease has been extremely difficult to control. Current drugs used in chemotherapy are extremely toxic to healthy tissue since they have poor specific mechanisms of action, leading to unspecific action in healthy tissues. In addition, the lack of efficacy of these compounds may be due to acquired or intrinsic resistance. Therefore, clinical research has been increasing in order to develop a drug, which may be termed as the "magic bullet", more specific to a potential therapeutic target. The compounds used in this study were developed to be directed to the mitochondria, given the importance of this organelle for the normal functioning of eukaryotic cells. Mitochondria are important organelles for cell homeostasis as they control the production of ATP by oxidative phosphorylation. For this process, the escape of electrons through complexes I and III can lead to the formation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion. Generally speaking, cancer cells produce more ROS than healthy cells, which justifies considering mitochondria as potential targets for treating cancers. With this purpose in mind, two molecules derived from caffeic acid and vitamin K, MitoXT1 and MitoXT2 respectively, were developed at the Faculty of Science, University of Porto. These compounds have a tetraphenyl phosphonium group that increases the targeting of these compounds into mitochondria and demonstrated antioxidant activity in a series of preliminary experiments. The present work has two tandem objectives: a) investigate whether MitoXT1 or MitoXT2 increase the cytotoxicity of classic anti-cancer agents, doxorubicin (DOX), cisplatin (CIS) and etoposide, on human lung cancer A549 cells and b) investigate whether the same agents protect lung MRC-5 fibroblasts from the toxicity of the above mentioned anti-cancer agents. The study was performed with a pre-treatment with antioxidants for 24h followed by incubation for 24 or 48 h with corresponding anti-cancer agent. Cell viability, caspase activity, superoxide production and cell cycle were assessed in order to investigate the effect of these mitochondria-directed antioxidants in both cell lines studied in the presence and absence of the anti-cancer agents. The results obtain suggest that the compound MitoXT2 protect MRC-5 cells from cell death resulting from DOX toxicity, while still causing cytotoxicity to A549 cells in conjugation with that snit-cancer agent. The conjugation of the same antioxidant with CIS also resulted in significant toxicity against A549 cells while showing little, if any toxicity against MRC-5 cells. Interestingly, MitoXT2 slightly, but significantly, decreased DOX toxicity on H9c2 cardiomyoblast. Regarding MitoXT1, the effects were somehow lower than MitoXT2 with no increased cytotoxicity resulting from MitoXT1 in conjugation with etoposide and CIS. When measuring caspase-like activities (caspase 3 and 9) MitoXT2 increase caspase 3 activity when added before DOX to A549 cells but interestingly decrease that same activity in MRC5 cells, again suggesting some protection to the non-tumour cell line. Surprisingly, the combination of MitoXT1 with CIS increased caspase 3 and 9-like activities in the tumour cell line, while decreasing those specific activities in the non-tumour cell line. Live/Dead assays by flow cytometry, although less robust in terms of differences, shows an apparent small increase in dead cells when the antioxidant were used in combination in tumour cells and the inverse in non-tumour-cells. Vital epifluorescence microscopy using nuclear and mitochondrial dyes appear to show that mitochondrial depolarization and chromatin condensation are associated to the cytotoxicity presented by the difference molecules, alone or in conjugation. Data was also obtained regarding cell cycle analysis which appear to be compound and cell type-dependent but the reduced number of experiments does not allow any conclusions. Finally, results obtained by using the mitochondrial superoxide anion specific dye MitoSOX suggest that the combination of agents may contribute to increase the production of the reactive oxygen species. In conclusion, although preliminary, the present work demonstrates that the novel mitochondria-directed molecule may be used to increase the cytotoxicity of anti-cancer agents as seen in a cell model for lung cancer. Interestingly, some of the data obtained suggested that the same approach resulted in a lower toxicity for non-tumour cells. Furthermore, the present work highlights a previously unknown feature of the two novel molecules: their ability to increase mitochondrial superoxide anion production, which can contribute to a hormesis-type effect. More work must be performed to distinguish the mechanisms involved and whether these are extended to others cancer cell lines.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica
A prática regular de exercício físico tem um impacto positivo na saúde humana. A prescrição correta de exercício permite um alargamento da limitação funcional do organismo, havendo assim uma modulação da homeostase de forma a proporcionar uma adaptação a esta atividade. O envelhecimento parece provocar o efeito contrário. Desta forma, o treino pode funcionar como uma prática que atua de forma preventiva sobre os danos associados a este processo, e assim provocar uma diminuição do aparecimento de doenças relacionadas com o envelhecimento. Até à data nenhum estudo avaliou as alterações adaptativas hepáticas provocadas pelo treino ao longo da vida e se este poderá prevenir algumas das consequências do envelhecimento. Além disso, a grande maioria dos estudos neste campo são realizados no músculo esquelético, no entanto, tendo em conta o papel importante do fígado na demanda energética requerida por esta atividade, é imperativo perceber como é que este órgão se comporta. Este estudo pretende avaliar a função mitocondrial e antioxidante, ao nível hepático, em resposta a um plano de exercício físico até à meia idade. Para tal, foram utilizadas amostras de fígado de 28 ratos Wistar Unilever, do sexo masculino distribuídos aleatoriamente em dois grupos: não exercitados ou exercitados, submetidos a um plano de exercício, de corrida em treadmill (5dias/semana, 60min/dia a uma intensidade correspondente a 70% da velocidade máxima definida no início de cada mês através da realização de um teste de esforço), durante 24 ou 54 semanas. Avaliou-se a função hepática através da análise de alguns marcadores bioquímicos. A análise de alguns marcadores do stresse oxidativo e das principais enzimas antioxidantes permitiu a avaliação da função antioxidante. Por fim, foi ainda avaliada a função mitocondrial hepática. Os biomarcadores séricos avaliados não mostraram qualquer dano hepático. Os marcadores do stresse oxidativo mostraram que os animais que praticaram exercício até uma idade jovem sofreram dano oxidativo, o que se refletiu num aumento da peroxidação lipídica e numa ligeira diminuição da razão GSH/GSSG, comparativamente aos animais praticaram exercício até à meia idade. Algumas das enzimas antioxidantes (CAT, GR, GPx) apresentaram uma diminuição de atividade com a idade, enquanto a SOD e a GST não se mostraram alteradas. O plano de exercício levou a um aumento da expressão da SOD e CAT, enquanto que a GPx, GST e GR mostraram uma diminuição. O processo de envelhecimento provocou uma diminuição da atividade da citrato sintase, porém o treino conseguiu reverter esta tendência. A atividade dos complexos pertencentes à cadeia transportadora de eletrões (complexo I, II, IV) mostrou que o complexo I responde de forma distinta do complexo II e IV, face ao processo de envelhecimento e ao treino. A velocidade de respiração, em estado 4, mostrou um aumento com o envelhecimento, sendo esta tendência revertida com o treino. Estes resultados confirmam que a prática de exercício físico ao longo da vida poderá melhorar a função mitocondrial e antioxidante ao nível hepático, sendo o tempo de treino essencial para esta melhoria. O treino ao longo da vida poderá prevenir algumas das consequências do envelhecimento associadas à função mitocondrial e ao dano oxidativo, podendo ser um importante contributo para a prevenção de algumas patologias associadas ao aumento da idade.
The active and regular practice of physical exercise has a positive impact on human healthy. A correct prescription of exercise allows an extension of the functional limitation of the organism, producing a modulation of the homeostasis because of the adaptation to this practice. The aging process seem to have the opposite effect. In this way, physical exercise can work preventively on the damages associated with this process and thus cause a decrease in the appearance of age-related diseases. To our knowledge, no studies have fully evaluated the hepatic adaptive alterations cause by physical exercise practiced throughout life and if it can prevent age related damage. Moreover, the vast majority of the studies in this field are performed on the skeletal muscle. However, because of the important role of the liver in the energetic demand required by this activity, it’s imperative to understand the behaviour of this organ. This study aims to determine if the exercise plan performed during the lifetime and the aging process are capable to promote hepatic physiological changes both in antioxidant and mitochondrial system. Liver samples from 28 male Wistar rats were randomly distributed into two groups: non-exercised or exercised, submitted to a treadmill exercise program (5 days / week, 60 minutes / day at an intensity of 70% of the maximum speed defined at the beginning of each month by performing a stress test) for 24 or 54 weeks. Hepatic function was evaluated by the variation of biochemical markers. Evaluation of oxidative stress markers and activity of antioxidant enzymes allowed the evaluation of the antioxidant function. Mitochondrial function was also evaluated. Clinical biomarkers of liver damage showed no liver injury. Oxidative stress biomarkers showed that animals that practice exercise until a young age suffer oxidative stress which was reflected in an increase in lipid peroxidation and a decrease in the ratio GSH/GSSG, contrarily to animals that practice exercise until the middle age. Some of the antioxidant enzymes (CAT, GR, GPx) showed a decrease of activity with age, whereas SOD and GST showed no alterations. The training performed caused an increase in the first line defence antioxidants (SOD and CAT), while GPx, GST and GR shows a slight but significant decrease. The aging process resulted in a decrease activity of citrate synthase, however, the training reverted this situation. The activity of complexes of mitochondrial electron transport chain (complex I, II, IV) showed that complex I responds differently from complex II and IV, to the aging process and physical exercise. Respiratory rate in state 4, has suffered an increase with the aging process, however, the exercise was able of reverted this situation. These results confirm that physical exercise practiced throughout life seems capable of improve the mitochondrial and antioxidant function. In fact, the duration of training proves to be essential for the improvement observed. The life time practice of exercise is capable of the prevent some of the consequences caused by the aging process. This confirms that this practice can be helpful to prevent some of the age-related diseases.

Dissertação de Mestrado em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
A mitocôndria é o centro de vários processos celulares, incluindo o balanço redox que é fundamental para o controle de vias relacionadas com as decisões de vida ou morte celular. Apesar dos conhecidos efeitos de antioxidantes e seus resultados satisfatórios em neutralizar a prejudicial desregulação na interação de vias redox in vitro, o seu sucesso terapêutico é limitado devido a limitações farmacocinéticas. Neste sentido, foram feitos esforços para desenvolver moléculas bioativas baseadas em antioxidantes provenientes da dieta direcionados para a mitocôndria, a fim de melhorar a função mitocondrial. Os ácidos fenólicos, como os ácidos hidroxibenzóico (HBA) e hidroxicinâmico (HCA) são reguladores naturais do estado redox da célula e têm interesse farmacológico devido às suas propriedades antioxidantes intrínsecas. Neste contexto, nós previamente desenvolvemos novos agentes direcionados para as mitocôndrias, desenvolvidos a partir de HBA (MitoBENs) e HCA (MitoCINs). O objetivo do presente trabalho é investigar o mecanismo de ação do tipo hormético dos novos antioxidantes derivados dos ácidos fenólicos direcionados para as mitocôndrias.Estudamos os efeitos de MitoBENs e MitoCINs em fibroblastos humanos da derme, células que no seu ambiente natural estão constantemente sujeitas a condições adversas, além de que têm um papel essencial na síntese e manutenção da matriz extracelular.Os antioxidantes direcionados para a mitocôndria revelam dois perfis distintos. Um aumento na capacidade proliferativa e uma alteração na função mitocondrial sem comprometer a produção energética celular. As células mantiveram o equilíbrio mitocondrial entre biogênese e auto remoção através da mitofagia, além de os antioxidantes direcionados para a mitocôndria preveniram a citotoxicidade induzida pelo hidroperóxido de tert-butilo. Assim, é provável que os antioxidantes direcionados para a mitocôndria regulem positivamente o sistema de defesa antioxidante intracelular como resultado de uma resposta adaptativa das células, um processo que pode protegê-las contra eventos subsequentes de indução de estresse.Em resumo, os derivados de ácidos fenólicos ligados a moléculas transportadoras direcionadas para a mitocôndria podem estimular uma resposta ao estresse e contribuir para a proteção de células e/ou tecidos, inibindo direta ou indiretamente uma produção excessiva de ROS mitocondriais. Assim, os antioxidantes direcionados para a mitocôndria podem ser considerados candidatos putativos para melhorar a saúde mitocondrial em doenças mitocondriais primárias e / ou secundárias.
Mitochondria are the core of several cellular processes, being the redox balance fundamental to cellular life and death pathways. Despite the well-known healthy benefits of dietary antioxidants and their in vitro satisfactory results to neutralize the impaired redox network, their therapeutic success is limited due to pharmacokinetic drawbacks. In that patch, a great effort has been done to develop bioactive molecules based on polyphenolic dietary antioxidants with mitochondria-targeted properties, to improve mitochondrial function. Phenolic acids such as hydroxybenzoic (HBA) and hydroxycinnamic acids (HCA) are natural regulators of the cellular redox status and have pharmacological interest due to their intrinsic antioxidant properties. In this context, we previously developed novel mitochondria-targeted agents based on HBA (MitoBENs) and on HCA (MitoCINs). The objective of the present work is investigating the hormetic-like mechanism of action of the novel mitochondria-targeted cinnamic and gallic antioxidants.We studied the effects of MitoBENs and MitoCINs on human dermal fibroblasts, cells that in their natural environment are constantly subjected to stress, although their essential role in modulating the dermal extracellular matrix.Mitochondria-targeted antioxidants revealed two distinct profiles. An increase in proliferative capacity and an alteration in mitochondrial function without compromising the cellular energetic production was measured. The cells kept the mitochondrial balance between biogenesis and self-removal by mitophagy, in addition the mitochondria-targeted antioxidants prevented tert-butyl hydroperoxide-induced cytotoxicity. Thus, it is likely that mitochondria-targeted antioxidants up-regulated the intracellular antioxidant defence system as a result of an adaptative response of cells, a process that can protect them against subsequent stress-inducing events.In summary, phenolic acids derivatives attached to mitochondria-targeting moieties can stimulate stress responses and contribute to cells and/or tissue protection, inhibiting directly or indirectly an excessive mitochondrial ROS production. Thus, mitochondria-targeted antioxidants can be considered putative drug candidates to improve mitochondrial health in primary and/or secondary mitochondrial diseases.