Tesis: "Substratspezifität"

1

Hörber, Christine. "Untersuchungen zur Substratspezifität von Aggrekanasen". [S.l.] : [s.n.], 2000. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=962123323.

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2

Fischer, Rita. "Anpassung von Acinetobacter baylyi Stamm ADP1 an aromatische Substratbedingungen". [S.l. : s.n.], 2008. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:289-vts-63643.

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3

Waniek, Thomas. "Untersuchungen zur Substratspezifität und Enantioselektivität mikrobieller Hydantoinasen". [S.l.] : Universität Stuttgart , Fakultät Chemie, 2000. http://www.bsz-bw.de/cgi-bin/xvms.cgi?SWB8536746.

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4

Henke, Erik. "Untersuchungen zur Erweiterung der Substratspezifität von Carboxylester-Hydrolasen". [S.l.] : [s.n.], 2001. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=964989050.

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5

Ludwig, Katrin. "Protein-Histidin-Phosphatase : Substratspezifität, Identifizierung neuer Interaktionspartner und Assoziationsverhalten /". Münster, 2008. http://opac.nebis.ch/cgi-bin/showAbstract.pl?sys=000276777.

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6

Knoll, Michael. "Von der Sequenz zur Funktion : systematische Modellierung verschiedener Proteinfamilien auf Sequenz- und Strukturebene$nElektronische Ressource /". [S.l. : s.n.], 2008. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-38488.

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7

Mörtl, Mario Samuel. "Substrate specificity of Glycine Oxidase and protein interaction specificity of the neuronal cell adhesion molecule TAG-1". [S.l. : s.n.], 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-66181.

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8

Strub, Christine Eva. "Untersuchungen zur Struktur und Substratspezifität des AAA+-Chaperons ClpB in Escherichia coli". [S.l.] : [s.n.], 2006. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=979900379.

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9

Linne, Uwe. "Epimerisierungsdomänen aus Peptidsynthetasen Untersuchungen zur Substratspezifität und zur Interaktion mit anderen Domänen /". [S.l.] : [s.n.], 2001. http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2001/0405/.

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10

Struhalla, Marc. "Veränderung der Substratspezifität von Ribonuclease T1 und Einsatz des Enzyms in Immunotoxinen". [S.l.] : [s.n.], 2003. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=968550835.

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11

Matthies, Claudia. "Erzeugung von Taq-DNA-Polymerasemutanten und Untersuchung ihrer Substratspezifität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie". [S.l. : s.n.], 2003. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=968361765.

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12

Ölschläger, Peter. "In vitro and in silico models for in vivo events". [S.l. : s.n.], 2002. http://www.bsz-bw.de/cgi-bin/xvms.cgi?SWB10252229.

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13

Jahnz, Michael. "Evolutive Biotechnologie und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie Systeme zur Änderung enzymatischer Substratspezifität und Auffindung neuer Wirkstoffe /". [S.l.] : [s.n.], 2003. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=969265085.

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14

Grigat, Silke. "Analyse der Substratspezifität des Carnitin-Transporters SLC22A5 (OCTN2) von Mensch, Ratte und Huhn mittels LC-MS/MS /". Köln, 2008. http://opac.nebis.ch/cgi-bin/showAbstract.pl?sys=000253974.

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15

Vogelsgesang, Martin. "Rho-ADP-ribosylierende Exoenzyme von Clostridium botulinum und Clostridium limosum : Untersuchungen zur Substratspezifität und Interaktion mit Ral-GTPasen /". [S.l. : s.n.], 2005. http://www.gbv.de/dms/bs/toc/513916806.pdf.

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16

Eifert, Andrea. "Substratspezifität und Thermostabilität der D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase aus Lactobacillus casei sowie strukturelle Untersuchungen von Phytochrom A aus Hafer". [S.l. : s.n.], 2001. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=963192698.

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17

Cramer, Janina. "Funktionelle Charakterisierung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase des Hepatitis-C-Virus Untersuchung molekularer Mechanismen der Substratspezifität von DNA-abhängigen DNA-Polymerasen /". [S.l. : s.n.], 2004. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=971700796.

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18

Seidel, Christian. "Experimentelle und theoretische Untersuchungen zur Modifizierung der Substratspezifität einer Amin-Pyruvat-Aminotransferase". Doctoral thesis, Universitätsbibliothek Leipzig, 2013. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-125429.

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Resumen

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

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Friebel, Andrea. "Substratspezifität der nicht-dbl-homologen G-Nukleotid-Austauschfaktoren SopE und SopE2 aus Salmonella typhimurium". Diss., lmu, 2002. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-1066.

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20

Kohlhaas, Christoph [Verfasser]. "Chemisch-molekularbiologische Studien zur Substratspezifität von Ketosynthase-Domänen in trans-AT-Polyketidsynthasen / Christoph Kohlhaas". Bonn : Universitäts- und Landesbibliothek Bonn, 2014. http://d-nb.info/1046622706/34.

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21

Mattay, Johanna [Verfasser] y Wolfgang [Akademischer Betreuer] Hüttel. "Selectivity and substrate specificity in proline and pipecolic acid hydroxylases = Selektivität und Substratspezifität in Prolin- und Pipecolinsäurehydroxylasen". Freiburg : Universität, 2017. http://d-nb.info/1153335395/34.

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22

Ernyei, Aliz Judit [Verfasser]. "Untersuchungen zur Substratspezifität der Tryptophan-5- und der Tryptophan-6-Halogenase und Optimierung der Reaktionen / Aliz Judit Ernyei". München : Verlag Dr. Hut, 2014. http://d-nb.info/104799500X/34.

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23

Heil, Stefanie [Verfasser], Harald [Akademischer Betreuer] Kolmar y Felicitas [Akademischer Betreuer] Pfeifer. "Evolutive Optimierung mikrobieller Lipasen und Esterasen in Hinblick auf Substratspezifität und Enantioselektivität / Stefanie Heil. Betreuer: Harald Kolmar ; Felicitas Pfeifer". Darmstadt : Universitäts- und Landesbibliothek Darmstadt, 2012. http://d-nb.info/1107772141/34.

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24

Sundermann, Uschi [Verfasser], Frank [Akademischer Betreuer] Schulz y Herbert [Gutachter] Waldmann. "Reduzierte Polyketide : Beiträge zur Erforschung und Manipulation der Substratspezifität von Polyketidsynthasen / Uschi Sundermann. Betreuer: Frank Schulz. Gutachter: Herbert Waldmann". Dortmund : Universitätsbibliothek Dortmund, 2012. http://d-nb.info/110828633X/34.

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25

Funkner, Andreas Verfasser], Gunter [Akademischer Betreuer] [Fischer, Mike [Akademischer Betreuer] Schutkowski y Rudi [Akademischer Betreuer] Glockshuber. "Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Substratspezifität von Mitgliedern der Proteindisulfidisomerase-Familie / Andreas Funkner. Betreuer: Gunter Fischer ; Mike Schutkowski ; Rudi Glockshuber". Halle, Saale : Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt, 2012. http://d-nb.info/102530313X/34.

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26

Geinitz, Christopher [Verfasser] y Bernhard [Akademischer Betreuer] Hauer. "Studien zur Substratspezifität der Linalool Dehydratase-Isomerase mit dem Fokus auf der Dehydratisierung von tertiären Alkoholen / Christopher Geinitz ; Betreuer: Bernhard Hauer". Stuttgart : Universitätsbibliothek der Universität Stuttgart, 2015. http://d-nb.info/1123083339/34.

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27

Biela, Inna [Verfasser] y Klaus [Akademischer Betreuer] Reuter. "Untersuchung der Substratspezifität der tRNA-Guanin-Transglykosylase (TGT) aus Eukaryoten und Prokaryoten und Charakterisierung der eukaryotischen TGT / Inna Biela. Betreuer: Klaus Reuter". Marburg : Philipps-Universität Marburg, 2014. http://d-nb.info/1051934699/34.

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Meincke, Sarah [Verfasser] y Jörn Oliver [Akademischer Betreuer] Sass. "Untersuchungen zur Substratspezifität der Aminoacylase 1 aus Schweineniere unter besonderer Berücksichtigung der Kettenlänge der Acylreste und der Suche nach bisher unbekannten Substraten". Freiburg : Universität, 2012. http://d-nb.info/1122646607/34.

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Otto, Silke [Verfasser], Elmar [Akademischer Betreuer] Wahle, Wolfgang [Akademischer Betreuer] Sippl y Albert [Akademischer Betreuer] Jeltsch. "Untersuchung der Substratspezifität der PRMTs 1, 3 und 6 und der Funktion der Arginindimethylierung / Silke Otto. Betreuer: Elmar Wahle ; Wolfgang Sippl ; Albert Jeltsch". Halle, Saale : Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt, 2009. http://d-nb.info/1024894908/34.

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30

Kreher, Sandra [Verfasser], Gabriele [Gutachter] Dieckert, Erika [Gutachter] Kothe y Volker [Gutachter] Müller. "Anaerobe O-Demethylierung in Acetobacterium dehalogenans : Untersuchungen zu den etherspaltenden Methyltransferasen I - Zinkbindung und Substratspezifität / Sandra Kreher ; Gutachter: Gabriele Dieckert, Erika Kothe, Volker Müller". Jena : Friedrich-Schiller-Universität Jena, 2010. http://d-nb.info/1177669862/34.

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Seidel, Christian [Verfasser], Annette [Akademischer Betreuer] Beck-Sickinger, Annette [Gutachter] Beck-Sickinger y Ulrich [Gutachter] Hahn. "Experimentelle und theoretische Untersuchungen zur Modifizierung der Substratspezifität einer Amin-Pyruvat-Aminotransferase / Christian Seidel ; Gutachter: Annette Beck-Sickinger, Ulrich Hahn ; Betreuer: Annette Beck-Sickinger". Leipzig : Universitätsbibliothek Leipzig, 2013. http://d-nb.info/1238527302/34.

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Hegyi, Annette. "Charakterisierung der Substratspezifität coronaviraler 3C-like-Proteasen". Doctoral thesis, 2001. https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271.

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Resumen

Coronaviren sind mit einer Genomgröße von 27-32 kb die größten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und führen zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie führt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmoleküle für die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst fünf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Domäne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivität gegenüber synthetischen Peptiden und konnten somit für die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repräsentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die über Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. Übereinstimmend konnte für die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine frühzeitige (möglicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge hätte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repräsentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen überaus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage für die Entwicklung eines für Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay für Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verfügbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und könnte in modifizierter Form auch für andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays für ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie für die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. Für das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifität. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit für die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften führten, die gute Voraussetzungen für eine röntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen
With genome sizes between 27,000 and 31,000 nucleotides, coronaviruses are the largest RNA viruses known to date. They infect a broad range of vertebrates and cause considerable economic losses in animal breeding. Proteolytic processing of large polyprotein precursors generates the individual functional subunits of the replication complex and thus represents a central regulatory mechanism in the replication cycle of coronaviruses. In this process, the coronavirus 3C-like proteases play a key role and, for this reason, they represent ideal targets for the design of inhibitors to control coronavirus infections. To develop effective and selective enzyme inhibitors, a comprehensive biochemical and structural characterization of the 3C-like protease (3CLpro) is required. In this study, the substrate specificities of coronaviral 3C-like proteases were characterized in vitro. To this end, five different 3C-like proteases (from FIPV, TGEV, HCoV-229E, MHV und IBV) were recombinantly expressed as fusion proteins with the Escherichia coli maltose-binding protein. The complete coding region of the FIPV 3C-like protease was cloned and sequenced for the first time. Upon comparison of the deduced amino acid sequence with the replicase polyprotein sequences of other coronaviruses a close phylogenetic relationship between FIPV and TGEV was revealed. The MBP-3C-like protease fusion proteins were purified by affinity chromatography and the authentic 3C-like proteases were released from the fusion protein by factor Xa cleavage. All recombinant proteases were shown to be active in synthetic peptide-based trans-cleavage assays and, thus, they were suitable for further biochemical characterization. Competition experiments using the purified 3C-like proteases of HCoV, TGEV and MHV, respectively, and peptide substrates representing pp1a/pp1ab cleavage sites revealed a specific ranking of cleavage sites. This ranking proved to be conserved among coronaviruses. The data consistently showed that the sites which flank the 3C-like proteases are most effectively cleaved. It thus seems reasonable to conclude that the release of 3CLpro from the viral polyprotein may be an early, possibly cotranslational step in the pp1a/pp1ab processing pathway. If this hypothesis is correct, most 3CLpro-mediated cleavages would occur in trans. Interestingly, the peptide substrate containing the aminoterminal HCoV 3CLpro cleavage site was cleaved very efficiently by all the coronaviral 3C-like proteases tested in this study. Therefore, the sequence of this peptide was used to develop a universally applicable, sensitive fluorometric assay suitable for the characterization of coronavirus 3C-like proteases and the identification and evaluation of inhibitors. This peptide-based fluorogenic assay not only significantly extends the spectrum of analytical methods in the characterization of coronavirus 3C-like proteases but, in a modified form, could also be applied for other viral proteases. The initial characterization of this novel assay using class-specific protease inhibitors demonstrated its suitability for high-throughput screening (HTS) applications which are widely used in the pharmaceutical industry to identify inhibitory lead compounds from large compound libraries generated by combinatorial chemistry. Structural information is essential for the rational design of 3CLpro-specific inhibitors. In this respect, the elucidation of the structural basis for subrate recognition is of particular interest. In an attempt to identify coronaviral 3C-like proteases with favourable crystallization properties, protocols for the purification of the FIPV and TGEV 3C-like proteases were developed in this study. The established methods proved to be suitable to produce large amounts of highly purified enzymes with significantly improved crystallization properties and thus provide a good basis for structure analyses by X-ray crystallography

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Sikorra, Stefan [Verfasser]. "Charakterisierung der Substratspezifität clostridieller Neurotoxine / von Stefan Sikorra". 2008. http://d-nb.info/989386368/34.

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Hörber, Christine [Verfasser]. "Untersuchungen zur Substratspezifität von Aggrekanasen / von Christine Hörber". 2000. http://d-nb.info/962123323/34.

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Voss, Jan. "Substratspezifität und Signaltransduktion zellulärer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen". Doctoral thesis, 2004. https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12819.

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Resumen

Deregulierte Überaktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leukämieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren für die CML als ursächlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Größe (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifität der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminosäuresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifität der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der für Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. Ähnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Präzipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leukämischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leukämischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifität aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden
Inappropriate activation of Abl family kinases plays a crucial role in different human leukaemias. In addition to the well known oncoproteins p190Bcr-Abl and p210Bcr-Abl, Tel-Abl, a novel fusion protein resulting from a different chromosomal translocation, has recently been described. In this study, the kinase specificities of the Bcr-Abl and Tel-Abl proteins were compared to the physiological Abl family kinases c-Abl and Arg (abl related gene). Using short peptides which correspond to the target epitopes in known substrate proteins of Abl family kinases, we found a higher catalytic promiscuity of Bcr-Abl and Tel-Abl. Similar to Bcr-Abl, Tel-Abl was found in complexes with the adapter protein CRKL. In addition, c-Crk II and CRKL are tyrosine phosphorylated and complexed with numerous other tyrosine phosphorylated proteins in Tel-Abl expressing cells. GTPase analysis with a Ras-GTP-specific precipitation assay showed constitutive elevation of GTP-loaded Ras in cells expressing the leukaemic Abl proteins. The mitogenic MAPK/Erk kinases as well as Akt/PKB, a kinase implicated to negatively regulate apoptosis, were also constitutively activated by both Bcr-Abl and Tel-Abl. The results indicate that the leukaemic Abl-fusion proteins have catalytic specificities different from the normal kinases c-Abl and Arg and that Tel-Abl is capable to activate at least some pathways which are also upregulated by Bcr-Abl

36

Schneider, Sarah [Verfasser]. "Änderung der Substratspezifität von Transaldolasen / vorgelegt von Sarah Schneider". 2009. http://d-nb.info/1008354295/34.

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Grundmann, Peter. "Charakterisierung eines industriellen Biokatalysators: Zur Substratspezifität der Glutaryl-Acylase". Phd thesis, 2006. https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/722/1/Dissertation_Peter_Grundmann_1.pdf.

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Resumen

Das Enzym Glutaryl-Acylase (GA) findet Verwendung in der industriellen Produktion semisynthetischer Antibiotika und weist eine strukturelle Verwandtschaft mit der Penicillin G-Acylase (PGA) auf. Letzteres Enzym findet vielfältige Anwendung in der präparativen Synthese, so etwa zur kinetischen Racematspaltung von Aminen oder in enzymatischen Schutzgruppenoperationen. Zur Klärung der Frage, ob die GA ein ähnlich breites Anwendungspotential wie die PGA aufweist wurde die Substrattoleranz, die Enantioselektivität der Umsetzung racemischer Amide und das Synthesepotential von GA untersucht. Zusätzlich wurden die Glutaryl-Acylasen zweier verschiedener Hersteller miteinander verglichen. Die GA weist nur eine geringe Toleranz gegenüber strukturellen Veränderungen des Glutarylrestes auf, während die Aminokomponente strukturell sehr breit variiert werden kann und sogar eine signifikante Esteraseaktivität beobachtet wurde. Glutarylderivate sekundärer Amine und ortho-substituierter Aniline wurden nicht als Substrate akzeptiert. Die GA zeigt meist eine nur moderate Enantioselektivität bei der Hydrolyse verschiedener racemischer Glutarylamide. Derivate von α-Aminosäuren und α-Aminoalkoholen wurden allerdings mit hoher Enantioselektivität (E>30) hydrolysiert. Die GA weist sowohl in wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmitteln als auch im wässrigen Medium ein beachtliches Synthesepotential für Glutarylamide auf. Der Vergleich der von Roche und Recordati produzierten Glutaryl-Acylasen zeigte, daß beide Enzyme polare Substrate bevorzugen. Die Recordati-GA weist eine höhere Enantioselektivität bei der Hydrolyse racemischer Amide auf und ist empfindlicher gegenüber strukturellen Veränderungen im Acylrest. Der Aktivitätsverlust bei der Umsetzung unpolarer Substrate ist für die Roche-GA weniger stark ausgeprägt.

38

Czaja, Rico [Verfasser]. "Strukturelle Untersuchungen zur Substratspezifität von Ribonuclease T1 / vorgelegt von Rico Czaja". 2006. http://d-nb.info/978965094/34.

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39

Hegyi, Annette [Verfasser]. "Charakterisierung der Substratspezifität coronaviraler 3C-like-Proteasen / vorgelegt von Annette Hegyi". 2002. http://d-nb.info/969620152/34.

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40

Waniek, Thomas [Verfasser]. "Untersuchungen zur Substratspezifität und Enantioselektivität mikrobieller Hydantoinasen / vorgelegt von Thomas Waniek". 2000. http://d-nb.info/958888515/34.

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41

Henke, Erik [Verfasser]. "Untersuchungen zur Erweiterung der Substratspezifität von Carboxylester-Hydrolasen / vorgelegt von Erik Henke". 2001. http://d-nb.info/964989050/34.

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Voss, Jan [Verfasser]. "Substratspezifität und Signaltransduktion zellulärer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen / vorgelegt von Jan Voss". 2005. http://d-nb.info/974671940/34.

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Seidel, Christian. "Experimentelle und theoretische Untersuchungen zur Modifizierung der Substratspezifität einer Amin-Pyruvat-Aminotransferase". Doctoral thesis, 2012. https://ul.qucosa.de/id/qucosa%3A12190.

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Resumen

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

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Heil, Stefanie. "Evolutive Optimierung mikrobieller Lipasen und Esterasen in Hinblick auf Substratspezifität und Enantioselektivität". Phd thesis, 2012. https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3643/1/Stefanie_Heil_Diss_final.pdf.

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Resumen

Das Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines robusten Hochdurchsatzverfahrens zur Identifizierung und Isolierung von lipolytischen Enzymvarianten mit veränderter Substratspezifität. Grundlegend für die Etablierung eines erfolgreichen Hochdurchsatzverfahrens ist die Verknüpfung des Phänotyps und des Genotyps. Die in dieser Arbeit verwendete Strategie für die Phänotyp-Genotyp-Kopplung ist die kovalente Bindung des fluoreszenzmarkierten Produktes auf der Zelloberfläche von Enzym-präsentierenden Zellen. Der Identifizierung von Enzymvarianten mit entsprechender Aktivität kann mittels Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated cell sorting, FACS) erfolgen, da es bei erhöhter Enzymaktivität zu einer vermehrten Bindung des Produktes kommt. Für die Genotyp-Phänotyp-Kopplung der lipolytischen Enzyme wurden zwei Ansätze verfolgt: 1) Oberflächenpräsentation auf E. coli Zellen über die Membranesterase (EstA) aus Pseudomonas aeruginosa und 2) Oberflächenpräsentation auf Saccharomyces cerevisiae Zellen über a Agglutinin. Anhand von Anreicherungexperimenten und/oder der Durchmusterung einer Variantenbibliothek wurden die Verfahren erprobt. Hierbei wurden die beiden Minimal-Hydrolasen Cutinase aus Fusarium solani pisi und Lipase A aus Bacillus subtilis als Modellenzyme gewählt. Das E. coli-basierte Zelldisplay zeigte sehr niedrige Überlebensraten der E. coli Zellen nach Expression der rekombinanten lipolytischen Enzyme. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse scheint eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung auf E. coli Zellen mit anschließender Selektion kein robustes System für die gerichtete Evolutive von Lipasen zu sein. Für das Hefe-basierte Zelldisplay konnte die Genotyp-Phänotyp-Kopplung erfolgreich etabliert werden. Durch Bestimmung der Überlebensrate sowie durch ein Mischungsexperiment wurde gezeigt, dass dieses Hefe-System ein robustes Selektionssystem für enantioselektive Varianten von lipolytischen Enzymen ist.

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Popp, Christian. "Identifizierung von Aminosäuren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin". Doctoral thesis, 2004. https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349.

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Resumen

Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gründemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminosäure in der 11. Transmembrandomäne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminosäuren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels“ aller 12 hypothetischen Transmembrandomänen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne auf einer Seite. Bei diesen Aminosäuren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingeführt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminosäuren bei den flankieren Aminosäuren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport führte. Weiterhin schien an Position 218 für den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminosäure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls Änderungen bei den Transportraten und Affinitäten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinität der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegenüber dem Wildtyp erhöht. Weiterführende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinitäten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls Änderungen in Affinität und Selektivität. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum verändert war, hingegen wurden sehr starke Änderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminosäurepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies könnte der Grund für die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch bestätigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte
The first organic cation transporter was cloned from rat (rOCT1) in 1994 by using the expression cloning technique (Gründemann et al., 1994). In 1999 it was found that one of the aminoacids in the 11th transmembranedomain of rOCT1, is part of it’s substrate binding pocket (Gorboulev et al., 1999). It was the aim of this thesis to identify more aminoacids of functional relevance for this transport protein. A comparison of all 12 helical wheels of the transporter showed, that there is an accumulation of 5 OCT and OCTN specific aminoacids at one side of the a-helix. These aminoacids were K215, W218, Y222, T226 and V229. Different single point mutations have been generated at these positions. Using radiolabeled substrates for rOCT1, the experiments showed, that even a substitution by a structural related aminoacid at the flanking aminoacids resulted in a failure of substrate transport. For TEA transport it has been suggested that the aminoacid at position 218 should have aromatic properties. We therefor suggest a cation-p interaction between the aromatic ringsystem of W218 and the positive charge of TEA. Experiments with mutations in position Y222 also showed differences in transport rates and affinities referring to the wildtype using different substrates. A cation-p interaction could be excluded, but it was shown, that there was a 20fold increased affinity of TPeA for the mutant Y222F. Further experiments utilizing the two electrode voltage clamp technique showed different affinities for wildtype rOCT1 in comparison to the mutated protein in its outward and inward conformation. The wildtype showed a competitive type of inhibition for TPeA inhibited TEA current, the mutant showed a non-competitive type of inhibition. The mutant T226A also showed changes in affinity and selectivity. In all transporting mutants we found no or lowest changes in the transport characteristics of MPP, but very big changes in the transport characteristics of TEA, an indication for different binding sites for these substrates. The experiment clearly showed, that these five aminoacids are of functional relevance for rOCT1 transport. In experiments using quinine as inhibitor of rOCT2 mediated transport quinine in it’s uncharged form passed the oocyte membrane by diffusion and inhibited rOCT2 from the inside. This might be the reason for the non-competitive type of inhibition, using quinine as the inhibitor for TEA uptake. This hypothesis was confirmed when we showed that the type of inhibition changed into the competitive type, when we used the protonated form of quinine

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Grundmann, Peter [Verfasser]. "Charakterisierung eines industriellen Biokatalysators : zur Substratspezifität der Glutaryl-Acylase / vorgelegt von Peter Grundmann". 2006. http://d-nb.info/981042201/34.

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Jung, Thomas Friedrich [Verfasser]. "Substratspezifität und Stereoselektivität der Galaktitoldehydrogenase aus Rhodobacter sphaeroides D / von Thomas Friedrich Jung". 2008. http://d-nb.info/996155317/34.

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Hennecke, Gerrit. "Zur Substratspezifität und Substratbindung des periplasmatischen Chaperons SurA aus Escherichia coli". Doctoral thesis, 2005. http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABBE-1.

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Sturm, Alexander. "Identifikation zweier für Regulation, Substratspezifität und Transportgeschwindigkeit bedeutsamer Cysteine des organischen Kationentransporters rOCT1". Doctoral thesis, 2007. https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25717.

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Resumen

Zur SLC22-Genfamilie von Karnitin- und organischen Ionentransportern gehören u. a. auch die organischen Kationentransporter der Ratte rOCT1 und rOCT2 sowie deren humane Analoga. Diese funtionell bereits gut charakterisierten Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert und transportieren endogene und pharmakologisch relevante Substanzen. Die Aufklärung des Transportmechanismus und der Regulation sind Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen. In dieser Arbeit wurde durch elekrophysiologische Methoden, die modifiziert auch zur Messung von Membrankapazitäten und des Strom-Teilchen-Aufnahmeverhältnisses (CFR) eingesetzt wurden, der Effekt des ungeladenen, membranpermeablen SH-Gruppenregenz MMTS auf den in Xenopus laevis-Oozyten exprimierten rOCT1 untersucht. Durch MMTS kam es zu einer Aktivierung von substratinduzierten Strömen und Kapazitätsänderungen, einer unterschiedlichen Veränderung von Substrat- und Inhibitoraffinitäten sowie einer Zunahme der absoluten Oozytenmembrankapazität. Die CFR und die Spannungsabhängigkeit änderten sich nicht. An rOCT2 konnten teils gleich-, teils gegensinnige Veränderungen nach MMTS-Exposition gezeigt werden. Diese Phänomene können am ehesten durch eine Konformationsänderung der polyvalenten Substratbindungsregion, einen verstärken Membraneinbau der Transportermoleküle und eine gesteigerte Transportrate des Einzeltransporters erklärt werden. Durch die Untersuchung von Mutanten konnten die Cysteine 322 und 451 als essentiell für den MMTS-Effekt identifiziert werden. Die Daten deuten darauf hin, dass die Modifikation dieser Cysteine für die Effekte zwingend erforderlich ist. Möglicherweise ist aber ein Xenopus-eigenes Regulatorprotein an der Entstehung der Effekte beteiligt, welches in die entsprechenden Proteinregionen des rOCT1 eingreift. Mit der Identifikation von Cystein 451 konnte ein weiterer Beweis für die wichtige Bedeutung der 10. Transmembrandomäne erbracht werden. Mit dem Cystein 322 wurde eine weitere wichtige Aminosäure für die Funktion und möglicherweise auch die Regulation von rOCT1 identifiziert
rOCT1 and rOCT2 are functionally well characterised members of the SLC22-transporter family. It includes carnitine and organic cation and anion transporters. OCTs are expressed in a variety of tissues and transport a number of drugs and endogenous substrates. Their transport mechanism and regulation are currently intensively being investigated. MMTS is an uncharged and membrane-permeable SH-reactive substance. Using electrophysiological methods the effect of MMTS on rOCT1 expressed in X. laevis-oocytes was investigated. These methods were modified to measure membrane capacitance and current-flux-ratios. MMTS-exposure induced an activation of substrate-induced currents and capacitance changes, a differing alteration of substrate and inhibitor affinities and an increase in the absolute oocyte membrane capacitance. The transport stoechiometry and voltage dependence were not influenced by MMTS exposure. Properties of rOCT2 were partially altered in the same and partially in the opposite way. The effects can most likely be explained by a conformational change of the polyvalent substrate binding region, an increased membrane insertion of OCT molecules and an increased substrate turnover number of the single transporter. Investigating mutants the cysteines 322 and 451 could be identified to be essential for the MMTS-effect. The data suggest that the modification of both cysteines is absolutely necessary to create the seen effects. However the participation of a Xenopus regulatory protein for the induction of the MMTS-effect interfering with the mentioned OCT regions must be taken into account. The identification of cysteine 451 proves once more the importance of the 10th TMD within the OCT family. Cyteins 322 might be another important amino acid for functional properties and the regulation of organic cation transporters

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Stein, Daniel Björn [Verfasser]. "Substratspezifität und Funktionalität von Epimerisierungsdomänen in der nichtribosomalen Peptidsynthese / vorgelegt von Daniel Björn Stein". 2006. http://d-nb.info/98180621X/34.

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Tesis sobre el tema "Substratspezifität"

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