Tesis sobre el tema "Encéphalomyélite auto-immune expérimentale – Recherche"

Les lymphocytes T régulateurs CD4+Foxp3+, gardiens de l’homéostasie, participent au maintien de la tolérance immunitaire. La stimulation de leur expansion et de leur fonction est finement régulée par un ensemble de mécanismes complexes dépendants de l’environnement tissulaire. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence le rôle critique du récepteur de type 2 du TNF (TNFR2) dans le contrôle de l’inflammation du système nerveux central par les lymphocytes T régulateurs (Treg). Dans le modèle murin l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, nous avons montré que le traitement par anti-TNF aux premiers signes cliniques de la maladie aggrave les symptômes et est associé à une réduction de proportion de cellules régulatrices dans le tissu cible. La génération d’un modèle murin de déficience spécifique nous a permis de révéler que le TNFR2 est nécessaire à l’accumulation et à la fonction des Treg dans le système nerveux central pour le contrôle de la maladie. Ces résultats pourraient expliquer l’échec des traitements anti-TNF dans la sclérose en plaques et ouvrent la perceptive aux thérapies utilisant des agonistes du TNFR2. Dans une seconde étude, nous avons pu révéler le potentiel tolérogénique des adjuvants vaccinaux. Administrée en sous-cutané ou en intramusculaire, la nouvelle génération d’adjuvant provoque l’activation et la prolifération de lymphocytes T régulateurs. De plus, certains adjuvants confèrent une protection complète contre le développement de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Nos données dévoilent que cette prévention pourrait être due à un nouveau mécanisme de suppression des Treg passant par l’altération des capacités migratoires des lymphocytes T effecteurs pathogènes. Ces travaux initient l’utilisation d’adjuvants pro-Treg dans la conception de vaccination contre les maladies autoimmunes
Regulatory T cells CD4+ Foxp3+, guardians of homeostasis, contribute to the maintenance of immune tolerance. Their expansion and function stimulation is tightly regulated by a set of complex mechanisms dependent of the tissue environment. My thesis work has highlighted the critical role of TNF receptor type 2 (TNFR2) in the control of the central nervous system inflammation by regulatory T cells (Treg). In the murine model of experimental autoimmune encephalomyelitis, we showed that the anti-TNF treatment at the first clinical signs of disease worsen the symptoms and is associated with a decrease percentage of regulatory T cells in the target tissue. The generation of a mouse model of specific deficiency has allowed us to prove that TNFR2 is necessary for the accumulation and function of Treg cells in the central nervous system for disease control. These results could explain the failure of anti-TNF treatment in multiple sclerosis and open the perceptive therapies using agonists TNFR2. In a second study, we have revealed the potential of tolerogenic vaccine adjuvants. Administered subcutaneously or intramuscularly, the new generation adjuvant causes the activation and proliferation of regulatory T cells. In addition, certain adjuvants confer complete protection against the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Our data reveal that this prevention may be due to a new Treg suppression mechanism through alteration of the migration capacity of pathogenic effector T lymphocytes. This work initiate the use of pro-Treg adjuvants in the design of immunization against autoimmune diseases

La sclerose en plaques (sep) est une maladie demyelinisante inflammatoire chronique du systeme nerveux central. Elle a un determinisme multifactoriel faisant intervenir a la fois des facteurs genetiques et des facteurs environnementaux. Les genes responsables de la maladie demeurent a l'heure actuelle inconnus. Il est possible d'induire chez le rat une pathologie proche de la sep: l'encephalomyelite auto-immune experimentale (eae). La susceptibilite a l'eae est sous dependance de facteurs genetiques. Cette maladie se traduit par des signes cliniques et infracliniques histologiques au sein du systeme nerveux central. Apres avoir montre la transmission de la maladie sur un mode dominant, 245 rats f2 ont ete immunises. Une etude comparative des distributions des phenotypes (cliniques et histologiques) des animaux a ete realisee afin de mettre en evidence la nature polygenique du controle de l'eae. L'adn des differents rats a ete extrait et une serie de genes candidats, cartographies chez le rat, ont ete selectionnes afin de rechercher leur implication potentielle dans la susceptibilite a l'eae. Trois genes ont ete retenus: le gene codant la glycoproteine oligodendrocytaire de la myeline (mog), localise au voisinage du cmh sur le chromosome 20, le gene codant la chaine b des recepteurs des lymphocytes t (tcr) localise sur le chromosome 4 et le gene codant l'interleukine 4 localise sur le chromosome 10. Une liaison entre la region cmh et la region du gene codant l'il-4 et l'eae a ete mise en evidence, permettant de conclure que des genes de susceptibilite a l'eae sont situes a proximite de ces deux regions. L'identification de trois nouveaux marqueurs polymorphes au niveau du gene de la mog humaine n'a pas permis de mettre en evidence une association entre ces marqueurs et la sclerose en plaques

Les données neuropathologiques et IRM suggèrent que le déficit permanent de la sclérose en plaques (SEP) est la conséquence d'une perte axonale diffuse. La juxtaposition des atteintes axonales et des cellules macrophagiques suggèrent le rôle des facteurs produits par ces cellules dans l'atteinte axonale. Ce travail apporte de nouvelles preuves de l'intervention du peroxynitrite (pox) dans la formation des lésions de SEP et d'EAE. Nous avons démontré la production précoce d'anticorps anti-SNO-cysteine dans l'EAE ; une corrélation entre la formation du pox et l'atteinte axonale lors d'une EAE à rechutes ; l'induction d'une axonopathie primitive sans composantes inflammatoires après injection de pox chez le rat ; la réduction de l'inflammation, de l'atteinte axono-myélinique et des signes cliniques par le traitement à l'acide urique, capteur spécifique du pox. Nos résultats étayent le rôle du pox dans les atteintes axonales et les déficits cliniques lors de l'EAE et peut-être lors de la SEP
Neuropathologic and MRI data suggest that the permanent deficit in multiple sclerosis (MS) is the consequence of diffuse axonal loss, which could be the remote consequence of acute axonal damage within inflammatory lesions. The juxtaposition of axonal damage and macrophages emphasises the role of factors produced by these cells in axonal damage. We provide new evidence that among these factors peroxynitrite (pox) is implicated in the lesion formation of MS and EAE by demonstrating : 1) the early production of anti-SNO-cysteine antibodies in EAE ; 2) a correlation between pox production and axonal lesions in relapsing EAE ; 3) an induction of primitive axonopathy by pox in absence of inflammatory components ; 4) an inhibition of inflammation, axono-myelinic lesion and clinical aspects in relapsing EAE by uric acid treatment, a specific pox scavenger. Our data shed new light on the role of pox in axonal lesion ans clinical deficits in relapsing EAE that may help understanding of MS aspects

Le système nerveux central est un site particulier vis-à-vis du système immunitaire, en raison de la présence de la barrière hémato-encéphalique et de la barrière sang-liquide céphalorachidien. Les plexus choroïdes ont été considérés comme une voie d’entrée de certains lymphocytes dans le système nerveux central. Et le liquide céphalo-rachidien a été considéré comme une voie préférentielle de circulation des cellules immune au cours de la surveillance neuro-immunitaire de l’ensemble des compartiments cérébraux, puisque le LCR circule des ventricules, aux espaces sous-arachnoïdiens ainsi qu’aux velum et citernes internes. L’implication du système plexus choroïdes-liquide céphalorachidien dans l’infiltration cellulaire et la distribution des différents effecteurs immuns a été évaluée. Premièrement, nous avons analysé la relation entre le LCR et la répartition des différentes cellules immune au sein du système nerveux central, dans deux modèles d’encéphalite autoimmune expérimentale, utilisé comme modèle de la sclérose en plaque. Deuxièmement, nous avons recherché les partenaires moléculaires pouvant être impliqués dans la mise en place d’une inflammation, tels que les molécules d’adhésion exprimés par l’épithélium choroïdien, et les chimiokines pouvant être sécrétées dans le liquide céphalorachidien. Nos résultats identifient les plexus choroïdes comme une source de chimiokines sécrétées dans le liquide céphalorachidien, ce dernier orchestrant la distribution des différents effecteurs immunitaire au cours de l’inflammation
The central nervous system is an immunologically specialized site, because of the blood-brain barrier and the blood-cerebrospinal fluid barrier. The choroid plexuses had been considered as a preferential site for the entry of lymphocytes into the CNS. And the cerebrospinal fluid has been considered as a preferential pathway of circulation for immune cells during physiological neuroimmune surveillance, in all cerebral compartments, as the cerebrospinal fluid circulates from the ventricles to the subarachnoid spaces as well as the velum and internal cisterns. We evaluate the involvement of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system in the cerebral infiltration and distribution of immune cells in CNS inflammation. First we realized a time course analysis of the different type of immune cell association with the CSF-containing compartments in two experimental autoimmune encephalomyelitis, models of multiple sclerosis. Secondly, we analyzed the molecular partners that could be involved in CNS inflammation development, such as adhesion molecules expressed on the choroid plexus, and chemokines secreted into the cerebrospinal fluid. Results identified the choroid plexuses as a source of chemokines, released into the cerebrospinal fluid that orchestrates the immune cell invasion during CNS inflammation

La sclérose en plaque est une maladie démyélinisante complexe du système nerveux central (SNC) associant inflammation chronique, perte axonale et atrophie cérébrale. Les lymphocytes T CD4+ et CD8+, présents au sein des lésions démyélinisantes, participent à la démyélinisation et aux lésions axonales. J'ai développé un modèle murin transgénique original dans lequel : i) l'hémagglutinine (HA) du virus Influenza est sélectivement exprimée par les oligodendrocytes en tant qu'antigène du non-soi et ii) les lymphocytes T CD8+ expriment un TCR spécifique d'HA. J'ai directement démontré la capacité in vivo de ces lymphocytes T CD8+ à induire la mort des oligodendrocytes après une reconnaissance directe de l'antigène. J'ai analysé les caractères pathogéniques de la réponse T CD4+ ciblant l'épitope immunodominant de la Myelin Oligodendrocyte Protein (MOG35-55). Dans ce but nous avons utilisé des souris transgéniques C57BL/6 2D2 dont une large proportion des lymphocytes T CD4+ exprime un TCR spécifique de MOG35-55. De manière surprenante, nous avons découvert que les souris issues d'un croisement entre ces souris 2D2 et des souris n'exprimant pas MOG (MOG-/-) développaient une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) spontanée, alors même que l'antigène cible MOG était absent. Nous avons donc émis l'hypothèse que les lymphocytes T CD4+ des souris 2D2 spécifiques pour l'antigène MOG35-55 reconnaissaient un second antigène du SNC. Nous avons pu mettre en évidence que le peptide MOG35-55 partageait une homologie de séquence avec un segment d'une protéine du cytosquelette exprimée dans les neurones et les axones, Neurofilament-medium (NF-M). Présentés par les molécules du CMH I-Ab, les épitopes issus de NF-M partagent notamment avec MOG35-55 des résidus de contact avec le TCR des lymphocytes T CD4+ 2D2. Etonnamment, le peptide NF-M15-35 induit une réponse hétérogène lorsqu'il est présenté aux lymphocytes des souris 2D2. Enfin, la reconnaissance de MOG et de NF-M par les lymphocytes T CD4+ des souris 2D2 contribue différemment au phénotype et à la sévérité de la maladie. Notre travail suggère qu'une réponse immunitaire clonale ciblant deux auto-antigènes présents dans le même tissu induit une majoration des lésions du SNC. Nous avons nommé cette observation de mimétisme entre deux peptides du soi " auto-immunité cumulative "
Multiple sclerosis (MS) is a complex demyelinating disease associated with chronic inflammation of the central nervous system (CNS), axonal loss, and brain atrophy. The CD4+ and CD8+ T cells that are present in the demyelinating lesions are considered to mediate demyelination and axonal damage. An autoimmune process likely contributes to CNS tissue damage in MS, although direct evidence for this is still lacking. A major focus of my work is to understand the mechanisms by which autoreactive T cells contribute to CNS tissue damage. Although CD8+ T cells mediate effector functions through production of cytokines or by direct cytotoxicity, the mechanisms by which they can cause CNS tissue damage are elusive. In order to assess whether CNS-infiltrating CD8+ T cells could directly induce oligodendrocyte death and demyelination, we developed an original mouse model combining selective expression of influenza hemagglutinin (HA) as a neo-self-Ag in oligodendrocytes with transgenic mice expressing a HA-specific TcR on CD8+ T cells. We demonstrate directly the potential of CD8+ T cells to induce oligodendrocyte death in-vivo, as a likely consequence of direct antigen-recognition. Untill recently, CD4+ T helper cells have been held responsible for MS immunopathogenesis, partly because certain MHC class II alleles clearly predispose for developing MS. We investigated the pathogenic traits of the CD4+ T cell response targeting the immunodominant epitope of myelin oligodendrocyte protein (MOG). To this end we obtained 2D2 TcR-transgenic C57BL/6 mice, which harbor a large population of MOG-specific CD4+ T cells and spontaneously develop optic neuritis and at a lower prevalence, EAE. Strikingly when we crossed these 2D2 mice with MOG-deficient mice (MOG-/-), we discovered that the 2D2 TcR-transgenic mice developed spontaneous EAE regardless of the presence or absence of the target self-antigen MOG. Therefore we hypothesized, that the 2D2 TcR specific for MOG35-55 recognizes a second CNS antigen. Furthermore, we were able to reveal, that MOG35-55 peptide shares sequence homology with a stretch of neurofilament-medium (NF-M), a cytoskeletal protein expressed in neurons and axons. .

Le système nerveux central est un site particulier vis-à-vis du système immunitaire, en raison de la présence de la barrière hémato-encéphalique et de la barrière sang-liquide céphalorachidien. Les plexus choroïdes ont été considérés comme une voie d'entrée de certains lymphocytes dans le système nerveux central. Et le liquide céphalo-rachidien a été considéré comme une voie préférentielle de circulation des cellules immune au cours de la surveillance neuro-immunitaire de l'ensemble des compartiments cérébraux, puisque le LCR circule des ventricules, aux espaces sous-arachnoïdiens ainsi qu'aux velum et citernes internes. L'implication du système plexus choroïdes-liquide céphalorachidien dans l'infiltration cellulaire et la distribution des différents effecteurs immuns a été évaluée. Premièrement, nous avons analysé la relation entre le LCR et la répartition des différentes cellules immune au sein du système nerveux central, dans deux modèles d'encéphalite auto-immune expérimentale, utilisé comme modèle de la sclérose en plaque. Deuxièmement, nous avons recherché les partenaires moléculaires pouvant être impliqués dans la mise en place d'une inflammation, tels que les molécules d'adhésion exprimés par l'épithélium choroïdien, et les chimiokines pouvant être sécrétées dans le liquide céphalorachidien. Nos résultats identifient les plexus choroïdes comme une source de chimiokines sécrétées dans le liquide céphalorachidien, ce dernier orchestrant la distribution des différents effecteurs immunitaire au cours de l'inflammation.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central (SNC). La réponse T CD4 est impliquée dans le développement de la SEP et son modèle animal : l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). De récentes données montrent que les lymphocytes T CD8 anti-myéline peuvent être impliqués d'autant plus qu'ils sont présents abondamment dans les lésions SEP. Afin de mieux comprendre la contribution des T CD8 pathogéniques, deux récents modèles ont été évalués. Le premier consiste à immuniser des souris avec un épitope de la myéline T CD8 spécifique (MOG37-46). Les souris développent une EAE modéré avec une prépondérance de T CD4 dans le SNC. La réactivation périphérique des T CD8 augmente le rapport T CD8/T CD4 dans le SNC. Le second modèle est basé sur le transfert de T CD8 anti-hémagglutinine (HA) dans des souris DKI exprimant HA par les oligodendrocytes. L'irradiation (2Gy) des souris DKI permet une infiltration lymphocytaire sans symptôme apparent. Les résultats sont discutés au vu des données récentes de la littérature. En parallèle, nous avons caractérisé la réactivité astrocytaire dans le modèle classique EAE afin de mieux définir l'implication des astrocytes dans la maladie. Pour la première fois dans ce modèle, nous avons caractérisé le profil moléculaire des astrocytes de la substance blanche isolés par microdissection laser dans les lésions spinales mettant en évidence l'expression spécifique de médiateurs proinflammatoires et d'enzymes du métabolisme stéroïdien. Ces données ouvrent de nouvelles voies pour contrer la réactivité gliale dans les maladies neuroinflammatoires comme la SEP
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune, demyelinating and degenerative disease of the central nervous system (CNS), in which astrocyte reactivity is considered an important player. The CD4 T cell response is strongly associated with development of MS and its animal models such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Recent data suggest that anti-myelin CD8 T cells may be also implicated as CD8 T cells are abundant in MS lesions. To better understand the contribution of pathogenic CD8 T cells, two animal models that have been described were evaluated. The first one consists of mice immunized with a specific CD8 T cell myelin epitope (MOG37-46). Mice develop mild EAE with CD4 T overwhelming CD8 T cells in CNS. Boosting the CD8 immune response increased slightly the CD8/CD4 ratio in the CNS. The second model is based on the adoptive transfer of anti-HemAgglutinin (HA) CD8 T cells in DKI transgenic mice, which express HA by oligodendrocytes. Only irradiation (2Gy) of DKI mice allowed CNS infiltration of CD8 T cells but without apparent clinical signs. These results are discussed in light of recent literature. In parallel, we characterized the astrocyte reactivity in a classical EAE to better define the implication of astrocytes in the pathology. For this, we used for the first time in this model laser-capture microdissection to isolate white matter astrocytes in spinal cord lesion. Selected transcript profiling analysis revealed astrocytic expression of pro-inflammatory mediators and enzymes involved in oestrogen metabolism. These results give new clues for targeting glial reactivity in neuroinflammatory disorders such as MS

TSSP (Protéase à Sérine Spécifique du Thymus) est une protéase exprimée de manière prépondérante dans le thymus par les cellules épithéliales thymiques corticales (cTEC) et par les cellules dendritiques thymiques (tDC). En revanche, TSSP n'est pas exprimée par les cellules dendritiques (DC) en périphérie même après activation par des agonistes de TLR (Toll-like Receptor). L'équipe a précédemment montré que les souris NOD déficientes pour TSSP (NOD TSSP°) sont totalement résistantes au développement du diabète de type 1 (T1D) contrairement aux souris NOD WT qui développent de manière spontanée la pathologie. L'absence de T1D est due à une augmentation de la sélection négative de cellules T CD4 spécifiques de certains antigènes des ilots de Langerhans par les tDC. Ainsi, la déficience en TSSP conduit à l'épuration du répertoire des cellules T CD4 auto-réactifs par des évènements de sélection négative dans le thymus limitant ainsi le développement du T1D. Bien que la fonction précise de TSSP reste inconnue, ces données et des données complémentaires montrent que TSSP dans les tDC limite la présentation de certains antigènes des ilots de Langerhans dans la voie classe II. Nous avons, dans un premier temps, déterminé si le rôle de TSSP peut être généralisé à une autre maladie auto-immune médiée également par les cellules T CD4, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle murin de sclérose en plaque. Nous avons montré que la sévérité de l’EAE induite par immunisation avec le peptide MOG35-55 (Glycoprotéine de l'Oligodendrocyte de la Myéline) est réduite chez les souris NOD TSSP°. La réduction de sévérité chez les souris NOD TSSP° est associée à une augmentation de la délétion des cellules T CD4 spécifiques du peptide MOG35-55. TSSP limiterait la délétion thymique des cellules T CD4 spécifiques de MOG35-55. Ainsi TSSP, en réduisant le répertoire peptidique présenté par les molécules I-Ag7, conduirait à un défaut de tolérance centrale favorisant le développement de maladies auto-immunes. Dans un second temps, l’objectif de mes travaux de thèse a été d'apporter de nouvelles connaissances quant à la fonction de TSSP dans les tDC. L’ensemble des données suggèrent que TSSP limiterait la présentation d’antigènes dans la voie classe II, nous avons donc analysé les capacités d’internalisation et de dégradation des tDC par imagerie en flux. Nous avons montré que TSSP limite spécifiquement l'internalisation de la protéine ovalbumine dans les cellules dendritiques conventionnelles 2 (cDC2) et dans une lignée de DC mais n'affecte pas leurs capacités dégradatives. De plus, la réduction de l’internalisation des antigènes dans les tDC de souris NOD WT est indépendant de l’endocytose médiée par récepteur. Ces données suggèrent que TSSP en réduisant l'internalisation des antigènes pourrait limiter la formation de complexes peptide/CMH II et la présentation antigénique dans la voie classe II. Par ce mécanisme, TSSP induirait un défaut de tolérance centrale et favoriserait le développement de maladies auto-immunes
TSSP (Thymus Specific Serine Protease) is a protease expressed predominantly in the thymus by thymic epithelial cortical cells (cTEC) and thymic dendritic cells (tDC). In contrast, TSSP is not expressed by dendritic cells (DC) in the periphery even after activation by TLR agonists (Toll-like Receptor). Previous studies showed that TSSP-deficient NOD mice are completely resistant to the development of type 1 diabetes (TD1) whereas NOD WT mice spontaneously develop pathology. The absence of T1D is due to an increase in the negative selection, by tDC, of CD4 T cells specific for certain antigens of the islets of Langerhans. Thus, TSSP deficiency leads to the crippling of the autoreactive CD4 T cells repertoire by negative selection in the thymus limiting the development of T1D. Although the precise function of TSSP remains unknown, these data and complementary data show that TSSP in tDC limits the presentation of certain islet antigens in the class II pathway. At first, the aim of my PhD work was to determine if the role of TSSP can be generalized to another autoimmune disease also mediated by CD4 T cells, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model of multiple sclerosis. We have shown that the severity of EAE induced by immunization with MOG35-55 (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) peptide is reduced in NOD TSSP° mice. Reduced disease severity is linked to increased deletion of MOG35-55 specific CD4 T cells in TSSP-deficient NOD mice. TSSP would limit the thymic deletion of MOG35-55 specific CD4 T cells. Thus, by reducing the peptide repertoire presented by the IAg7 molecules, TSSP would limit central tolerance and favor the development of autoimmune diseases. In continuation, the second objective of my thesis work was to clarify the function of TSSP in tDC. Given the suspected role of TSSP in the class II pathway we analyzed the internalization and degradation capabilities of tDCs by flow imaging. We have shown that TSSP specifically limits the internalization of ovalbumin protein in conventional dendritic cells 2 (cDC2) and in a DC line but does not affect the degradation of endocytosed OVA. The reduction of antigens internalization in the tDC of NOD WT mice is independent of receptor-mediated endocytosis. These data suggest that, by reducing internalization of antigens, TSSP could limit the formation of peptide/MHC II complexes and antigenic presentation in the class II pathway. By this mechanism, TSSP induces a defect of central tolerance and promotes the development of autoimmune diseases

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune médiée par les cellules T caractérisée par l'infiltration de leucocytes inflammatoires dans le système nerveux central (SNC) aboutissant à la destruction de la gaine de myéline. Des rémissions cliniques sont fréquemment observées lors de la grossesse chez des patientes atteintes de SEP suggérant que les hormones, particulièrement les œstrogènes, pourraient jouer un rôle protecteur. En effet, l'administration d'œstrogènes (17beta-œstradiol, E2) inhibe l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris, le modèle animal de la SEP. Par l'utilisation de souris KO conditionnelles pour REalpha dans différentes cellules du système immunitaire, notre équipe a précédemment montré que l'inhibition de l'EAE par l'E2 était associée à une suppression de l'activation des cellules Th1 et Th17 encéphalitogènes et que cet effet était dépendant de l'expression de RE? dans les lymphocytes T. Les objectifs de ma thèse ont été d'identifier les cellules T impliquées dans l'effet protecteur de l'E2 dans l'EAE et de disséquer les mécanismes sous-jacents. Nous avons mis en évidence que de fortes doses d'E2 in vivo inhibait sélectivement la différenciation des cellules T 2D2, possédant un TCR spécifique du peptide MOG, en lymphocytes Th1 et Th17 suite à leur transfert chez des souris receveuses. En utilisant des cellules T 2D2 déficientes pour REalpha, nous avons pu mettre en évidence que l'expression de REalpha par les cellules T CD4+ spécifiques de MOG n'était pas nécessaire à l'action inhibitrice de l'E2. Ces résultats suggéraient que l'activation intrinsèque de la voie de signalisation E2/RE? dans les cellules T spécifiques de l'antigène n'avait pas d'impact sur leur différenciation en cellules T effectrices. Nous avons confirmé ces résultats par des expériences effectuées in vitro, montrant que la sensibilisation des cellules T naïves à l'E2 in vivo et in vitro n'affectait pas leur capacité à se différencier en cellules Th1, Th2, Th17 ou Treg. De plus, nous avons mis en évidence que l'E2 via REalpha agissait sur les cellules T CD4+ endogènes pour inhiber le développement des réponses Th1 et Th17 inflammatoires par un mécanisme de suppression en trans. Ensuite, nous avons montré par un modèle de transfert adoptif que les cellules T REalpha+/+, mais pas REalphaKO, sensibilisées à l'E2 conféraient une protection contre l'EAE lorsqu'elles étaient transférées avec les cellules T 2D2 naïves REalphaKO dans des souris receveuses Rag2KO REalphaKO immunisées avec MOG. De plus, en utilisant des souris déficientes pour RE? sélectivement dans les Treg Foxp3+, nous avons démontré que l'action protectrice des cellules T CD4+ bystander sensibilisées à l'E2 était non seulement maintenue mais augmentée en comparaison aux cellules contrôles exprimant RE?. Ces résultats ont donc permis de mettre en évidence que l'E2 agissait sur les cellules T CD4+ Foxp3neg pour restreindre la différenciation des cellules T encéphalitogènes en lymphocytes Th17 en trans et ainsi inhiber le développement de l'EAE
Multiple sclerosis (MS) is a T-cell mediated autoimmune disease characterized by the inflammatory leukocytes infiltration into central nervous system (CNS) resulting in myelin damages. Clinical remissions in MS patients are frequently observed during pregnancy suggesting that steroid hormones, particularly estrogens, could be protective. Indeed, administration of estrogens (17beta-œstradiol, E2) inhibits experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, the animal model of MS. Using ERalpha conditional KO mice, our group has shown previously that E2-mediated inhibition of EAE was associated with suppression of encephalitogenic Th1 and Th17 cell activation and that this effect required ERalpha expression in T cells. The objectives of my thesis aimed to identify the T cells implicated in E2 protective effect on EAE and to dissect the underlying mechanisms. We highlighted that pharmacological doses of E2 in vivo selectively inhibited MOG specific TCR 2D2 T cells differentiation into Th1 and Th17 lymphocytes following their transfer into recipient mice. Using ERalpha deficient 2D2 T cells, we have showed that ERalpha expression in MOG specific CD4+ T cells was not required for the E2 inhibitory action. These results suggested that intrinsic activation of E2/ERalpha signaling in antigen specific T cells didn't impact their differentiation into effector T cells. We confirmed these results by in vitro experiment, showing that in vitro and in vivo E2 treatment of naïve T cells didn't affect their differentiation capacity into Th1, Th2, Th17 or iTreg cells. Moreover, we highlighted that E2 acted through ER? in endogenous CD4+ T cells to inhibit inflammatory Th1 and Th17 responses by a suppressive mechanism in trans. Then, we have shown using an adoptive transfer model that E2 primed ER?+/+, but not ERalphaKO, CD4+ T cells conferred substantial protection against EAE when transferred together with 2D2 ERalphaKO transgenic T cells into naïve RagKO recipients lacking ERalpha prior to MOG immunization. Futhermore, using mice selectively lacking ERalpha in Foxp3+ Treg, we have demonstrated that E2-primed CD4+ T cell protective action was not only maintained but increased in comparison to ERalpha+/+ T cells. These results allowed us to conclude that E2 acts on CD4+ Foxp3neg T cells to restrict encephalitogenic Th17 cell differentiation in trans and inhibit EAE development

De nombreuses études épidémiologiques, cliniques et expérimentales suggèrent que la vitamine D et son récepteur, facteurs à la fois génétiques et environnementaux, pourraient jouer un rôle majeur dans l’étiologie de la Sclérose en plaques (SEP). L’objectif principal de ce travail a été de rechercher comment un dérèglement du métabolisme de la vitamine D pourrait conduire à une susceptibilité accrue à la SEP. Dans une première étude, nous avons recherché une éventuelle association entre trois polymorphismes dans la région promotrice du gène du récepteur humain de la vitamine D et la SEP, sur une population française de 600 trios. Les résultats ont été négatifs. En revanche, nous avons confirmé un effet date de naissance sur le risque de développer la SEP. Dans une deuxième étude, nous avons modélisé l’effet date de naissance chez des souris en instaurant une déficience en vitamine D (DVD) chez les femelles gestantes. A l’âge adulte, la descendance (F1 DVD) a été immunisée avec un peptide myélinique (modèle de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, EAE) et nous avons constaté qu’elle développait de manière plus tardive des symptômes moins sévères. Cette résistance à la maladie s’accompagne d’une surexpression du récepteur de la vitamine D et de protéines de stress (Heat shock protein). Dans une troisième étude, nous avons observé que les souris issues de mères carencées présentent des ventricules latéraux plus petits ainsi qu’une diminution des performances dans un test de mémoire associative. Nos résultats indiquent que la vitamine D module le risque de développer la SEP mais les mécanismes impliqués dans ce phénomène complexe restent à élucider.

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune touchant le système nerveux central. Paradoxalement, bien qu'elle soit plus fréquente chez les femmes que chez les hommes, elle est globalement moins sévère. Par ailleurs, des phases de rémission de la maladie sont fréquemment observées chez les femmes enceintes, suggérant que les hormones sexuelles pourraient exercer un effet protecteur. Il a ainsi été clairement établi que l'administration d'E2 inhibait le développement de l'EAE. Dans ce travail, nous avons évalué le rôle des hormones ovariennes endogènes et exogènes sur la susceptibilité à l'EAE chez les souris C57BL/6 femelles, et en particulier le rôle des œstrogènes via leur récepteur nucléaire de type alpha (REalpha). Dans un premier temps, j'ai pu démontrer que l'ovariectomie accroît la susceptibilité des souris au développement de l'EAE active et passive par un mécanisme impliquant REalpha montrant que les œstrogènes endogènes, exercent un effet bénéfique sur la maladie. Cet effet protecteur des œstrogènes endogènes ne semble pas s'exercer par une action directe sur les lymphocytes T encéphalitogènes et ne nécessite pas l'expression de REalpha par les cellules hématopoïétiques. En absence d'œstrogènes endogènes, j'ai mis en évidence une augmentation du recrutement précoce des cellules inflammatoires dans le système nerveux central, suggérant qu'ils régulent la migration trans-endothéliale des lymphocytes T. Dans un second temps, j'ai confirmé le rôle crucial de REalpha dans l'effet protecteur de l'E2 in vivo. J'ai également pu montrer grâce à des souris KO conditionnelles et de greffes de moelle osseuse que le compartiment hématopoïétique représentait la cible majeure de l'E2. Ensuite, à l'aide de souris invalidées de manière sélective pour le gène de REalpha dans différentes cellules du système immunitaire, comme les cellules présentatrice d'antigène (monocytes/macrophages et cellules dendritiques) et les lymphocytes T, j'ai montré que l'activation pharmacologique de REalpha, par l'E2, dans les cellules T était requise pour observer l'effet protecteur des œstrogènes dans l'EAE. En conclusion, nos résultats établissent clairement que les œstrogènes endogènes et exogènes exercent un effet protecteur sur le développement de l'EAE par des mécanismes distincts
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease which affects the central nervous system. Although MS is more frequently observed in women, disease progression is slower in women as compared to men. Moreover, variations of disease activity during pregnancy have suggested that sex hormones could modulate the autoimmune response and inflammation. Based on these observations, the effect of estrogens administration has been evaluated in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, and was shown to strongly inhibit disease development. The goal of this work was to analyze the implication of endogenous and exogenous estrogen in EAE susceptibility in females C57BL/6 mice through estrogen receptor ? signaling. In the first part of my thesis, we showed that ovariectomy increases both susceptibility and severity of mice on active as well as passive mouse induced EAE. This required a mechanism that implicated ERalpha signaling, suggesting that endogenous estrogen are important for the protective effect on EAE. The beneficial effect of endogenous estrogen doesn't seem have any action on T lymphocytes and doesn't required expression on ERalpha on hematopoietic cells. A lack of estrogen increased the early recruitment of inflammatory cells to the central nervous system, suggesting that endogenous estrogen regulates trans-endothelial migration of T lymphocytes. In the second part of my work, we confirmed the crucial role of ERalpha in the protective effect of the estrogen treatment in vivo on EAE. Using conditional ERalpha knock-out mice and bone marrow chimeras, we showed that the hematopoietic compartment is the major target of estrogens. We then used a Cre/loxP strategy to study the effect of selective deletion of ERalpha on immune cells such as monocyte/macrophages, dendritics cells or T lymphocytes on E2-mediated EAE protection. We observed that pharmacological activation of ERalpha by E2 intrinsic to T cells is crucial to mediate the anti-inflammatory effect of E2 and sustained inhibition of EAE development. In conclusion, this work provides direct genetic evidence that endogenous or exogenous estrogens protect from EAE development through distinct mechanisms that could be amenable to pharmacological manipulation to prevent central nervous system autoimmunity

L'activation dérégulée de lymphocytes T conduit à une réponse immune délétère envers les antigènes du soi. Malgré une utilisation croissante de doses élevées d'IVIg pour traiter les maladies auto-immunes, la compréhension des mécanismes sous-jacents aux bénéfices thérapeutiques demeure un enjeu majeur. En effet, les effets des IVIg restent inexplorés dans le cadre des maladies auto-immunes associées aux lymphocytes T. J'ai recherché les effets de doses élevées d'IVIg dans la polarisation des lymphocytes T en utilisant le modèle de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), une maladie auto-immune associée aux lymphocytes T. Les IVIg inhibent la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en sous-populations effectrices (lymphocytes Th1 et Th17) et induisent, de manière concomitante, une prolifération des lymphocytes T Foxp3+. Les IVIg diminuent les effets délétères des lymphocytes T sur les tissus en diminuant l'expression du GM-CSF et de la podoplanine. En outre, les IVIg empêchent la dégénérescence neuronale en inhibant l'infiltrat en lymphocytes T CD4+ dans le système nerveux central (SNC). Ce mécanisme passe par une séquestration de ces lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainants à travers la voie de signalisation S1P-S1P1-mTor. De manière intéressante, et contrairement aux données actuelles, le récepteur inhibiteur FcγRIIB et la sialylation des IVIg ne sont pas indispensables pour la modulation des sous-populations de lymphocytes T CD4+ effecteurs et régulateurs induite par les IVIg. Ainsi, le bénéfice thérapeutique des IVIg dans le modèle de l'EAE implique un déséquilibre de la balance entre les lymphocytes Th17/Th1 et les lymphocytes Trég, au profit des lymphocytes Trég. Ces cellules diminuent l'expression de médiateurs favorisant l'apparition de l'encéphalomyélite et inhibent la migration des lymphocytes T vers l'organe cible.

RAE-1 est un ligand du récepteur activateur NKG2D exprimé par les cellules NK, impliquées dans les pathologies tumorales, infectieuses et auto-immunes. Les transcrits de Rae-1 sont exprimés dans l'embryon et sont réprimés pendant le développement sauf au niveau de la zone sous-ventriculaire (SVZ), principale zone de neurogenèse. Ils sont surexprimés dans le tissu nerveux après l’induction de l’EAE et dans les bulbes olfactifs après axotomie des afférences olfactives. Les neurosphères, issues de cellules souches neurales, expriment RAE-1 et l’expression disparait dès leur différenciation en cellules neurales, reproduisant ainsi la situation développementale. RAE-1 joue un rôle nonimmun dans la prolifération cellulaire des neurosphères. La souche C57BL/6 possède 2 protéines RAE-1 : RAE-1δ et RAE-1ε. RAE-1ε est caractérisée par une affinité plus élevée pour NKG2D que RAE-1δ. On observe des différences d’expression des transcrits de Rae-1δ et Rae-1ε en fonction des lignées cellulaires, des cultures primaires et des tissus que nous avons analysés. Ces différences s’expliquent notamment par un contrôle de la transcription par des régions promotrices différentes. L’expression de Rae-1 en condition pathologique corrèle avec un recrutement de cellules immunes exprimant NKG2D et NKp46, marqueur spécifique des cellules NK. La déplétion des cellules NK avant l’immunisation induit une phase aigüe plus sévère. Celle au moment du pic inhibe la rémission. Le nombre de cellules NK, très limité au moment de la phase aigüe, augmente pendant la phase de rémission. Nous proposons que les cellules NK jouent un rôle protecteur dans l’EAE soit en agissant sur les étapes de la réponse immune en périphérie, soit en interagissant localement avec des cellules exprimant RAE-1 comme les cellules souches neurales, les cellules macrophagiques recrutées ou la microglie activée.

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle d’étude des mécanismes de recrutement des effecteurs immunitaires dans le système nerveux central (SNC), est utilisée pour tester des approches thérapeutiques pour le traitement de la sclérose en plaques (SEP). Nous avons exploré deux cibles thérapeutiques : un membre récemment identifié de la famille du TNF, TWEAK et le système métalloprotéases/inhibiteurs des métalloprotéases (MMPs/TIMPs). Une première contribution concerne l 'illustration de l’implication de TWEAK exprimé constitutivement dans le SNC comme son principal récepteur, Fn14. L’analyse de l’EAE chez des souris C57BL/6 transgéniques surexprimant du TWEAK soluble et l’injection d’anticorps bloquants aux différents stades de l'EAE nous permettent de conclure que (1) TWEAK n’exerce pas d’action, contrairement à d’autres membres de la famille du TNF, sur la réponse immunitaire et (2) que son action est limitée aux étapes de recrutement et de processus lésionnels neuroinflammatoires. TWEAK augmente la libération de cytokines, de chimiokines et de MMPs par les cellules endothéliales et les astrocytes et favorise ainsi le recrutement central de cellules immunes. Les MMPs clivent les éléments de la matrice extracellulaire (MEC) et favorisent le passage des cellules immunes aux niveaux de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de la barrière sang-LCR. L’influence de l’équilibre MMPs/TIMPs a été étudiée chez des souris 129/Sv invalidées pour l’expression d’un inhibiteur endogène des MMPs, TIMP-1. Paradoxalement, les souris TIMP-1-/- sont plus résistantes à l’EAE active alors qu’elles développent, comme attendu, une pathologie plus grave que les souris contrôles dans le modèle d’EAE par transfert adoptif. L’augmentation de l’activité métalloprotéasique peut être« anti-inflammatoire » en inhibant des étapes de la réponse immunitaire et en limitant les conséquences pro-inflammatoires dépendantes de l’activation de la voie Fas. Les données de la littérature permettent également de proposer que les observations paradoxales in vivo soient liéesà des effets « pro-inflammatoires » propres de TIMP-1. Nos travaux appellent donc à une grande prudence sur la mise en place de protocole thérapeutique ciblant les MMPs dans le but de limiter le recrutement inflammatoire dans le SNC de patients souffrant de SEP. Les voies d’entrée dans le SNC, détaillées dans l’introduction, sont multiples. La plupart des travaux ont porté jusqu’à présent sur la BHE. Le passage des lymphocytes à travers la barrière épithéliale des plexus choroïdes a été très peu étudié du fait notamment de l’absence de modèle de culture expérimental. La contribution majeure du travail a été la mise au point d’un nouveau modèle d’étude in vitro de l’épithélium choroïdien adapté à l’étude du passage des cellules immunes. Nous montrons que la barrière épithéliale est plus perméable au passage des lymphocytes T que la BHE. Le passage des lymphocytes se fait, sans aucune altération de la sélectivité de la barrière, au niveau des contacts épithéliaux tricellulaires. Ce modèle, une fois totalement caractérisé, sera utilisé pour déterminer l’influence de différentsfacteurs sur le passage de cellules immunes et étudier leurs mécanismes moléculaires de passage transépithélial. Dans les perspectives, un intérêt particulier sera porté sur le recrutement dans le SNC des populations immunes régulatrices dont les cellules NK qui exercent des rôles neuroprotecteurs dans l’EAE

Les troubles mnésiques sont fréquents dans la sclérose en plaques (SEP) mais leurs substrats anatomique et biologique sont mal connus. L’objectif de cette thèse translationnelle était de comprendre les mécanismes physiopathologiques des troubles mnésiques à la phase précoce de la SEP, avec pour perspective de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de définir de nouveaux marqueurs d’imagerie. Nous avons réalisé une analyse neuropsychologique et IRM de patients atteints de forme précoce de SEP et nous avons étudié des souris à la phase précoce d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE, le modèle animal de la SEP) avec une combinaison d’expériences comportementales, d’IRM, histologiques, électrophysiologiques et pharmacologiques. Nous avons démontré que l’atteinte hippocampique était précoce dans l’histoire de la maladie et qu’elle était corrélée au déclin mnésique des patients atteints de SEP. Nous avons identifié chez les souris EAE que la structure et la fonction du gyrus denté étaient plus vulnérables que les autres sous-champs de l’hippocampe au stade précoce de la maladie et nous avons transposé cette découverte à la pathologie humaine en démontrant une perte des capacités de pattern separation chez des patients atteints de forme précoce de SEP. Du point de vue mécanistique, nous avons démontré que l’activation microgliale précoce était responsable de l’atteinte du gyrus denté et des troubles mnésiques dans l’EAE et que cette cascade physiopathologique pouvait être prévenue grâce à un traitement par minocycline. Du point de vue de l’imagerie, nous avons également démontré que l’atteinte microstructurale de l’hippocampe ainsi que la neurodégénérescence précoce du gyrus denté pouvaient être étudiées in vivo en tenseur de diffusion (DTI). Nous travaillons à la mise en place de méthode encore plus spécifique par l’imagerie de densité neuritique et d’orientation/dispersion (NODDI). Nos résultats relient l’atteinte mnésique précoce de la SEP à une neurodégénérescence sélective du gyrus denté. Ce processus physiopathologique peut être prévenu en inhibant l’activation microgliale chez les souris EAE et peut être étudié in vivo grâce au DTI chez la souris comme chez l’homme, offrant d’évidentes perspectives cliniques dans la prise en charge des patients atteints de SEP
Memory impairment is frequent in multiple sclerosis (MS) but its anatomical and biological substrates are poorly understood. The objective of this translational thesis was to understand the pathophysiological mechanisms of early memory impairment in MS, to find new potential therapeutic targets and to define new imaging biomarkers related to memory impairment. We used neuropsychological and MRI experiments in patients with early MS and we explored experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice (a mouse model of MS) at the early stage of the disease with a combination of behavioral, in vivo MRI, histological, electrophysiological and pharmacological approaches. In patients with MS, we demonstrated that hippocampal damage occurs early during the course of the disease and that it correlates with memory impairment. In EAE-mice, we identified that dentate gyrus structure and function are more vulnerable than other hippocampal subfields at the early stage of the disease and we translated this finding back to humans by demonstrating loss of pattern separation performances in patients with early MS. From a mechanistic point of view, we demonstrated that early microglial activation causes dentate gyrus disruption and memory impairment in EAE-mice and that this pathophysiological cascade can be prevented with minocycline. From the imaging point of view, we demonstrated that hippocampal microstructural damage and early dentate gyrus degeneration can be monitored in vivo with diffusion tensor imaging (DTI). We are currently developing more specific imaging approaches with optimization of the Neurite Orientation Dispersion and Density Imaging (NODDI) to assess hippocampal subfields. Our results link early memory impairment in MS to a selective disruption of the dentate gyrus. We were able to prevent this neurodegenerative process with microglial inhibitors in EAE-mice and to capture these features non-invasively with DTI in both humans and rodents, paving the way toward new clinical perspectives in MS

La sclérose en plaques est une maladie chronique, auto-immune et neurodégénérative qui se traduit par l’apparition de plaques inflammatoires démyélinisantes dans le système nerveux central. Pour caractériser la réponse immunitaire innée, j’ai développé des outils d’imagerie optique non linéaire multispectrale intravitale, et des solutions semi automatisées d’analyse d’images. J’ai participé à la mise au point d’un protocole d’identification des phénotypes immunitaires en cytométrie. Ces outils appliqués à l’étude de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle murin de SEP, ont permis d’analyser la cascade immunitaire par immunomarquages et marquages fluorescents transgéniques, de décrire les distributions des populations cellulaires dans le SNC, et de les associer à la dégradation axonale sur des échelles de temps de la seconde à la semaine. Sur une lignée de souris transgénique, Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, j’ai suivi en microscopie biphotonique l’évolution des densités de cellules fluorescentes dans la moelle épinière pendant plusieurs semaines. J’ai conclu que la dégénération axonale et les déficits moteurs sont corrélés avec l’infiltration par les méninges de neutrophiles et monocytes. Les monocytes se différencient in situ en cellules dendritiques d’origine monocytaire (moDCs) parallèlement à l'activation de la microglie. Ces événements cellulaires, dont la maturation des moDCs sont corrélés avec la résorption de l’inflammation. La méthodologie est en place pour poursuivre ces investigations sur d’autres modèles. L’optimisation du microscope m’a aussi permis d’accéder simultanément au contraste endogène CARS pour visualiser la gaine de myéline
Multiple sclerosis is a chronic auto-immune neurodegenerative disease characterized by the appearance of inflammatory plaques in the central nervous system. To characterize the innate immune response I have developed nonlinear optical tools for intravital multispectral imaging as well as semi-automated image processing solutions. I also contributed to the development of a flow cytometry protocol allowing the identification of immune cell phenotypes. Applied to study of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, a mouse model of MS, these tools have allowed to analyze the immune cascade thanks to immunolabelings and transgenic expression of fluorescence, describe the distributions of cell populations in the CNS with regard to neuron degeneration on time scales ranging from seconds to weeks. On a transgenic mouse line Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, I have followed by two-photon microscopy the evolution of fluorescent cells densities in the same area of the spinal cord for several weeks. I conclude that axonal degeneration and motor deficits are correlated with neutrophils and monocytes infiltration from the meninges. The monocytes differentiate in situ in monocyte-derived dendritic cells (moDCs) along with the recruitment of activated microglia. These cellular events correlated with a stabilization/remission phase of the disease. MoDCS maturation thus seems involved in the dampening of inflammation. Methodology and tools are now set for further investigations with other models. The microscope optimization for multicolor excitation allowed me to access simultaneously to the endogenous CARS contrast to visualize the myelin sheath

Les immunoglobulines polyclonales intraveineuses (IVIG) sont préparées à partir de plasmas provenant de plusieurs milliers de donneurs sains et utilisées comme traitement dans de nombreuses maladies inflammatoires et autoimmunes. Lors de ma thèse, j’ai investigué si cette thérapie pouvait interférer avec la détection sérique du virus Zika chez des patients atteints du syndrome de Guillain-Barré (GBS). J’ai démontré que la thérapie par IVIG n’interférait pas avec la détection sérique du virus dans le plasma des patients atteints de GBS suivant un traitement aux IVIG. Contrairement aux souris, les IVIG peuvent activer les basophiles humains par une voie différente que celle de l’IL-33. Les IVIG induisent la sécrétion d’Il-4, IL-6 et IL-8 par interaction directe avec les IgE à la surface des basophiles. Cette fonction est dépendante de la fraction F(ab’)2 et implique l’activation de Syk. Ces résultats montrent un nouveau mécanisme dans l’activation des basophiles humains par les IVIG. La dernière partie de ma thèse m’a permis d’étudier le rôle de la voie de signalisation β-caténine sur les effets anti-inflammatoires médiées pars les IVIG. La β-caténine, composante de la voie Wnt, joue un rôle important dans la tolérogénicité des cellules dendritiques (DC) et dans la protection contre l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Les données générées montrent que les IVIG activent la voie β-caténine chez les DC humains en plus de la production de Wnt 5a nécessitant une IgG complète ainsi que les co-récepteurs LRP5/6. En dépit de l’induction de β-caténine par les IVIG, cette voie est dispensable pour ses actions anti-inflammatoires in vitro et in vivo dans le modèle EAE
Intravenous immunoglobulin (IVIG) is a therapeutic preparation of pooled normal IgG obtained from the several thousand healthy donors. It is established as first-line therapy for many autoimmune and inflammatory diseases. In the first part of my thesis, I have investigated if IVIG therapy interferes with the serological detection of Zika virus infection in Guillain–Barré syndrome (GBS) patients. By analyzing the plasma of GBS patients treated with IVIG for anti-Zika IgG, I have demonstrated that IVIG therapy in GBS patients does not interfere with the serological Zika detection. The second part addresses the immunoregulatory role of IVIG on human basophil function. Unlike in mice, IVIG does not require DC-SIGN-dependent IL-33 for the activation of human basophils. IVIG directly induces the activation of IL-3-primed human basophils and secretion of IL-4, IL-6, and IL-8 by directly interacting with the basophil surface-bound IgE. This function was F(ab’)2-dependent and involves Syk activation. These results demonstrate a novel mechanism of human basophil activation by IVIG. The last part unravels the signaling pathways associated with IVIG-mediated anti-inflammatory effects specifically the Wnt/β-catenin pathway, which imparts tolerogenic properties to dendritic cells (DCs) and protection against experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). My data shows that IVIG activates β-catenin in human DC along with upregulation of Wnt 5a. Activation of β-catenin requires intact IgG and LRP5/6 co-receptors. However, despite the activation of β-catenin by IVIG, this pathway is dispensable for its anti-inflammatory actions both in vitro and in vivo in the EAE model

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique, autoimmune, inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central (SNC). Le rôle des lymphocytes B (LB) dans la pathogénèse de la SEP reste complexe, décrit parfois comme pathogène, régulateur ou réparateur. Dans un premier temps, notre travail a été réalisé sur un modèle animal de SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Le modèle à rechutes, induit par immunisation active de souris femelles SJL/J (H2s) par le peptide encéphalitogène de la protéine protéolipidique de la myéline (pPLP139-151) a été utilisé. La comparaison avec des souris femelles B10.S, congéniques pour le complexe H2, et décrites comme résistantes car ne développant pas de signes cliniques caractéristiques de l’EAE après immunisation active, nous a permis d’étudier l’implication des sous-populations lymphocytaires B au cours du développement de la pathologie. L’utilisation de ces modèles susceptible/résistant nous a permis de démontrer l’implication de l’homéostasie des sous-populations lymphocytaires B dans la physiopathologie de la réponse auto-immune. Dans un second temps, ces observations ont été confirmées par des études réalisées chez l’Homme, dont la répartition des sous-populations lymphocytaires B circulantes présente un déséquilibre homéostatique lors des premières phases de la maladie. En effet, nous avons observé que les LB transitionnels, aussi connus sous le nom de LB immatures tardifs, présentent des altérations quantitatives (nombre de cellules circulantes) et qualitatives (état d’activation particulier et expression accrue de molécules d’adhésions impliquées dans le processus d’extravasation leucocytaire). Ces caractéristiques, spécifiques des LB transitionnels de patients SEP, ont été associées au recrutement de ces cellules au sein du SNC. Ces résultats originaux mettent en exergue que les LB mémoires et les plasmablastes ne sont pas les seules populations lymphocytaires B impliquées dans de développement de la SEP
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory demyelinating disease affecting the central nervous system (CNS). The role of B-lymphocytes in MS pathogenesis remains unclear, since they have been described to have pathogenic and regulatory effects, and also to be involved in remyelination process. To better understand the mechanisms underlying MS, we used the well-studied animal model, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by the encephalitogenic peptide 139-151 of the myelin proteolipid (PLP139-151) in females SJL/J mice, which presents at least one relapsing/remitting episode. Unlike SJL/J model, females B10.S (congenic for the H2 complex) do not develop the clinical signs characteristics of the EAE after active immunization. Thus, B10.S mice are considered as resistant to the disease induction. The experimental approach carried out in the susceptible/resistant EAE models highlighted the involvement of the B-cell homeostasis on the physiopathology of the autoimmune responses. These observations were confirmed in patients with MS, which showed altered B-cell subsets balance during the early phases of the disease. In fact, transitional B cells, also known as late-immature B cells, showed quantitative (cell numbers) and qualitative (a particular activation status and an increased expression of several adhesion molecules involved in the leukocyte extravasation) modifications. These characteristics, exclusively found in transitional B cells from patients with MS, were associated to their ability to home the central nervous system. Altogether these findings highlighted that B-cell involvement in MS pathogenesis may not be exclusively restricted to memory B cells

Jusqu’à 90% des patients atteints de sclérose en plaque (SEP) présentent des lésions dans la moëlle épinière. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) des lésions médullaires demeure un challenge difficile et par conséquent, leur développement et le lien avec la progression clinique du patient restent à ce jour fortement méconnus. Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez le marmoset présente des caractéristiques lésionnelles cérébrales ainsi que des déficits sensori-moteurs se rapprochant fortement de la SEP. L’objectif de cette thèse a été de développer de nouveaux protocoles IRM à 7T en association avec des analyses histopathologiques afin de caractériser le type de lésions médullaires et de suivre leur évolution spatio-temporelles chez le marmoset EAE. Notre première étude postmortem nous a permis de démontrer une forte ressemblance des lésions focales avec celles retrouvées chez les patients SEP, ainsi que une grande hétérogénéité des lésions subpiales entre animaux le long de la moelle épinière. Dans un second temps, nous avons mis en place une routine expérimentale robuste adapter à la morphologie de l’animal, ainsi que la création d’une antenne 12-canaux en réseau phasé. Pour la toute première fois, nous avons imager in vivo la totalité de la moëlle épinière de nos primates au cours de la maladie. Nous avons trouvé une forte corrélation entre la charge lésionnelle médullaire et les scores cliniques. Ces nouveaux éléments soulignent la pertinence des lésions médullaires chez le marmoset EAE pour étudier les mécanismes de développement des lésions chez les patients SEP
Up to 90% of multiple sclerosis (MS) patients present spinal cord lesions. Magnetic resonance imaging (MRI) of spinal cord lesions is still a difficult challenge. Consequently, the evolution of spinal cord lesions in MS and their contribution to disease progression remain poorly understood. The brain of common marmoset with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) displays closer radiological and pathological features as well sensori-motor deficits with MS. The objective of this thesis was to develop new MRI protocols at 7 Tesla in association with histopathological analysis to better characterize the type of spinal cord lesions in the marmoset EAE, and to understand their spatiotemporal evolution. A first postmortem study demonstrated a strong resemblance to MS focal lesions in terms of shape and distribution, as well a heterogeneous subpial pathology between animals and along the spinal cord length. Secondly, we implemented a robust in vivo experimental setup in order to adapt to the morphology of the animals and created a 12-element phase-array coil. This new setup enabled us to image for the first time the entire spinal cord of nonhuman primates with EAE during the disease. We also found a strong association between the lesion load and the disability scores. These new findings highlight the relevance of the spinal cord lesions in the marmoset EAE model for studying the disease mechanisms of spinal cord lesions in MS

Les cellules iNKT, une sous-population de cellules T, expriment un TCRαβ très conservé constitué d'une chaîne a invariante et des marqueurs spécifiques des cellules NK. Ils reconnaissent des antigènes glycolipidiques présentés par la molécule de classe I non classique CD1d et sécrètent rapidement de grandes quantités de cytokines variées, ce qui leur permet d'exercer de nombreux effets dans de diverses maladies inflammatoires ou auto-immunes. Dans l'EAE, la protection contre la maladie par les lymphocytes iNKT est associée à une infiltration des cellules iNKT doubles négatives dans le SNC et à une expression locale de CD1d. Cette protection est indépendante de l'expression de CD1d en périphérie. Dans l'ALD, autre pathologie neurodégénérative, les patients ont une fréquence réduite de lymphocytes iNKT et une expression diminuée de CD1d à la surface des cellules B. Enfin, les lymphocytes iNKT 17 étant détectés à une fréquence beaucoup plus élevée chez la souris NOD que chez la souris C57BL/6, nous avons cherché à identifier leur rôle dans le diabète de type 1
INKT cells are a subpopulation of T cells that express a highly conserved αβTCR characterized by an invariant a chain, along with specific markers of NK cells. They recognize glycolipid antigens presented by the non classical class I molecule CD1d and secrete rapidly large amounts of various cytokines, which enables them to exert numerous effects in various inflammatory or autoimmune diseases. In EAE, the prevention from the development of the disease by iNKT lymphocytes is associated with an infiltration of double negative iNKT cells in the CNS and a local expression of CDld molecule. This prevention is independent from the peripheral CD1d expression. In ALD, another neurodegenerative pathology, patients have a lower frequency of iNKT cells and a decreased expression of CD1d on the surface of B cells. Finally, we were interested in identifying the role of iNKT 17 lymphocytes in type 1 diabetes, these lymphocytes being detected in a higher frequency in NOD mice than in C57BL/6 mice

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Multiple sclerosis is an idiopathic inflammatory disease of the central nervous system. It is characterized by the formation of focal perivascular lesions and demyelination of the surrounding area, which appear concomitantly to a massive immune cell infiltration and disruption of the blood brain barrier. Experimental autoimmune encephalomyelitis is the animal model most extensively used for the study of multiple sclerosis. Unfortunately, this model does not mimic many aspects of the human disease. The goal of this project is to further the characterization of a new transgenic model of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis, the TCR1640 model, and to validate it as a relevant tool for the study of multiple sclerosis physiopathology and treatment. The TCR1640 mouse possesses a transgenic T cell receptor which recognizes a myelin peptide and triggers an autoimmune response against endogenous myelin in the central nervous system. In situ and in vitro observations have led to the identification of early changes which appear at the neurovascular unit in presymptomatic TCR1640 animals. This early disruption of blood brain barrier homeostasis is linked to the establishment of a proinflammatory immune profile in the periphery. Animals at the chronic stage show sustained inflammation of the central nervous system parenchyma and massive leukocyte infiltration, compared to animals in acute phase of disease. An in vivo experiment has allowed modulating the disease by treatment with a multiple sclerosis-approved therapy, in wild type mice which had received reactivated CD4+ T cells from TCR1640 animals. Finally, the implication of new cell adhesion molecules in the development and maintenance of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis has been suggested by in vitro study of melanoma cell adhesion molecule (CD146) and activated leucocyte cell adhesion molecule (CD166). The results obtained in this study suggest that the TCR1640 model is a valuable asset in the study of neuroimmune diseases such as multiple sclerosis. It could also be used to validate new therapeutic strategies for the treatment of this disease.

Introduction: La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central (SNC). Les lymphocytes T pro-inflammatoires CD4 TH1/TH17 sont considérés pathogéniques en SEP et dans son modèle animal, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). La restriction alimentaire en méthionine (MR) est associée à un effet anti-inflammatoire en périphérie. Cependant, l’impact de la disponibilité de la méthionine sur la fonction des lymphocytes T et sur la neuroinflammation centrale médiée par les lymphocytes T dans la SEP et l'EAE n’est pas connu. Il a été récemment découvert que le métabolisme de la méthionine est induit dans les lymphocytes T murins activés in vitro et que la restriction en méthionine affecte les fonctions effectrices et la prolifération des lymphocytes TH17. Nous formulons donc l’hypothèse que la manipulation du métabolisme des lymphocytes T via la restriction diététique en méthionine représente une nouvelle voie thérapeutique pour contrôler les maladies neuroinflammatoires telles que la SEP. Méthode: Des femelles C57BL/6 sont exposées à une diète contrôle ou réduite en méthionine puis immunisées au MOG35-55 pour induire une EAE active. Un suivi clinique et des expériences de cytométrie en flux permettent de caractériser le profil et l’activation immunitaire. Le prélèvement d'échantillons fécaux et le séquençage de l'ARNr 16S permettent d’évaluer l'influence de la diète sur la composition du microbiome intestinal. Résultats: La MR est associée à un délai significatif de l'apparition des déficits neurologiques chez les femelles C57BL/6 immunisées au MOG. Ceci est associé à une réduction du nombre de cellules immunitaires et de lymphocytes T pro-inflammatoires dans la rate au 7e jour post-induction (présymptomatique) et dans le SNC aux jours 10-13 (début) et 15-16 (pic). Nos résultats préliminaires suggèrent que le microbiome intestinal des souris sous la MR est différent de celui des souris sous la MC et est enrichi de bactéries ayant des effets bénéfiques en inflammation. Conclusion: Nos résultats suggèrent un impact bénéfique de la MR sur l'évolution clinique et les processus neuroinflammatoires dans un modèle animal de SEP.
Introduction: Multiple Sclerosis (MS) is an inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Pro-inflammatory CD4 TH1/TH17 are considered pathogenic in MS and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Dietary methionine restriction (MR) is associated with an anti-inflammatory impact in the periphery. However, little is known about how methionine availability can affect the function of T lymphocytes and impact T-lymphocytes mediated central neuroinflammation in MS and EAE. It was recently discovered that methionine pathway is upregulated in activated murine T lymphocytes in vitro and that methionine restriction affects the effector functions and proliferation of TH17 lymphocytes. We therefore hypothesize that the manipulation of T lymphocyte metabolism via the restriction of dietary methionine intake represents a new therapeutic avenue for controlling neuroinflammatory diseases such as MS. Method: Active MOG35-55-EAE is induced in C57BL/6 female mice exposed to low methionine vs. control diet. Clinical evaluation and flow cytometry studies are used to characterize immune cells phenotype and activation. Fecal samples are collected and 16S rRNA sequencing is used to assess the influence of the diet on the composition of the intestinal microbiome. Results: Dietary MR is associated with a significantly delayed onset of neurological deficits in active EAE (female mice). This is paralleled by a lower number of immune cells and pro-inflammatory T lymphocytes in the spleens at day 7 post-induction (presymptomatic) and in the CNS at day 10-13 (onset) and 15-16 (peak). Our preliminary results suggest that the intestinal microbiome of mice under dietary MR is different from that of mice under control diet and is enriched for bacteria with beneficial effects on inflammation. Conclusion: Our results suggest a beneficial impact of MR on clinical course and neuroinflammation in an animal model of MS.

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires.
Objective: In multiple sclerosis (MS), pro-inflammatory lymphocytes use adhesion molecules to cross the blood-brain barrier (BBB) and accumulate in central nervous system (CNS) lesions. CD4 T lymphocytes polarized into auto-aggressive encephalitogenic TH17 (IL-17 secreting) are known to partake in MS lesion formation. Much less is known about the role of CD8 TC17. Identification of specific surface markers and adhesion molecules expressed by TH17 and TC17 lymphocytes would allow further characterization of these pathogenic subsets and would provide new therapeutic targets in MS. Methodology: We identified MCAM in a proteomic screen of human BBB endothelial cells (ECs) and on a subset of T lymphocytes. We characterized the phenotype and function of MCAM-expressing cells ex vivo, in vitro and in situ using human and mouse material obtained from controls, MS subjects and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) animals. Results: MCAM is expressed by human BBB-ECs and by human effector memory CD161+ and CCR6+ T lymphocytes. Both CD4 and CD8 MCAM+ lymphocytes express more IL-17, IL-22, GM-CSF and Gz B than MCAMneg lymphocytes. Moreover, MCAM is strikingly up-regulated in human on CD4+ and CD8+ T lymphocytes during MS relapses, while treatment decreases MCAM expression. In situ, MCAM+ CD8 and CD4 T lymphocytes are present in perivascular infiltrates of MS and EAE CNS specimens, while MCAM expression is up-regulated on BBB-ECs within lesions. In vitro, MCAM+ CD8 T lymphocytes display higher killing capacity of oligodendrocytes, and MCAM blockade reduces CD8 TC17 and CD4 TH17 transmigration across human BBB-ECs. In vivo, depletion of MCAM+ cells from reactivated CD4 T lymphocytes and from CD8 T lymphocytes decreases clinical symptoms in adoptive transfer EAE. Furthermore, expression of MCAM is up-regulated on CD4 and CD8 T lymphocytes in the TCR1640 transgenic mice, a model of spontaneous EAE. Finally, blocking MCAM in both MOG35-55-induced and spontaneous primary progressive EAE attenuates chronic neurological deficits. Conclusions: Our data demonstrate that encephalitogenic IL-17-producing lymphocytes with high effector and migratory capacity express MCAM, and that MCAM could serve as a biomarker for MS and a valuable target for the treatment neuroinflammatory conditions.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées.
Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.

Chez les patients atteints de la sclérose en plaques (SEP), les lymphocytes T autoréactifs utilisent des molécules d'adhérence (CAM) pour traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE), pénétrer dans le système nerveux central (SNC) et médier la détérioration de la myéline. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) constituent l’un des éléments clés de la tolérance immunitaire, protégeant contre les réactions auto-immunes. Cependant, l'entrée et la fonction des Treg dans le SNC restent largement inconnues. Notre laboratoire a démontré la contribution de plusieurs CAM, dont la molécule melanoma cell adhesion molecule (MCAM), dans la migration des lymphocytes pathogéniques à travers la BHE. L'objectif de cette étude est de déterminer si les Treg migrent dans le SNC en utilisant MCAM et s’ils exercent des fonctions anti-inflammatoires qui pourraient atténuer l'inflammation du SNC. L'expression de MCAM, des marqueurs fonctionnels de Treg (CTLA-4, CCR6, CCR5), ainsi que leur sécrétion de cytokines (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), ont été étudiées sur des Treg du sang périphérique, du liquide céphalo-rachidien (LCR) et de la culture in vitro, provenant de patients atteints de SEP et d’individus sains (HC), par cytométrie de flux, en corroboration avec qPCR et ELISA. De plus, la présence de MCAM+ Treg dans le SNC a été évaluée par immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, noyaux) sur des souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Nos données ont montré une augmentation de l'expression de MCAM sur les Treg de patients atteints de la forme cyclique de SEP (RRMS) par rapport aux HC. Nous avons observé une tendance vers une fréquence plus élevée de MCAM+ Treg dans le LCR par rapport au sang périphérique des patients atteints de SEP, ce qui suggère que MCAM pourrait jouer un rôle important dans la migration des Treg. Ces cellules MCAM+ Treg semblent avoir un phénotype plus fonctionnel et anti-inflammatoire que leurs contreparties MCAM-. De plus, nous avons trouvé des niveaux plus élevés de MCAM+ Treg dans les périodes de rémission de l'EAE, ce qui souligne leur implication durant cette phase de la maladie. Dans l'ensemble, nos données montrent que MCAM est une CAM essentielle pour la migration des Treg vers le SNC.
In multiple sclerosis (MS), autoreactive T cells upregulate cellular adhesion molecules (CAMs) to cross the blood brain barrier (BBB), enter the central nervous system (CNS) and mediate damage to myelin. Regulatory T cells (Treg) are one of the key components of immune tolerance, protecting against autoimmune reactions. However, Treg's entry and function in the CNS remains largely unknown. Our lab has demonstrated the contribution of several CAMs, including melanoma cell adhesion molecule (MCAM), in the migration of pathogenic lymphocytes across the BBB. The goal of this study is to determine whether Treg migrate into the inflamed CNS using MCAM and exert anti-inflammatory functions, possibly dampening CNS inflammation. The expression of MCAM and Treg functional markers and chemokine receptors (CTLA-4, CCR6, CCR5,), as well as cytokine secretion (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), were studied on MS patients and healthy individuals (HC) Treg from the peripheral blood, cerebrospinal fluid (CSF), and in vitro culture, by flow cytometry, in corroboration with qPCR and ELISA. Moreover, the presence of MCAM+ Treg in the CNS was assessed by immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, nuclei) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) affected mice. Our data showed an increase in the expression of MCAM on Treg during relapse-remitting MS patients (RRMS) compared to HC. We observed a trend for a higher frequency of MCAM+ Treg cells in the CSF versus the peripheral blood of MS patients, suggesting that MCAM might play an important role in the migration of Treg. These MCAM+ Treg seem to have a more functional and anti-inflammatory phenotype than their MCAM- counterparts. Moreover, we found higher levels of MCAM+ Treg in periods of EAE remission, underlining their involvement during this disease phase. Overall, our data depicts MCAM as an essential CAM for Treg homing to the CNS.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) caractérisée par de l’infiltration leucocytaire et de la démyélinisation axonale. Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) jouent un rôle primordial dans ce processus en activant dans la périphérie les lymphocytes T réactifs contre la myéline. Les lymphocytes activés peuvent traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et infiltrer le SNC. Les lymphocytes sont ensuite réactivés dans l’espace périvasculaire par les APC, suite à quoi ils contribuent à la démyélinisation et aux dommages axonaux. Nétrine-1 (N1) est une protéine de guidance axonale possédant d’importantes propriétés anti-inflammatoires. L’importance de N1 dans le maintien de la BHE et l’inhibition de l’infiltration leucocytaire dans le SNC a été bien démontrée, mais son implication dans la présentation antigénique et la régulation de l’activation lymphocytaire n’a jamais été étudiée. Le présent ouvrage propose l’hypothèse que N1 est produite par les APC afin de réguler la neuro-inflammation. Il cherche à caractériser l’expression de N1 par les APC, déterminer l’influence de N1 sur l’activation lymphocytaire et explorer le rôle de la production de N1 par les APC dans la neuro-inflammation. Les expériences menées à terme dans le cadre de ce projet démontrent que N1 est exprimée par les cellules dendritiques matures et les macrophages de type M1. De plus, N1 a pour effet de stimuler la prolifération des lymphocytes TH1, TH17 et CD8+. N1 inhibe également la production de cytokines par les lymphocytes TH17 et diminue l’expression de perforine par les lymphocytes T CD8+. N1 n’a toutefois pas d’influence sur l’expression des molécules d’adhérence par les lymphocytes T. Enfin, les cellules dendritiques, macrophages et cellules microgliales n’expriment pas N1 dans le SNC des souris dans le cadre de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de SEP. En somme, les résultats ici présentés suggèrent que N1 est produite par les APC afin d’influencer le fonctionnement des lymphocytes T.
Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disorder of the central nervous system (CNS) characterized by leukocytic infiltration and axonal demyelination. Antigen presenting cells (APCs) play a crucial role in this process by activating myelin-reactive lymphocytes in the periphery. Activated lymphocytes subsequently cross the blood-brain barrier (BBB) and infiltrate the CNS. These lymphocytes are reactivated in the perivascular space by APCs, following which they contribute to demyelination and axonal damage. Netrin-1 (N1) is an axonal guidance protein with considerable anti-inflammatory properties. The relevance of N1 in maintaining BBB function has been thoroughly established, but its involvement in antigen presentation and T cell activation has yet to be studied. This project investigates the hypothesis that N1 is produced by APCs to regulate neuroinflammation and aims to characterize N1 production by APCs, delineate the impact of N1 on T cell activation and clarify the role of APC-derived N1 in neuroinflammation. The results presented in this thesis demonstrate that N1 is produced by mature dendritic cells and M1 macrophages. Furthermore, N1 is shown to increase T cell proliferation, decrease TH17 cell cytokine production and decrease CD8+ T cell perforin expression. N1 does not alter T cell expression of adhesion molecules. Finally, N1 is not expressed by the CNS dendritic cells, macrophages or microglial cells of mice undergoing experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for MS. In summary, these results suggest that N1 is produced by APCs to modulate T cell function.

But : La perte de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) est l’une des caractéristiques principales de la sclérose en plaques. Cette augmentation de la perméabilité est associée à une désorganisation des molécules de jonction serrée et à une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence essentielles à l’extravasation des cellules immunitaires. Identifier de nouvelles molécules impliquées dans ce processus est donc crucial pour le développement de nouvelles thérapies contre la sclérose en plaques visant à promouvoir l’intégrité de la BHE et à diminuer la migration des leucocytes dans le système nerveux central (SNC) au cours du processus neuro-inflammatoire. Dans cette étude, le rôle spécifique de la molécule d’adhérence ALCAM, qui est exprimé à la surface des cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et de certains sous-types de leucocytes, a été évalué. Méthodologie : À l’aide d’une analyse protéomique exhaustive, notre laboratoire a identifié ALCAM comme étant une molécule d’adhérence surexprimée par les CE-BHE mises en culture dans un milieu pro-inflammatoire. Dans le but d’étudier le rôle spécifique d’ALCAM durant la diapédèse leucocytaire, nous avons induit chez des souris de type sauvages et des souris ALCAM déficientes l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle animal de la sclérose en plaques. Le rôle d’ALCAM a aussi été étudié à l’aide d’un système d’adhérence sous flux laminaire. Cet appareil, qui imite un capillaire cérébral, permet de suivre en temps réel le mouvement des leucocytes, soumis à une pression physiologique, dans un tube couvert à sa base par des CE-BHE. Résultats : En utilisant ce système d’adhérence, j’ai pu démontrer que des anticorps dirigés contre ALCAM réduisent de façon significative le roulement et l’adhérence de monocytes CD14+ humains à la surface de CE-BHE. Par ailleurs, ces anticorps préviennent de façon marquée la diminution de la vitesse moyenne des cellules au cours de l’expérience. Par le fait même, j’ai aussi observé une réduction significative de l’extravasation des monocytes traités avec de l’anti-ALCAM au travers de CE-BHE dans un modèle statique de migration. Subséquemment, j’ai démontré que ces monocytes migrent plus rapidement et en plus grand nombre au travers d’une barrière constituée de cellules endothéliales méningées à comparer à des CE-BHE. Bien que des observations similaires ont été effectuées en utilisant des lymphocytes T CD4+ humains ex vivo, j’ai été incapable de reproduire ces résultats à l’aide de cellules Th1 et Th17 réactivées in vitro. Par opposition à nos données in vitro, j’ai découvert que les souris déficientes en ALCAM développent une EAE active plus sévère que celle observée chez des souris de type sauvages. Cette EAE est par ailleurs associée à une infiltration périvasculaire de lymphocytes T pro-inflammatoires et de monocytes/macrophages de type M1 plus marqué chez les souris ALCAM déficientes. L’induction d’une EAE par transfert adoptif, dans laquelle des cellules immunitaires de type sauvage réactivées par du MOG sont injectées à des souris déficientes en ALCAM, suggère que la pathophysiologie observée durant l’EAE active serait liée à l’absence d’ALCAM au niveau de la BHE. Une caractérisation de la barrière des souris ALCAM déficientes non immunisées a par la suite révélé une réduction de l’expression de certaines molécules de jonction serrée. Une analyse plus poussée a par ailleurs démontré qu’ALCAM est lié indirectement à des molécules de jonction serrée des CE-BHE, ce qui expliquerait l’augmentation de la perméabilité de celle-ci chez les souris déficientes en ALCAM. Une analyse de la perméabilité intercellulaire de la BHE effectuée in vitro a d’autre part corrélé ces résultats. Conclusion : Collectivement, nos données prouvent qu’ALCAM joue un rôle prépondérant dans la diapédèse des monocytes, mais pas des lymphocytes Th1 et Th17 au travers de la BHE. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’ALCAM remplit une fonction biologique cruciale favorisant le maintien de l’intégrité de la BHE en agissant comme molécule adaptatrice intermédiaire entre les molécules de jonction serrées et le cytosquelette. De cette façon, l’absence d’ALCAM au niveau des CE-BHE promeut indirectement le recrutement de leucocytes pro-inflammatoires dans le SNC des souris atteintes de l’EAE en augmentant la perméabilité des vaisseaux sanguins de la BHE.
Aim: The loss of blood-brain barrier (BBB) integrity is a hallmark of multiple sclerosis. It is associated with a disorganization of junctional molecules and an upregulation of cell adhesion molecules essential for immune cell transmigration. Identifying novel key players involved in this process is thus crucial for the development of MS therapies aimed at promoting BBB integrity and decreasing leukocytes trafficking into the central nervous system (CNS) during neuroinflammation. In this study, the specific role of the adhesion molecule ALCAM, found on BBB endothelial cells (BBB-ECs) and subsets of leukocytes, was assessed. Methods: We first identified ALCAM as an important molecule upregulated during inflammation in a proteomic screen of in vitro cultured primary human BBB-ECs. In order to study the effects of ALCAM on leukocyte transmigration, both active and passive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in ALCAM KO and WT animals. The specific role of ALCAM during leukocyte transmigration was also assessed using a modified adhesion assay under sheer-stress, in which leukocytes flow across a capillary-like channel lined with a monolayer of BBB-ECs under physiological pressure. Results: Using the modified adhesion assay, we demonstrated that anti-ALCAM blocking antibodies significantly reduce the rolling and the adhesion of human CD14+ monocytes interacting with primary human BBB-ECs, as well as prevent their overall decrease in velocity. Concurrently, we also observed a significant reduction in the migration of ex vivo CD14+ monocytes, across a monolayer of human BBB-ECs. These monocytes also migrated more rapidly and in higher number across meningeal endothelial cells, as compared to BBB-ECs. While similar observations were made using ex vivo CD4+ T lymphocytes, we failed to reproduce these results using in vitro activated Th1 and Th17 cells. In opposition to our in vitro data, ALCAM KO mice developed a more severe active EAE associated with a significant increase in perivascular infiltration of pro-inflammatory lymphocytes (Th1/Th17) and M1 monocytes/macrophages, as compared to WT controls. In addition, EAE transfer experiments, in which ALCAM KO mice received WT MOG-reactivated splenocytes, suggested that the pathophysiology observed in active EAE was linked to the absence of ALCAM on BBB-ECs. Phenotypic characterization of un-immunized ALCAM KO mice revealed a reduced expression of BBB junctional proteins. Further analysis showed that ALCAM is indirectly associated with tight junction molecules of the BBB-ECs, which explains the increased CNS parenchymal blood vessel in vivo permeability in ALCAM KO animals. Correlating with these data, primary culture of mouse brain BBB-ECs was shown to possess a lower TEER and an increased permeability coefficient. Conclusion: Collectively, our data provide evidence of the implication of ALCAM in monocyte transmigration, but not Th1 or Th17 lymphocyte diapedesis across CNS endothelium. Our results also point to a biologically crucial function of ALCAM in maintaining BBB integrity by acting as an adaptor molecule between tight junctions and the cytoskeleton. As such, the absence of ALCAM at the level of BBB-ECs indirectly promotes the recruitment of pro-inflammatory leukocytes in the CNS of EAE animals by increasing the BBB vessels permeability.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP.
Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated disorder of the central nervous system (CNS) characterized by multifocal areas of leukocyte infiltration and demyelination associated with a breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Typically, demyelination is centered around perivascular accumulation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, monocytes, macrophages and dendritic cells (DCs) that arise from migration of peripheral blood immune cells across the CNS microvascular endothelium. We have thus suggested that the migration across the BBB of immune cells subsets from the blood is controlled by molecular mechanism specific for each cell type. To answer this hypothesize, we have performed four different studies. We first show a beneficial effect of statins on the BBB, restricting the migration of lymphocytes and monocytes as well as the diffusion of soluble molecular tracers. This phenomenon is mediated through abrogation of isoprenylation processes that is probably inhibiting the ability of endothelial cells of the BBB to contract. We also show that CD14+ monocytes migrate across the inflamed human blood BBB and differentiate into DCs in response to BBB-secreted TGF-beta and GM-CSF. These DCs then promote the proliferation and expansion of inflammatory CD4+ T lymphocytes. We demonstrate that the migration of monocytes is controlled by a new adhesion molecule called Ninjurin-1. Ninjurin-1 neutralization specifically abrogated the adhesion and migration of human monocytes across endothelial cells of the BBB, without affecting lymphocyte recruitment. Moreover, Ninjurin-1 blockade reduced clinical disease activity and histopathological indices of experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Finally we show that migration of CD8+ T lymphocytes across BBB is dependent on alpha-4 integrin. Also, the majority of CD8+ T lymphocytes found in the cerebrospinal fluid of MS patients, and in the CNS of EAE mice as well as the CNS of mouse infected with hepatitis virus are showing an effector memory phenotype. These data could explain the numerous cases of progressive multifocal leukoencephalopathy seen in natalizumab treated MS patients. In conclusion, our study unveils an important role of peripheral monocytes in MS. The inhibition of migration of these cells to the CNS could be a beneficial therapy since it would allow immune surveillance of the brain. The statins could also be a very interesting option since these molecules would reduce the inflammatory processes involved in MS.