Tesis sobre el tema "HSFA2"

Les stress ont un impact majeur sur l'agriculture. Les études réalisées jusqu'à présent portent majoritairement sur des stress simples, appliqués indépendamment dans des conditions de culture idéales. Cependant, les combinaisons de stress sont la norme dans les champs et la réponse aux combinaisons de stress ne peut être extrapolée à partir de l'addition des réponses aux stress simples. Une analyse bioinformatique de banques de données de transcriptomique a permis d’identifier un gène (HSFA2) répondant a de multiple stress, isolés ou combinés. La présente thèse a pour but de découvrir les mécanismes contrôlant l'expression d’HSFA2. Deux stratégies ont alors été mise en oeuvre. Dans un premier temps, les facteurs capables de fixer une région promotrice d’HSFA2 ont été étudiés par système de « simple hybride levure ». Dans un second temps, une lignée transgénique biosenseur de l’activité d’HSFA2 a été produite et mutagénéisée. De nombreux mutants ont été sélectionnés sur la base d’une expression constitutive du biosenseur. La capacité des mutants sélectionnés à résister à une combinaison de stress chaleur et de stress lumière a ensuite été analysée. L’identification des mutations causales par séquençage du génome entier a permis, dans certains cas, de déterminer quels étaient les loci responsables des résistances observées. En particulier, deux mutations conférant une large résistance seront discutées
Stresses represent the major cause of yield loss in modern agriculture. Previously, the majority of studies concern simplified, single stress situations, whereas in the field, stresses are complex and most often occurring in combinations. However, multiple stress response cannot be extrapolated from single stress responses added together. Bioinformatic analysis of transcriptomic data banks allowed us to identify a gene (HSFA2) involved in multiple stress responses. The work presented here aimed at discovering the mechanisms controlling HSFA2 expression. Two strategies were used.First, factors able to bind a region of HSFA2 promoter were studied through a “yeast one hybrid” system. Secondly, a transgenic biosensor of HSFA2 activity line was produced and mutagenized. A great number of mutants were selected on the basis of showing a constitutive activation of the biosensor. Resistance potentials to a combination of heat and high light stresses were then determined. Causal mutations identification through whole genome sequencing allowed, in some cases, to determine which were the loci responsible for the resistance traits. In particular, two mutations confering broad spectrum stress resistance will be discussed

Le réchauffement climatique planétaire annoncé ne sera pas sans conséquence sur le métabolisme de la baie et en particulier sur la teneur en composés phénoliques. Les objectifs de cette thèse visent à mieux comprendre les processus de régulation associant le microclimat des baies et la synthèse des composés phénoliques. Par des approches moléculaires et biochimiques, ce travail a permis de mieux décrire les réponses spécifiques des baies de raisin (cultivar Cabernet-Sauvignon) aux facteurs rayonnement et température.L'analyse du transcriptome des baies exposées soit à un stress thermique soit à un stress lumineux a mis en lumière deux processus, une réponse rapide ayant lieu dès les premières heures de traitement et une réponse apparaissant au bout de plusieurs jours d’exposition aux stress. Cette étude a également permis de valider le système expérimental de découplage des effets du rayonnement et de la température.L'analyse des profils d’expression d’une vingtaine de gènes intervenant dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes révèle des différences dans la réponse transcriptionnelle des gènes en fonction du stress et du stade développement auquel il a été appliqué. Néanmoins cette réponse n'est pas ou peu corrélée avec les variations des teneurs en anthocyanes et flavonols observées. Les teneurs en anthocyanes sont fortement réduites par l’action de la chaleur alors que les teneurs de certains flavonols augmentent sous l’influence du rayonnement. Au niveau des acides présents dans la pulpe des baies, l’acide malique voit sa teneur réduite sous l’effet de la chaleur ainsi que d’une forte intensité lumineuse. Les analyses montrent un impact important du stress thermique sur la teneur de la phénylalanine, de la tyrosine et de la lysine dans la pellicule.Parallèlement, l'initiation d’une étude du métabolome des pellicules de baies de raisin a été entreprise par UPLC-ESI-LTQ-Orbitrap™ et a permis d'acquérir des bases solides pour optimiser le protocole utilisé en vue d'analyses futures. Cette étude permet de dresser une liste préliminaire de métabolites d’intérêts.Enfin, le gène VvGOLS1 (Galactinol synthase 1) voit son expression stimulée dans les baies exposées au stress thermique, ce qui se traduit par une accumulation de galactinol, précurseur de la voie des RFOs. Un rôle de molécule «signal» est envisagé pour le galactinol. Un régulateur de la transcription de VvGOLS1 a également été identifié par des expériences d'expression transitoire en protoplastes. Il s'agit du facteur de transcription VvHsfA2, dont l'expression est également stimulée par le stress thermique. Dans ce contexte, la caractérisation des gènes de la famille des Hsfs (Heat Stress Factors) a été initée
Global warming will affect berry metabolism, and especially phenylpropanoïd contents. This PhD work aimed to acquire a better understanding on the cellular processus linking the microclimate and the phenolic synthesis. By molecular and biochemical approaches, we extended this study to detail specific responses taking place in berries under heat and light stress.Transcriptomic analysis of heat-stressed and light-stressed berries showed the existence of two processes that occur in exposed berries. The first one triggers a rapid and transient expression of genes within the first hours of treatment. The second one mobilizes a set of genes showing increase in their expression after several days of stress exposure. Furthermore, this study validated the experimental set used to discriminate the effects of light and temperature, respectively.Expression analysis of 20 genes involved in the flavonoid biosynthetic pathway revealed strong differences among the transcriptional responses, depending on the nature of stress and the developmental stage of the berry. However, expression patterns of genes involved in the biosynthesis of flavonoid could not fully explain the changes in anthocyanin and flavonol contents. This suggests that additional regulation processes such as post-traductional modifications of enzymes or metabolite degradation might take place in berries under abiotic stress. Anthocyanin content decreases under heat stress whereas flavonol content increases under high light. Malic acid increases in berry exposed to heat stress and high light. Moreover, heat-stressed berries showed an accumulation of phenylalanine, tyrosine and lysine in skin but not in pulp.In parallel, a metabolomic analysis was initiated on stress exposed berry skins by using UPLC-ESI-LTQ-Orbitrap™ technology. The first experiments revealed contrasted metabolite contents in berries according to the stress applied, and highlighted several metabolites of interest. The preliminary assays will help optimize this powerful tool for futures analysis.Finally, expression of VvGOLS1 (Galactinol synthase 1) was strongly induced in grape berries exposed to heat stress, in good agreement with the observed galactinol accumulation. Role of galactinol as a signaling molecule is discussed. Transient expression experiments revealed that VvGOLS1 expression is regulated at the transcriptional level through VvHsfA2 action. VvHsfA2 expression is also stimulated under heat stress. In this context, characterization of the grapevine heat stress factors was initiated

Un certain nombre d’études épidémiologiques font état d’une augmentation de l’infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d’une augmentation des malformations de l’appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l’hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d’apparition ce syndrome semblent être d’origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l’environnement. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d’action à l’origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L’objectif de notre travail était d’identifier et caractériser les mécanismes d’action de type épigenétique impliqué dans l’infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d’hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l’altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l’expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l’ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l’apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L’augmentation de son expression provoque une chute de l’expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d’HSPA2 est une autre explication de l’apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l’exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu’il est réversible quand l’exposition à lieu à l’âge adulte. Ces données suggèrent que l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate induit une programmation développementale de l’hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d’expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l’homme en montrant que l’expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l’hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l’animal adulte après exposition néonatale à l’EB met en jeu une modification d’expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d’une oligo ou azoospermie chez l'homme
Epidemiological studies have reported an increase in male infertility over the past fifty years, especially in industrialized countries, but also an increase in malformations of the male reproductive tract such as cryptorchidism (no migration of the testes into the scrotum) and hypospadias (malformation of the penis), and testicular cancers. Experimental data suggest that these abnormalities of the male genital tract are related. These symptoms form the testicular dysgenesis syndrome. The causes of the occurrence of this syndrome appear to be environmental in origin. Indeed, the relatively rapid evolution of this syndrome suggests dynamic factors related to lifestyle or environment. One hypothesis is that exposure during fetal or neonatal life to compounds present in the environment can interfere with the hormonal system (environmental endocrine disruptors), would be responsible for the increased incidence of these pathologies. Bench of the main accused, molecules that have estrogenic or anti-androgenic activity types. To date, the mechanisms of action behind the testicular dysgenesis syndrome are poorly understood. Some studies suggest that epigenetic mechanisms are at playThe objective of our work was to identify and characterize the epigenetic mechanisms of action involved in male infertility induced by neonatal exposure to xenoestrogen. For this, we used an experimental model based on a developmental exposure to estrogen (estradiol benzoate). This model induced in adult rats a hypospermatogenesis phenotype due to chronic apoptosis of germ cells.We show that this phenotype is related to an alteration of two pathways, involving upstream effectors epigenetic. The first pathway involves the family of miR- 29s. Thus, we observe an up-regulation of miR -29a, b, c, which causes a decrease in two of his targets: the anti-apoptotic protein MCL- 1 and the enzymes of DNA methylation DNMTs. Falling DNMTs leads to a global hypomethylation (estimated through the Line -1 gene) and to specific hypomethylation of the heat shock factor, HSF1. This causes a re-expression of factors that induce apoptosis in adult germ cells. The second pathway involves up-regulation of miR -18a that causes a down-regulation of its target HSF2 which regulates the heat shock protein HSP70/HSPA2. The down-regulation of HSPA2 is another explanation of germ cell apoptosis in our model. We also show that this phenotype is irreversible when the estrogen exposure takes place in the newborn whereas it is reversible when exposure takes place in adulthood, suggesting that neonatal exposure to estradiol benzoate induced a developmental programming of hypospermatogenesis.Finally, abnormal tissue expressions of miRNAs are found in the blood, suggesting their potential use as biomarkers. We validated this aspect in humans showing that the expression of miR29s and miR-18a was higher in patients with decrease or no sperm counts compared to normal sperm count. In conclusion, our results indicate that hypospermatogenesis due to chronic germ cell apoptosis observed in adult animals after neonatal exposure to EB involves a change in expression of several key epigenetic effectors: miR-29, miR-18a and DNMTs. In addition, miR-29 and miR-18a could be new non invasive circulating biomarkers of men infertility

L'alcool (EtOH) est une des substances d'abus les plus consommées en France chez les adolescents comme chez les adultes. La consommation d'EtOH induit des déficits mnésiques en perturbant les phénomènes de plasticité synaptique de type potentialisation à long terme (PLT) et dépression à long terme (DLT) dépendants du récepteur NMDA (PLTNMDA et DLTNMDA), et qui constituent la base cellulaire des apprentissages et de la mémoire, notamment au niveau de l'hippocampe. La composition en sous-unités GluN2A et GluN2B du récepteur NMDA peut influencer l'induction de ces deux formes de plasticité synaptique selon le modèle théorique de Bienenstock et al. (1982). De plus, la plasticité synaptique est sous l'influence de mécanismes épigénétiques et/ou de facteurs de transcription. A l'heure actuelle, les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la perturbation de la plasticité synaptique suite à la consommation d'EtOH demeurent mal compris. Durant ma thèse, j'ai testé l'hypothèse que les perturbations de la plasticité synaptique dépendante du NMDA impliqueraient une modulation des sous-unités GluN2A et GluN2B dans un modèle de binge drinking-like chez le rat jeune adulte et dans un modèle d'alcoolisation chronique chez des souris adultes. Afin de comprendre les mécanismes sous-tendant ces perturbations, j’ai étudié l'implication des facteurs épigénétiques et le rôle d'un facteur de transcription de la famille des heat shock factor, HSF2. Pour cela, j'ai utilisé la technique d'enregistrement de potentiel de champs somatique et dendritique (potentiel postsynaptique excitateur NMDA ; PPSE-NMDA) dans l'aire CA1 de tranches d'hippocampe. De manière intéressante, nos résultats montrent que les deux types d'alcoolisation, aigue et chronique, augmentent la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste de la sous-unité GluN2B alors que la sensibilité à l'antagoniste de la sous-unité GluN2A diminue. Chez le rat jeune adulte, ces modifications sont accompagnées d'une forte réduction de la DLTNMDA et d'un déficit d'apprentissage (test de reconnaissance de nouvel objet). Dans ce modèle, l'inhibition de l'activité des enzymes HDACs, responsables de la désacétylation des histones, prévient l'ensemble des effets de l’EtOH (sensibilité pharmacologique du PPSE-NMDA, DLTNMDA et apprentissage). Concernant HSF2 et avant toute alcoolisation, des souris adultes hsf-/- présentent une absence de DLTNMDA accompagnée d'une plus grande sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B comparé à des souris sauvages. L'exposition chronique à l'EtOH induit chez les souris sauvages, une abolition de la DLTNMDA accompagnée d'une augmentation de la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B et à une diminution de la sensibilité de ce signal à un antagoniste GluN2A. En revanche, les souris hsf-/- ne présentent aucune de ces modifications. Ainsi, l'ensemble de mes travaux de thèse montre que quel que soit le type d'alcoolisation, aigue ou chronique, mais aussi l'espèce animale utilisée, rat ou souris, l'EtOH induit des adaptations du réseau hippocampique qui consiste en une augmentation de la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B et en une diminution de sa sensibilité à un antagoniste GluN2A ; modifications qui accompagnent une abolition de la DLT. Cette réponse globale à l'EtOH mettrait en jeu des facteurs épigénétiques modulant l'état d'acétylation de l'ADN et des facteurs transcriptionnels de type heat shock
Alcohol (EtOH) remains one of the most consumed substances of abuse in France among adolescents and adults EtOH consumption, inducing learning deficits through disturbances of the NMDA-dependent form of synaptic plasticity (long term potentiation, LTP and long-term depression, LTD), the cellular signal responsible for learning and memory, notably into the hippocampus, involved in memory formation in mammals. Importantly, induction of NMDA-dependent synaptic plasticity relies on the subunit composition of the NMDA receptor (GluN2A and GluN2B) while mechanisms of genome regulation such as epigenetic or some transcription factors may have important role in determining the quality of synaptic plasticity signals. However, the molecular mechanisms by which EtOH disrupts NMDA-dependent synaptic plasticity are still unclear. During my thesis work, I tested the hypothesis that NMDA-dependent synaptic plasticity is disrupted by EtOH through the modulation of the involvement of GluN2B and GluN2A subunits of the receptor whatever the type of EtOH exposure, either acute in young adult (binge-drinking like model) rodents or chronic in adult rodents. I further tested the involvement of epigenetic and the role of HSF2, a transcription factor in the modifications induced by EtOH. Using pharmacological tools and field potential recordings in CA1 area of hippocampal slices from adolescent rats and adult mice, I found that both acute and chronic ethanol exposure increased field NMDA excitatory post synaptic potential (fNMDA-EPSP) sensitivity to a GluN2B antagonist while sensitivity to GluN2A antagonist was decreased. In adolescent rats, these modifications were accompanied with a lower LTD without affecting LTP and with memory impairment. Interestingly, inhibition of enzymes responsible for chromatin deacetylation (HDAC) in binge like adolescent rat model, prevents the EtOH effects in learning performance associated with a correction of the GluN2A/GluN2B balance and LTD. Concerning the role of HSF2, I found that before chronic EtOH consumption, fNMDA-EPSPs of HSF2 KO adult mice lack LTD and showed the opposite sensitivity to GluN2A and GluN2B antagonists compared to WT mice. Chronic EtOH exposure in HSF2 KO mice induced different adaptations than in WT animals. Altogether, my thesis work show that, 1) regardless the type of EtOH exposure, the hippocampus neuronal network adapt via changes in the balance between GluN2A and GluN2B subunits leading to LTD reduction and learning impairment; 2) these EtOH-induced changes in fNMDA-EPSPs involved epigenetic processes and 3) some transcription factors, affecting basal conditions of the role for GluN2A/GluN2B balance determines the capacity to respond to EtOH exposure

At the beginning of mitosis, chromosomes are condensed and segregated to facilitate correct alignment later in cytokinesis. Condensin is the pentameric enzyme responsible for this DNA compaction and is composed of two structural maintenance of chromosomes (SMC) subunits and three non-SMC subunits. Condensin mutations generate chromosomal abnormalities due to improper segregation, leading to genome instability and eventual malignant transformation of the cell. Cdc2 phosphorylation of the non-SMC subunits, CAP-G, CAP-D2, and CAP-H, has been demonstrated to be important for condensin supercoiling activity and function. While these subunits are thought to be phosphorylated by Cdc2, the exact sites have not yet been identified and characterized. The basis of this research was to determine the Cdc2 phosphorylation sites in the CAP-G subunit of the condensin enzyme and to characterize the functional significance of the sites in the regulation of condensin activity using site-directed mutagenesis and immunofluoresence microscopy. While DNA condensation represents a critical step early in mitosis, formation of the mitotic spindle represents a vital event leading to the division of a cell into two daughter cells in a process known as cytokinesis. Protein regulating cytokinesis 1 (PRC1) is a mitotic protein essential for cytokinesis that participates in formation of the mitotic spindle in a phosphorylation dependent manner. PRC1 possesses microtubule bundling properties. Loss of PRC1 leads to mis-segregation of chromosomes and abnormal cytokinesis. HSF2 is a transcription factor known to be important in development and differentiation. Previous research has determined that HSF2 plays a significant mechanistic role in the process of hsp70i gene bookmarking during mitosis. Bookmarking is an epigenetic phenomenon whereby certain gene promoters remain uncompacted, in contrast to the majoritiy of genomic DNA during mitosis. This lack of compaction allows quick reassembly to a transcriptionally competent in G1 of the cell cycle and ensures the ability of the cell to induce expression of the cytoprotective hsp70i protein. HSF2 and PRC1 were found to interact in a yeast-two hybrid screen. Given the importance of both of these proteins during mitosis, this study seeks to characterize the HSF2/PRC1 interaction and determine the potential role for PRC1 in hsp70i gene bookmarking.

The heat-shock response is one of the many complex physiological systems that organisms have developed in order to protect their cells against stress. This response is initiated by the binding of heat shock factor 1 (HSF1) to the promoters of genes containing heat-shock elements (HSEs,) which results in the expression of several proteins, among them the proteo-protective inducible heat-shock protein (hsp70i). Due to HSF1s critical role in this process, an active area of research is trying to understand of how HSF1 executes its function. Considering the rapidity with which the field of cell biology is expanding, in particular the sub-field of nuclear compartmentalization, this study seeks to understand how nuclear structure affects the function of HSF1. Specifically, this study investigates the potential role for the interaction between HSF1 and the translocated promoter region protein (Tpr,) a structural component of the nuclear pore, an interaction initially identified by yeast two-hybrid analysis, in the transcription of hsp70i. Due to Tprs location and its putative function in nucleo-cytoplasmic trafficking, this works seeks to answer to the question, Does Tpr play a role in the export of HSF1-driven mRNAs? In a similar vein, heat-shock transcription factor 2 (HSF2,) a less well-understood member of the heat-shock transcription factor family, also interacts with Tpr in the yeast two-hybrid assay. HSF2 has recently been shown to have an active role during mitosis, when the hsp70i gene is being bookmarked for potential expression that might be needed in early G1, when most genes are unable to be expressed. This body of work also seeks to answer the question of, Does the Tpr/HSF2 interaction have a role in positioning the gene in relation to the nuclear pore after mitosis? This study was performed using both novel and standard in vivo and in vitro molecular biology techniques. It ultimately aims to clarify the less understood, although much broader, subject of how does transcription occur in the three-dimensional space of the nucleus.

La phase de maturation des graines est caractérisée par l’ac-quisition successive de composantes qui constituent la qua-lité physiologique d’un lot de semences, à savoir la toléranceà la dessiccation (capacité à survivre au retrait total de l’eaucellulaire), la longévité (capacité de survivre à l'état sec pen-dant le stockage), la dormance ainsi que la vigueur germina-tive (capacité à germer de façon rapide et homogène quelquessoient les conditions de l’environnement). La production desemences à haute qualité germinative représente un enjeumajeur pour les semenciers car elle constitue un levier clefpour augmenter les rendements agricoles. Cependant, lesmécanismes régulant l’acquisition de la qualité germinativeet en particulier la longévité restent peu connus. Une étudepréalable d’un réseau de co-expression génique de facteursde transcription avait identifi é trois gènes candidats associésà la longévité chez Medicago truncatula :MtABL (ABA INSEN-SITIVE4-LIKE), MtABI5 (ABA INSENSITIVE5) et MtHSFA2.2(HEAT SHOCK FACTOR A2.2). L'objectif de cette thèse était devalider ces gènes et d’en comprendre leur fonction chez Medicagotruncatula et le pois par la caractérisation de mutantsd’insertion et EMS. ABL et ABI5 jouent un rôle dans la matu-ration en régulant positivement la longévité alors que celle-ci n’est pas affectée dans les mutants hsfa2.2. Des étudestranscriptomiques et biochimiques montrent que ABL et ABI5régulent de manière complexe la photosynthèse, la dégrada-tion de la chlorophylle et l’accumulation des oligosaccharide
Seed maturation is characterized by the acquisition ofthe various components that collectively constitute thephysiological quality or vigor of the seed: desiccation tolerance(DT, i.e. the capacity to survive complete drying), seedstorability or longevity (the capacity to remain alive duringstorage), dormancy, as well as fast and uniform germinationand seedling emergence under stressful conditions. Thesetraits are pivotal to ensure rapid and homogenous seedlingestablishment required for stable yield and are a majoreconomic challenge for the seed industry. Despite theiragronomic importance, the mechanisms regulating theiracquisition, including longevity, are still poorly understood. InMedicago truncatula, a gene co-expression network inferredthat transcription factors such asMtABL (ABA INSENSITIVE4-LIKE), MtABI5 (ABA INSENSITIVE5) and MtHSFA2.2 (HEATSHOCK FACTOR A2.2) are putative regulators of seedlongevity. The aim of this thesis was to characterize theirroles in Medicago truncatula and Pisum sativum using Tnt1insertion and EMS mutants. ABL and ABI5 are positiveregulators of longevity while defects in hsfa2.2 do not affectit. Transcriptomic and biochemical analyses show that ABLand ABI5 are involved in the regulation of photosynthesisassociated genes, chlorophyll loss and accumulation ofraffi nose family oligosaccharides (RFO). ABI5 is also involvedin the accumulation of stress proteins such as LEA proteins.By establishing a link between degreening, RFO contents andlongevity, our work offers new opportunities to tackle a

Un certain nombre d'études épidémiologiques font état d'une augmentation de l'infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d'une augmentation des malformations de l'appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l'hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d'apparition ce syndrome semblent être d'origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l'environnement. Une des hypothèses est que, l'exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l'environnement capables d'interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l'augmentation de l'incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d'action à l'origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L'objectif de notre travail était d'identifier et caractériser les mécanismes d'action de type épigenétique impliqué dans l'infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d'hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l'altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l'expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l'ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l'apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L'augmentation de son expression provoque une chute de l'expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d'HSPA2 est une autre explication de l'apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l'exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu'il est réversible quand l'exposition à lieu à l'âge adulte. Ces données suggèrent que l'exposition néonatale à l'estradiol benzoate induit une programmation développementale de l'hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d'expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l'homme en montrant que l'expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l'hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l'animal adulte après exposition néonatale à l'EB met en jeu une modification d'expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d'une oligo ou azoospermie chez l'homme.

Les cellules d’un tissu sont soumises à des variations de leur environnement qui sont susceptibles de perturber leur équilibre et de provoquer un stress. Afin de se défendre, elles se sont dotées de mécanismes adaptatifs spécifiques du type de composants affectés (lipides, acides nucléiques, protéines). Ce travail s’est intéressé au stress protéotoxique provoqué par une inhibition du protéasome. La réponse mise en place se caractérise par une surexpression des protéines de choc thermique (HSPs) qui est dépendante d’un événement transcriptionnel impliquant les facteurs de transcription HSF. Ce travail s’est focalisé sur le rôle d’HSF1 et d’HSF2 dans cette réponse. Nous avons montré qu’HSF1 est primordial pour l’induction des HSPs alors qu’HSF2 intervient dans l’expression des sous-unités du protéasome. De plus, nos résultats montrent que les isoformes d’HSF2 ont des rôles opposés sur l’activité transcriptionnelle d’HSF1 et que la quantité relative de ces isoformes est régulée par l’inhibition du protéasome. Ce dernier est une cible dans la lutte contre le cancer et des traitements le ciblant existent. Cependant, des cancers résistent et le développement d’inhibiteurs d’HSF2 pourrait être envisagé pour augmenter l’effet de ces drogues
Cells of a tissue are subject to changes in their environment that can disrupt their balance and to cause stress. To defend themselves, the cells are equipped with adaptive mechanisms specific to the type of affected components (lipids, nucleic acids, proteins). This work focused on proteotoxic stress caused by proteasome inhibition. The established answer is characterized by an overexpression of heat shock proteins (HSPs) which is dependent on a transcriptional event involving transcription factors HSF. This work has focused on the role of HSF1 and HSF2 in response to proteasome inhibition. We have shown that HSF1 is essential for the induction of Hsps whereas HSF2 mediate proteasome subunit expressions. Moreover, data obtained have show that HSF2 isoforms have opposite roles in transcriptional activity of HSF1 and the relative amount of these two isoforms is regulated by proteasome inhibition. Proteasome is a target in the fight against cancer and treatments targeting it exist. However cancers are resistant and development of inhibitors of HSF2 could be a valuable approach to increase the therapeutic effect of these drugs

Au cours de ma thèse, je me suis intéressé aux facteurs de choc thermique HSFs (Heat Shock Factors) et aux fonctions qu'ils exercent au cours du développement. Mon projet de thèse comportait deux parties principales, la première concernant l'identification des gènes cibles du facteur maternel HSF1, et la seconde concernant les fonctions d'HSF1 et HSF2 au cours du développement précoce. Dans un premier temps, nous avons donc cherché à identifier les gènes cibles du facteur HSF1 par une analyse transcriptomique afin de mieux caractériser sa fonction maternelle dans l'ovocyte de souris. Ainsi, parmi les gènes régulés par HSF1, nous avons observé un enrichissement en gènes impliqués dans la cohésion des chromosomes homologues et des chromatides sœurs et nous avons mis en évidence la présence d'HSF1 sur le promoteur de 4 de ces gènes : Stag2, Stag3, Syce1 et Msh4. Ensuite, nous avons mis en évidence que la réduction de ces gènes dans les ovocytes Hsf1-/- entraine des défauts de progression à travers la prophase I aboutissant à une ségrégation précoce des chromosomes homologues lors de la métaphase I. L'ensemble de ces données montrent qu'HSF1 participe à la coordination de la dynamique des chromosomes au cours de la méiose chez la femelle. La deuxième partie de mon projet de thèse concernait les fonctions exercées par HSF1 et HSF2 au cours du développement précoce. En combinant l'utilisation de lignées transgéniques rapportrices (Hsp70. 1 Luciférase) et de lignées mutantes pour Hsf1 ou Hsf2 (Hsf1-/-, Hsf2-/-), nous avons montré qu’HSF1 et HSF2 jouent un rôle dans l’activation zygotique du gène Hsp70. 1 et qu’HSF2 intervient dans la réponse au choc thermique au stade blastocyste
During my PhD, I studied heat shock factors HSFs and their functions during development. My thesis project included two main parts. The first one was aimed to identify HSF1 dependent target genes, and the second part investigated the functions of HSF1 and HSF2 during early development. First, we sought to identify HSF1 target genes by a transcriptome analysis to further characterize its maternal function in mouse oocyte. Among the genes regulated by HSF1, we observed an enrichment of genes involved in the cohesion of homologous chromosomes and sister chromatids and we observed the presence of HSF1 on the promoter of 4 of these genes: Stag2, Stag3, Syce1 and Msh4. Then, we demonstrated that the lower expression of these genes in Hsf1-/- oocytes led to defects in prophase I progression and early segregation of homologous chromosomes at metaphase I. Taken together, these data show that HSF1 helps to coordinate the dynamics of chromosomes during female meiosis in mammals. The second part of my project was about the functions performed by HSF1 and HSF2 during early development. Using several mouse transgenic and knockout lines, we showed that HSF1 and HSF2 play a role in the activation of zygotic Hsp70. 1 and that HSF2 takes part to the heat shock response at the blastocyst stage

Les facteurs hsf sont des facteurs de transcription impliques dans la reponse cellulaire au choc thermique et autres stress. L'analyse des proprietes biochimiques des facteurs hsf1 et hsf2 de souris a revele qu'ils presentent des fonctions differentes, hsf1 etant implique dans la reponse au choc thermique, tandis que hsf2 jouerait plutot un role a temperature normale. D'autre part, j'ai pu montrer que le facteur hsf2 est une proteine d'origine embryonnaire, dont l'expression et l'activite de liaison a l'adn sont regulees au cours du developpement. L'analyse detaillee de son profil d'expression montre qu'il n'est probablement pas responsable de l'expression des proteines de choc thermique, cibles habituelles des facteurs hsf. Ainsi, de par ses proprietes biochimiques et la nature de ses genes cibles, le facteur hsf2 est un facteur hsf atypique. De plus, cette analyse fournit des informations quant a sa fonction potentielle. La proteine hsf2 est exprimee selon deux phases successives : tres precocement, des la fin de la periode preimplantatoire, son expression apparait de facon ubiquitaire et importante puis se restreint au niveau de tissus a taux eleve de proliferation, comme le systeme nerveux central. Cette expression precoce, associee a une localisation nucleaire de la proteine et une activite de liaison a l'adn, suggere fortement un role pour hsf2 comme facteur de transcription dans des cellules en proliferation. Plus tardivement, son expression dans des structures fortement differenciees (muscles et nerfs) -en association avec une localisation cytoplasmique de la proteine et sans qu'une activite de liaison a l'adn ne soit detectable- suggere une seconde fonction non determinee (cytoplamique). L'invalidation, par recombinaison homologue, de la fonction du gene hsf2 permettra d'apprehender son role, a la fois precocement et tardivement, au cours de l'embryogenese chez la souris.

Les recherches exposées dans ce document portent sur l'étude du rôle de HSF2 au cours du développement du système nerveux central. Les Heat Shock Factors (HSF) sont impliqués dans la réponse au choc thermique et également au cours du développement embryonnaire. Mes travaux ont démontré que HSF2 est requis au cours de la formation du cortex cérébral pour la migration de certains neurones en régulant directement l'expression de p35, sous unité activatrice de CDK5. D'autres cibles ont été identifiées NudE, Dclk, Dab1 nécessaires à la migration des neurones en participant à la dynamique du cytosquelette. De plus, ces travaux montrent que HSF2 module la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales (NSC) et des progéniteurs (NP) car i) par électroporation in ovo chez le poulet, la surexpression de HSF2 provoque une augmentation de la prolifération des NP; ii) les NSC Hsf2−/− en culture présentent un retard de prolifération, de survie et de différenciation. Ainsi, HSF2 pourrait assister la décision cellulaire des NSC/NP vers la prolifération ou la différenciation et la migration, tel un aiguilleur de destin cellulaire

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) regulates numerous biological functions. In a previous study we found that sumoylation of HSF2 is involved in regulating HSF2 bookmarking function, but the mechanism that mediates this regulation was unknown. The results in my work support the intriguing hypothesis that polycomb protein, Mel-18, actually functions as an anti-SUMO E3 protein, interacting both with HSF2 and the SUMO E2 Ubc9, but acting to inhibit Ubc9 activity and thereby decrease sumoylation of the HSF2. This study also suggested that Mel-18 negatively regulates the sumoylation of other cellular proteins, and we extend its targets to RanGAP1 protein. The results also show that RanGAP1 sumoylation is decreased during mitosis, and that this is associated with increased interaction between RanGAP1 and Mel-18. Previous studies showed little evidence of anti-SUMO E3 proteins, however, my study, taken together, found Mel-18 actually functions as a novel anti-SUMO E3 protein, interacting both with substrates and the SUMO E2 Ubc9 but acting to inhibit Ubc9 activity to decrease sumoylation of target proteins and also provide an explanation for how mitotic HSF2/RanGAP1 sumoylation is regulated. This finding also gives a clue for a future study direction in Mel-18 as a tumor suppressor: the anti-SUMO E3 function. Additionally, we identify a single-nucleotide polymorphism in another human PcG protein, Bmi-1, that changes a cysteine residue within its RING domain, cysteine 18, to a tyrosine. This C18Y polymorphism is associated with a significant decrease in levels of the Bmi-1 protein. Furthermore, the C18Y Bmi-1 protein exhibits a very high level of ubiquitination compared to wild-type Bmi-1, suggesting that that the low levels of this form of Bmi-1 are due to its destruction by the ubiquitin-proteasome system. Consistent with this hypothesis, treatment of cells with the proteasome inhibitor MG-132 results in a significant increase in levels of C18Y Bmi-1. This is the first example of a polymorphism in human Bmi- 1 that reduces levels of this important protein.

Le cerveau fœtal est vulnérable aux stress environnementaux comme l’exposition prénatale à l’alcool (EPA), première cause non génétique de retard mental. Ce stress induit un large spectre de défauts neurodéveloppementaux souvent diagnostiqués tardivement. Mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de ces défauts permettrait d’élaborer des outils diagnostics fiables, pour une prise en charge précoce des sujets à risques.Le facteur de transcription HSF2 est un acteur majeur de la réponse à l’EPA dans le cerveau en développement. Bien que nécessaire au développement physiologique du cortex, il conduit, en contexte de stress, à des anomalies du développement cérébral, en changeant de cibles génomiques. De plus, dans le cortex embryonnaire, dans un contexte physiologique ou suite à une EPA, HSF2 lie DNMT3A, protéine responsable de la méthylation de novo de l’ADN.Comme, il a été montré que des adultes ayant subi une EPA présentent une perturbation de leur méthylome, il était concevable que l’interaction DNMT3A/HSF2 dans un contexte de stress, puisse, en partie, être à l’origine de cette modification du méthylome. Pour tester cette hypothèse, une alcoolisation de type binge drinking dans des cortex embryonnaires murins a été réalisée et trois études de séquençage à haut débit (NGS) ont été menées en parallèle, puis intégrées.Un ChIP-seq ciblant HSF2 dans le cortex cérébral fœtal murin a permis de cartographier les sites de fixation de ce facteur et d’identifier 280 cibles de HSF2 après cette EPA. La plupart de ces cibles sont des gènes impliqués dans le développement cérébral, dans la réponse au stress et/ou associées dans la littérature à des effets d’une EPA.L’identification de 432 régions différentiellement méthylées (DMRs), immédiatement après EPA entre des cortex fœtaux témoins (traités au PBS) ou traités à l'alcool a été possible, par une capture du méthylome. Cette analyse a nécessité la mise au point d’un outil et d’une approche bio-informatiques spécifiques. Ces DMRs se situent majoritairement au niveau d’enhancers actifs du cortex adulte. Une forte proportion des gènes affectés correspond à des gènes soumis à l’empreinte ou des gènes codant des protocadhérines (impliquées dans le neurodéveloppement ou des fonctions cérébrales), connus comme étant perturbés chez l’adulte à la suite d’une EPA. Ces gènes sont donc porteurs de marques épigénétiques anormales, déposées dès la fin de l’EPA, et constituent de potentiels biomarqueurs d’exposition. Ainsi, des cicatrices épigénétiques sont mises en place rapidement après l’EPA et suggèrent, à la lumière de la littérature, que certaines persistent chez l’adulte.Pour estimer les conséquences fonctionnelles de l’EPA sur le cerveau en développement, une étude de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression des gènes sur la période encadrant le stress a été réalisée en contexte physiologique, en analysant des données publiques (ENCODE) d’ATAC-seq et de RNA-seq provenant de cortex préfrontaux murins non stressés. Ce data mining, a permis de dénombrer et d’identifier les régions chromatiniennes différentiellement ouvertes ou fermées, ainsi que les gènes activés ou réprimés entre les stades embryonnaires E13 et E16 dans le cortex en développement. Les DMR sont associées à des régions chromatiniennes dont l’accessibilité varie au moment du stress, mais aussi au niveau de gènes dont l’expression augmente au cours du développement, suggérant une sensibilité particulière de ces régions dynamiques du génome.L’analyse intégrée des différents jeux de données NGS, n’a pas permis de mettre en évidence une corrélation entre les sites fixés par HSF2 et les DMR. En revanche, les sites de fixation de HSF2 étant souvent associés à des sites de liaison de readers du méthylome ou des remodellers de la chromatine, il est possible que HSF2 soit impliqué dans les conséquences fonctionnelles des perturbations du méthylome dues à l’EPA, plutôt que dans la mise en place de ces défauts
Fetal brain is vulnerable to environmental stress such as prenatal alcohol exposure (PAE), the leading non-genetic cause of mental retardation. This stress induces a wide spectrum of neurodevelopmental defects that are often lately diagnosed. A better understanding of molecular mechanisms underlying these defects would help to develop reliable diagnostic tools for the early care of high-risk subjects.HSF2 transcription factor is a major actor of PAE response in the developing brain. Necessary for cortical physiological development, it also leads, in the context of chronic PAE stress, to abnormalities in brain development by changing its genomic targets. In addition, V. Mezger's team has demonstrated, in the embryonic cortex, that HSF2 binds DNMT3A - in a physiological context or following a PAE, DNMT3A being responsible for de novo DNA methylation.Since it has been shown that the methylome profile of adults that were exposed to a PAE stress, is often perturbed, it was conceivable that the DNMT3A/HSF2 interaction, in a stressful context, may, in part, be responsible for this methylome profile modifications. To test this hypothesis, three integrative high-throughput sequencing (NGS) studies were conducted, using cerebral cortices of mouse embryos exposed, or not, to PAE corresponding to a binge drinking alcoholization.ChIP-seq experiments, targeting HSF2 in alcohol-exposed fetal cortices, allowed us to map its binding sites in the genome, and identify 280 HSF2 targets. Most of these target sites are associated with genes involved in brain development or in stress response. Some of these genes are also linked, in the literature, with PAE effects.Few hours after PAE, 432 differentially methylated regions (DMRs) were identified between control (PBS treated) or alcohol-treated fetal cortices, using a methylome capture protocol. This analysis required the development of specific bioinformatics tools and approaches. These DMRs are mainly localized in active enhancers of the adult cortex. A high proportion of their associated genes correspond to imprinted genes or genes encoding clustered Protocadherins, both involved in neurodevelopment or brain function, and known to be impacted in adults prenatally exposed to an alcoholic stress. Because their deposition is linked to PAE per se and show some persistence in the postnatal/adut period, this strongly reinforces their potential as biomarkers of exposition. These results indicate that epigenetic ‘scars‘ are deposited very quickly after PAE and suggest, based on the literature, that some of them persist in adults.To estimate the functional consequences of PAE on the developing brain, a study of chromatin accessibility and gene expression over the stress period was conducted in a physiological context, analyzing public data (ENCODE) of ATAC-seq and RNA-seq from unstressed murine prefrontal cortices. This data mining study allowed us counting and identifying the chromatin regions that are differentially opened or closed, as well as the genes that are activated or repressed between the embryonic stages E13 and E16 in the developing cortex. Of note, a proportion of DMRs are significantly associated with chromatin regions whose accessibility varies - under physiological conditions - during the stress period, but also with genes whose expression increases during development, suggesting a particular vulnerability at these dynamic regions of the genome to stress.Our integrative analysis of the different NGS datasets did not reveal any correlation between HSF2 binding sites and the DMRs. However, since HSF2 target sequences contain often binding sites of methylome readers or chromatin remodellers, HSF2 might be involved in functional consequences of PAE-induced methylome disturbances, rather than in the establishment of these defects

碩士
中國醫藥大學
生物醫學研究所碩士班
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第一部分：Hypertension-induced cardiac hypertrophy to attenuate cardiac function is the major characteristics of early-stage heart failure. Our previous studies found that SUMOylation of the heat shock factor 2 (HSF2) was severely attenuated by MEL-18 in the heart of spontaneously hypertensive rats (SHR). However, the role of underlying mechanism regulating MEL-18 in hypertension-induced cardiac hypertrophy remains elusive. In this study, we identified mammalian of target of Rapamycin compex1 (mTORC1) activated MEL-18 to deSUMOylate HSF2 for insulin-like growth factor II receptor (IGF-IIR)-mediated cardiac hypertrophy. mTORC1 activation by angiotensin II (ANG II) is responsible for MEL-18 upregulation both in vitro and in vivo. Furthermore, inhibition of mTORC1 by resveratrol and Rapamycin completely abrogated downstream targets of MEL-18 and restored the SUMOylation of HSF2 to alleviate the cardiac dysfunction. Our results revealed an unanticipated mTORC1-MEL-18-HSF2-IGFIIR axis was a critical regulatory pathway of cardiomyocyte hypertrophy in vitro and in vivo, suggesting that Rapamycin could be a potential therapeutic candidate to alleviate cardiac dysfunction and attenuate high blood pressure during hypertension-induced cardiac hypertrophy. 第二部分：Solanum Nigrum is a natural compound that can decrease triglycerides, cholesterol, VLDL, and LDL cholesterol, and also increase HDL cholesterol. Growing evidences shows Protein Kinase C (PKC) family is involved in hypertension-related cardiac disease. However, the underlying mechanism of Solanum Nigrum ameliorated the cardiac hypertrophy remains unknown. According to our results, we found that mammalian target of Rapamycin complex 1 (mTORC1) plays a critical role in angiotensin II (ANG II) induced cardiac hypertrophy. Growing evidences suggest that PKC-zeta regulates mTORC1 activation-mediated hypertension-related disease, implying PKC-zeta may be a cardioprotective therapeutic strategy to suppress ANG II-induced cardiac hypertrophy. Here, we identified PKC signaling pathways modulates insulin-like growth factor II receptor (IGF-IIR) expression by mTORC1 signaling under ANG II-induced cardiac hypertrophy. But, Administration of Solanum Nigrum reduces high blood pressure , particularly in diastolic pressure and also markedly restored SUMOylation on HSF2 to inhibit IGF-IIR upregulation. Taken together, these findings demonstrated that Solanum Nigrum improves hypertension-related hypertrophy in vivo and in vitro, by rescuing SUMOylation of HSF2 to downregulate IGF-IIR, eventually reduce BNP expression and cardiac hypertrophy.