Tesis sobre el tema "Bursaphelenchus"

Objective – research the pine wood nematodes Bursaphelenchus sp. situation in Lithuania. Goals: 1. Research of native pine wood nematode species composition in Lithuania; 2. Research of preconditions for harmful pine wood nematode species to enter Lithuania; 3. Research of conditions for non-native pine wood nematode species to establish, breed and spread; 4. Research of consequences if harmful species becomes established in Lithuania, anticipate pest management options. Object of the study – coniferous (pine) forests in Lithuania and companies, processing imported wood. Methods. Samples were taken in coniferous clearcuts and wood processing companies from the stained wood or wood with evidence of Monochamus activities. Nematodes were extracted sing Baermann method. Preconditions for nematodes to enter Lithuania, establish and spread were analysed using statistical and literature sources. Strengths, weaknesses, opportunities, threats (SWOT) analysis was applied to the situation of Bursaphelenchus in Lithuania. Results. 27 forest enterprises and 62 wood processing companies were studied. For the first time in Lithuania non-pathogenic species Bursaphelenchus mucronatus was found. Assessement of conditions for wood nematodes in the country (import assortment and volume, countries, host plants and potential vectors), real probability for harmful species, particularly Bursaphelenchus xylophilus, to enter, establish and spread was defined. Existing quarantine system might... [to full text]

Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à l’invasion du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, un ver microscopique responsable de la maladie du dépérissement du pin et causant la perte de millions d’arbres annuellement à travers le monde. Notre objectif global était d’affiner nos connaissances sur ce cas d’invasion et particulièrement d’établir l’histoire d’invasion des populations européennes. Nous avons analysé la diversité génétique neutre d’échantillons de populations naturelles de nématode du pin de l’aire native et de différentes zones envahies à l’aide de méthodes de génétique des populations. Ces analyses ont essentiellement mis en évidence que (i) l’aire native du nématode du pin est fortement structurée à fines échelles spatiales et présente une diversité génétique faible à modérée, suggérant un rôle important de la dérive génétique, non compensée par la dispersion, (ii) les populations européennes présentent une diversité génétique extrêmement faible, suggérant un seul évènement d’introduction en Europe, et que (iii) l’Amérique du Nord est la source la plus probable des populations envahissantes européennes, non le Japon et la Chine. Ce projet souligne l’intérêt que les nématologistes et les généticiens des populations ont à collaborer. La génétique des populations a en effet permis de clarifier l’histoire de l’invasion des populations européennes et ce modèle nématode, du fait de son cycle de vie complexe résultant en un cas extrême de faible diversité génétique, a permis de s’interroger sur des méthodes et analyses couramment utilisées en génétique des populations
In this project, we were interested in the invasion of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, a microscopic worm responsible for the pine wilt disease and causing the annual loss of millions of trees worldwide. Our global objective was to improve our knowledge on this case of invasion and particularly to clarify the invasion history of European populations. After developing the microsatellite markers needed for our study, we analysed the genetic diversity of samples of natural populations from both the native area and invaded areas thanks to population genetics methods. These analyses revealed that (i) the native area is strongly genetically structured at fine scales and displays a low to moderate genetic diversity, suggesting an important role of the genetic drift, not compensated by dispersal, (ii) the European populations exhibit an extremely low genetic diversity, indicating a unique event of introduction in Europe and (iii) North America is the most probable source of European populations compared to China and Japan. This project is finally a good example of the benefits of collaboration between nematologists and population geneticists. Population genetics allowed to clarify the invasion history of European populations and this “nematode” model, because of its complex life cycle resulting in an extreme case of low genetic diversity, provided the opportunity to question methodologies in population genetics that are routinely used

Plant-parasitic nematodes cause huge economic and ecological losses in agriculture and forestry ecosystems worldwide. The migratory endoparasitic nematode Bursaphelenchus xylophilus is unique in having phytoparasitic and mycetophagous phases in its life cycle. During the phytoparasitic stage, the nematode migrates within pine trees feeding on the contents of cortex and xylem parenchymal cells. Interactions of the nematode with the plant host are mediated by effectors - secreted proteins originating from the pharyngeal gland cells. The main objective of this work was to identify and characterise nematode effector genes that play key roles in parasitism. Next-generation sequencing and bioinformatic analysis were used as a neutral approach to identify novel effectors. The transcriptome of B. xylophilus has been sequenced to compare gene expression in the mycetophagous and plant-parasitic stages to identify genes and morphological adaptions involved in plant parasitism. Additionally, transcripts from pharyngeal gland cells were sequenced. Analysis of the data revealed new parasitism-related proteins. A promoter DNA sequence motif was identified that is associated with expression in the pharyngeal gland cells, and was used to predict further effector sequences. A panel of 118 predicted effector genes with a signal peptide, at least one occurrence of the motif and that are upregulated in planta were identified. Functional data suggest that effectors are one key part of a multi-layered detoxification strategy deployed by B. xylophilus in order to protect itself from host defence responses. B. xylophilus secretes detoxification enzymes into the host, while simultaneously upregulating other detoxification enzymes within its digestive system. We showed that one of these enzymes – a glutathione S-transferase - has a protective activity against defence compounds produced by the host. These data represent the most comprehensive analysis of novel effectors from this nematode to date; Caracterização funcional de putativos effectors do nemátode da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus RESUMO: Os nemátodes fitoparasitas representam enormes perdas económicas e ecológicas na Agricultura e em sistemas florestais. O nemátode endoparasita migratório Bursaphelenchus xylophilus tem a característica única de ser fitófago e micófago, no seu ciclo de vida. Durante a fase parasítica, o nemátode migra dentro dos pinheiros, alimentando-se dos conteúdos das células do parenquima presentes no córtex e xilema. As interações do nemátode com a planta hospedeira são mediadas por effectors – proteínas secretadas com origem nas glândulas esofágicas. O objectivo principal deste trabalho foi a identificação e caracterização dos effectors do nemátode que têm um papel preponderante no parasitismo. Sequenciação de última geração e análises bioinformáticas foram usadas como uma abordagem neutra para identificar novos effectors. O transcriptoma do B. xylophilus foi sequenciado e a expressão dos genes foi comparada entre as fases micófaga e parasítica, para identificar os genes e adaptações morfológicas envolvidas no parasitismo. Adicionalmente, foram sequenciados os transcritos originários das glândulas esofágicas. A análise dos dados revelou novas proteínas de parasitismo. Foi identificado um motif de DNA no promotor, cuja sequência está associada à expressão nas glândulas esofágicas e que pode ser utilizado para predizer novos effectors. Foi identificado um conjunto de 118 novos genes effectors com sinal peptídeo, com pelo menos uma ocorrência do motif na região promotora e altamente expressos na planta. Os dados funcionais sugerem que os effectors são parte importante na estratégica de destoxificação, a diferentes níveis, estabelecida pelo nemátode para se proteger das respostas de defesa do hospedeiro. B. xylophilus secreta enzimas de destoxificação dentro do hospedeiro, enquanto simultaneamente expressa outras destas enzimas no seu sistema digestivo. Aqui demonstramos que uma destas enzimas - glutationa S-transferase – tem uma actividade protectora contra compostos de defesa produzidos pelo hospedeiro. Estes dados representam a análise mais completa de novos effectors deste nemátode encontrados até ao presente.

Kyoto University (京都大学)
0048
新制・課程博士
博士(農学)
甲第13121号
農博第1626号
新制||農||941(附属図書館)
学位論文||H19||N4247(農学部図書室)
UT51-2007-H394
京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻
(主査)教授 二井 一禎, 教授 髙藤 晃雄, 教授 武田 博清
学位規則第4条第1項該当

O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophiius, tem uma extensa distribuição na América do Norte, e encontra-se atualmente distribuído ao longo da maioria dos territórios de Canadá e dos Estados Unidos. Durante o último século, esta espécie foi transportada pelo Homem para outras regiões do mundo (não-nativas), associadas com o comércio e o fluxo global de produtos de origem florestal. Atualmente, esta espécie invasiva está reportada para algumas regiões do SE asiático (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente para a Europa (Portugal). Devido ao impacto que este organismo agente da doença da murchidão dos pinheiros causa nas florestas nativas destas regiões esta espécie assume uma elevada importância económica a nível mundial Em Portugal, a distribuição do NMP encontra-se confinada a uma área restrita e limitada (500 000 ha), a sul de Lisboa (península de Setúbal); contudo, constitui uma das maiores ameaças às florestas de pinheiro do país e da UE. Ate recentemente, nenhum consenso existia quanto à origem do NMP em Portugal. Diversas hipóteses têm sido colocadas para explicar esta introdução, nomeadamente a partir de zonas onde o nematode ocorre naturalmente (América do Norte), ou de outras áreas (não-nativas) onde o nematode se comporta como uma espécie invasiva (Leste da Ásia). A fim de avaliar a variabilidade genética do NMP proveniente da área afetada em Portugal, foram utilizadas várias técnicas moleculares, designadamente o random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) e o satellite DNA (satDNA). No caso do RAPD-PCR, foram utilizados 24 isolados do NMP provenientes de Portugal, 1 proveniente da América do Norte e 1 da Ásia, tendo sido utilizado como out-group um isolado de B. mucronatus. A partir dos 28 RAPD primers utilizados obtiveram-se 640 fragmentos. No caso do satDNA, foram utilizados 21 isolados do NMP provenientes de Portugal, obtendo-se no total 206 sequências da família MspI. Ambos os métodos revelaram uma elevada similaridade genética entre os vários isolados do NMP da área afetada em Portugal O nível reduzido de diversidade genética obtido entre os isolados portugueses do NMP, permite concluir que se trata de uma única introdução deste organismo em Portugal, e proveniente de uma região asiática. A inexistência de uma de correlação entre a variabilidade genética e a distribuição geográfica do NMP dentro da área afetada em Portugal, indica que o NMP se encontra distribuído de forma uniforme ao longo de toda a área afetada, provavelmente relacionado com a distribuição e a expansão natural do inseto vector. The pinewood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, has a wide distribution in North America, and is present throughout most of the territories of Canada and the United Stata. During the last century, this species has been transported by man to several non-native regions of the world, associated with trade and the global flow of forest products. Up to date, this invasive species has been reported from Asia (PR China, Japan, Korea and Taiwan) and more recently in Europe (Portugal). Due to the impact on native pine forests of these regions, this nematode species, the causal agent of pine wilt disease, is of great economic importance worldwide. In Portugal, the distribution of the PWN has been constrained to a relatively small area (500 000 ha) in the south of Lisbon (Setúbal Peninsula); however, it has become the most serious threat to pine forests in the country. Until recently, no consensus had emerged on the possible pathway of the PWN introduction in Portugal. Several hypotheses have been put forward to explain this introduction, such as an origin from endemic areas where the nematode naturally occurs (North America), or non-endemic areas where the nematode behaves as an exotic pest (East Asia). Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) and satellite DNA (satDNA) techniques were used in order to assess the level of genetic variability and genetic relationships, among several isolates of the PWN, representative of the entire affected area in Portugal. In the case of RAPD-PCR, 24 Portuguese isolates, plus two additional isolates of B. xylophilus, representing North America and East Asia were included. B. mucronatus was used as an out-group. Twenty-eight random primers generated a total of 640 DNA fragments. With satDNA, 206 Mspl sequence repeats were obtained from 21 Portuguese isolates of B. xylophilus. Both molecular methods revealed a high genetic similarity among the Portuguese isolates, and the low level of genetic diversity strongly suggests that they were dispersed recently from a single introduction, and from East Asia. The lack of apparent relationship between the genetic variability and the geographic distribution of the PWN within the affected area, suggests that the recent introduction of this pest (and pathogen) in Portugal has been uniformly distributed since its establishment, probably following the natural distribution and expansion of the insect vector.

Doctor of Philosophy
Department of Horticulture, Forestry, and Recreation Resources
Jason Griffin
Feeding preference experiments with the pine sawyer beetle (Monochamus carolinensis Olivier) were conducted using eleven taxa of Pinaceae. One newly emerged adult beetle (≤ 24 hours) was placed into each feeding arena (n = 124) containing three or four shoots of current season's growth from different tree species (one shoot per species) for choice experiments. Beetles were allowed to feed for 48 (2011) or 72 (2012-2014) hours, at which point shoots were removed and data collected on feeding occurrence and percent feeding area. Augmented design analyses of feeding occurrence and percent feeding area of the eleven taxa did not indicate significant evidence for feeding preferences of the pine sawyer beetle on most taxa except for a higher preference for both scots (Pinus sylvestris L.) and eastern white (P. strobus L.) pines compared to deodar cedar [Cedrus deodara (Roxb. ex D. Don) G. Don]. The feeding preference experiments suggest that pine sawyer beetle may feed on a wide-range of Pinaceae taxa. Virtual plant walk maps were developed using a web-application for two semesters of an ornamental plant identification course (n = 87). The maps allowed students to revisit plants and information covered in lecture and laboratory sections at their own convenience, using either a computer or mobile device. Survey results indicated 63% of the students used the virtual plant walk maps as a study resource. Students mainly used the maps to study the most current plant list. Most students who used the virtual maps did so to review the plants online. When asked to rate usefulness of the maps on a scale from slightly useful (1) to very useful (3), 43% of students indicated that the virtual maps study tool was very useful, 25% indicated the maps were useful, and 8% indicated that the maps were slightly useful. A significant dependence between student use frequency and student usefulness ratings of virtual plant walk maps was observed. As students’ use of the virtual maps increased, they perceived the maps to be more useful to their studies in preparing for identification quizzes. No differences between plant identification quiz scores were observed between students who used and did not use the virtual plant walk maps or between learning styles. Our survey indicated students used the virtual plant walk maps as a resource and perceived the maps as a useful tool in preparation for identification quizzes.

Suite à la récente introduction du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, au Portugal, ses risques de propagation en France ont été étudiés. Premièrement des campagnes de captures d’insectes ont montré que l’insecte vecteur Monochamus galloprovincialis était présent sur 3 espèces de pins sensibles au nématode, qu’on le retrouvait majoritairement dans le Sud de la France, la température jouant un rôle important dans sa distribution. Les études sur la nématofaune du genre Bursaphelenchus spp, ont, tout d’abord, mis en évidence, avec l’aide de marqueurs moléculaires, une large distribution de B. Mucronatus en France aussi bien dans les pins hôtes que sur l’insecte vecteur. L’étude de son développement a confirmé la forte similitude de son cycle biologique avec celui de B. Xylophilus malgré un taux de croissance plus faible. Enfin une étude de compétition entre les 2 espèces a montré un avantage compétitif de B. Xylophilus sur B. Mucronatus dans les pins et sur l’insecte, en conditions contrôlées. L’ensemble de ces résultats a indiqué un risque important de dissémination du nématode du pin dans les pinèdes françaises s’il y était introduit.

Le nématode du pin Bursaphelenchus xylophilus, originaire des Etats-Unis, est responsable de dépérissements massifs dans les forêts de pin des pays où il a été introduit. Il utilise comme vecteur un insecte du genre Monochamus, notamment M. galloprovincialis en Europe. L’objectif de cette thèse est de fournir des informations concernant les capacités de dispersion de ce coléoptère afin de mieux prédire le risque d'invasion. A l'aide d'expériences en manège de vol, nous avons montré que les adultes émergents, encore immatures, sont déjà en mesure de maintenir des vols soutenus. Ils peuvent parcourir une distance d'environ 500m par jour et les capacités de vol augmentent avec la prise de poids pendant la phase de maturation sexuelle. Il n'existe pas de compromis d'allocation de l'énergie entre fonctions de dispersion et de reproduction pendant cette période et nous proposons de qualifier ces insectes de "income breeder" et "capital disperser". A l'état mature M. galloprovincialis est capable de voler un total de 16 km, avec des vols individuels d'environ1 km; ces performances augmentent avec l'âge et le poids des insectes. Le maintien des capacités de vol tout au long de la vie adulte de M. galloprovincialis conduit à proposer que les distances potentiellement parcourues dépendent surtout de la longévité de l'insecte. Dans une expérience d'élevage en conditions contrôlées nous avons montré que la vie adulte dure au moins 4 mois, augmentant quand les fluctuations thermiques sont atténuées. Ces résultats ont des implications pour la gestion de B. xylophilus en Europe puisqu'ils démontrent que la méthode d'éradication par coupe rase sur un rayon de 500m est probablement inopérante
The pinewood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus, native to the USA, is responsible of the pine wilt disease, causing large economic losses in the pine forests of all countries where it has been introduced. It uses as vector an insect of the genus Monochamus, e.g. M.galloprovincialis in Europe The objective of this thesis is to provide information about the dispersalabilities of, this beetle in order to better predict the spread rate of the PWN. Using flight mill experiments, we showed that immature adult beetles were able to fly since their emergence. The meanflight performance was ca. 500m per day, increasing with weight gain during the maturation period.There was no trade-offs in energy allocation between reproduction and dispersion. We therefore suggest that M. galloprovincialis is both "income breeder" and "capital disperser". Mature beetles were able to fly a total of 16km on average during their lifetime, with individual flights of ca. 1km. Flight performances increased with age and body weight, being equal for males and females. Because flight capacity remained constant across time, we suggested that the total distance potentially covered by beetles was mainly driven by their longevity. In a rearing experiment under controlled conditions we estimated the adult lifespan at 4 months. It was reduced under temperature regime with higheryearly thermal fluctuations. These results have important implications for the management of the PWN since they demonstrate that precautionary clear-cuts of 500m radius are likely to be ineffective in eradicating the disease

Kyoto University (京都大学)
0048
新制・課程博士
博士(農学)
甲第16905号
農博第1921号
新制||農||998(附属図書館)
学位論文||H24||N4666(農学部図書室)
29580
京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻
(主査)教授 二井 一禎, 教授 植田 充美, 教授 天野 洋
学位規則第4条第1項該当

Kyoto University (京都大学)
0048
新制・課程博士
博士(農学)
甲第9738号
農博第1287号
新制||農||851(附属図書館)
学位論文||H14||N3701(農学部図書室)
UT51-2002-J520
京都大学大学院農学研究科地球環境科学専攻
(主査)教授 津田 盛也, 教授 髙藤 晃雄, 教授 武田 博清
学位規則第4条第1項該当

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 género Bursaphelenchus compreende quase 100 espécies, distribuídas sobretudo nos países do hemisfério norte do globo terrestre. Embora algumas espécies já tenham sido detectadas em plantas herbáceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste género são as coníferas, particularmente pinheiros. 0 nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é considerado a espécie mais importante deste género uma vez que é o agente causal da doença da murchidão dos pinheiros ("pine wilt disease"). Originário dos Estados Unidos, onde não causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns países da Ásia (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regiões é responsável pela destruição de milhares de hectares de coníferas, assumindo uma elevada importância económica. Em Portugal, depois da sua detecção em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a área afectada pela praga (a sul do rio Tejo, península de Setúbal) bem como definir e implementar estratégias de controlo e prevenção da disseminação do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presença de B. xylophilus em outras regiões de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o território continental como zona afectada e de restrição. As prospecções intensivas realizadas nos últimos anos incluíram a recolha e análise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo à identificação de várias espécies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracterização morfológica, biométrica e molecular das espécies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribuição geográfica e abundância. Os estudos biométricos foram realizados com populações extraídas directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que estão associadas essas espécies, os seus possíveis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 espécies pertencentes a seis famílias diferentes). Foram identificadas um total de nove espécies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfológicos e biométricos de todas as espécies com excepção de B. mucronatus; o reduzido número de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagnóstico molecular desta espécie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que possível, a confirmação molecular, na maioria dos casos a caracterização morfológica e biométrica permitiu a correcta identificação das espécies. Contudo, foi imprescindível a análise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identificação de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhança entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas populações de B. xylophilus que possuíam fêmeas com cauda mucronada, foi necessária a realização da confirmação molecular. Com excepção de B. xylophilus, todas as outras espécies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a espécie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequência. Algumas destas espécies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribuição geográfica; este resultado está em consonância com a forte associação destas espécies a climas mediterrânicos tal como acontece em Espanha, França, Itália e Grécia. Em oposição, espécies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasião na região centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do país, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus é igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na região norte, na Galiza. Esta espécie preferirá climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequência nas regiões de latitude norte; esta análise é corroborada pela presença constante em países como Alemanha, Finlândia, França, Noruega, Rússia e Suécia. A nível mundial são descritas neste trabalho pela primeira vez as associações das espécies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.

“Diversidade genética dos nemátodes entomopatogénicos (Nematoda: Steinernematidae e Heterorhabditidae) e do nemátode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididade) em Portugal continental” Os nematodes entomopatogénicos são utilizados como agentes de controlo biológico. Para compreender a sua diversidade, foi realizada uma prospecção em Portugal. Cinco espécies, nomeadamente Steinernema feltiae, S. intermedium, S. kraussei, Steinernema sp. e Heterorhabditis bacteriophora foram identificadas. As sequências de ITS, região D2D3 do 28S rRNA, COXI e cytb foram utilizadas para estudar a diversidade genética das duas espécies mais abundantes, S. feltiae and H. bacteriophora, não tendo sido encontradas diferenças significativas entre isolados. O nemátode da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, provoca doença nos pinheiros tendo sido detectada pela primeira vez na Europa e em Portugal em 1999. Para avaliar a diversidade genética dos isolados Portugueses e identificar o padrão de propagação da doença, foram utilizadas a sequência da região IGS do 5.8S rRNA, e os genes cytb e cellulase, combinados com os padrões ISSR. Os padrões de ISSR mostraram elevada diversidade genética entre os recentes isolados Portugueses, sugerindo a possibilidade de uma nova introdução. As árvores filogenéticas dos genes da celulase e cytb sugeriram uma origem Asiática para os isolados Portugueses; ABSTRACT: Entomopathogenic nematodes are used as biocontrol agents. To understand their diversity, a survey was undertaken in Portugal. Five species, namely Steinernema feltiae, S. intermedium, S. kraussei, Steinernema sp. and Heterorhabditis bacteriophora were identified. The ITS, 28S rRNA D2D3 region, COXI and cytb sequences, used to study the genetic diversity of the two most abundant species, S. feltiae and H. bacteriophora, showed no significant differences among the isolates. Bursaphelenchus xylophilus causes severe disease in pine trees and was detected for the first time in Europe and in Portugal in 1999. To evaluate the genetic diversity of Portuguese isolates and identify disease spread pathways, the sequence of 5.8S rRNA IGS region, cytb and cellulase genes, combined with ISSR fingerprints were used. ISSR fingerprints show a high genetic variability among recent Portuguese isolates, suggesting the possibility of a new introduction. Phylogenetic trees based on cellulase and cytb genes suggests an Asian origin for Portuguese isolates.

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente
Studies show that the number of biological invasions has increased. The spread of species from their native range to other places is directly related to the increase in transport and movement of people and their goods. The Pine Wood Nematode (Bursaphelenchus xylophilus) (PWN), the causal agent of the pine wilt disease, is an example of this problem, originated from North America, has become a serious pest on Eurasia. This dissertation aims to understand if environmental factors are determining tree mortality in an area where the PWN has been confirmed since 2009. The study area is located in the centreal part of Portugal, a complex area regarding the topography and soil making it also complex concerning climatic and ecological conditions, providing a good study case on the possible interaction between a biological invasion and local environmental conditions. In order to evaluate the study area several of environmental parameters were determined, and analyzed in GIS. Additionally it was determined the proportion of recently dead trees in randomly selected pine forests within the study area. The Binary logistic model showed that temperature in the warm trimester was the only parameter that better predicted the mortality. Climate change models predict an increase in the temperature in the future, thus indicating that the susceptability of Pinus pinaster to the PWN will increase.
Portuguese Science Foundation - project “Developing an adaptive management system for predicting and mitigating damage caused the pine wilt nematode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) in Portugal” refª PTDC/AGR-CFL/098869/2008

A doença da murchidão do pinheiro, causada pelo nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é uma das mais devastadoras doenças florestais, afetando, em Portugal, Pinheiro bravo (Pinus pinaster). Dado que uma das estratégias de controlo é a plantação de pinheiros resistentes, foi iniciado em Portugal um programa pioneiro de melhoramento para a resistência a esta doença. Paralelamente, e considerando que os esforços para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético para a resistência a doenças devem ser focados também em populações melhoradas para outras características, considerou-se um estudo à variabilidade genética de resposta à inoculação com NMP numa população já melhorada para o volume e forma do tronco. Neste estudo efetuou-se um ensaio de inoculação em estufa, de diferentes concentrações de NMP, em plantas de Pinheiro bravo com dois anos, provenientes da população já melhorada. Os resultados permitiram confirmar a existência de variabilidade na resposta das famílias testadas, assim como os efeitos das diferentes concentrações de inóculo e caraterísticas biométricas das plantas no resultado final. Permitiu também obter maiores conhecimentos quanto às técnicas e duração de ensaios de inoculação, que irão ser usadas nos testes às descendências do programa de melhoramento para a resistência já iniciado; ABSTRACT: Pine wilt disease, caused by the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most threatening forest diseases. The only known host in Portugal is the maritime pine, Pinus pinaster. One of the strategies to control this disease is the establishment of resistant hosts. Thus, a pioneer breeding programme for resistance to this disease has already been initiated in Portugal. Simultaneously, and considering that the breeding efforts for disease resistance should also be focused in populations improved for other traits, a study of the variability in response to the PWN inoculation in a Portuguese population already improved for volume and stem form, was considered. Inoculating different PWN concentrations in two year-old maritime pines, from the already improved population, was the methodology used in this study. The results confirmed the existence of variability in response of the tested families, the effects of plant height and stem diameter, and the effects of the different inoculum concentrations applied in this study. The results obtained allowed also increased knowledge of the inoculation techniques. This knowledge will be used to test the progenies from the breeding programme for resistance, already initiated.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Objetivou-se estudar a flutuação populacional de Rhynchophorus palmarum, Metamasius hemipterus e Bursaphelenchus cocophilus na cultura do dendê em dois ambientes de Roraima. O experimento foi realizado em duas áreas da Embrapa Roraima, sendo uma na área de pesquisa em Boa Vista na região do Monte Cristo (área de savana) e a outra na Fazenda Califórnia no Município de Caroebe, sul do estado de Roraima (área de floresta). A captura dos insetos foi realizada através de armadilhas do tipo balde contendo feromônio de agregação Rincoforol e o atrativo alimentar cana-de-açúcar. A cada 15 dias os espécimes capturados foram levados para o Laboratório de Entomologia da Universidade Federal de Roraima para a contagem, sexagem e avaliação populacional do nematóide Bursaphelenchus cocophilus. Os dados de flutuação populacional dos insetos e do nematóide foram submetidos à estatística descritiva e análises de correlação e regressão linear múltipla através do aplicativo computacional Statistica 7.0. Para verificação da existência de correlação entre a abundância de Bursaphelenchus cocophilus e os fatores climáticos observados, foram calculados os valores de r (coeficiente de correlação de Pearson) e utilizado o teste t de Student a 5% de probabilidade para averiguar suas significâncias. Verificou-se maior incidência de Rhynchophorus palmarum nos meses de fevereiro e setembro de 2011, e janeiro de 2012, e de Metamasius hemipterus no mês de março de 2011 em ambiente de savana. Ocorreu maior incidência de Rhynchophorus palmarum nos meses de março, abril e setembro de 2011, e janeiro de 2012, e de Metamasius hemipterus nos meses de agosto, setembro e dezembro de 2011 em ambiente de floresta. O trabalho permitiu chegar às seguintes conclusões: A densidade populacional de Rhynchophorus palmarum ocorre de maneira semelhante em ambiente de savana e floresta em Roraima. A abundância de Rhynchophorus palmarum e Metamasius hemipterus em ambiente de savana é afetada negativamente, principalmente pela umidade relativa do ar e pela temperatura média do ar, respectivamente. A abundância de Rhynchophorus palmarum e Metamasius hemipterus no ambiente de floresta em Roraima, não é influenciada diretamente pela precipitação pluvial, umidade relativa e temperatura media do ar. A densidade populacional de Bursaphelenchus cocophilus em Rhynchophorus palmarum é maior no ambiente de floresta do que em savana. A densidade populacional de Bursaphelenchus cocophilus em Metamasius hemipterus não difere entre os ambientes de savana e floresta. A frequência de nematoides entre machos e fêmeas em Rhynchophorus palmarum é semelhante. A densidade populacional de Bursaphelenchus cocophilus nas espécies Rhynchophorus palmarum e Metamasius hemipterus nos ambientes de savana e floresta, não foi correlacionada diretamente, no período estudado, com a precipitação pluvial, temperatura média e umidade relativa do ar.
The objective was to study the population dynamics of Rhynchophorus palmarum, Metamasius hemipterus cocophilus Bursaphelenchus in culture and oil palm in two environments Roraima. The experiment was conducted in two areas of Embrapa Roraima, one in the search field in Boa Vista in the region of Monte Cristo (Savanna area) and the other in the city of California Farm Caroebe, southern state of Roraima (forest area) . A Sampling is performed using bucket traps containing pheromone aggregation pheromone attractive food and cane sugar. Every 15 days the specimens captured were taken to the Entomology Laboratory of the Federal University of Roraima for counting, sexing and evaluation of nematode Bursaphelenchus cocophilus population. The data on population fluctuations of insects and nematodes were subjected to descriptive statistical analysis and correlation and multiple linear regression using the Statistica 7.0 computer application. To verify the existence of a correlation between the abundance of Bursaphelenchus cocophilus Climatic factors and observed values were calculated "r" (Pearson correlation coefficient) and the test "t" test at 5% probability to ascertain their significances. Was verified a higher incidence of Rhynchophorus palmarum in February and September 2011, and January 2012, and Metamasius hemipterus in March 2011 in savanna environment. There was a higher incidence of Rhynchophorus palmarum in the months of March, April and September 2011 and January 2012, and Metamasius hemipterus the months of August, September and December 2011 in a forest environment. The work led to the following conclusions: The population density of Rhynchophorus palmarum occurs similarly in savanna environment and forest in Roraima. The abundance of Rhynchophorus palmarum and Metamasius hemipterus in savanna environment is adversely affected primarily by the relative humidity and the air temperature, respectively. The abundance of Rhynchophorus palmarum and Metamasius hemipterus the forest environment in Roraima, is not directly influenced by rainfall, average temperature and relative humidity of the air. The population density of Bursaphelenchus cocophilus in Rhynchophorus palmarum is significantly larger in the forest than in savanna. The population density of Bursaphelenchus cocophilus in Metamasius hemipterus not differ between forest and savanna habitats. The frequency of nematodes between males and females in Rhynchophorus palmarum is similar. The population density of the species Bursaphelenchus cocophilus, Rhynchophorus palmarum and Metamasius hemipterus in forest and savanna habitats, was not directly correlated, in the period studied, with the rainfall, average temperature and relative humidity.

Mestrado em Biotecnologia Molecular
A doença da murchidão do pinheiro foi identificada pela primeira vez no Japão em 1905 e foi associada ao nemátodo Bursaphelenchus xylophilus em 1972. A devastação provocada por esta doença, assim como as perdas económicas a ela associadas e o impacto na fileira florestal levaram a Organização Europeia para a Proteção das Plantas a declarar o nemátodo da madeira do pinheiro como uma praga. Atualmente já existe informação extensa sobre a morfologia, ciclo de vida, associação com um vetor e potenciais hospedeiros para este organismo. No entanto, o mecanismo molecular da doença é pouco conhecido, mas um dos fatores apontados, passa pela aquisição de novas funções por incorporação horizontal de genes. O transcriptoma de B. xylophilus foi sequenciado e anotado recentemente no Biocant, gerando um grande volume de dados. O objetivo do nosso trabalho foi identificar novos genes incorporados no genoma do nemátodo por transferência horizontal. Para levar a cabo esta tarefa, foi estabelecido um pipeline de análise de dados contendo um conjunto sequencial de filtros usados para remover genes com origem em nemátodos e reter os de origem bacteriana ou fúngica. Os transcritos de B. xylophilus anotados foram também filtrados de acordo com as funções dos genes e pelo E-value. Uma última filtragem foi realizada tendo por base a composição da comunidade microbiana associada ao nemátodo, obtida por pirosequenciação. O pipeline definido gerou 21 candidatos que foram validados através de análise filogenética com proteínas homólogas de bactérias, fungos, nemátodos e outros organismos e ainda com uma posterior identificação do gene no genoma do nemátodo, disponibilizado no decurso deste trabalho. Esta abordagem identificou três genes incorporados por transferência horizontal: uma β-1,3-endoglucanase, uma álcool desidrogenase, e um gene que pertence à família das desidrogenases/redutases de cadeia curta. Os primeiros dois genes já foram descritos em B. xylophilus e C. elegans, respetivamente, o que valida a nossa abordagem. O papel que o gene recém-identificado desempenha no nemátodo e na doença terá de ser estudado futuramente, na expectativa deste fornecer novas informações sobre o mecanismo da doença e novos alvos elegíveis para o controlo da doença.
Pine wilt disease was first identified in Japan in 1905 and its association with the nematode Bursaphelenchus xylophilus dates back to 1972. The devastating nature of this disease and the big economical losses it generates along with the ecological impact led the European Plant Protection Organization to consider its causal agent as an european quarantine pest. Until now, information regarding the nature of B. xylophilus with reference to its morphological characters, life cycle, vector association and potential host have been gathered and documented. However, little is known on the molecular mechanisms of the disease. According to current knowledge one of the factors that may play a role in the disease is the acquisition of new gene functions through horizontal gene transfer (HGT). The transcriptome of B. xylophilus was recently sequenced and annotated at Biocant, providing a large amount of genomics information. The goal of our work was to identify new genes incorporated through HGT in these transcripts. To accomplish our objective we established a data analysis pipeline composed of several filters to discard genes of nematodal origin and select only those of bacterial or fungal origin. B. xylophilus transcripts were screened based on the information held in their annotation: E-value, organism origin and existence of a specific function. A final screen was performed by removing all hits matching the microbial community associated with the nematode, as determined by barcoded pyrosequencing. The pipeline outlined 21 candidates that were compared to homologous sequences from bacteria, fungi, nematodes and other organisms through phylogenetic analysis. This last step confirmed the presence of three genes resulting from HGT a β-1,3- endoglucanase, an alcohol dehydrogenase and a short chain dehydrogenase/reductase. The first two genes were already described for B. xylophilus and C. elegans, respectively, validating our approach. The role of the newly identified HGT gene in the nematode and disease will be studied in the future, expecting to provide new information on the disease mechanism and contribute to the identification of new targets eligible for disease control.

Mestrado em Gestão e Conservação de Recursos Naturais - Instituto Superior de Agronomia / Universidade de Évora
Pine wilt disease, caused by the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most threatening forest diseases. The only known host in Portugal is the maritime pine, Pinus pinaster. One of the strategies to control this disease is the establishment of resistant hosts. Thus, a pioneer breeding programme for resistance to this disease has already been initiated in Portugal. Simultaneously, and considering that the breeding efforts for disease resistance should also be focused in populations improved for other traits, a study of the variability in response to the PWN inoculation in a Portuguese population already improved for volume and stem form, was considered. Inoculating different PWN concentrations in two year-old maritime pines, from the already improved population, was the methodology used in this study. The results confirmed the existence of variability in response of the tested families, the effects of plant height and stem diameter, and the effects of the different inoculum concentrations applied in this study. The results obtained allowed also increased knowledge of the inoculation techniques. This knowledge will be used to test the progenies from the breeding programme for resistance, already initiated.

Les invasions biologiques se sont intensifiées au cours des dernières décennies en raison d’une accélération des échanges commerciaux. Ces invasions représentent une menace pour les écosystèmes et de nombreuses activités anthropiques, il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui les sous-tendent afin de mieux prévoir et limiter leurs impacts. Dans cette thèse, j’aborde la question du potentiel dispersif d’espèces natives et non natives impliquées dans une association phorétique nouvellement formée. En particulier, je me focalise sur le cas de l’association entre un nématode invasif ravageur des pinèdes, le nématode du pin (Bursaphelenchus xylophilus) et son insecte vecteur endémique en Europe (Monochamus galloprovincialis). J’ai tout d’abord étudié les flux de gènes de l’insecte vecteur seul afin d’identifier les barrières à sa dispersion. J’ai ensuite simulé l’expansion spatiale du couple nématode-vecteur à l’aide d’un modèle de dispersion, en intégrant l’effet synergique de cette nouvelle association. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent qu’il existe un important potentiel de dispersion du nématode invasif en Europe par le biais de cette association phorétique. En revanche, certains paramètres de l’environnement tels que les reliefs et les températures basses qui leur sont associées, ainsi que les fortes densités en pins constituent des barrières à la dispersion du vecteur et donc des obstacles potentiels à l’expansion du nématode invasif. Au-delà des apports relatifs au modèle d’étude, cette thèse a conduit au développement de plusieurs méthodes pouvant être adaptées à d’autres cas d’associations phorétiques nouvelles et, par extension, contribuer à la compréhension de la dispersion des espèces au sein de ces systèmes complexes et peu étudiés
Biological invasions dramatically increased over the last decades due to the intensification of international trade. These invasions constitute a threat for ecosystems and many anthropic activities, therefore it is crucial to understand underlying processes in order to better predict and manage their impacts. In this PhD thesis, I explore the potential of dispersion of native and non-native species involved in a novel phoretic association. I focus on the case of the association between a pest for pine forests, the pinewood nematode (Bursaphelenchus xylophilus) introduced in Europe, and its endemic insect vector (Monochamus galloprovincialis). I first estimated gene flows of the insect vector alone in order to identify the barriers and corridors to dispersal of this species. Then I have simulated the spatial spread of the nematode-vector couple using a spread model, and accounting for the synergistic effect of this novel association. The results obtained during this PhD showed that the invasive nematode has an important potential to spread through this phoretic association. However, some environmental features such as elevation, areas with low temperatures, and the high pine densities constitute barriers to dispersal of the vector and so, potential obstacles to the spread of the invasive nematode. Beyond these results focused on the model of study, this thesis has led to the development of several methods that may be adapted to other cases of novel phoretic association and, by extension, may contribute to a better understanding of dispersal of species involved in those complex and poorly known systems

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é responsável pela doença da murchidão do pinheiro (DMP) e tem causado sérios danos em florestas de todo o mundo, sendo responsável por elevadas perdas económicas e ecológicas. Dois isolados portugueses (BxPt17AS e BxPt96Mang) e dois isolados japoneses de referência (T4, virulento; C14-5, avirulento), mantidos em culturas do fungo Botrytis cinerea crescido em extrato de malte e agar, foram caracterizados morfológica e molecularmente. A análise morfológica foi realizada utilizando caracteres de diagnóstico específicos: cauda do macho, prega vulvar e términus da cauda da fêmea. A caracterização molecular foi realizada através da reação em cadeia da polimerase das regiões espaçadoras internas transcritas do DNA ribossomal seguida de análise dos polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (PCR ITS-RFLP) com cinco endonucleases de restrição. A caracterização morfológica e molecular confirmou claramente a identificação dos isolados como pertencentes à espécie B. xylophilus. Nemátodes dos quatro isolados do NMP foram inoculados em plântulas de Pinus pinaster e a taxa de mortalidade do hospedeiro e capacidade de reprodução de cada isolado foram determinadas de forma a avaliar a sua virulência. Os resultados demonstraram que todos os isolados desenvolveram sintomas em P. pinaster, alguns dias após a inoculação. No fim do ensaio, 32 dias após inoculação, três dos isolados causaram 100% de mortalidade das plantas, enquanto o isolado C14-5 causou uma taxa de mortalidade de 80%. Entre os quatro isolados, o isolado português BxPt17AS apresentou maior capacidade reprodutiva em P. pinaster e foi selecionado para os estudos posteriores. Adicionalmente, de forma a avaliar a suscetibilidade de P. pinea à infeção pelo NMP, plântulas foram inoculadas com o isolado BxPt17AS. Após o términus do ensaio, nenhum sintoma da doença foi observado nas plântulas inoculadas. Estes resultados indicam que a espécie P. pinea é menos suscetível à doença que P. pinaster. Para além disso, nemátodes do isolado BxPt17AS foram utilizados para obter e comparar o secretoma de B. xylophilus quando exposto a um estímulo de extrato de pinheiro destes dois hospedeiros com diferentes suscetibilidades à doença. Da análise SWATH-MS, 776 proteínas foram quantificadas em ambos os secretomas. Destas, 501 encontraram-se aumentadas no secretoma de B. xylophilus exposto ao estímulo de P. pinea e 22 aumentadas no secretoma de B. xylophilus sujeito ao estímulo de P. pinaster. A análise funcional das 501 proteínas revelou um enriquecimento de proteínas com atividade de ligação. Das 22 proteínas, as mais representadas foram as peptidases, hidrolases e proteínas com atividade antioxidante. As diferenças encontradas no secretoma evidenciam respostas diferentes do nemátode para superar as defesas de hospedeiros com diferentes suscetibilidades.
The pinewood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the causal agent of the pine wilt disease (PWD). It has been causing serious damages to pine forests worldwide, being responsible for high economic and ecological losses. Two Portuguese PWN isolates (BxPt17AS and BxPt96Mang) and two reference PWN Japanese isolates (T4, virulent; C14-5, avirulent), maintained on the fungus Botrytis cinerea cultures grown in Malt Extract Agar medium, were morphologically and molecularly characterised. Morphological analysis was carried out using species-specific diagnostic characters: male tail, vulval flap and tail terminus on female. Molecular characterisation was made using the polymerase chain reaction of the internal transcribed spacer regions followed by restriction fragment length polymorphism (PCR ITS-RFLP) with five restriction endonucleases. The morphological and molecular characterisation confirmed the B. xylophilus identity of the isolates. Nematodes of the four PWN isolates were then inoculated in Pinus pinaster seedlings. Host mortality rate and the reproductive ability of each isolate were determined to assess isolates virulence. All isolates revealed to be pathogenic to P. pinaster seedlings, with symptoms development in a few days after inoculation and high mortality rates. However, while three of the isolates presented 100% host mortality rate, the C14-5 had 80%. From the four isolates, the Portuguese isolate BxPt17AS exhibited the higher reproductive ability in P. pinaster seedlings and was selected for further studies. Pinus pinea seedlings were inoculated with BxPt17AS isolate to evaluate this host susceptibility and no dead seedlings or any symptoms of the disease were observed. Additionally, this isolate was unable to reproduce inside P. pinea seedlings. These results shown that P. pinea is much less susceptible than P. pinaster to PWN infection. Moreover, nematodes from the isolate BxPt17AS were used to obtain and compare the nematode secretome when exposed to pine extract stimuli from these two hosts with different susceptibility. Of the SWATH-MS analysis, 776 different secreted proteins were quantified in both secretomes. From these, 501 were found upregulated in B. xylophilus secretome under P. pinea stimulus and 22 upregulated under P. pinaster stimulus. Functional analyses of the 501 proteins revealed an enrichment of proteins with binding activity. From the 22 proteins, proteins with peptidase, hydrolase and antioxidant activity were the most represented. The differences found in the secretome highlighted the diverse response of the nematode to overcome host defences with different susceptibilities.
Outro - This work was carried out at the R&D Unit Centre for Functional Ecology - Science for People and the Planet (CFE), with reference UIDB/04004/2020 and Centre for Neuroscience and Cell Biology with reference UIDB/04539/2020, financed by Fundação para a Ciência e Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT/MCTES) through national funds (PIDDAC) and also supported by projects “POINTERS - Host tree-pinewood nematode interactions: searching for sustainable approaches for pine wilt disease management” (PTDC/ASP-SIL/31999/2017 - POCI-01-0145-FEDER-031999) funded by FCT, “RENATURE (CENTRO-01-0145-FEDER-000007) - Valorization of the Natural Endogenous Resources of the Centro Region”, funded by the Comissão de Coordenação da Região Centro (CCDR-C) and subsidised by the European Regional Development Fund (FEDER) and Instituto do Ambiente, Tecnologia e Vida (IATV).

碩士
國立中興大學
植物病理學系
93
Bursaphelenchus xylophilus causes the pine wilt disease (PWD). The resistant plant Pinus massoniana and P. taiwenensis tend to be infected PWD recently. The objective of this study is to investigate the distribution of pine wilt disease and to understand the association between morphology variation and parasitism diversity of Bursaphelenchus spp. in Taiwan. We collected 19 isolates that were divided into 5 groups by morphology characteristics and the ITS region database. Some isolates were considered as B. mucronatus or B.thailandae that haven’t found yet in Taiwan. B. mucronatus can survive at P. taiwenensis and P. morrisonicola , but B. xylophilus causes PWD both that never reporded. It shows rich biodiversity of Bursaphelenchus nematodes and host variation in Taiwan. In addition to collect more nematode samples and inoculation test ,it should be compared with the foreign spices to understand the origin of Bursaphelenchus spp. in Taiwanwe in the future.

O nematode da madeira do pinheiro (NMP) Bursaphelenchus xylophilus é o agente etiológico da doença do nemátode da madeira do pinheiro em Pinus pinaster. Não existe ainda um método eficiente para controlar e/ou eliminar este agente patogénico. O quitosano é um produto extraído da parede celular de alguns fungos ou da desacetilação da quitina, um produto amigo do ambiente e amplamente usado como agente antimicrobiano. O objetivo deste trabalho foi o de testar a influência do quitosano no aumento da defesa da planta contra o NMP e também compreender as bases fisiológicas de ação deste composto a múltiplos níveis: efeito na população de nemátodes na planta, na produção de compostos de defesa e na modulação da carga microbiana no nemátode. Também se testou o quitosano como agente de esterilização da madeira comparando também este composto com outros métodos como o tratamento térmico em estufa e por microondas. Para este trabalho de investigação infetaram-se pinheiros com NMP onde 75 pinheiros foram mantidos em solo sem quitosano e 75 em solo com quitosano. Verificou-se que até aos 28 dias após a infeção o quitosano evitou a morte dos pinheiros e o número total de nemátodes foi inferior ao número de nemátodes dos pinheiros mantidos em solo sem quitosano e idêntico ao longo de todo o tempo experimental. Este composto aumentou a produção de carotenoides, (53.8 ± 4.6 mol/g-1 aos 21 dai para 111.5 ± 11.9 mol/g-1 aos 28 dai) antocianinas (63.4 ± 5.5 mol.g-1 para 142.3 ± 20.4 mol.g-1 aos 28 dai), polifenóis totais (2.70 ± 0.1 μg.g-1 aos 7 dai para 3.2 ± 0.7 μg.g-1 aos 14 dai) e lenhina (0.7 ± 0.1mg.g-1 aos 14 dai para 1.5± 0.1 mg.g-1 aos 28 dai) demonstrando a sua capacidade para aumentar os mecanismos de defesa da planta. Foi estudada também a influência do quitosano nas bactérias associadas ao nemátode na planta e Enterobacter sp. foi o género predominante encontrado ao longo do tempo, o que sugere que as bactérias deste género estejam associadas à doença. De forma a se compreender se as bactérias obtidas no estudo anterior provinham realmente do nemátode ou se teriam sido transmitidas a este pela planta realizou-se um estudo “in vitro” do efeito do quitosano no NMP. Verificou-se que Stenotrophomonas sp., Bacillus sp., Kluyvera sp., Buttiauxella sp., Klebsiella sp. e Paenibacillus sp. não foram encontrados associados com o nematode mantido em cultura no laboratório, o que pode indicar que estas bactérias são transmitidas pela planta. Para a comparação do quitosano com outros métodos de controlo, como o tratamento térmico através de uma estufa e de energia microondas, utilizou-se serrim de madeira de pinheiro infetado com NMP. Este estudo demonstrou que o tratamento térmico com estufa e com micro-ondas tiveram uma maior capacidade nematicida quando comparado com soluções de quitosano a diferentes concentrações. Este estudo permitiu concluir que o quitosano apresenta-se com um potencial método de prevenção da doença do NMP aumentando a defesa da planta contra este agente patogénico e evitando a evolução da doença e consequente morte do pinheiro. O quitosano influencia a carga microbiana do nematode, mas mais testes têm que ser realizados para perceber qual o efeito na evolução da doença. Este composto apresenta um efeito limitado nematicida em serrim quando comparado com outros métodos de tratamento.
The pine wood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus is the causal agent of the pine wood disease (PWD) in Pinus pinaster. There isn’t an effective method for control and/or elimination of this pathogen. Chitosan is a product extracted from the cell wall of some fungi or deacetylation of chitin, an environment friendly product, widely used as an antimicrobial agent. The objective of this study was to test the influence of chitosan in the increase of plant defence against the PWN and also understand the physiological bases of action of this compound at multiple levels: effect on the population of nematodes in the plant, production of defence compounds and modulation the microbial load in the nematode. Chitosan was also tested as a wood sterilizing agent and compared with other methods such as heat-treatment by kiln-drying and microwave radiation. For this research project trees were infected with PWN and 75 were kept in soil without chitosan and 75 trees were kept in soil with chitosan. It was found that up to 28 days after infection chitosan prevented the death of pine trees and the total number of nematodes was below the number of nematodes of pine trees kept in soil without chitosan. This compound increased the production of carotenoids, (from 53.8 ± 4.6 mol / g-1 at 21 dai to 111.5 ± 11. 9 mol / g-1 at 28 dai) anthocyanins (from 63.4 ± 5.5 mol g-1 to 142.3 ± 20.4 mol g-1 at 28 dai), total polyphenols ( from 2.7 ± 0.1 μg.g-1 at 7 dai to 3.2 ± 0.7 μg.g-1 at 14 dai) and lignin (rising from 0.7 ± 0.1 mg. g-1 at 14 dai to 1.5 ± 0.1 mg.g-1 at 28 dai) demonstrating its ability to increase the defence mechanisms of the plant. The influence of chitosan on the bacteria associated with the nematodes was also studied in the plant, and Enterobacter sp. was the predominant genus found over time, suggesting that bacteria of this type are associated with the disease. In order to understand if the bacteria obtained actually came from the nematode or was transmitted to the nematode by the plant, an “in vitro” study was performed, were the effect of chitosan on the PWN kept in laboratory culture conditions was studied. It was found that Stenotrophomonas sp., Bacillus sp., Kluyvera sp., Buttiauxella sp., Klebsiella sp. and Paenibacillus sp. were not found associated with the nematode, which may indicate that these bacteria were transmitted by the plant. To compare chitosan with other control methods, such as heat- treatment through kiln-drying and microwave energy, wood chips infected with PWN were used. The heat-treatment by kiln-drying and microwave energy had a higher nematicide capacity when compared to chitosan solutions with different concentrations. This study found that chitosan is a potential prevention method for the PWD increasing plant defence against this pathogen and preventing disease progression and consequent death of the tree. Chitosan influences the microbial load of the nematode but more tests have to be performed to understand the effect on the progression of the disease. This compound has a limited nematicide effect on wood chips when compared with other treatment methods.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia da Conservação). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
O Nemátode da Madeira do Pinheiro (NMP) representa a maior ameaça para as florestas de pinheiro em Portugal e na Europa. O NMP tem devastado extensas áreas de Pinus pinaster com consequências socioeconómicas significativas para o país. Por estas razões é fulcral atuar na gestão deste ecossistema, para evitar a perda deste habitat e das espécies que dele dependem. Como forma de contribuir para o reconhecimento desta problemática, este trabalho teve como objetivo, avaliar a resposta fitoquímica de espécies pertencentes ao género Pinus, à infeção por NMP, pela avaliação da produção de metabolitos secundários. Estudaram-se 6 espécies de pinheiro, P. halepensis, P. nigra, P. pinaster, P. pinea, P. radiata e P. sylvestris. O total de compostos fenólicos e o total de proantocianidinas presentes no floema e córtex das 6 espécies foram quantificados pelos métodos de Folin-Ciocalteau e pelo método DMCA (ácido-3,4-dimetoxicinâmico), respetivamente. Caracterizaram-se os Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) emitidos por P. pinaster são, ferido e inoculado com NMP ao longo de uma semana. Os perfis cromatográficos foram obtidos por SPME-GC/MS e SPME-GC/FID. Os hidrocarbonetos monoterpénicos foram o grupo de compostos voláteis com maior relevância (92 e 99 %) nos voláteis emitidos por P. pinaster. O α-pineno (36 - 56 %), o β-pineno (23 - 43 %), o limoneno (1 - 9 %) e o canfeno (vestigial - 9 %) foram os componentes dominantes. Apesar de não terem sido registadas variações qualitativas na composição volátil dos pinheiros sãos, feridos e inoculados, os perfis cromatográficos revelaram uma tendência para o aumento da percentagem de alguns desses compostos, entre o momento da inoculação ou ferimento até às 3h após inoculação. A concentração Total de Compostos Fenólicos (TCF) variou significativamente entre as várias espécies. P. pinea apresentou a maior concentração (0,09 μg de ácido gálico/mg de material vegetal) e P. halepensis a menor concentração (0,06 μg de ácido gálico/mg de material vegetal). P. pinaster não pareceu apresentar concentrações significativamente diferentes quanto ao estado sanitário (são e infetado). Quanto ao Total de Proantocianidinas (TPA) verificou-se um padrão similar às concentrações de compostos fenólico. De novo P. pinea registou maior concentração (0,01 μg de hidrato de catequina/mg de material vegetal), e P. halepensis a mais baixa (0,004 μg de hidrato de catequina/mg de material vegetal). De novo, P. pinaster não apresentou concentrações significativamente diferentes quanto ao estado sanitário.
The Pine Wood Nematode (PWN) represents the biggest threat to Pine Forests in Portugal and in Europe. The NMP has devastated large areas of Pinus pinaster with significant socio-economic consequences for the country. For these reasons it is crucial to act in the management of this ecosystem, to prevent the loss of this habitat and the species that depend on it. As a contribution to the recognition of this problem, this study aimed at evaluating the phytochemical response of Pinus species, to NMP infection by assessing the production of secondary metabolites. Six pine species, P. halepensis, P. nigra, P. pinaster, P. pinea, P. radiata and P. sylvestris were studied. The total phenolics and proanthocyanidins present in the phloem and cortex of the 6 studied species were quantified by the methods of Folin-Ciocalteau and DMCA (3,4-dimethoxycinnamic acid), respectively. The volatile organic compounds (VOCs) emitted by P. pinaster were characterized, during one week, in healthy pine trees, as well as in trees wounded and/or inoculated with PWN. Analyses were carried out by SPME-GC/MS and SPME-GC/FID. The monoterpene hydrocarbons were most relevant group (92 and 99 %) in the volatile compounds emitted by P. pinaster. α-pinene (36 - 56 %), β-pinene (23 - 43 %), limonene (1 - 9 %) and camphene (traces - 9 %) were the dominant volatiles. Although there were no qualitative variations in volatile composition of the healthy, wounded and inoculated pine trees, the chromatographic profiles showed a tendency to increase in the percentage of some of these compounds, between the time of inoculation or wounding up to 3h after inoculation. The total concentration of phenolic compounds (TPC) varied significantly among the various species. P. pinea showed the highest concentration (0,09 μg of gallic acid /mg of plant material) and P. halepensis the lowest (0,06 μg de gallic acid /mg of plant material). P. pinaster did not show significant different concentrations depending on the health status (healthy and infected). Total of proanthocyanidins (TPA) revealed a similar pattern as for the phenolic compounds. P. pinea displayed the highest concentration (0,01 μg of catechin hydrate /mg of plant material), whereas P. halepensis showed the lowest (0,004 μg of catechin hydrate /mg of plant material). Again, P. pinaster concentrations were not significantly different according to the health status (healthy and infected).

The longhorn beetle Monochamus galloprovincialis (Oliver, 1795)) is a secondary wood-boring pest of pine trees. It is also an important vector of the pine wood nematode (Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer, 1934)), a quarantine organism that has caused large damage to pine forests in Asia and Portugal. Therefore, it is desirable to monitore the vector and its associated organisms. The aim of this work was to gain insight into the nematodes transmitted by Monochamus galloprovincialis and to evaluate their biological interactions based on literary sources. The trapping of the longhorn beetle was counducted at ten locations in the Czech Republic by teflon coated pheromone traps in 2015, 2016 and 2017. The extraction of nematodes was done by macerating the captured beetles in distilled water. Determination of nematodes was done on the basic of morphological and molecular features. In total, 1704 individuals of Monochamus galloprovincialis were analyzed, 12,6 % of them carried nematodes. Following taxa of nematodes were found: Aphelenchoides sp., Aphelenchoides stammeri, Bursaphelenchus mucronatus, Contortylenchus sp., Deladenus sp., Diplogasteroides sp., Ektaphelenchoides sp., Parasitaphelenchus sp., Parasitorhabditis sp., and larvae of the order Tylenchida.

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia e Gestão Ambiental). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
O nemátode da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi descoberto pela primeira vez em Portugal em 1999, desde então vários estudos têm sido efectuados com intuito de melhorar o conhecimento da sua interacção com o hospedeiro e o seu vector, Monochamus galloprovincialis, em Portugal. É a coexistência de árvores hospedeiras, por norma associadas a coníferas, do género Pinus, do nemátode e do insecto vector, que dita a existência da doença, uma vez que para se fazer transportar de árvore para árvore o nemátode necessita de um vector. Para além destas interacções biológicas é fundamental conhecer as condições abióticas que estão associadas ao estabelecimento do nemátode da madeira do pinheiro, como é o caso da temperatura e disponibilidade hídrica, a fim de prever a existência de árvores afectadas, de modo a optimizar a gestão dos pinhais e da própria doença, através dos meios de combate adequados. Para tal é fundamental estudar a resposta fisiológica das diferentes espécies de pinheiro para tentar prever precocemente a existência de sintomas. O presente trabalho tem como principal objectivo avaliar os factores ambientais que influenciam o estabelecimento e potencial infeccioso do nemátode da madeira do pinheiro, em três espécies de Pinus (Pinus pinaster, Pinus pinea e Pinus radiata). Pretende-se com o mesmo estudar in loco as condições ambientais que interferem na infecção de Pinus pinaster e a vitalidade dos pinhais infectados. Pretende-se ainda testar diferentes temperaturas e diferentes condições hídricas no potencial infeccioso do nemátode nas três espécies de pinheiro seleccionadas. Os resultados sugerem maior vitalidade em pinhais sujeitos a maior gestão de matos e corte de árvores com sintomas de nemátode. Sugerem também que P. pinaster e P. radiata são espécies susceptíveis à infecção de B. xylophilus, em oposição a P. pinea, que é uma espécie resistente. Verificou-se o papel da temperatura e disponibilidade de água no desenvolvimento da doença, nas espécies susceptíveis. Estes resultados alertam para o alastramento da doença a outras espécies que actualmente não são infectadas e para o alargamento da área infectada, de acordo com as previsões de alterações climáticas, de aumento de temperatura e de períodos de seca prolongado.
The pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was first reported in Portugal in 1999, since then several studies have been conducted with the aim of improving knowledge of its interaction with the host and its vector, Monochamus galloprovincialis, in Portugal. It is the coexistence of host trees, normally associated with conifers, the genus Pinus, the nematode and insect vector, which dictates the presence of the disease, once to move to the tree to the tree requires a nematode vector. In addition to these biological interactions it is important to know the abiotic conditions that are associated with establishment of the pine wood nematode, such as temperature and water availability to provide the existence of affected trees in order to optimize the management of pine forests and the disease by appropriate means. For this is essential to study the physiological response of different pine species to predict the existence of early symptoms. The main objective of this work is to assess the environmental factors that influence the establishment and infection potential of the pine wood nematode in three Pinus species (Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus radiata). It is intend to study in situ environmental conditions that interfere with infection of Pinus pinaster and vitality of infected pine. Another objective it is to test different temperatures and different water conditions in infection potential of the nematode in the three pine species selected. The results suggest a greater vitality in pine forests subject to greater management of woods and cut trees with symptoms of nematode. It also suggests that P. pinaster and P. radiata are susceptible species to infection by B. xylophilus, as opposed to P. pinea, which is a resistant species. It was found the role of temperature and water availability in the development of the disease in susceptible species. These results emphasize the spread of disease to other species that are not currently infected and the enlargement of the infected area, according to the predictions of climate change, temperature rise and prolonged periods of drought.

RESUMO O nemátode–da-madeira-do-pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é um fitoparasita, com elevado potencial destrutivo de coníferas, a nível mundial, sendo considerado organismo de quarentena. É originário da América do Norte. Foi detetado em Portugal, e pela primeira vez na Europa, em 1999, na Península de Setúbal. As entidades oficiais desenvolveram de imediato medidas de erradicação e controlo do nemátode. Foram impostas restrições ao transporte e comercialização da madeira e subprodutos, de Portugal para outros países. Pelas suas características biológicas, o NMP é um organismo de difícil controlo, sendo urgente encontrar um método que o detenha. O objetivo deste trabalho foi estudar o potencial nematodicida de extratos de urtiga-maior e urtiga-menor em relação ao NMP. Foram realizadas experiências in vitro, testando extratos frescos e frescos que foram armazenados, de urtiga. Foram feitas cinco repetições para cada extrato e para a testemunha. O efeito dos extratos sobre o nemátode foi observado às 12, 24, 48, 27, 96 e 168 horas após o início da experiência. Com base nos resultados obtidos, os extratos frescos têm um efeito nematostático superior aos extratos frescos armazenados. O extrato de Urtica urens é o que tem efeito nematostático mais rápido e duradouro, podendo ser bastante vantajoso. Palavras chave: Bursaphelenchus xylophilus, extratos frescos armazenados, extratos frescos, nemátode-da- madeira-do-pinheiro, urtiga-maior (Urtica dioica), urtiga-menor (Urtica urens). ABSTRACT The pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is a phytoparasite with a great destructive potential of conifers, worldwide, considered a quarantine organism. It originates from North America. Was detected in Portugal, and for the first time in Europe in 1999, in the Setúbal Peninsula. The officials immediately developed measures to eradication and control the nematode. Restrictions were imposed on the transport and marketing of wood and byproducts, from Portugal to other countries. By their biological characteristics, the NMP is an organism difficult to control, so it`s urgent to find a method that holds. The aim of this work was to test the nematicidal potential extracts greater nettle (Urtica dioica) and lower nettle (Urtica urens) for PWN. Tests were conducted in vitro, in extracts that were tested fresh and fresh stored extracts. Five replications were used for each extract and witness. The effect of the extracts on nematode was observed at 12, 24, 48, 72, 96 and 168 hours of exposure. Based on the results, the fresh nettle extracts have an effect nematostatic than the fresh stored extracts. The extract of Urtica urens is what has nematostatic effect more rapid and enduring and may be advantageous. Keywords: Bursaphelenchus xylophilus, fermented extracts, fresh extracts, greater nettle (Urtica dioica), lower nettle (Urtica urens), pine wood nematode

Tese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
A bioinformática é uma área mutidisciplinar que envolve a aplicação de técnicas computacionais para analisar informação biológica em larga escala. Este conjunto de ferramentas e técnicas computacionais foi desenvolvido para dar suporte à análise da crescente quantidade de dados gerados neste domínio, e em particular por técnicas de next-generation sequencing. Uma das áreas da biologia largamente dependente das ferramentas bioinformáticas é a análise do perfil do transcriptoma. Atualmente, a técnica de RNA-sequencing tem sido a abordagem predominante em estudos transcriptómicos de dados de sequenciação. Esta técnica tem sido bastante usada em estudos de resistência, especialmente em espécies florestais ameaçadas. A Floresta é um recurso natural essencial em termos globais, não apenas pela sua importância a nível ecológico, mas também a nível económico e paisagístico. Ela representa um suporte de Vida na Terra, fornecendo inúmeros benefícios fundamentais para o equilibrio de diversos ecossistemas. No entanto, recentemente tem vindo a verificar-se um preocupante declínio de várias espécies florestais, sendo o Pinheiro Bravo (Pinus pinaster Ait.) uma das mais afectadas. Este declínio tem causado um impacto negativo no equilibrio dos ecossistemas e na manutenção da biodiversidade. Um dos organismos com maior potencial destrutivo para a área florestal de Pinheiro Bravo é o nemátodo da madeira do pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus), um verme microscópico responsável pela doença da murchidão do pinheiro. Numa tentativa de reduzir as perdas resultantes da doença, surgiram vários estudos de resistência do hospedeiro para a identificação de árvores com menor susceptibilidade à infecção. No entanto, parte desses estudos apresenta uma abordagem mais tradicional, sem recurso às novas tecnologias de sequenciação. Nesse sentido, o presente trabalho, baseado no estudo de dados de RNAsequencing produzidos pela plataforma de sequenciação Ion Proton, tem como principal objectivo a caracterização da resposta do Pinheiro Bravo à infecção com o nemátodo da madeira do pinheiro entre três diferentes estágios após inoculação. Para isso, foram identificados genes diferencialmente expressos, vias metabólicas e marcadores moleculares potencialmente associados à resistência à doença. Um total de 355,287 unigenes foram obtidos a partir de um conjunto de 176,282,168 reads sequenciadas para todas as bibliotecas, pela técnica de de novo assembly. A baixa percentagem de genes predictos (23.5%) a partir do conjunto de unigenes assemblados e o elevado número de genes sem anotação ou com anotação desconhecida, evidenciam as limitações existentes num estudo de RNA-Seq em espécies não-modelo, sem o genoma sequenciado, como é o caso do Pinheiro Bravo. Apesar disso, foram obtidos 17,533 genes diferencialmente expressos entre todas as comparações. No seguimento desta análise, há a evidência de duas fases de resposta à infecção. Em primeiro lugar, é desencadeada uma resposta imediata, logo após a infecção. Posteriormente, uma segunda fase de resposta parece acontecer aos 7 dias após a infecção. Foi ainda identificado um conjunto de genes candidatos envolvidos na resistência à doença nos vários estágios em estudo. Desse conjunto, é possível identificar genes envolvidos no metabolismo secundário, stress oxidativo e defesa contra infeção de agentes patogénicos. Este estudo representa uma nova abordagem ao nivel dos mecanismos moleculares e vias metabólicas envolvidas na defesa contra a infeção do nemátodo da madeira do pinheiro. Podendo assim ser um recurso útil para estudos ulteriores e também para programas de melhoramento com vista à seleção de plantas com menos susceptibilidade à doença.
Bioinformatics is a multidisciplinary field that involves the application of computational tools to analyze biological information on a large-scale. This set of computational techniques were developed to support the analysis of the increasing amount of data generated in this area, and in particular by next-generation sequencing (NGS). One of the main fields of biology that is largely dependent on bioinformatics tools is the transcriptome profile analysis. Currently, RNA-Sequencing (RNA-Seq) is the dominant transcriptomics approach for NGS data. RNA-Seq has been highly used in disease pathogenesis studies, especially in endangered forest species. Forests are essential resources on a global scale, not only for the ecological benefits, but also for economical and landscape purposes. They represent one of the Life support systems on Earth, providing essential resources for a range of ecosystems. However, in recent years there has been a worrying decline of a large number of forest species around the world, with maritime pine (Pinus pinaster Ait.) being one of the most affected. This alarming decay is caused by abiotic and biotic factors. Within this last group of factors we must highlight the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus as one of the main responsible. PWN is a microscopic organism reported for the first time in Portugal in 1999, being the causal agent of pine wilt disease (PWD). In an attempt to reduce losses arising by PWD, the study of maritime pine resistance is one of the research programs that recently started in Portugal, aiming to improve their resistance and select trees with lower susceptibility to infection. However, just a few of these studies were based on next generation sequencing data. Taking this into account, this study is an approach to pine wilt disease, using RNA-Sequencing data produced by Ion Proton platform. The aims of this study was to analyze RNA-Seq data to characterize the maritime pine transcriptome in the response to infection with Bursaphelenchus xylophilus, over three different time stages after inoculation of the PWN, by determining the differentially expressed genes, regulatory networks and pathways, with the purpose of identifying potential genes involved in resistance against PWD. A total of 355,287 unigenes were obtained by de novo assembly from the 176,282,168 sequenced reads for all libraries. Moreover, we obtained 17,533 differentially expressed genes (up and down regulated) between all comparatives. The low rate of predicted genes (23.5%) from the set of assembled contigs and the high number of genes without annotation or with "Unknown" annotation, evidences the existing limitations when working in RNA-Seq studies with non-model species like Pinus pinaster. Despite this, further analysis suggest an early response that may occur immediately after inoculation and a late response that may occur 7 days after inoculation. A set of candidate genes involved in resistance against PWN infection were identified over different time points. These genes were related to secondary metabolism, oxidative stress and defense against pathogen infection. Our results provide new insights about the molecular mechanism and metabolic pathways involved in resistance of Pinus pinaster against PWN infection. It may be a useful resource in future studies and for future breeding programs to select plants with lower susceptibility to PWD.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e Medicinais
Diversas espécies de nemátodes fitoparasitas são conhecidas pelos efeitos prejudiciais causados em inúmeras culturas com importância económica, a nível mundial. Os nemátodes-das-galhas-radiculares (NGR), Meloidogyne spp., estão entre os nemátodes parasitas das plantas com maior impacte económico, especialmente nas regiões tropicais e sub-tropicais. O nemátode da madeira do pinheiro Bursaphelenchus xylophilus (NMP), é por outro lado, um dos agentes patogénicos das florestas de coníferas mais importantes. É amplamente conhecido o seu efeito, a doença da murchidão dos pinheiros (“pine wilt disease”), na Ásia e mais recentemente na Europa, desde a sua detecção em Portugal, em 1999. O controlo destes nemátodes tem assentado principalmente na aplicação de químicos sintéticos. No entanto, devido aos seus efeitos altamente nocivos para o ambiente, a sua comercialização tem vindo a ser proibida. Deste modo o interesse pela utilização de produtos naturais no controlo de pragas, nomeadamente por nemátodes, tem aumentado nos últimos anos. Têm sido numerosas as plantas aromáticas e medicinais (PAM) alvo de estudo no sentido de se conhecerem as suas propriedades tóxicas contra diversos organismos. O presente trabalho incidiu essencialmente na avaliação dos efeitos nematotóxicos de três espécies de Hypericum, H. androsaemum, H. perforatum e H. undulatum sobre M. javanica e B. xylophilus. Os objectivos desta investigação consistiram em avaliar: 1) os efeitos dos extractos liofilizados das espécies de Hypericum sobre a eclosão e mortalidade de jovens de segundo estádio (J2) de M. javanica, e sobre a mortalidade de jovens e adultos de B. xylophilus; 2) o efeito de dois compostos isolados comercializados, de Hypericum (n-nonano e β-pineno), sobre a eclosão e a mortalidade J2 de M. javanica; 3) os efeitos da aplicação directa no solo, de infusão e de folhas secas das três espécies de Hypericum, sobre a penetração de J2 de M. javanica em tomateiros mantidos em vaso. Apenas o extracto de H. androsaemum, respectivamente nas concentrações 10 mg/ml e 20 mg/ml, teve um efeito inibidor na eclosão e efeito na mortalidade de J2 de M. javanica. Considerando ainda a mortalidade, B.xylophilus, mostrou-se mais resistente do que M. javanica no ensaio realizado, não tendo sido encontradas diferenças significativas com os extractos utilizados. A aplicação dos compostos n-nonano e β-pineno, não foram obtidos resultados significativos sobre a acção na mortalidade de J2 de M. javanica. Relativamente ao efeito da aplicação directa da infusão das três espécies de Hypericum na penetração de J2 de M. javanica em tomateiro, as espécies H. androsaemum e H. perforatum, respectivamente na concentração de 10 mg/ml teve um efeito inibidor. Nos ensaios da aplicação de folhas secas de H. androsaemum sobre o solo de tomateiro infectado, apenas foram obtidas diferenças significativas no ensaio com H. perforatum. De acordo com os resultados obtidos, o H. androsaemum poderá, de algum modo, constituir uma alternativa promissora à utilização de nematodicidas químicos, como fonte de compostos com propriedades nematodicidas, seguros para o homem e para o ambiente.
Diverse plant-parasitic nematodes are known wildworld by their damaging impact on agriculture. Root-knot nematodes, Meloidogyne spp., are widespread and among the more economically important phytonematodes, causing significant reduction on many cultures, specialy in tropical and subtropical regions. The pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus is, on the other hand, one of the most important pathogens in conifer forests. His effect, the pine wilt disease, is well known in Asia and recently on Europe, after his detection in 1999 in Portugal. The control of plant parasitic nematodes is greatly based on synthetic chemical nematicides. However, due to their harmful effects on humans and the environment, many of these chemicals have been withdrawn from the market. By this way the interest for natural products as alternative to control pests, namely nematodes, has increased in the last years. Several medicinal and aromatic plants have been studied in order to fully understand their toxic properties against a number of organisms, including nematodes. The present work focused mainly on the evaluation of the nematotoxic effects of three species of Hypericum, H. androsaemum, H. perforatum and H. undulatum against M. javanica and B. xylophilus. The aim of the present study was to evaluate: 1) the effects of Hypericum spp. water extracts over the hatching and mortality of second stage juveniles (J2) of M. javanica and over mortality of juveniles and adults of B. xylophilus; 2) the effect of two commercialized Hypericum spp. isolated compounds (nnonane and β-pinene) over the hatching and mortality of M. javanica J2; 3) the effects on root penetration of M. javanica J2, by direct application of the infusion and of dried leaves of the three species of Hypericum, on the soil of tomato plants in pots. Only the H. androsaemum extracts, (10 mg/ml e 20 mg/ml) showed an inhibitory effect on the hatching, and increased mortality of J2 of M. javanica. Considering the mortality, B. xylophilus seemed more resistant than M. javanica, however without significant differences among the used extracts. Concerning the application of n-nonane and β-pinene, no significant differences were found on the M. javanica J2 mortality. The H. androsaemum and H. perforatum infusions (10 mg/ml) showed an inhibitory effect on penetration of the M. javanica J2 on tomato roots, when applied directly. By other hand, a significant effect of the direct application of dried leaves on penetration was only found with H. perforatum. Accordingly to the results obtained in this study H. androsaemum can be, in some way, a promising and safe alternative, for humans and the environment, to the use of chemical nematicides.

Tese de mestrado, Geografia - Sistemas de Informação Geográfica e modelação territorial aplicados ao ordenamento, Universidade de Lisboa, Instituto de Geografia e Ordenamento do Território, 2012
O Bursaphelenchus xylophilus, mais conhecido por Nemátodo da Madeira do Pinheiro (NMP), foi introduzido em Portugal Continental no ano de 1999. Esta espécie, nativa dos Estados Unidos da América, chegou a Portugal através de madeira infetada proveniente dos países asiáticos, nomeadamente do Japão, país onde o nemátodo tem causado grandes prejuízos a nível económico e ambiental. A distribuição deste verme microscópico em Portugal Continental é feita através do vetor Monochamus galloprovincialis, sendo o hospedeiro a espécie Pinus pinaster com uma grande área de ocupação em Portugal. Com o intuito de calcular a adequabilidade de presença do NMP em Portugal Continental foram integradas, em Sistemas de Informação Geográfica (SIG), diversas variáveis espaciais consideradas representativas de fatores que infuenciam a adequabilidade ao NMP, assim como a sua dispersão: temperatura (máxima média do trimestre mais quente e mínima média do trimestre mais frio), densidade de áreas florestais de coníferas, precipitação anual média e distância às estradas. Com base nestas variáveis espaciais, foram produzidos diversos modelos - de adequabilidade climática e bioclimática, de expansão, correlativo e gravítico (neste, com a utilização adicional da atividade madeireira por concelho) - baseados em dados de áreas afetadas e de dados de presença. Os resultados dos vários modelos permitiram obter diferentes níveis de adequabilidade à presença do NMP e determinar as áreas mais suscetíveis à sua ocorrência futura. Constata-se que o território de Portugal Continental é, em geral, propício ao desenvolvimento e expansão do NMP; no entanto, o padrão da sua evolução temporal e espacial só pode ser compreendido através da integração da atividade humana, como fator difusor desta espécie invasiva.
Abstract: The Bursaphelenchus xylophilus, commonly known as Pine wood nematode (PWN), has reached Portugal in 1999. This specie, native to the United States, arrived in Portugal through infected wood from Asian countries, including Japan, at country where the nematode has caused great economic and environmental damages. The distribution of this microscopic worm in Portugal is done through the vector Monochamus galloprovincialis, being the Pinus pinaster the host species, with a large distribuition in Portugal. In order to calculate the suitability for the presence of PWN in Portugal, several spatial variables considered representative of factors that infuence suitability to PWN, as well as its dispersion, were integrated in Geographic Information Systems (GIS): temperature (average maximum the quarter and warmer minimum quarterly average colder), density of conifer forests, average annual precipitation and distance to roads. Based on these spatial variables, several models were produced - the climate and bioclimatic suitability, expansion, correlative and gravity (in this, with the additional use of logging by municipality) - based on data from the affected areas and presence data. The results of the various models have enabled different levels of suitability to the presence of PWN and determine the most susceptible areas to PWN future occurrence. It is noted that the mainland Portugal is generally propitious to the development and expansion of PWN, however, the pattern of their temporal and spatial evolution can only be understood through the integration of human activity, as a diffuser factor of invasive species.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
Bursaphelencus xylophilus, também conhecido como Nematode da Madeira do Pinheiro (PWN), é o agente patogénico da Doença do Pinheiro que afeta pinheiros em todo o mundo. A infeção espalha-se globalmente através do comércio internacional e localmente através de insetos vetores, ameaçando a economia mundial da madeira. Devido às alterações climáticas, um número crescente de países fica ameaçado pela Doença da Murchidão do Pinheiro (PWD), sendo necessário conhecer melhor este agente patogénico para prevenir a disseminação da infeção e limitar as perdas económicas e ecológicas. As bactérias do género Serratia, presentes na comunidade endofítica do pinheiro e transportadas pelo PWN, podem desempenhar um papel importante na PWD.Este trabalho visa estudar como o nemátode Bursaphelencus xylophilus interage com estirpes bacterianas do género Serratia e avaliar o potencial nematicida de dois Serratomolides (Serrawettinas W1 and W2) produzidos por estirpes de Serratia.A presença dos genes codificantes de Serrawettinas foi investigada em estirpes selecionadas de Serratia. Foram realizados testes de mortalidade com bactérias, sobrenadantes e amino lípidos extraídos, de modo a determinar o seu potencial nematicida contra C. elegans (nemátode modelo) e B. xylophilus. Foram realizados testes de atração com C. elegans. Foram realizadas análises bioinformáticas para compreender os processos de biossíntese das Serrawettinas e para esclarecer as interações proteína-ligando entre estes Serratomolides e a proteína recetora TOL1 de C. elegans.Os sobrenadantes concentrados das estirpes de Serratia contendo Serrawettinas foram capazes de matar mais de 77% de B. xylophilus após 72 h. Oito amino lípidos específicos demonstraram uma elevada atividade nematicida contra B. xylophilus. A análise dos clusters dos genes codificantes de Serrawettinas W1 e W2 revelou a presença de várias proteínas envolvidas no processo de biossíntese destes Serratomolides.O trabalho permitiu concluir que várias estirpes de Serratia, os seus sobrenadantes e amino lípidos específicos foram capazes de demonstrar atividade nematicida contra B. xylophilus. O processo de biossíntese destes Serratomolides e as interações proteína-ligando entre estes e TOL1 merecem um estudo mais aprofundado.
Bursaphelencus xylophilus, also known as Pine Wood Nematode (PWN), is the pathogenic agent of Pine Wilt Disease that affects pine trees around the world. Infection is spreading globally through wood international commerce and locally by vector beetles, threatening wood world economy. As climate changes, more countries are becoming susceptible to Pine Wilt Disease (PWD) and, to prevent disease spread and limit economic and ecological losses, better knowledge about this pathogenic agent is needed. Serratia strains, present in endophytic community of pine trees and carried by PWN, may play an important role in PWD. This work aims to better understand interaction between Serratia strains and Bursaphelencus xylophilus and to assess nematicidal potential of Serratomolides (Serrawettin W1 and W2) produced by Serratia strains. Serrawettin genes presence was evaluated in selected Serratia strains. Mortality tests were performed with bacteria, supernatants and extracted amino lipids against C. elegans (model organism) and B. xylophilus to determine their nematicidal potential. Attraction tests were performed with C. elegans. Bioinformatic analysis were performed in order to better understand biosynthesis processes and to elucidate protein-ligand interactions between Serratomolides and C. elegans TOL1 receptor protein.Concentrated supernatants of Serratia strains with Serrawettins were able to kill more than 77% of B. xylophilus after 72 h. Eight specific amino lipids showed a high nematicidal activity against B. xylophilus. Cluster analysis of Serrawettin W1 and W2 biosynthesis gene revealed several new proteins involved in Serratomolides biosynthesis process.We conclude that some Serratia strains, their supernatants and specific amino lipids show nematicidal activity against B. xylophilus. Serratomolides biosynthesis process and protein-ligand interactions between TOL1 and Serratomolides deserve to be entirely studied.

Durante algum tempo pensou-se que o Bursaphelenchus xylophilus era o único agente etiológico da doença do nemátode da madeira do pinheiro. Recentemente, descobriu-se que existem bactérias associadas ao nemátode que contribuem para a patogénese desta doença, sobretudo através da libertação de toxinas que promovem a morte dos pinheiros. De entre as espécies mais comummente encontradas estão bactérias pertencentes aos géneros Bacillus, Pantoea, Pseudomonas e Xanthomonas. Este trabalho teve como principal objectivo o estudo do efeito da inoculação de pinheiro bravo (Pinus pinaster) com quatro isolados diferentes de nemátodes, na população bacteriana dos nemátodes e das árvores, em diferentes fases da progressão da doença. A monitorização da progressão dos sintomas da doença foi igualmente registada. Pretendeu-se também identificar as bactérias isoladas do xilema das árvores e da superfície dos nemátodes através de métodos de identificação clássicos, do sistema de identificação API20E e da sequenciação de ADN bacteriano. Os resultados obtidos demonstraram que, relativamente à progressão dos sintomas da doença, a diferença mais marcante foi verificada para os pinheiros inoculados com o isolado não virulento C14-5, onde se visualizou um agravamento de sintomas mais lento e menos severo do que nos pinheiros inoculados com os isolados virulentos. Verificou-se que numa fase inicial da doença, no geral, a população bacteriana dos ramos inoculados foi menor do que a que foi verificada passados 7 e passados 14 dias de inoculação. Num dos métodos de quantificação foi recuperado um maior número de bactérias nos pinheiros inoculados do que nos controlos aos 7º e ao 14º dias de inoculação. Os isolados que levaram à obtenção de maior quantidade bacteriana foram o HF e o 20, sendo que, comparativamente, o isolado não virulento levou à obtenção de menor quantidade bacteriana. Relativamente à identificação bacteriana, concluiu-se que o sistema API20E não foi suficiente na identificação das espécies bacterianas isoladas, mostrando-se pouco discriminatório, tendo sido identificada a espécie Enterobacter cloacae em 79% dos isolados e não sendo possível a identificação de sete colónias bacterianas. Assim, a adopção de métodos moleculares de identificação, através da sequenciação do ADN bacteriano, permitiu uma identificação mais fiável, tendo sido identificadas onze espécies bacterianas diferentes dentro dos géneros Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, Paenibacillus, Terribacillus, Citrobacter, Pantoea e Escherichia. No geral, a diversidade bacteriana aumentou ao longo da progressão da doença. A espécie Bacillus spp. predominou na fase mais precoce da doença e a espécie Klebsiella oxytoca nas fases mais tardias. As espécies bacterianas isoladas da superfície dos nemátodes não diferiram muito das isoladas do xilema dos pinheiros. Neste trabalho foram identificadas espécies bacterianas nunca antes reportadas neste tipo de estudo, podendo estas estar associadas a Portugal. A espécie de pinheiro utilizada neste estudo foi diferente das que são usualmente utilizadas no Japão e na China. Foi a primeira vez que foram isoladas e identificadas bactérias de um isolado não virulento do nemátode da madeira do pinheiro.
For a long time it was thought that Bursaphelenchus xylophilus was the only agent of the pine wilt disease. Recently, it was discovered that there are bacteria associated with the nematodes that contribute to the pathogenesis of this disease, mainly through the release of toxins that promote the death of the pines. Among the species most commonly found, are bacteria belonging to the Bacillus, Pantoea, Pseudomonas and Xanthomonas genera. The main objective of this work was to study the effect of inoculation of maritime pine (Pinus pinaster) with four different nematode isolates, in the bacterial population of nematodes and trees, at different stages of disease progression. The monitoring of progression of disease symptoms was also recorded. Also, the identification of bacteria isolated from the xylem of trees and the surface of nematodes was performed by classical identification methods, by identification system API20E and by sequencing of bacterial DNA. The results showed that for the symptoms progression, the most striking difference was observed for the pines inoculated with the avirulent isolate, C14-5, which led to a slower and less severe aggravation of symptoms than in pines inoculated with the virulent isolates. It was found that at an earlier stage of the disease, in general, bacterial population of inoculated twigs was lower than what was observed 7 and 14 days after inoculation. In one of the quantification methods more bacteria were recovered from the inoculated pines than from the control pines on the 7th and 14th days after inoculation. A bigger bacterial quantity was isolated from pines inoculated with the nematode isolates HF and 20, and, comparatively, few bacteria were isolated from pines inoculated with the avirulent isolate. The identification system API20E proved to be insufficient and poorly discriminatory in the identification of bacterial species; Enterobacter cloacae species was identified in 79% of the isolated bacterial colonies and seven of these colonies couldn’t be identified by this method. Thus, the adoption of identification molecular methods, through bacterial DNA sequencing, allowed a more reliable identification: eleven different bacterial species within the Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Paenibacillus, Pantoea and Terribacillus genera were identified. General bacterial diversity increased with the progression of the disease. Bacillus spp. species were predominant at the earlier stage of disease progression and Klebsiella oxytoca species at the later stages. Bacterial species isolated from the surface of nematodes were similar to those isolated from the xylem of pines. In the present work new bacterial species were identified which have never been reported before in this type of study and may be associated with Portugal. P. pinaster, the pine species used in this study, was different from those commonly grown in Japan and China. Furthermore, it was the first time that bacteria were isolated and identified from an avirulent pine wood nematode isolate.

Tese de Doutoramento em Ciências Agronómicas e Florestais
O nemátode da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é uma das mais sérias ameaças à floresta de pinheiros a nível mundial. Em Portugal, o nemátode afecta o pinheiro bravo (Pinus pinaster Ait.), uma espécie de coníferas de grande valor económico. Os nemátodes migram através dos canais de resina e alimentam-se de células do parênquima, induzindo rápidas alterações metabólicas nas células do parênquima, áreas de cavitação, desnaturação e necrose do parênquima e células cambiais. O objectivo deste trabalho foi avaliar o impacto das alterações bioquímicas, do stress hídrico na madeira e da perda de produção de resina devidos ao ataque do nematode nas propriedades químicas e físicas da madeira de P. pinaster, nomeadamente, a densidade básica da madeira, a composição química elementar, o teor de extractivos, as propriedades de sorção, o poder calorífico superior (PCS), e a inflamabilidade. Este estudo interdisciplinar salienta os aspectos tecnológicos e económicos relacionados com a aptidão da madeira infectada para uso nas indústrias de processamento de madeira e de produção de bioenergia. Foram estudadas amostras de madeira de P. pinaster infectada com nemátode e não infectada. Árvores sintomáticas (escurecimento/vermelhidão das agulhas) e sem sintomas foram amostradas num povoamento de pinheiro bravo na região centro de Portugal. Foram recolhidas as amostras de seções transversais do tronco (1,5 m, 6 m da base, topo) e de ramos. Para todas as amostras foi realizado o teste de identificação e contagem de nemátodes. Os valores do PCS foram determinados de acordo com a norma CEN/TS-14918 usando o calorímetro de bomba Parr-6300 automático e o calorímetro de bomba Leco- AC600 semiautomático. Na análise da composição química, foram determinados os teores de carbono, hidrogénio, azoto, enxofre e cinzas por meio da combustão instantânea com a oxidação completa. A densidade básica foi calculada com base no peso seco e no volume saturado, sendo o último medido pelo método de imersão. A análise do conteúdo de extractivos foi efectuada recorrendo a um aparelho de extracção de Soxhlet e com base nas normas Tappi 204cm-07 e Tappi 207cm-08, tendo sido utilizados dois reagentes orgânicos (diclorometano e etanol) e um não-orgânico (água destilada). Os testes para determinar a variação de humidade e o teor de humidade de equilíbrio foram realizados na câmara climática Fitoclima-300 EDTU. Os testes de inflamabilidade foram realizados num calorímetro de cone com um fluxo constante de calor de 16 kW/m2. A análise estatística dos dados foi realizada com o software STATISTICA StatSoft Inc. Foram encontradas as seguintes diferenças entre a madeira de P. pinaster infectada e não infectada para os parâmetros estudados. •Verificou-se a diferença estatisticamente significativa para o PCS e os teores de hidrogénio e de azoto, em que a madeira infectada apresenta, em média, menor poder calorífico, menor teor de azoto e maior de hidrogénio. Os teores de carbono, oxigénio, enxofre e cinzas não se diferenciaram significativamente. O valor médio do PCS da madeira infectada (19,79 MJ/kg) posiciona-se entre o PCS de madeira de folhosas (18,6-19,8 MJ/kg) e o PCS de madeira de resinosas (20,0-22,5 MJ/kg). •Verificou-se a diminuição de 2% da densidade básica da madeira, e a diminuição de 8,90% a 5,98% para o teor total de extractivos. Nas árvores infectadas, os extractivos têm distribuição inversa ao longo do tronco comparativamente com as árvores não infectados. •Diferentes valores de humidade de equilíbrio foram obtidos para certas condições ambientais (algumas das diferenças foram estatisticamente significativas). As isotermas de adsorção para a madeira infectada e não infectada têm posicionamento similar. •Verificaram-se diferenças estatisticamente significativas para o tempo de ignição e o tempo em chama, e ligeiras diferenças nos valores de perda de massa. Para todos estes parâmetros, os valores obtidos para a madeira não infectada foram inferiores aos da madeira infectada. •Para a taxa de perda de massa, verificaram-se os valores mais baixos para a madeira infectada para as amostras recolhidas das secções do tronco a 6 e 1,5 m. Já para as secções do topo dos troncos não foram observadas diferenças significativas. •A madeira infectada tem menor taxa de liberação de calor e menor energia total libertada (diminuição estatisticamente significativa) do que a madeira não infectada. Os valores do teor total dos extractivos foram correlacionados (com significância estatística) com os do tempo de ignição, do tempo em chama e da perda de massa. Por fim, foram analisados os impactos socio-económico e ambiental do nemátode no contexto de Portugal. Foram apresentados os principais aspectos e parâmetros a incluir na modelação do impacto total do nemátode, e proposta uma nova abordagem para o controlo da doença da murchidão do pinheiro baseada na estrutura de mosaico florestal com o apoio das actividades económicas relacionadas. Apesar das diferenças verificadas para os parâmetros estudados, a conclusão geral é que o nematode do pinheiro bravo tem um pequeno impacto sobre as características estudadas de madeira. No entanto, existem algumas questões relacionadas com o uso industrial da madeira de P. pinaster infectada (produção de bioenergia, produção de papel e de pasta de papel, ciclo de vida de paletes) que necessitam de estudos adicionais.
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is considered one of the most serious threats to pine forest worldwide. In Portugal, this nematode affects maritime pine (Pinus pinaster Ait.): a coniferous species of a great economic value. The nematodes migrating through resin canals and feeding on parenchyma cells, induce rapid metabolic changes in ray parenchyma cells, cavitation areas, denaturation and necrosis of parenchyma and cambial cells. The objective of this research was to evaluate the impact of biochemical changes, water stress and loss of resin production due to nematode attack on the chemical and physical properties of P. pinaster wood, specifically, on wood basic density, elementary chemical composition, content of extractives, sorption properties, gross calorific value (GCV), and flammability. This interdisciplinary study stresses technological and economic aspects related with suitability of infected P. pinaster wood for use in the wood-processing and energy industries. Samples of PWD infected and uninfected wood were studied. P. pinaster trees with PWD symptoms (browning/reddening of the needles) and without symptoms were sampled in a planted pine forest in the central region of Portugal. Cross sections of the trunk at 1.5 m, 6 m from the base, top and crown branches were collected. Nematode screening, identification and quantification were performed for all sampled trees. The GCVs were determined using Parr 6300 automatic isoperibol calorimeter and Leco AC600 Semi-Automatic Isoperibol Calorimeter according to the standard method CEN/TS 14918. Chemical composition analysis was performed by determining the contents of carbon, hydrogen, nitrogen, sulfur and ash on complete and instant oxidation of samples by “flash” combustion. Wood basic density was calculated on the basis of dry weight and green volume, the last one measured by water displacement or immersion method. The extractive content analysis was carried out with a Soxhlet extraction apparatus and based on the norm Tappi 204 cm-07 and Tappi 207 cm-08 norms. Two organic (dichloromethane and ethanol) and a non-organic (distilled water) reagents were used. The tests to determine the moisture content variation end equilibrium moisture content were carried out using a climatic chamber Fitoclima 300 EDTU. Flammability tests were performed in a cone calorimeter at a constant heat flux of 16 kW/m2. Statistical data analysis was performed with STATISTICA StatSoft Inc. software. The following differences for the studied parameters were found between infected and uninfected P. pinaster wood. •Statistically significant difference was found for the GCV and the contents of hydrogen and nitrogen, in which the infected wood has on average lower calorific value, lower nitrogen content and higher hydrogen content. The carbon, oxygen, sulfur and ash contents did not differ statistically. The mean GCV of infected wood (19.79 MJ/kg) varied between the GCV of hardwoods (18.6-19.8 MJ/kg) and the GCV of softwoods (20.0-22.5 MJ/kg). •The wood basic density decreases 2%, and the total extractives content decreases from 8.90% to 5.98%. Extractives in infected trees have inverse distribution along the trunk as compared with uninfected trees. •Differences (some of them statistically significant) in the equilibrium moisture content values, determined under varying environmental conditions, were found. The adsorption isotherms for infected and uninfected wood have similar positioning. •Statistically significant differences were found for time to ignition and time in flame, and slight differences were found for mass loss. For all these parameters, obtained values for uninfected wood were lower than those for infected wood. •Lower values of the mass loss rate were found for infected wood for trunk at 6 and 1.5 m. No differences were observed for top of the trunk. •Statistically significant decrease of the values of the total energy released was found for infected wood. Statistically significant correlation was found between the total extractive content and time to ignition, time in flame and mass loss. Finally, socio-economic and environmental impacts of the PWD in the context of Portugal were analyzed. Framework for modelling of the total PWD impact was presented and new approach for the PWD control, based on forest mosaic structure supported by economic activities, was discussed. Despite the differences verified for studied parameters, the overall conclusion is that PWN has a slight impact on studied characteristics of wood. However, there are some related issues of industrial use of PWN infected P. pinaster wood (bioenergy production, pulp and paper production, pallets life cycle) that need additional studies.

Tese de doutoramento em Bioquímica, especialidade de Microbiologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
Pine wilt disease (PWD), a major illness of several Pinus species, native to North-America, has spread into Asia and recently into Europe. The first report in Portugal was in 1999 but since 2008 has spread to the Center-North of the country. Bursaphelenchus xylophilus, the pinewood nematode (PWN), is considered the only causative agent of PWD. In recent years, it has been proposed that PWD is a complex disease induced by both PWN and the bacteria it carries. The present thesis aimed to assess the microbial community, within the host-plant and associated with the nematode upon nematode infection in PWD, in order to elucidate the community structure and to understand roles of several bacteria involved. The endophytic microbial community structure was studied from infected and non-infected pine trees, Pinus pinaster, in Avô and Malhada areas, based on culture isolates and molecular profiling (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE). The endophytic strains were identified by 16S rRNA gene sequencing. The classes Acidobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Betaproteobacteria, Flavobacteria, Gammaproteobacteria and Sphingobacteriia were identified from the sampling areas. Gammaproteobacteria were the most abundant bacteria. DGGE profiles failed to produce a common pattern for PWD indicating that the microbial community was diverse and variable within diseased pine trees. DGGE detected the presence of endophytes belonging to six additional classes: Bacteroidia, Deinococci, Fusobacteria, Spirochaetes, Planctomycetaceae and Verrumicrobiae. Furthermore, Archaea were found as part of the endophytic community (DGGE), belonging to the phyla Euryarchaeota, Thaumarchaeota and Crenarchaeota. Finally, the presence of nifH, nifJ, nirS and nirK genes in the endophytic bacterial community supports the possibility of N2 fixation inside the trees, and also denitrification, with the production of the metabolic relevant intermediary NO. The presence of Bacteria and Archaea as part of the endophytic community in P. pinaster could potentiate the ability of pine trees to adapt to changes in the habitat. An endophytic bacterium was characterized by a polyphasic approach and described as new species Chitinophaga costaii A37T2T. The diversity of PWN-associated bacteria in Portugal and USA was assessed in this work. The results obtained were compared with information from databases, in order to detect specific bacterial species associated with the nematode, and to make suggestions on the role of these bacteria in PWD. In Portugal, the associated bacteria were studied in the previously mentioned two sampling areas and in the first area where PWN was identified in this country, Setúbal. All isolates, except one Gram-positive strain (Actinobacteria), belonged to the Gram-negative Beta- and Gammaproteobacteria. Most isolates belonged to the genus Pseudomonas, Burkholderia or to the family Enterobacteriaceae. The strains were able, depending on sampled areas, to produce siderophores (60-100%), proteases activity (0-30%), and lipases activity (10-100%). This suggests that the ability to produce siderophores or lipases by most isolates may enable these bacteria to play a role in plant physiological response to external factors. In the USA, bacteria carried by PWN mainly belonged to the class Gammaproteobacteria. The genera Chryseobacterium (class Flavobacteriia) and Pigmentiphaga (class Betaproteobacteria) were for the first time found associated with nematodes in the USA. The major bacterial population associated with the nematodes differed depending on the forest area/country and none of the isolated bacterial species was found in all different forest areas. Only strains from the genus Pseudomonas were found carried by nematodes from all countries. Moreover, the potential nematotoxic activity of bacteria carried by PWN was tested. Twenty-one strains showed capacity to produce extracellular products with nematicidal activity. The strain with the highest nematicidal activity, Serratia sp. A88copa13, produced proteases in the supernatant and a serine protease with 70 kDa was identified as the major factor responsible for the toxicity against PWN and other Bursaphelenchus species. The genome of two bacterial strains, Serratia sp. M24T3 and Pseudomonas sp. M47T1, with nematotoxic activity was sequenced, in order to identify genes potential involved in toxicity towards PWN. The genome sequence of both strains featured genes that might be involved in nematotoxicity. In addition, potentially plant-growth promoting bacterial genes were also found in both genome sequences. The colonization process in Arabidopsis thaliana by Serratia sp. M24T3, labeled with gfp and gusA reporter genes, was evaluated and the identification genes potentially involved in plant growth promotion was investigated. Strain M24T3 showed potential to be a plant growth-promoting bacterium, since it produced siderophores, solubilized phosphate and zinc oxide and because it has a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene, it most probably lowers plant ethylene levels. Findings with A. thaliana demonstrated Serratia sp. M24T3 to be able to colonize other plants beyond pine trees. In conclusion, the results presented in this thesis provided a broad overview and comprehensive insight of the microbial diversity and functionality related to PWD.
A doença da murchidão do pinheiro (DMP), uma das principais doenças de várias espécies de Pinus, nativa da América do Norte, espalhou-se para a Ásia e, recentemente, na Europa. O primeiro registo em Portugal foi em 1999, mas em 2008 alastrou para o Centro-Norte do país. Bursaphelenchus xylophilus, o nemátode da madeira do pinheiro (NMP), é considerado o único agente causador da DMP. Nos últimos anos, tem sido proposto que a DMP é uma doença complexa induzida por ambos, o NMP e as bactérias a ele associadas. A presente tese teve como objectivo avaliar a comunidade microbiana, dentro da planta hospedeira e associada ao nematode, após infecção pelos nemátodes na DMP, a fim de elucidar a estrutura da comunidade e compreender a função das várias bactérias envolvidas. A estrutura da comunidade microbiana endofítica foi estudada a partir de pinheiros infectados e não infectados, Pinus pinaster, nas áreas de Avô e Malhada, com base no cultivo de isolados e no perfil molecular (electroforese em gel de gradiente desnaturante - DGGE). As estirpes endofíticas isoladas foram identificadas por sequenciação do gene 16S rRNA. Estirpes das classes Acidobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Betaproteobacteria, Flavobacteria, Gammaproteobacteria e Sphingobacteriia foram identificadas nas áreas de amostragem. Gammaproteobacteria foi a classe que apresentou maior número de isolados. Os perfis de DGGE da comunidade microbiana não apresentaram um padrão comum em pinheiros com DMP, indicando que a comunidade era diversa e variável dentro destes. DGGE detectou a presença de endófitos pertencentes a seis classes adicionais: Bacteroidia, Deinococci, Fusobacteria, Spirochaetes, Planctomycetaceae e Verrumicrobiae. Além disso, foram encontradas Archaea como parte da comunidade endofítica (DGGE), pertencente aos filos Euryarchaeota, Thaumarchaeota e Crenarchaeota. Finalmente, a presença dos genes nifH, nifJ, nirS e nirK na comunidade endofítica bacteriana suporta a possibilidade de fixação de N2 no interior das plantas, e também de desnitrificação, com a produção de NO intermediário metabólico relevante. A presença de Bacteria e Archaea como parte da comunidade endofítica em P. pinaster poderá potenciar a capacidade de adaptação dos pinheiros às mudanças no habitat. Uma das bactérias endofíticas foi caracterizada por uma abordagem polifásica e descrita como nova espécie Chitinophaga costaii A37T2T. A diversidade de bactérias associadas ao NMP em Portugal e nos EUA foi avaliada neste trabalho. Os resultados obtidos foram comparados com a informação contida nas bases de dados, a fim de detectar as espécies bacterianas associadas ao nemátode, e sugerir o papel destas na DMP. Em Portugal, foram estudadas as bactérias associadas das duas áreas de amostragem mencionadas anteriormente e na primeira área onde NMP foi identificado neste país, Setúbal. Todos os isolados, excepto uma estirpe Gram-positiva (Actinobacteria), pertenciam a Gram-negativos Beta- e Gammaproteobacteria. A maioria dos isolados pertencia aos géneros Pseudomonas, Burkholderia ou à família Enterobacteriaceae. As estirpes foram capazes, dependendo das áreas amostradas, de produzir sideróforos (60-100 %), ter actividade proteolítica (0-30 %) e actividade lipídica (10-100 %). Isto sugere que a capacidade de produzir sideróforos ou lípases, observada na maioria dos isolados, pode permitir que estas bactérias desempenhem um papel na resposta fisiológica da planta a factores externos. Nos EUA, as bactérias transportadas pelo NMP pertenciam principalmente à classe Gammaproteobacteria. Os géneros Chryseobacterium (classe Flavobacteriia) e Pigmentiphaga (classe Betaproteobacteria) foram pela primeira vez encontrados associados com nemátodes nos EUA. A população bacteriana maioritária associada aos nemátodes diferiram dependendo da área florestal/país e nenhuma das espécies bacterianas isoladas foi encontrada em todas as áreas florestais diferentes. Somente estirpes do género Pseudomonas foram encontradas como transportadas pelos nemátodes de todos os países. Além disso, foi testado o potencial da actividade nematotóxica das bactérias transportadas pelo NMP. Vinte e uma estirpes mostraram capacidade para produzir produtos extracelulares com actividade nematicida. A estirpe com maior actividade nematicida, Serratia sp. A88copa13, produziu protéases no sobrenadante e uma protéase serínica com 70 kDa foi identificada como o principal factor responsável pela toxicidade contra o NMP e outras espécies de Bursaphelenchus. Os genomas das duas estirpes bacterianas, Serratia sp. M24T3 e Pseudomonas sp. M47T1, com actividade nematotóxica foram sequenciados, a fim de identificar potenciais genes envolvidos na toxicidade para NMP. A sequência do genoma de cada uma das estirpes apresentou genes que podem estar envolvidos na nematotoxicidade. Além disso, potenciais genes bacterianos de promoção de crescimento de plantas foram encontrados em ambas as sequências do genoma. O processo de colonização em Arabidopsis thaliana pela Serratia sp. M24T3, marcada com os genes repórteres gfp e gusA, foi avaliado e a identificação de genes potencialmente envolvidos na promoção do crescimento das plantas que coloniza foi investigada. A estirpe M24T3 mostrou potencial para ser uma bactéria promotora do crescimento da planta, uma vez que produziu sideróforos, solubilizou fosfato e óxido de zinco e porque tem um gene de desaminase de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, que muito provavelmente reduz os níveis de etileno das plantas. Os resultados obtidos com A. thaliana indicam que Serratia sp. M24T3 é capaz de colonizar outras plantas além pinheiros. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese proporcionaram uma visão ampla e abrangente da diversidade microbiana e funcionalidade relacionada à DMP.

Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) is considered an A2 quarantine pest in the European Union and the only recognized causative agent of the pine wilt disease (PWD), a disease affecting pine trees in Europe and Asia with far-reaching economic and environmental impacts. Tree to tree transmission of B. xylophilus depends on its insect-vector of the genus Monochamus (Cerambycidae: Coleoptera). Wilt toxins were found to be produced by nematode-associated bacteria leading to the hypothesis that bacteria might play an important role in the wilt mechanism. Similarly, the insect-vector and the host tree microbiome might be relevant for the disease mechanism. Therefore, the aim of this study is to clarify the role of bacteria in pine wilt disease through the characterization of the bacterial communities’ composition and function associated to the disease players: the nematode, the insect-vector and the tree. To do so, both culture-independent (denaturing gradient gel electrophoresis, massive parallel sequencing and clone libraries) and classic culture-dependent methods were used. Results demonstrated that the disease players (i.e. the nematode, the insectvector and the tree) each has a specific bacterial community, which is influenced by the environmental context. However, a core microbiome was identified, comprising shared bacterial groups mainly of the families Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae. When analysing insect-vectors from different species, the results demonstrated a species-specific microbiome. The bacterial community composition of the nematode in its propagative stage was similar to one from the insect vector, suggesting that it may, in part, be inherited from the insect. In agreement, the Pseudomonas community associated to the nematode and the insect-vector were similar and different from the one associated to the tree. Results showed that Pseudomonas might play a relevant role in disease progression. In silico analyses demonstrated the potential of bacteria associated with the nematode and the insect for xenobiotic degradation and also for tree weakening. It was also possible to establish a collection of endophytic bacterial isolates from trees belonging to three different pine species and to determine their traits regarding plant growth promotion, cell-wall degradation and oxidative stress tolerance. The results suggested the involvement of the pine endophytic community in tree susceptibility to B. xylophilus. The genome of four bacterial endophytic strains detected in the trees trunk were sequenced. From these, two Methylobacterium strains displayed genomic characteristics consistent with a positive interaction with the plant and gave a positive result in Arabidopsis thaliana root elongation assays, suggesting a potential to be used as biological control agents. Overall, this study demonstrated that the PWD results from a multitrophic interaction in which the microbiome associated to the disease is one of the players having a role in disease progression.
Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) é o agente causador da doença da murchidão do pinheiro (DMP) e considerado uma praga na União Europeia. A DMP é uma doença que afeta árvores de pinheiro na Europa e na Ásia, com grande impacto económico e ambiental. A transmissão do nemátode entre árvores é feita por um inseto vetor do género Monochamus (Cerambycidae: Coleoptera). A descoberta da produção de toxinas por parte de bactérias associadas ao nemátode levou a hipótese de que as bactérias podem ter um papel importante no desenvolvimento da DMP. Tal como para o nemátode, também as bactérias associadas ao inseto vetor e à árvore poderão ser relevantes para o desenvolvimento da DMP. Assim sendo, o objetivo do estudo será clarificar o papel das bactérias na DMP através da caracterização da composição e função das comunidades bacterianas associadas aos organismos envolvidos na doença: o nemátode, o inseto vetor e a árvore. Para tal, foram utilizados métodos independentes do cultivo (eletroforese em gel de gradiente desnaturante, sequenciação massiva paralela e construção de bibliotecas de genes) e métodos dependentes do cultivo. Os resultados permitiram identificar um microbioma central da doença ao qual pertencem os grupos bacterianos Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Foi também identificado um microbioma específico de cada espécie estudada (i.e. nemátode, inseto e pinheiro) e a sua estrutura variou com o local de onde os organismos foram obtidos. A comunidade bacteriana do nemátode na sua fase propagativa mostrou-se mais semelhante à do inseto vetor do que à da árvore, o que sugere que o microbioma do nemátode poderá ser em parte herdado do inseto. A análise da diversidade de Pseudomonas associada aos três organismos corroborou a semelhança entre o microbioma do nemátode e do inseto. Os resultados obtidos mostraram que Pseudomonas poderá ser um grupo bacteriano importante no desenvolvimento da doença. Análises in silico mostraram o potencial das comunidades bacterianas associadas ao nemátode e ao inseto para degradação de xenobióticos e para o enfraquecimento da árvore, como sugerido por outros estudos. Foi ainda possível estabelecer uma coleção de isolados bacterianos endofíticos de três espécies de pinheiro e avaliar a sua capacidade para promoção do crescimento da planta, degradação da parede celular das células vegetais e tolerância a stress oxidativo. Os resultados sugerem que a comunidade endofítica dos pinheiros poderá ter um papel na suscetibilidade da árvore à doença. Os genomas de quatro estirpes bacterianas isoladas do tronco das árvores foram sequenciados, das quais duas estirpes de Methylobacterium, que promoveram o crescimento da raiz em Arabidopsis thaliana, mostraram potencial para serem utilizadas como agentes de controlo biológico. No geral, este estudo mostrou que a DMP resulta de interações multitróficas e que o microbioma associado à doença participa nessas interações sendo importante na progressão da doença.
Programa Doutoral em Biologia

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
A floresta constitui um bem precioso à escala mundial, do ponto de vista ecológico, paisagístico e económico. No entanto, nos últimos tempos tem-se registado um grave declínio de muitas espécies florestais, sendo em Portugal, o pinheiro bravo, Pinus pinaster Ait das espécies mais afetadas. Uma das principais causas, identificada nas últimas décadas, para este declínio, é o nemátode da madeira do pinheiro. O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é um organismo microscópico que causa a doença da murchidão dos pinheiros “pine wilt disease”. Numa tentativa de diminuir as perdas resultantes da doença, o estudo da resistência do hospedeiro é uma das abordagens de investigação que se iniciou recentemente em Portugal, com o objetivo de melhorar a sua resistência e selecionar árvores com menor suscetibilidade à infeção. A identificação de genes, promotores e marcadores moleculares ligados à resistência à doença, que possam vir a ser mais tarde utilizadas na seleção assistida de genótipos com menor suscetibilidade ao NMP, poderá contribuir para acelerar os programas de melhoramento para a resistência a implementar para esta espécie. Nesse sentido, este trabalho teve como principal objetivo determinar os tempos mais relevantes, após inoculação com NMP, a utilizar para ulterior sequenciação em massa, de bibliotecas de cDNA de Pinus pinaster a a espécie Asiática Pinus yunnanensis, utilizada como controle de tolerância/ resistência para a comparação ulterior de transcritomas destas duas espécies em resposta à infeção com NMP. Foi também comparada a distribuição e propagação do nemátode no interior das duas espécies, após inoculação com NMP, em plantas de três anos, através de observações histológicas. Para determinação dos TAI (Tempos Após Inoculação) relevantes, em termos de expressão de genes candidatos de resistência a stresses bióticos, estudou-se a expressão diferencial dos seguintes genes: Thaumatin like protein, Endo-quitinase, Pinosylvin synthase, Superoxide dismutase-like protein e Allene Oxyde Cyclase, através da técnica Real-Time Polymerase Chain Reaction. As observações histológicas permitiram observar que os canais de resina têm maior diâmetro em Pinus pinaster do que em Pinus yunnanensis, foi possível também verificar que, após inoculação, há um aumento acentuado de inclusões de amido na espécie Mediterrânica, em comparação com a espécie Asiática, em que as inclusões não sofrem alteração de número depois da inoculação com NMP. Quanto aos TAI, pode-se concluir que os primeiros tempos após a infeção, respetivamente 6h e 24h são os tempos em que há uma maior expressão diferencial dos genes em estudo e, portanto, os que se elegem para ulterior sequenciação de bibliotecas de cDNA.
The forest is a valuable resource on a global scale, for ecological, economical and landscape purposes. However, recently there has been a serious decline of many forest species, being the maritime pine, Pinus pinaster Ait the most affected species in Portugal. A major cause detected in recent decades for this decline is the pine wood nematode. The pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is a microscopic organism that causes pine wilt disease. In an attempt to reduce losses caused by this disease, the study of host resistance is one of the research approaches that recently started in Portugal, aiming to improve their resistance and select trees with lower susceptibility to infection. The identification of genes, promoters and molecular markers linked to disease resistance, that can be later used in marker assisted selection of genotypes with reduced susceptibility to NMP may help to accelerate the breeding programs for resistance to be implemented for this species. Taking this into account, this study aimed to determine the most relevant times after inoculation with NMP to be used for subsequent sequencing of cDNA libraries of Pinus pinaster and Pinus yunnanensis an Asian species, used as control of tolerance / resistance for further comparison of transcriptoms for these two species in response to the infection with PWD. The distribution and spread of nematodes was also compared within the two species after inoculation of three years’ old plants with NMP, by histological observations. For the determination of relevant TAI (Time After Inoculation) gene expression of the following genes was studied: Thaumatin like protein, endo-chitinase, Pinosylvin synthase, Superoxide dismutase-like protein and Allene Oxyde cyclase using Real-Time Polymerase Chain Reaction.Histological observations allowed the observation that the resin ducts have a larger diameter in Pinus pinaster, than in Pinus yunnanensis. It was also possible to verify that, after inoculation, there is an increase of starch inclusions in the Mediterranean type, as compared with the Asian species, where the inclusions do not change in number after inoculation with NMP. Regarding the TAI, one can conclude that early times after infection, respectively 6h and 24h are the ones where a greater differential expression of the genes under study was observed and therefore they are chosen for subsequent sequencing of cDNA libraries.

Tese de mestrado, Ecologia e Gestão Ambiental, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
A Doença da Murchidão do Pinheiro foi primeiramente detetada em Portugal em 1999 na Marateca, Península de Setúbal. O agente causador desta doença, que leva à morte da árvore infetada, é Bursaphelenchus xylophilus, um nematode micofágico, oriundo da América do Norte, que coloniza várias espécies de coníferas, especificamente Pinus spp, usando como vetor um inseto do Género Monochamus (Coleoptera). Enquanto que as espécies nativas da América apresentam resistência, ou alguma tolerância à infeção por parte do nematode, as espécies Asiáticas e Europeias são suscetíveis, desenvolvendo uma sintomatologia característica, que leva ao rápido apodrecimento e morte da árvore. Este facto suporta a teoria de que o Nematode da Madeira do Pinheiro (como ficou conhecido) terá sido transportado desde a América até ao Japão, onde a doença foi inicialmente detetada no início do século XX, em madeira infetada e não tratada. Após a entrada no Japão, o nematode espalhou-se rapidamente pela China, Tailândia e Coreia. A doença é o resultado de uma complexa interação entre o nematode, o inseto-vetor, a conífera hospedeira e vários fatores climáticos, o que atrasou a atribuição de uma relação causa-efeito entre a presença do nematode e os sintomas da doença, permitindo a larga propagação da mesma. Em Portugal, e na Europa, tem afetado essencialmente espécies como Pinus nigra, P. sylvestris e P. pinaster, representado perdas significativas de rendimentos e de biodiversidade. Devido ao seu grande potencial destrutivo, o Nematode de Madeira do Pinheiro (NMP) está listado na Diretiva Europeia 2000/29/CE para medidas de proteção contra a introdução e propagação de organismos prejudiciais o que levou a restrições na comercialização de madeiras e de subprodutos não tratados tal como de plantas vivas. O nematode, que mede apenas 1.5 milímetros, tem uma alta taxa de reprodução e um ciclo de vida de duas fases, uma em que se alimenta de fungos e outra em que se alimenta de células vivas do parênquima. Também se desenvolve de duas formas distintas; se as condições forem favoráveis desenvolve-se rapidamente sob a forma “Reprodutora”, se as condições começarem a ser desfavoráveis, ou seja, quando a árvore hospedeira decai, desenvolve-se como uma forma de “Dispersão” que é uma forma mais resistente. É nesta fase que o nematode migra para junto das câmaras pupais do inseto vetor e aguarda pela muda das pupas para infestar os adultos recém-formados. O inseto vetor do Género Monochamus com distribuição em Portugal é M. galloprovincialis (Olivier,1795), um besouro endémico Cerambicídeo, da subfamília Lamiinae, considerado uma praga secundária pelo que não existia muita informação sobre a sua ecologia e anatomia antes da entrada do nematode no país. Tem um ciclo de vida univoltino ou seja, produz descendência apenas uma vez no ano, para se reproduzir tem de se alimentar de rebentos da copa de pinheiros saudáveis, a chamada alimentação de maturação sexual. Os machos produzem feromonas para atrair as fêmeas para a reprodução e as fêmeas para ovipositar necessitam de pinheiros em declínio ou mortos recentemente. As larvas e pupas do inseto vetor, e outros colonizadores dos pinheiros, convivem com juvenis do nematode dentro da madeira do pinheiro durante os vários meses de desenvolvimento do inseto. De alguma forma, o nematode identifica as pupas do inseto vetor e aguarda pela última muda para entrar no sistema respiratório através dos espiráculos dos adultos recém-formados. O inseto depois emerge da árvore hospedeira, transportando o nematode e transmitindo-o para novas árvores durante a sua alimentação, ocorrendo a “Transmissão Primária”. As fêmeas infetadas, quando depositam os seus ovos em árvores enfraquecidas também podem transmitir o nematode, ocorrendo a chamada “Transmissão Secundária”. Inserido no Projeto NEMATRANSFER (PTDC/AGR-FOR/4391/2014), esta dissertação visa a análise do Sistema Respiratório, espiráculos e traqueia, do inseto vetor e de 3 outras espécies colonizadoras do pinheiro bravo, nomeadamente Arhopalus syriacus (Reitter, 1895), Acanthocinus griseus (Fabricius, 1793), e Pogonocherus perroudi Mulsant, 1839 que são as mais abundantes e mais próximas filogeneticamente da espécie vetora, na tentativa de isolar características que possam ser barreiras físicas à entrada do nematode nas espécies não vetores, na expectativa que os dados obtidos possam ser usados na criação de novas medidas de gestão de pragas. Para alcançar o objetivo principal, foram testados protocolos de preparação de exemplares para se conseguir uma caracterização dos espiráculos (tamanho e existência, ou não, de sedas) através de imagens obtidas em Microscopia Eletrónica de Varrimento (MEV) e medições da traqueia e suas ramificações usando Micro Tomografia de raio X (Micro-CT) e modelos 3D dos exemplares. A Micro-CT é uma técnica não invasiva, baseada na interação dos raios X com os diferentes constituintes da amostra, que permite a observação da anatomia interna dos exemplares uma vez que produz imagens de alta resolução que podem depois ser integradas para gerar um volume virtual da mesma. Esta técnica permite também individualizar partes dos exemplares, por exemplo certos órgãos, usando o software CTAnalyzer (distribuído por BRUKER®), também conhecido como “Segmentação”. A MEV é amplamente usada para observar estruturas ao nível da superfície das amostras. Um feixe de eletrões, chamados eletrões primários, passa rapidamente pela superfície da amostra. Antes da observação em MEV, a mostra é metalizada com ouro, ou ouro-paládio, para promover a emissão de eletrões, chamados eletrões secundários, o impulso elétrico é depois detetado e transformado numa imagem. Para a preparação e estabilização dos exemplares para suportarem estas técnicas, tentou-se a Fixação Química com glutaraldeído e tetróxido de ósmio seguida de Secagem pelo método do Ponto Crítico e como alternativa a este processo moroso, a Liofilização que consiste numa sublimação a baixa pressão e temperatura. Obtivemos sucesso em ambos os procedimentos, com percentagens semelhantes entres estes, no entanto não foi possível preparar o mesmo número de indivíduos com ambas as técnicas, pois as larvas recolhidas não eram igualmente distribuídas pelas quatro espécies em análise e algumas larvas morreram antes da muda. Os exemplares estabilizados foram observados no microscópio eletrónico para avaliar a sua integridade e foram distribuídos entre as técnicas de observação, MEV ou Micro-CT. Devido ao moroso processo de estabilização e ao tempo gasto na resolução dos problemas metodológicos e na agilização do processo de tratamento dos exemplares, não foi possível atingir as repetições inicialmente planeadas e necessárias para uma avaliação estatística adequada sobre o sucesso entre os diferentes métodos de preparação. As fotografias dos espiráculos, obtidas na MEV, foram analisadas com o software ImageJ e as medições obtidas foram trabalhadas em Excel. Foi medida a área total de 199 espiráculos de 1 pupa e 9 adultos M. galloprovincialis, 2 pupas e 10 adultos A. Syriacus, 3 A. griseus adultos e 1 P. perroudi. tal como a área do espiráculo não coberta por sedas e a circularidade, uma razão entre a área e o perímetro, automaticamente calculada pelo ImageJ, que permite classificar a forma do espiráculo como mais circular, se o valor se aproximar de 1, ou mais elíptica se o valor se aproximar de 0. Os resultados obtidos através das medições feitas, indicam que os espiráculos dos adultos de M. galloprovincialis são os que apresentam a menor percentagem de área descoberta, ou seja, a área em que não há sedas a cobrir a entrada do espiráculo, quando comparados com os adultos das outras três espécies estudadas, que não desempenham um papel de disseminação do nematode. Enquanto que os espiráculos dos adultos das espécies A. syriacus e A. griseus estão mais desprotegidos, tendo uma menor percentagem de cobertura de sedas, os espiráculos de M. galloprovincialis têm mais sedas que poderão ser facilitadoras do movimento do nematode para dentro do espiráculo enquanto também preservam um nível de humidade favorável à sobrevivência, e à própria movimentação, do NMP. Por outo lado, as pupas de M. galloprovincialis apresentam uma cobertura de sedas ainda maior que o adulto da mesma espécie, o que nesta fase de desenvolvimento do inseto pode atuar como uma barreira física à entrada do nematode e que poderá explicar por que razão este só infecta o inseto adulto. Apesar de várias dificuldades em agilizar o processo de segmentação que acabou por inviabilizar a individualização da rede de ramificações da traqueia, através das radiografias obtidas da Micro-CT foi possível identificar quatro principais ramificações na cabeça e tórax e duas ramificações no abdómen de insetos das espécies M. galloprovincialis, A. syriacus e A. griseus, que são consistentes com as descrições morfológicas consultadas. Também foi possível medir o diâmetro das ramificações, nesses mesmos indivíduos, e posteriormente fez-se uma estimativa do volume das traqueias observadas. Os resultados obtidos das medições, indicam que o volume total da traqueia é maior em insetos maiores, o que corrobora o fato de as traqueias se estenderem por todo o corpo para que o oxigénio chegue a todos os órgãos e tecidos. Ao comparar o macho e a fêmea de M. galloprovincialis é notável a diferença de volume da traqueia ao nível do abdómen, sendo o da fêmea praticamente o dobro do macho, mas o volume total de ambos é semelhante o que sugere que poderá haver uma distribuição desigual das ramificações da traqueia consoante o sexo, para esta espécie, o que não se verifica no macho e fêmea de A. griseus que foram também medidos. Todos estes pontos resultantes do trabalho feito e da comparação entre a espécie vetor do NMP e as outras espécies estudadas, que convivendo com o nematode nas árvores hospedeiras não desempenham um papel de disseminadoras, poderão trazer novas perspetivas sobre a complexa interação entre o inseto vetor e o NMP. Todo o trabalho feito na preparação dos indivíduos é também uma mais valia para futuros trabalhos que tenham como objetivos a observação de estruturas anatómicas semelhantes. Todos os dados obtidos são originais e podem ser relevantes para futuras propostas de gestão do NMP
The Pine Wilt Disease (PWD) is caused by a non-indigenous nematode, Bursaphelenchus xylophulis, that disseminates widely through a flying insect-vector, Monochamus galloprovincialis (Oliver, 1795), colonizer of the pine tree, leading the trees to death due to the clogging of the tree vessels. It remains unknown how the nematode identifies and infect the newly formed adult individuals of the vector species. Whereby, in the procedure of the project NEMATRANSFER (PTDC/AGR-FOR/4391/2014), we compare anatomic structures of pupae and adult insects of the vector species and other three cerambycid species, Arhopalus syriacus (Reitter, 1895), Acanthocinus griseus (Fabricius, 1793), and Pogonocherus perroudi Mulsant, 1839, in as attempt to recognize differences that may be considered as physiological barriers to nematode entry in non-vector species. To accomplish the main goal, several protocols were tried to achieve a characterization of the spiracles (measures, existence, or not, of bristles) using Scanning Electron Microscopy images and to measure the tracheal system (its length, ramifications, etc.) with Micro-computed Tomography and 3D models using proper software. From the obtained SEM results we presume that, while the non-vector species spiracles’, have lower bristles coverage, the insect-vector has only a small area not covered by them. This can imply that the bristles should help the nematode to tangle itself and crawl into the trachea while provide a moisture environment that also favour the nematode survival and movement. On the other hand, the bristles coverage of the pupae may be so dense that in this stage of the insect development it can work like an obstacle for the nematode entrance. This may be the reason why the PWN enter the spiracles only when the newly adult insects are formed. It has found evidence that the shape of the spiracles may represent an important feature to explain how PWN colonizes the insect-vector, or why it prefers M. galloprovincialis over the other species. In what concerns the Micro-CT results, we were able to identify four main tracheal trunks in the head and thorax and two main trunks in the abdomen of M. galloprovincialis, A. syriacus and A. griseus specimens. Also it was possible to measure tracheal trunks in one lyophilized specimen, in specimens fixated with glutaraldehyde and osmium tetroxide, and critical point dried, and even in not treated specimens, although in this last case it was harder to find the main trachea trunks lengthwise the entire body of the insect. The volume estimated values obtained are consistent with the insects’ body length, being higher in bigger specimens, and diameter and number of the main trunks are consistent with the described morphology of the trachea ramifications for Coleoptera insects. By comparing the abdominal tracheal volumes of both M. galloprovincialis male and female specimens, it seems that a differential ramification arrange occurs, as the female abdominal tracheal volume is twice of the male while the total volume is similar. All the worked done for the stabilization and preparation of the samples to endure SEM and Micro-CT is an asset for future similar studies. Our results, obtained by comparing the vector species with the non-vector species, that also share the host tree but do not have a role in the spread of the nematode may bring some understanding about the complex interaction between the PWN and the insect- vector. All our data are original and may be relevant for future pest managements measures.