Literatura académica sobre el tema "Protéines de cellule hôte (HCPs)"

Les protéines de cellule hôte (HCPs) sont des impuretés indésirables dans la production d’anticorps monoclonaux (mAbs), pouvant compromettre la sécurité, l’efficacité et la stabilité des traitements. Bien que l’ELISA soit couramment utilisée, elle présente des limites de couverture. Cette thèse explore des méthodes complémentaires basées sur la spectrométrie de masse. Une approche d’immuno-capture permet de détecter les HCPs non immune-réactifs, tandis que des workflows LC-MS/MS avancés avec des peptide standards offrent une quantification plus précise. Ces stratégies visent à améliorer le contrôle qualité dans la fabrication des mAbs
Host cell proteins (HCPs) are unwanted by-products in the production of monoclonal antibodies (mAbs), and even at low levels, they can affect the safety, efficacy, and stability of biopharmaceuticals. While ELISA is widely used for HCP detection, it lacks full impurity coverage. This work explores complementary mass spectrometry-based methods to address these limitations. An immune-capture MS approach targets non-immunoreactive HCPs missed by ELISA, while advanced LC-MS/MS workflows using peptide standards enable more accurate and flexible quantification. These tools aim to improve impurity profiling and strengthen quality control in mAb manufacturing

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire ; son implication en pathologie humaine est bien connue notamment chez la femme enceinte (par passage transplacentaire de la mère au fœtus) et chez les immunodéprimés (par réactivation de kystes cérébraux). Les mécanismes entrant en jeu dans l'infectivité du parasite, et plus particulièrement l'invasion de la cellule hôte par le parasite, sont peu connus, néanmoins plusieurs études ont montré l ‘importance du calcium lors de ces phénomènes. En effet, le calcium joue un rôle important dans la mobilité du parasite, ainsi que dans l'attachement du toxoplasme à la cellule hôte. Le calcium activerait plusieurs cascades de réaction impliquant des protéines kinases telles que les MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases), les CDPKs Calcium Dependent Protein Kinases). . . En effet, l'utilisation d'inhibiteurs de kinases tel que le PD98059 empêchent la pénétration du toxoplasme dans les cellules en culture et inversement le traitement des cellules 3T3 en culture par la bombésine, un peptide activant les MAPK via les protéines kinases C (PKC), favorise l'invasion et la multiplication du toxoplasme. De plus, la présence de calcium jusqu'à un certain seuil favorise aussi fortement cette pénétration du toxoplasme dans les cellules en culture. Dans un " in gel assay ", Nous avons montré chez le tachyzoïte la présence de plusieurs protéines kinases qui phosphorylent fortement en présence de calcium et dont les activités sont inhibées en présence d'EGTA (chélateur du calcium). Nous avons cloné et séquencé les gènes de plusieurs protéines kinases dont une CDPK sur laquelle nous avons approfondi notre recherche et que nous avons nommée TgCDPK3. Cette dernière est une protéine kinase dépendante du calcium qui appartient à une famille de protéine kinase découverte uniquement chez les plantes et les protistes. TgCDPK3 est une protéine de 62 kDa. La localisation intracellulaire grâce à deux anticorps spécifiques anti-SE41 et anti-SE42 a montré que cette protéine était cytoplasmique. L'ensemble de ces résultats semblent indiquer que TgCDPK3 joue un rôle dans l'infectivité de T. Gondii et qu'elle peut être une nouvelle cible thérapeutique
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite ; its implication in human pathology is well known regarding two particular aspects : congenital toxoplasmosis and reactivated toxoplasmosis in immunodeficient patients. Regulation of the infectivity of the parasite is not clear at this time. Meanwhile, many studies point to the importance of the calcium during the processus of the invasion of the parasite. Ca2+ has an important role for the motility of the parasite, for attachment to the host cells and for survival. Intracellular Ca2+ plays a essential role in signal transduction in eukaryotic cells, by activating protein kinase cascades (such as MAPKs involving protein kinase C ; and CDPKs). In addition, tachyzoite stimulation with bombesin stimulated host cell invasion 2-fold, and conversely, tachyzoite treatment with PD98059, a MAP kinase inhibitor, significantly reduced both parasite infectivity and growth. To demonstrate the presence of protein kinase activity in Toxoplasma gondii, an " in gel renatured protein assay " was performed after different Ca2+ stimuli, showing the existence of proteins that can strongly phosphorylate MBP in the presence of Ca2+. This increase was reversed with the incubation of tachyzoite with EGTA (calcium inhibitor). In this study, we have cloned and sequenced kinase genes, in particular a 62 kDa CDPKs that we named TgCDPK3. TgCDPK3 is an enzyme from the calcium dependent protein kinase superfamily, that is absent from the complete genome sequence of yeast and of nematode and human. It is then tempting to speculate that CDPKs might be present in plants and protozoans only. The immunolocalization using two specifics antibodies of TgCDPK3, anti-SE41 and anti-SE42 antibody reveal that this protein is cytoplasmic. This result suggest that TgCDPK3 plays a role in the infection of the parasite and may be a novel therapeutic target

Le travail de cette thèse qui porte sur la leishmaniose viscérale à L. Infantum, maladie parasitaire mortelle en l’absence de traitement, endémique sur le pourtour du bassin méditerranéen comporte deux volets principaux. Le premier est constitué par un essai vaccinal, réalisé avec l’ADNc de l’antigène papLe22, précédemment caractérisé au laboratoire. Cet antigène fortement immunogène, stimule in vitro la production d’IL-10, cytokine de la voie Th2 favorisant l’infection ? L’immunisation a permis de réorienter la réponse vers la voie Th1 et de contrôler partiellement la multiplication parasitaire. PapLe22 représente donc un candidat potentiel pour un cocktail vaccinal. Le second volet comporte le clonage et la caractérisation d’un nouvel antigène de L. Infantum, dénommé Lepp12. Nous avons montré que la protéine Lepp22 constitue un substrat probable pour la protéine kinase C de la cellule hôte et un potentialisateur potentiel de la voie d’activation par le PMA. De ce fait, la protéine Lepp12 pourrait in vivo interférer avec les voies de signalisation impliquées dans l’activation du macrophage soit en stimulant la voie PKC et/ou en inhibant des activités phosphatases
This thesis devoted to visceral leishmaniasis due to L. Infantum, parasitic disease fatal if left untreated, endemic in Mediterranean basin, includes two main parts. We first performed a vaccination trial using cDNA encoding for the L. Infantum protein papLe22 previously described in our laboratory. This highly immunogenic antigen enhances in vitro IL-10 production, cytokine of the Th2 pathway, favoring the development of the infection. After immunization we observed a reorientation of the immune response toward the th1 pattern and a marked decrease of the frequency of parasite circulation. Therefore, papLe22 represents a potential candidate for an antileishmanial vaccine cocktail. The second aprt describes the characterization of a novel L. Infantum protein termed Lepp12. Both recombinant and natural Lepp12 are phosphorylated in vitro by Protein Kinase C (PKC) or PKC-like activities Transfection experiments indicate that Lepp12 specifically enhances basa; and PMA induced IL-1 beta production in myelomonocytic THP-1 cell line. Togethenr these results indicate that in vitre Lepp12 represents a pytative substrate for PKC and enhances the signal transduction pathway involving PKC

Legionella pneumophila est une bactérie opportuniste qui émerge de l'environnement après multiplication dans des amibes et peut infecter accidentellement les macrophages alvéolaires humains, provoquant une pneumonie sévère, la légionellose. La capacité de L. pneumophila à survivre dans ses cellules hôtes est strictement dépendante du système de sécrétion de type 4 Dot/Icm, qui sécrète un large répertoire d'effecteurs dans le cytosol de l'hôte. Identifier la contribution individuelle de chaque protéine bactérienne sécrétée par le système Dot/Icm, dans le cycle infectieux de L. pneumophila reste un enjeu majeur pour comprendre les bases moléculaires de la virulence des légionelles. Mes travaux de thèse participent à cet objectif en caractérisant la voie cellulaire ciblée par la protéine kinase LegK2. Des tests d'interaction et de phosphorylation ont identifié le complexe nucléateur d'actine ARP2/3 comme cible de LegK2. Suite à l'adressage de LegK2 à la surface de la vacuole après sa translocation dans le cytosol de l'hôte, l'interaction LegK2-ARP2/3 inhibe la polymérisation d'actine sur le phagosome. Cette inhibition permet à Legionella de diminuer le trafic des endosomes tardifs et/ou des lysosomes vers le phagosome et favorise ainsi l'évasion du phagosome à la voie de dégradation endocytique. L'interaction LegK2-ARP2/3 met en évidence un mécanisme original de virulence dans lequel le remodelage local du cytosquelette d'actine de la cellule hôte permet à la bactérie de manipuler le trafic vésiculaire pour échapper aux défenses de l'hôte
Legionella pneumophila is an opportunistic bacterium that emerges from the environment after multiplication in protozoans and can accidentally infect human alveolar macrophages leading to a severe pneumonia, the legionellosis. The L. pneumophila ability to survive within host-cells is strictly dependent on the Dot/Icm Type 4 Secretion System that translocates a large repertoire of effectors into the host cell cytosol. Deciphering the individual contribution of each bacterial protein translocated by the Dot/Icm system in the L. pneumophila infectious cycle remains a major challenge to understand the molecular basis of Legionella virulence. My works contribute to this objective by characterizing the cellular pathway targeted by the protein kinase LegK2. Interaction and phosphorylation assays identified the actin nucleator ARP2/3 complex as the target of LegK2. Following the LegK2 addressing to the vacuole surface after its translocation into host cytosol, LegK2- ARP2/3 interplay inhibits the actin polymerization on the phagosome. This inhibition allows Legionella to decrease the late endosome/lysosome trafficking towards the phagosome and promotes the phagosome evasion from endocytic degradation pathway. LegK2-ARP2/3 interplay highlights an original mechanism of virulence wherein the local actin cytoskeleton remodeling of host cell allows bacteria to hijack the vesicles trafficking in order to escape host-cell defenses

Les récents progrès instrumentaux en spectrométrie de masse, notamment en terme de- rapidité de balayage et de résolution, ont permis l'émergence de l'approche « data independent acquisition» (DIA). Cette approche promet de combiner les points forts des approches « shotgun » et ciblées,mais aujourd'hui l'analyse des données DIA reste compliquée. L'objectif de cette thèse a été de développer des méthodes innovantes de spectrométrie de masse, et en particulier d'améliorer l'analyse des données DIA. De plus, nous avons développé une approche originale Top 3-ID-DIA, permettant à la fois un profilage complet des protéines de la cellule hôte (HCP) ainsi qu'une quantification absolue d'HCP clés dans les échantillons d'anticorps monoclonaux (mAb), au sein d'une même analyse.Cette méthode est prête à être implémentée en industrie, et pourrait fournir un support en temps réel aux développements du procédé de production de mAb, ainsi que pour évaluer la pureté des biomédicaments
Recent instrumental developments in mass spectrometry, notably in terms of scan speed and resolution, allowed the emergence of “data independent acquisition” (DIA) approach. This approach promises to combine the strengths of both shotgun and targeted proteomics, but today DIA data analysis remains challenging. The objective of my PhD was to develop innovative mass spectrometry approaches, and in particular to improve DIA data analysis. Moreover, we developed an original Top 3-ID-DIA approach, allowing both a global profiling of host cell proteins (HCP) and an absolute quantification of key HCP in monoclonal antibodies samples, within a single analysis. This method is ready to be transferred to industry, and could provide a real time support for mAb manufacturing process development, as well as for product purity assessment

Les phytovirus empruntent les vaisseaux du phloème pour envahir leur plante hôte de manière systémique. Ce mouvement étant très mal connu, l’objectif de cette étude était d’identifier par une approche transcriptomique, des gènes spécifiquement dérégulés dans les cellules compagnes (CC) suite à l’infection virale par un Polerovirus, le Turnip yellows virus (TuYV) ou par un Potyvirus, le Lettuce mosaic virus (LMV). Pour ce faire, des protoplastes de CC ont été préparés et triés par la technologie de FACS. Les ARN extraits ont ensuite été traités par RNAseq et hybridation sur puces CATMA. Malgré d’importantes variations entre les expériences, nous avons identifié des processus biologiques communs affectés par les infections virales : la voie d’assimilation du soufre et le mécanisme de résistance systémique acquise (SAR) pour le LMV, et la voie de biosynthèse des glucosinolates pour le TuYV. Pour compléter cette étude, une banque d’ADNc spécifique des CC a été construite et criblée en utilisant le domaine C-terminal de la protéine RT du TuYV. Une interaction avec la protéine CIPK7 a été détectée et le rôle potentiel de cette interaction dans le cycle viral a été étudié in planta
Phytoviruses invade systemically their host plant through the phloem. As this viral step remains poorly understood, the aim of this work was to identify, using a transcriptomic approach, genes specifically deregulated in companion cell (CC) during infection with the Polerovirus Turnip yellows virus (TuYV) and the Potyvirus Lettuce mosaic virus (LMV). CC protoplasts were prepared and sorted by FACS technology. Extracted RNA were further analyzed by RNAseq andCATMA microarrays. Although considerable variations between the experiments were observed,we were able to identify common biological processes affected by viral infections: sulfate assimilation and systemic acquired resistance (SAR) mechanism for LMV and glucosinolate biosynthesis for TuYV. To complete this study on systemic viral movement, a CC-specific cDNA library was constructed and screened using the TuYV RT C-terminal domain as a bait. An interaction with the AtCIPK7 protein was retrieved, a protein kinase interacting with calcineurin Blike proteins. The potential role of this interaction in the viral cycle in planta was further investigated in planta

Mon travail de Thèse a porté sur la description de l’immunité antibactérienne de la planaire, et plus particulièrement la mémoire immunitaire innée.La mémoire immunitaire innée constitue une ligne de défense de l’hôte à la réinfection qui ne fait intervenir que des composants de l’immunité innée. Présente chez les vertébrés et les invertébrés, ces derniers constituent un modèle de choix car dépourvus d’immunité acquise. La planaire dispose d’une mémoire immunitaire innée envers S. aureus, qui, suite à une réinfection, se traduit par une élimination exacerbée. La déplétion des planaires en cellules souches et la greffe tissulaire ont permis de mettre en avant les cellules souches comme acteurs principaux de cette réponse immunitaire. Un criblage RNAi associé à un profilage transcriptomique ont fait ressortir des gènes en les hiérarchisant au sein d’une voie de signalisation impliquant un récepteur au peptidoglycane (pgrp-2), une histone méthyltransférase (setd8.1), et un mécanisme effecteur dans l’élimination bactérienne (p38 et morn2). Setd8.1, histone méthyltransférase, se placerait au cœur du processus en déposant des marques épi-génétiques sur des loci de l’ADN, garantissant l’expression accrue des gènes effecteurs suite à la réinfection. Ce mécanisme, décrit chez l’Homme, n’avait jusqu’alors jamais impliqué des cellules souches, ni ce type d’histone méthyltransférase comme acteurs dans la mémoire immunitaire innée.Collectivement, l’investigation du système immunitaire de la planaire a permis la découverte de mécanismes de défense antibactérienne inédits, dont le transfert à l’Homme pourrait compléter l’approche actuelle du traitement des maladies infectieuses
My Thesis work has focused on the description of the planarian antibacterial immunity, and more precisely the innate immune memory.The innate immune memory forms a host defense line to the reinfection which only involves components from innate immunity. Present in vertebrates and invertebrates, invertebrates are a model of choice because devoid of acquired immunity. The planarian has an innate immune memory against S. aureus, which, after a reinfection, displays an exacerbated elimination. The depletion of stem cells from planarians and tissue graft highlighted stem cells as the main actors of this immune response. An RNAi screening combined with a transcriptomic profiling brought out genes and classified them within a signaling pathway involving a peptido-glycan receptor (pgrp-2), a histone methyltransferase (setd8.1), and an effector mechanism of the bacterial elimination (p38 and morn2). Setd8.1, histone methyltransferase, would be the core of the process putting epigenetic marks on DNA loci, ensuring the increased expression of effector genes after reinfection. This mechanism, described in humans, has neither involved stem cells, nor this type of histone methyltransferase as actors in the innate immune memory.Collectively, the investigation of the planarian immune system allowed the discovery of new antibacterial defense mechanisms, and transferring it to humans could complete the actual approach of the infectious disease treatment