Tesis sobre el tema "F1 Fo ATP synthase"

La F1 Fo ATP synthase est un complexe enzymatique localisé au sein de la membrane interne mitochondriale qui utilise le gradient électrochimique en protons formé par la chaîne respiratoire pour synthétiser de l'ATP à partir d'ADP et de Pi. Cette enzyme conservée de la levure S. cerevisiae aux cellules de mammifères s'organise dans les membranes internes mitochondriales sous forme de structures supramoléculaires d'ATP synthases. Chez la levure, il est aujourd'hui parfaitement identifiée que cette organisation nécessite la présence de deux sous-unités accessoires de l'enzyme : les sous-unités e et g.Les travaux présentés dans ce manuscrit visaient à étudier l'implication des sous-unités e et g dans les mécanismes de dimérisation et d'oligomérisation des ATP synthases ainsi que dans la morphogénèse des crêtes mitochondriales chez la levure S. cerevisiae et dans les cellules humaines en culture.Chez la levure, l'étude réalisée nous a permis de déterminer la stœchiométrie des sous-unités e et g, élément indispensable à la modélisation de l'agencement des sous-unités membranaires de l'enzyme dans la membrane interne mitochondriale.Dans les cellules humaines en culture, nous avons pu établir que les sous-unités e et g participent à la stabilité des dimères d'ATP synthases. Cependant l'implication de ces sous-unités dans la stabilité de l'enzyme semble différente des observations effectuées dans les cellules de levure
The F1Fo ATP synthase is an enzymatic complex embedded in the inner mitochondrial membrane which use the electrochemical proton gradient generated by the phosphorylation oxydative pathway to synthesize ATP from ADP and inorganic phosphate. This enzyme is conserved from yeast to mammalian cells and displays supramolecular organization in the inner mitochondrial membrane. In yeast, it is actually well-known that the supramolecular assembly required two accessory subunits : e and g subunits.The present work was realized to understand the involvement of subunits e and g in dimerization and oligomerization of mitochondrial ATP synthases as well as their effect on mitochondrial inner membrane morphogenesis in yeast S. cerevisiae and human cultured cells.In yeast, this study led us to determine subunits e and g stoechiometry, which was cruelly missing to establish a model of the ATP synthases membranous subunits layout in the inner mitochondrial membrane.In human cells, we have demonstrated that subunits e and g are implicated in ATP synthase dimer stabilization. However, their involvement in this stabilization seems to be quietly different of what have been observed in yeast cells

L'effet protecteur des HDL sur les pathologies cardio-vasculaires est principalement attribué à leur rôle central dans le Transport Retour du Cholestérol (TRC). Ce processus assure l'efflux du cholestérol excédentaire des cellules périphériques vers le foie, au niveau duquel il est éliminé dans les sécrétions biliaires. Dans ce contexte, notre équipe a identifié à la surface des cellules hépatiques la présence d’un complexe enzymatique, très proche de l’ATP synthase mitochondriale, comme étant un récepteur de haute affinité pour l’apoA-I (protéine majoritaire des HDL). Cette ATP synthase de surface, également appelée ecto-F1-ATPase, joue un rôle clé dans l’endocytose hépatique des HDL. En effet, la liaison de l’apoA-I stimule l’activité ATPasique de l’enzyme, entrainant la production d’ADP extracellulaire puis l’activation spécifique du récepteur nucléotidique P2Y13, aboutissant in fine à l’endocytose des HDL. Ainsi, l’équipe a montré le rôle clé de la voie ecto-F1-ATPase/P2Y13 dans l’endocytose hépatique des HDL et par conséquent dans les effets protecteurs de ces derniers dans l’athérosclérose.Les travaux de thèse présentés ici visent à déterminer les mécanismes de régulation de cette ecto-F1-ATPase. Compte tenu de l’importance de la régulation des taux d’ADP et d’ATP extracellulaires dans l’endocytose des HDL, nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux acteurs moléculaires qui pourraient réguler le métabolisme nucléotidique à la surface cellulaire. Nous avons mis en évidence la présence, à la surface des cellules HepG2, de l’adénine nucléotide translocase (ANT), une autre protéine classiquement localisée à la mitochondrie. Nous avons montré que l’ecto-ANT est impliquée dans la régulation des taux des nucléotides adényliques ADP et ATP extracellulaires et que son fonctionnement est lui-même dépendant du taux de ces derniers dans le milieu extracellulaire
The cardioprotective effect of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) is mostly attributed to their metabolic functions in reverse cholesterol transport (RCT), a process whereby excess cell cholesterol is taken up from peripheral cells and processed in HDL particles, and later delivered to the liver for further metabolism and bile excretion. ATP synthase, classically known to be located in the mitochondrial inner membrane, has been unexpectedly found expressed at the plasma membrane of hepatocytes, as a receptor for apoA-I, playing a role in HDL-cholesterol uptake. On hepatocytes, apoA-I binding to ecto-F1-ATPase stimulates extracellular ATP hydrolysis into ADP, which subsequently activates a P2Y13-mediated HDL endocytosis pathway. The strict dependence of HDL endocytosis on extracellular ADP level led us to study first, whether other plasma membrane proteins than ecto-F1-ATPase could regulate extracellular ADP level. We highlighted the presence on hepatocytes cell surface of Adenine Nucleotide Translocase (ANT), another transmembrane protein of the inner mitochondrial membrane. We showed that ecto-ANT activity could increase or reduce extracellular ADP level, depending on the extracellular ADP/ATP ratio. Furthermore, we demonstrated that pharmacological inhibition of ecto-ANT activity increased extracellular ADP level when ecto-F1-ATPase was activated by apoA-I. This increase in the bioavailability of extracellular ADP accordingly translated into an increase of HDL endocytosis in human hepatocytes. We then sought to explore the molecular mechanisms involved in targeting ecto-F1-ATPase to the plasma membrane. Indeed, F1-ATPase ectopic expression at the plasma membrane has been described on several cell types and has been related to several physiological and pathophysiological processes however, the pathway involved in its transport to the cell surface remains unknown

We have studied the inhibitory effect of natural and structurally modified polyphenols on Escherichia coli ATP synthase to test (I) if the beneficial dietary effects of polyphenols are related to their inhibitory actions on ATP synthase, (II) if inhibitory effects of polyphenolic compound could be augmented through structural modifications, and (III) if they can act as antimicrobial agent through their actions on ATP synthesis. X-ray crystal structures of polyphenol binding sites suggested that polyphenols bind at a distinct polyphenol binding pocket, at the interface of α,β,γ-subunits. We found that both natural and modified polyphenols inhibit E. coli ATP synthase to varying degrees and structural modifications resulted in augmented inhibition. Inhibition was reversible in all cases. Both natural and modulated compounds inhibited E. coli cell growth to varying degrees. We conclude that dietary benefits of polyphenols may be in part due to the inhibition of ATP synthase.

Proton channels are essential for many of the processes of life. The influenza A viral protein M2 is responsible for sensing the conditions necessary for viral RNA release. The proton-translocating FoF1 ATPase (ATP synthase) uses a proton gradient to drive adenosine triphosphate (ATP) synthesis. We have directly measured proton uptake in vesicles containing reconstituted M2 or FO by monitoring external pH after addition of valinomycin to vesicles with 100-fold diluted external [K+]. This proton flux assay was utilized to quantify proton flux through single M2 and Fo channels. Contrary to previous reports, proton uptake by M2 was not significantly altered by acidification of the extravesicular pH. We conclude that pH only weakly affects proton flux through M2 in the pH range of 5.4 - 7.0. Theoretical analysis utilized for such vesicle uptake assays illuminates the appropriate time scale of the initial slope and an important limitation that must be placed on inferences about channel ion selectivity. The rise in pH over 10 seconds after ionophore addition yielded time-averaged single channel conductances of 0.35±0.2 aS and 0.72±0.4 aS at pH 5.4 and 7.0 respectively. Such a low time-average conductance implies that M2 is only conductive 10^-6 to 10^-4 of the time. M2 selectivity for hydrogen over potassium is ~10^7. Fo translocates protons across membranes, converting electrochemical energy to rotational inertia. Previous experiments have been partially confounded by a contaminating channel, CL, which co-purifies with Fo and leaks cations. CL activity is shown to not decrease following deletion of the previously uncharacterized yraM open reading frame of E. coli. Fo purified from a deletion strain lacking yraM is just as active as Fo purified from the wild-type strain. Using Fo from the deletion strain, the single-hit hypothesis of DCCD inhibition of passive proton flux through Fo was examined. A DCCD-induced reduction in ATP synthase activity correlates with a reduction in the total initial slope, the number of functional Fo per µg protein, and the single channel proton flux. At least 2 DCCD per Fo are required to totally inactivate passive proton flux. M2 and Fo have similar single channel conductances but different open probabilities.

Les lymphocytes T Vgamma9/Vdelta2 ont originellement été décrits pour être activés par de petites molécules (phosphoantigènes) isolées à partir de Mycobacterium tuberculosis, agent pathogène responsable de la tuberculose chez l'homme. Ces lymphocytes ont également un large potentiel antitumoral qui pourrait être utilisé pour le développement d'immunothérapies anticancéreuses. Nous nous intéressons aux mécanismes d'activation des lymphocytes T Vgamma9/Vdelta2 par les cellules tumorales et avons récemment identifié l'Ecto-F1-ATPase comme antigène impliqué dans leur reconnaissance. Les travaux effectués au cours de cette thèse mettent en évidence une interaction entre cette molécule et le Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I, connu pour réguler l'activation de ces lymphocytes. Nous avons également obtenu des données indiquant que l'Ecto-F1-ATPase peut présenter des phosphoantigènes aux lymphocytes T Vgamma9/Vdelta2
Vgamma9/Vdelta2 T cells have originally been described to be activated by small molecules (phosphoantigens) purified from Mycobacterium tuberculosis, the pathogen responsible for the development of tuberculosis in humans. These lymphocytes also have a broad antitumoral potential which could be exploited for the development of anticancer immunotherapy. We are studying the mechanisms by which tumor cells activate Vgamma9/Vdelta2 T cells and have recently identified the Ecto-F1-ATPase as an antigen involved in their recognition. Our results, gathered in this thesis, show an interaction between this complex and Major Histocompatibility Class I molecules, which are known to regulate the activation of these lymphocytes. We also provide experimental data showing that Ecto-F1-ATPase can present phosphoantigens to Vgamma9/Vdelta2 T cells.

Ces travaux portent sur l'étude de mutants nucléaires de la levure S. Cerevisiae, modifiés dans la synthèse mitochondriale des sous-unités 8 et 6 de l'ATPsynthase, qui restent respiratoire-compétents. Ces souches sont modifiées dans la régulation de la synthèse de l'ATP par la concentration en phosphate externe. Ceci est dû à la modification de la stoechiométrie relative des sous-unités 8, 6 et 9 dont le résultat est une altération de la perméabilité aux protons de la membrane interne. Une analyse des transcrits mitochondriaux a permis de corréler cette baisse du taux protéique à une modification spécifique du cotranscrit ATP8-ATP6. Une analyse génétique des mutants a mis en évidence deux mutations nucléaires indépendantes toujours associées à une mutation mitochondriale, qui entraîne une sensibilité accrue à la paromomycine, un antibiotique qui augmente le taux d'erreurs au niveau traductionnel mitochondrial. Les séquences nucléotidiques de l'ARN ribosomique 15S et de l'ARN messager VAR1, deux composants des mitoribosomes codés par l'ADN mitochondrial, ont été étudiées : aucune différence n'a pu être mise en évidence entre les souches mutante et sauvage. Les deux gènes nucléaires mutés entraînent un phénotype de cryosensibilité sur substrat respiratoire seulement lorsqu'ils sont présents simultanément. Donc, les deux gènes sauvages ont été recherchés par complémentation fonctionnelle. Deux gènes nucléaires NCA2 et NCA3, impliqués dans l'expression spécifique des sous-unités 8 et 6 de l'ATP synthase, ont été isolés et séquencés. Aucune homologie significative avec des protéines connues n'a été identifiée dans les banques de données. NCA2 et NCA3 sont deux gènes monocopie qui codent respectivement pour des protéines de 70800 et 35400 Da. NCA2 est localisé sur le chromosome 16 et NCA3 sur le chromosome 4. Leur disruption au locus chromosomique ne conduit pas à une incompétence respiratoire
These works concerned the study of respiratory-competent nuclear mutants of the yeast S. Cerevisiae, altered in the mitochondrial synthesis of subunits 8 and 6 of the ATPsynthase. These strains are altered in the regulation of the ATP synthesis by the external phosphate concentration. It was due to a modification of the relative stoichiometry of the mt DNA-encoded 8, 6 and 9 subunits which results in an enhanced proton-leakage through the inner membrane. The mitochondrial transcripts has permitted to correlate the decrease in the subunits 6 and 8 ratio with a specific modification of cotranscript ATP8-ATP6. Genetic analysis of these mutants showed the presence of two unlinked mutations always associated with a mitochondrial mutation, which confered a paromomycin sensitivity, an inhibitor of the mitochondrial protein synthesis. The nucleic sequence of 15S rRNA and VAR1 mRNA, two components of mitoribosomes encoded by mitochondrial DNA, were studied : no difference exist between mutant and wild-type strains. The simultaneous presence of the two mutant nuclear genes induced a cryosensitive phenotype on a nonfermentable carbon source. Then, the two wild-type genes were cloned by functional complementation. Two nuclear genes NCA2 and NCA3, involved in the specific expression of subunits 8 and 6 of the ATPsynthase, were isolated and sequenced. No significant homologies with known proteins were identified in data bases. NCA2 and NCA3 are two single-copy genes which encode for proteins of molecular mass of 70800 and 35400 Da respectively. NCA2 is located on chromosome 16 and NCA3 on chromosome 4. A null mutation of each gene did not let to a respiratory-incompetent phenotype

Récemment, l'ATP synthase mitochondriale a été décrite à la surface de différents types cellulaires où elle est un récepteur de haute affinité pour l'apoA-I, la protéine majoritaire des HDL. L'expression ectopique de l'ATP synthase est impliquée dans diverses fonctions, par exemple, le contrôle de l'angiogenèse sur les cellules endothéliales. Dans ce travail, nous avons évalué le rôle de l'ATP synthase de surface sur la survie et la prolifération des cellules endothéliales humaines induite par l'apoA-I. Nos résultats montrent que l'apoA-I stimule la prolifération et inhibe l'apoptose des HUVEC à travers l'activité hydrolase de l'ATP synthase (ATP -> ADP + Pi) qui activerait les voies PI3K / Akt et MAPK en aval des récepteurs P2Y1 et P2Y12. Ainsi, l'ATP synthase de surface constitue un nouveau mécanisme de protection induit par l'apoA-I sur la paroi vasculaire
Mitochondrial ATP synthase has been recently detected at the surface of different cell types, where it is a high affinity receptor for apoA-I, the major HDL protein. ATP synthase expression is related to different biological effects, for example, angiogenesis control in human endothelial cells. In this work, we have evaluated the implication of the cell surface ATP synthase in the pro-survival and proliferative effects induced by apoA-I on human endothelial cells. Our results show that apoA-I stimulates proliferation and inhibits apoptosis by activating the hydrolase activity of ATP synthase (ATP -> ADP + Pi), which would activate PI3K / Akt and MAPK pathways downstream of P2Y1 and P2Y12 receptors. Thus, the cell surface ATP synthase is a new protector mechanism induced by apoA-I on the vascular wall

F₁-ATPase, the sector of ATP synthase where the synthesis of cellular ATP occurs, is a rotary molecular motor in its own right. Driven by ATP hydrolysis, direct observation of the rotation of the central axis within single molecules of F₁ is possible. Operating at close to 100% efficiency, F₁ from thermophilic Bacillus has been shown to produce ~40pN˙nm of torque during rotation. This thesis details the groundwork required for the direct measurement of the torque produced by F₁ using a rotary angle clamp, an optical trapping system specifically designed for application to rotary molecular motors. Proof-of-concept experiments will be presented thereby demonstrating the ability to directly manipulate single F₁ molecules from Escherichia coli and yeast mitochondria (Saccharomyces cerevisiae), along with activation of F₁ out of its inhibited state by the application of external torque. Despite in-depth knowledge of the rotary mechanism of F₁ from thermophilic Bacillus, the rotation of F₁ from Escherichia coli is relatively poorly understood. A detailed mechanical characterization of E.coli F₁ will be presented here, with particular attention to the ground states within the catalytic cycle, notably the ATP-binding state, the catalytic state and the inhibited state. The fundamental mechanism of E.coli F₁ appears to depart little from that of F₁ from thermophilic Bacillus, although, at room temperature, chemical processes occur faster within the E.coli enzyme, in line with considerations regarding the physiological conditions of the different species. Also presented here is the verification of the rotary nature of yeast mitochondrial F₁. The torque produced by F₁ from thermophilic Bacillus, E.coli and yeast mitochondria is the same, within experimental error, despite their diverse evolutionary and environmental origins.

碩士
國立成功大學
工程科學系碩博士班
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Placed protein enzyme, F1-ATPase (F1 motor) into the aqueous liquid that contains ATP, the chemical free energy will be released. This free energy is used to actuate F1 motor rotation. The speed of rotation will be affected by the following forces: viscous drag force, medium fluid Brownian force and driving potential force by ATP hydrolysis. The contributions of power strokes and thermal excitations actuating the F1 motor rotation will be different under the effect of these forces. Employing the numerical simulation of the Langevin equation, a sequence of F1 motor angular position versus time is generated. The effective driving potential is then constructed. Finally, the relative contributions of the power strokes and thermal excitation on each angular position are estimated in this paper. The results are found that when the positive work done by Brownian motion on the F1 motor, the mechanism of motor is power strokes and the output torque from motor is strong. However, when the negative work done on the F1 motor, the mechanism of motor are both power strokes and thermal excitations, but the output torque is small.

Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase 1. Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten gamma-Untereinheiten wur­den mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8), 15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste. 2. Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Syntha­sen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindig­keit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit. 3. Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung der Untereinheit gamma kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu ei­nem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (Kontroll-EF1 ohne Verkürzung des gamma-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletions­mutanten wiesen ein ähnliches alpha/beta:gamma-Verhältnis auf. 4. Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Ab­hängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35ºC von 93 u/mg (KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivie­rungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zu­nehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden. Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%. 5. Das durch die Rotor-Untereinheit gamma erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deleti­onsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographi­schen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobach­tungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1 erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Ro­tations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismä­ßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Ver­hältnisses jedoch nicht möglich. 6. Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale gamma-Deletion deltaS281-V286 (gamma-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität der Enzymkomplexe. 7. Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die gamma-Deletionen offenbar kaum beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydroly­seaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität ak­tiver Enzymkomplexe. 8. Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung der Rotoruntereinheit gamma mit einer Statoruntereinheit alpha über die Cysteine alphaC280 und gammaC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öff­nung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubations­zeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrü­cke zwischen alphaC280 und gammaC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydroly­seaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10-EF1. 9. MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5 min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%), während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 + 1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen. 10. Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des C-termi­nalen Bereichs von gamma im alpha3beta3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzym­komplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen gamma-Be­reichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte gamma-Rotation zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen struktu­rellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fi­xierung des C-terminalen gamma-Bereichs bei der gamma-Rotation für die Funktion des EF1-Komplexes offenbar keine Rolle spielt. Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der gamma Ro­tationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.

Interaktion der FO Statoruntereinheiten a und b der ATP-Synthase aus Escherichia coli Die ATP-Synthase nimmt im Energiestoffwechsel vieler Organismen eine zentrale Stellung ein und ist ubiquitär in strukturell und funktionell homologer Form bei eukaryotischen Zellen in der inneren Mitochondrienmembran, der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der Cytoplasmamembran von Prokaryoten zu finden. Besonders zwischen F-, V- und A-Typ ATPasen bestehen strukturelle Ähnlichkeiten im Aufbaus des Gesamtenzyms aus zwei großen Subkomplexen. Darüber hinaus weisen die F-Typ ATPasen aller Organismen hohe Sequenzhomologien auf, welche sich auch in strukturellen Gemeinsamkeiten widerspiegeln. Als "Modellenzym" dient die FOF1 ATPase aus dem Enterobakterium Escherichia coli. Es setzt sich aus acht funktionell verschiedenen Untereinheiten zusammen, die unter Hydrolysebedingungen relativ zueinander rotieren. Die Unterteilung der Enzymstruktur in Rotor (g e -c-Oligomer) und Stator (a 3b 3d ab2) erfordert das Vorhandensein einer stabilisierenden Struktur, dem sog. "second stalk". Im Hinblick auf den Mechanismus der rotierenden ATP-Synthase und dem Modell der elastischen Kopplung erscheint die Untereinheit b geeignet, um die durch das g e -c-Oligomer aufgebaute Rotationsspannung zu speichern. Wie die beiden b Untereinheiten mit den anderen FO Untereinheiten a bzw. c interagieren ist weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Untereinheiten a und b auf mögliche Interaktionsstellen mit anderen Enzymuntereinheiten mittels genetisch eingefügte Cysteine und anschließender chemischer Quervernetzung untersucht. In der hier vorgestellten Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit dem Nulllängen Cross-linker Cu(1,10-Phenanthrolin)2SO4 [CuP] in der Region bP28C-bE39C möglich ist, Quervernetzungen zur Untereinheit a zu erzeugen. Mit den heterobifunktionellen Cross-linkern Benzophenon-4-maleimid [BPM] und N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3´-(2´-pyridydithio)propionamid [APDP] vergrößert sich diese Region. Dabei sind die a-b Interaktionen in einer gewissen Periodizität (bP28C, bL29C, bM30C, bA31C, bK38C und bE39C) zu beobachten, was für eine Beteiligung beider b Untereinheiten spricht. Neben dem immunologischen Nachweis durch Antikörper, konnte auch über ein N-terminales Polyhistidinmotiv (His12) gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den Untereinheiten a und b ausbildet wird. Der aN-His12-b Cross-link kann mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. b-Dimerisierungen konnten für die Reste bS60C, bL65C und die Region bY24C-bA45C nachgewiesen werden. Der relative Abstand der b Untereinheiten zueinander nimmt dabei in ihrem Verlauf vom Cytoplasma in Richtung Membran zu, wie mit den Cross-link Reagenzien CuP, BPM und APDP gezeigt werden konnte. Ausgehend von der Untereinheit a konnten für die Reste aS27C, aN33C, aA130C, aG173C, aP182C, aN184C, aS202C und aG227C ebenfalls CuP vermittelte Quervernetzungen mit der Untereinheit b nachgewiesen werden. Die Reaktion an der Position aS27C weist auf eine cytoplasmatische Lokalisation des N-Terminus hin, die in einem 6 Transmembran-Sekundärstrukturmodell vorgeschlagen wird. Mit BPM konnte die Nähe der Aminosäuren aN33C und aP182C zum c-Oligomer gezeigt werden.

Die mit der in dieser Arbeit entwickelten Rekonstitutionsmethode gemessenen Protonentranslokationsraten erreichen physiologisch relevante Werte und liegen ca. eine Größenordnung über Messungen, die mit vergleichbaren Methoden erzielt wurden. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c ist in vitro vom Verhältnis der Untereinheiten a, b und c abhängig. Das bedeutet, dass bei einer Rekonstitution mit verringerter Menge an Untereinheit c Fo-Komplexe mit einheitlich weniger c-Untereinheiten entstehen. Das deutet darauf hin, dass der Fo-Komplex möglicherweise mit verschiedenen c-Stöchiometrien Protonen translozieren kann und dass die Stöchiometrie der Untereinheit c einen Einfluss auf die Protonentranslokationsrate des Fo-Komplexes haben könnte. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c im FoF1-Komplex ist in vivo von der Expressionsrate ihres Gens weitgehend unabhängig. - Das unterschiedliche Verhalten der c-Stöchiometrie bei Variation der relativen c-Menge in vitro und in vivo legen einen Regulationsmechanismus in der Zelle nahe, der die Stöchiometrie der Untereinheit c je nach physiologischer Notwendigkeit einstellt und der unabhängig von der Expressionsrate der Untereinheit c arbeitet.

Zu den Eigenschaften eukaryotischer Zellen gehört ihre Kompartimentierung, welche durch die Abtrennung verschiedener Reaktionsräume durch Lipiddoppelschichten erreicht wird. Verschiedene Vesikel-Transportwege verbinden diese Kompartimente miteinander, einer dieser Wege in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der sogenannte ALP-Weg. Dieser gehört zu den biosynthetischen Wegen, über die neue Proteine an ihren Bestimmungsort gebracht werden, in diesem Falle die Vakuole. Ausgehend vom Golgi-Apparat werden die Vesikel dieses Weges mit Hilfe des Adaptorproteinkomplexes-3 (AP-3) gebildet. Ein weiteres Protein, das eine spezifische Funktion in diesem Weg übernimmt, ist Vps41. Ein aktuelles Modell beschreibt seine Funktion in der Aufnahme der Vesikel an der Vakuole. Es konnte gezeigt werden, das Vps41 mit der sogenannten ear-Domäne von Apl5, einer Untereinheit des AP-3- Komplexes, interagiert. In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass die Interaktionsstelle im Vps41 innerhalb einer konservierten PEST-Domäne liegt. Eine Deletion dieser Domäne beeinflußte die Funktion des Proteins im ALP-Weg jedoch nicht die in der homotypischen Vakuolenfusion und im CPY-Weg. Eine weitere Eingrenzung des deletierten Bereiches zeigte, dass die PEST-Domäne eine Sequenz enthält, die einem Di-Leucin- Sortierungssignal ähnlich ist. Dieses konnte ich als minimal notwendigen Bereich für die Wechselwirkung mit der Apl5-ear-Domäne bestimmen. Meine Daten zeigen, dass dieser Bereich des Proteins notwendig ist für das Docking der AP-3-Vesikel an der Vakuole. Weiterhin konnte ich eine kompetitive Bindung von Liposomen und Apl5 an die N-terminale Hälfte von Vps41 zeigen. Zusammengefasst und mit aktuellen Veröffentlichungen in Zusammhang gebracht, ergänzen meine Daten das Modell der Funktion von Vps41 in der Vesikelaufnahme an der Vakuole: Vps41 wird durch die Rab-GTPase Ypt7, als deren Effektorprotein, an späte Endosomen gebunden. An dieser stark gekrümmten Membran taucht ein kürzlich identifiziertes ALPS (amphipathic lipid packing sensor)-Motiv im Vps41 in die Membran des Organells ein und zieht so den N-terminalen Bereich mit der Bindestelle für die AP-3-Vesikel an die Oberfläche des Organells wodurch eine verfrühte Fusion der AP-3-Vesikel mit dem Endosom verhindert wird. Erst nach der Reifung zur Vakuole wird die PEST-Domäne für die Bindung an Apl5 verfügbar, da sich die Membrankrümmung ändert. Zusätzlich wird das ALPS-Motiv phosphoryliert, so dass dieses nicht mehr in die Membran eintauchen kann. Erst jetzt ist eine Interaktion zwischen Apl5 und Vps41 und damit eine Fusion der AP-3-Vesikel mit der Vakuole möglich. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Protonentranslokation durch den Fo-Teil der ATP-Synthase aus Escherichia coli. Durch Mutagenese wurden ATP-Synthasen hergestellt, in denen die beiden für den Protonentransport essentiellen Aminosäurereste D61 in der Untereinheit c und R210 in der Untereinheit a in der α-Helix in der sie liegen, entweder einzeln oder beide zusammen, um je eine Helixwindung nach oben oder unten verschoben wurden. Dies führt zu einer Verlängerung bzw. Verkürzung der Protonenzu- und austrittskanäle. Durch die Untersuchung der Funktionalität dieser ATPasen auf sowohl aktives und passives Protonenpumpen, als auch ATP-Synthese konnte ich zeigen, daß die Position der beiden essentiellen Aminosäurereste cD61 und aR210 zueinander nicht entscheidend ist. Werden beide Reste in die gleiche Richtung verschoben, so daß ihre Position zueinander gleich bleibt, kommt es unabhängig von der Richtung immer zu einem kompletten Funktionsverlust. Weiterhin läßt sich aus meinen Daten folgern, daß die Position des Restes aR210 in der Mitte der Membran wichtig ist. Beim Verschieben des Restes auf die Position 206 (a-up) geht die gesamte Funktion des Fo-Teiles verloren, während das Verschieben auf die Position 214 (a-down) zu einem passiven Ausströmen der Protonen durch den Fo-Teil führt. Die Position des Restes cD61 in der Membran ist flexibler. Obwohl die Repositionierung des Aspartats auf die Position 57 (c-up) jegliche Funktionalität des Fo-Teiles beeinträchtigt, ermöglicht ein Verschieben auf die Position 65 (c-down) aktives und passives Protonenpumpen, sowie die Synthese von ATP.

English Abstract The incoming paradigm of the network (or systems) biology calls for a new high throughput tool for a wide scale study of protein-protein interactions. Mass spectrometry-based proteomics have experienced a great progress in recent years and have become an indispensable technology of elementary as well as clinical research. Glutamate carboxypeptidase II (GCPII; EC 3.5.17.21) is a transmembrane protein with two known enzymatic activities. Its expression is highly upregulated in some solid tumors and also in tumor-associated neovasculature in general. Nevertheless, none of the two enzymatic activities were shown to be physiologically relevant to these cells. Some facts point at a possible receptor function of GCPII, however, no specific binding partner has been found yet. In the search for potential binding partners and/or ligands of GCPII, a series of methods have been employed, including pull-down experiment, immunoprecipitation and mass spectrometry. Sample preparation and mass spectrometry data processing methodology was specifically developed in order to identify potential binding partners. As one of the outcome of that methodology, the interaction of β-subunit of F1 ATP synthase was selected for further detailed analysis as a putative ligand of GCPII.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI)
The multi-protein complex of F0F1 ATP synthase has been of great interest in the fields of microbiology and biochemistry, due to the ubiquitous use of ATP as a biological energy source. Efforts to better understand this complex have been made through structural determination of segments based on NMR and crystallographic data. Some experiments have provided useful data, while others have brought up more questions, especially when structures and functions are compared between bacteria and species with chloroplasts or mitochondria. The epsilon subunit is thought to play a signi cant role in the regulation of ATP synthesis and hydrolysis, yet the exact pathway is unknown due to the experimental difficulty in obtaining data along the transition pathway. Given starting and end point protein crystal structures, the transition pathway of the epsilon subunit was examined through computer simulation.The purpose of this investigation is to determine the likelihood of one such proposed mechanism for the involvement of the epsilon subunit in ATP regulation in bacterial species such as E. coli.