Thèses sur le sujet « Cristallisation membranaire »

Les procédés membranaires sont considérés comme l’une des technologies de rupture les plus prometteuses pour les opérations de cristallisation/précipitation. Les matériaux les plus exploités à ce jour sont poreux mais leurs limitations en terme de bouchage de pores et de mouillage entravent le bon déploiement du procédé. L’utilisation de matériaux denses permettrait de s’affranchir de ce phénomène de colmatage des pores tout en conservant les bénéfices apportés par les procédés membranaires. Dans une première partie expérimentale, le composé modèle choisi, le BaCO3, est précipité dans un contacteur membranaire gaz-liquide et liquide-liquide, opéré dans les deux cas en conditions statiques. Cette configuration permet de s’affranchir de l’influence de l’hydrodynamique. Les interactions membranes-cristaux sont étudiées sur divers matériaux polymères denses. La perméabilité des espèces réactives et la tension de surface sont les deux paramètres ayant un impact majeur sur la localisation de la précipitation et la capacité à décrocher les cristaux déposés de la surface du matériau. Le PDMS et le Teflon AF 2400 ont été retenus comme étant les deux matériaux les plus prometteurs pour l’application visée car ils ne présentent pas de colmatage interne et de surface. Une deuxième partie expérimentale a été menée en conditions dynamiques sur le même composé modèle, en système gaz-liquide. Des modules membranaires de fibres creuses autosupportées (PDMS) et de fibres creuses composites (PP-Teflon AF 2400) ont été utilisés. Les études réalisées sur l’influence des paramètres opératoires ont présenté des résultats semblables à ceux des contacteurs membranaires utilisés pour le captage du CO2 : la résistance au transfert de matière est majoritairement localisée dans la phase liquide. Les performances stables obtenues sur le module PP-Teflon AF 2400 d’une compacité de 10 % ont permis de valider le concept. La géométrie du module, en particulier sa compacité, est un critère primordial pour limiter le colmatage du module. Enfin, une modélisation de mécanique des fluides en 2D, par la méthode des éléments finis, a été menée. Le modèle repose sur l’ajustement d’un seul paramètre cinétique. Les profils de concentration simulés ne sont pas satisfaisants. En revanche, le modèle permet de prédire correctement la productivité des cristaux
Membrane processes are considered as one of the most promising breakthrough technology for crystallization/precipitation operations. Porous materials have been extensively investigated but they have shown some serious limitations due to pore blocking and wetting phenomenon. The use of a dense membrane is expected to circumvent the pore blocking issue while keeping the advantages of membrane processes. In a first part, the model compound, BaCO3, is precipitated within a gas-liquid or liquid-liquid membrane contactor working under static conditions for both systems. In this configuration, hydrodynamic influences are avoided. The membrane-crystals interactions are studied using several dense membrane polymers. Permeability of both reactant species and surface tension are the key parameters to be considered. Indeed, these parameters greatly affect the deposit location of the crystals and their adherence on the membrane surface. Fouling within the membrane and on the surface are prevented with PDMS and Teflon AF 2400 which are thereby the two most promising materials for the given application. In a second part, the same model compound is precipitated in gas-liquid system under dynamic conditions. Self-supporting (PDMS) and composite hollow fibers (PP-Teflon AF 2400) are studied. Investigations on the operating condition influences show similar results to those obtained with membrane contactor used for CO2 capture: resistance to mass transfer is mainly located in the liquid phase. Proof of concept is supported by the stable performances obtained with the PP-Teflon AF 2400 module of 10 % packing ratio. The module geometry, and more specifically its packing ratio, is an important criterion to take into account to avoid module blocking. Finally, 2D computational fluid dynamics simulations, using the finite element method are performed. One single kinetic parameter is used to fit the experimental data. The simulated concentration profiles are not satisfactory. Nonetheless, predictability of the model seems to be promising: crystal productivities are rather well estimated

Le développement de systèmes d’assainissement spécifiques et décentralisés peut apporter des réponses à une double problématique : l’amélioration des conditions sanitaires dans les zones les plus pauvres du monde et le développement de sources renouvelables de nutriments essentiels pour l’agriculture. L’objectif de cette thèse est de développer des connaissances scientifiques sur une filière de traitement et valorisation de l’urine couplant une cristallisation à une séparation membranaire. Il a été démontré que la précipitation de phosphore sous forme de struvite permet de récupérer la quasi-totalité du phosphore et une partie de l’azote en 20 secondes environ suite à l’ajout de magnésium avec un ratio Mg :P=1,3 :1. L’influence des conditions d’agitation, de l’apport en magnésium, des conditions de stockage de l’urine et de la présence de matières organiques et de cristaux initiaux a été étudié en réacteur batch et continu.L’ultrafiltration de différents types d’urine (fraichement excrétée, stockée, stockée puis cristallisée) a été réalisée avec des membranes en PES, PAN et PVDF. Les mécanismes responsables de cette chute de flux ainsi que l’influence spécifique des fractions particulaires colloïdales et particulaires ont été étudiés. En se basant sur ces résultats différents procédés ont été proposés et discutés
The development of decentralized and specific sanitation system is an issue that concerns both the improvement of sanitary conditions in the poorest area of the world and the development of renewable sources of nutrients for agriculture. This study aims to provide some elements about a treatment line including crystallization and membrane separation for the treatment and valorization of urine. Crystallization allows to recover phosphorus and part of nitrogen contained in urine. Membrane separation is used in order to remove bacteria and viruses from urine. To check the potentialities of these processes some tests were performed at labscale with synthetic and real human urines.It was shown that the struvite crystallization by magnesium addition with a ratio Mg:P=1,3:1 allows recovering most of the phosphorus from urine with a very rapid kinetics (about 20s). Influence of mixing conditions, urine storage, organic matter and initial crystals in urine was studied in batch and continuous reactor. Ultrafiltrations of different pretreated urines (no pretreatment, stored urine, stored and crystallized urine) were performed with PES, PAN and PVDF membranes. Mechanisms responsible for an important flux decline during urine flitration were studied. Specific influence of particular, colloidal and soluble fraction on the flux decline was also evidenced. On these basis different possible treatment lines of urines are proposed and discussed

La cristallisation est une opération unitaire cruciale en ingénierie des procédés, largement utilisée dans des secteurs tels que la chimie, la pharmacie et l'électronique. Malgré son importance, les méthodes actuelles de cristallisation rencontrent diverses limitations, affectant la qualité du produit final, la constance de la production et le contrôle de la forme polymorphique. Récemment, les procédés membranaires sont apparus comme une approche prometteuse pour améliorer le contrôle de la cristallisation, en particulier la pervaporation, qui utilise une membrane dense ou composite sélective. Appliquée à la cristallisation, cette méthode permet de retirer le solvant d'un mélange solvant/antisolvant, créant ainsi la sursaturation nécessaire pour initier la cristallisation. L'objectif principal de cette thèse est de contrôler le polymorphisme du paracétamol par la cristallisation sélective et la stabilisation de la forme métastable II en utilisant la cristallisation membranaire par pervaporation. La forme II du paracétamol est privilégiée pour sa haute solubilité et compressibilité par rapport à la forme I, plus stable, mais son instabilité pendant la cristallisation, notamment sa transformation rapide vers la forme I, pose des défis importants. Pour cela, la première étude a consisté à produire la forme II en petites quantités grâce à des cycles de chauffage et de refroidissement utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), suivie de sa caractérisation à l’aide de diverses techniques analytiques. Un modèle prédictif de polymorphisme par spectroscopie infrarouge proche (FT-NIR) hors ligne, combiné à une technique chimiométrique telle que l'analyse discriminante par moindres carrés partiels (PLS-DA), a été développé et validé lors d'une cristallisation par refroidissement en batch avec ensemencement. La cristallisation sélective et la stabilisation de la forme II en cristallisation batch ensemencée ont été optimisées en contrôlant le niveau de sursaturation et la température de fonctionnement. Les résultats ont montré que maintenir une température basse (5-10°C) et des niveaux de sursaturation faibles (β = 1,25) prolongeait la stabilité de la forme II jusqu'à 30 min. Cependant, l'augmentation de la masse de semences n'a pas amélioré la stabilité, car le stress mécanique pendant la récupération des semences générait des impuretés de la forme I. L'application de la cristallisation membranaire par pervaporation pour le contrôle du polymorphisme du paracétamol a révélé que la forme I cristallisait lors des opérations non ensemencées à différents débits de perméation et rapports surface membranaire/volume d’alimentation (S/Vc), tandis que la stabilité de la forme II était d'environ 15 min en solution sursaturée, et que sa transition était ralentie à au moins 49 min pendant les opérations de cristallisation membranaire ensemencée avec un niveau de sursaturation βs=1,1, une température de fonctionnement de 5°C et une température de semis de 7,4°C. Cependant, comparée à la cristallisation batch ensemencée conventionnelle, la stabilité de la forme II n'a pas été améliorée, ce qui suggère une préférence pour la nucléation hétérogène de la forme I qui a accéléré la transition de la forme II. La stabilisation de la forme II s'est avérée dépendre principalement des températures de fonctionnement et de semence plutôt que du débit de perméation. D'autre part, la cristallisation membranaire par pervaporation a montré des rendements de cristallisation plus élevés que la cristallisation batch par refroidissement conventionnelle. L'augmentation du rapport S/Vc et du débit de perméation a conduit à une légère amélioration de la concentration en antisolvant d'environ 5 %, ce qui n'a pas affecté le polymorphisme du paracétamol mais a augmenté le rendement de cristallisation à 43 % sans détection de vieillissement notable de la membrane ni de colmatage irréversible après 13 utilisations de la membrane
Crystallization is a crucial unit operation in process engineering, widely utilized across industries such as chemical, pharmaceutical, and electronics. Despite its importance, current crystallization methods encounter various limitations, impacting the final product quality, production consistency, and the control over the polymorphic form. Recently, membrane processes have emerged as a promising approach to enhance crystallization control, particularly pervaporation, which employs a dense selective membrane. Applied to crystallization, this method allows for the removal of the solvent from a solvent/antisolvent mixture, creating the supersaturation needed for crystallization initiation. The primary goal of this PhD work is to control paracetamol polymorphism through the selective crystallization and stabilization of the metastable form II using membrane crystallization by pervaporation. Paracetamol form II is favored for its high solubility and compressibility compared to the most stable form I, but its instability during crystallization, particularly its rapid solvent-mediated phase transformation (SMPT) to form I, poses significant challenges. To do so, the initial investigation involved producing form II in small quantities through heating and cooling cycles using differential scanning calorimetry (DSC), followed by its characterization using numerous analytical techniques. An offline Fourier transform near infrared spectroscopy (FT-NIR) polymorphism prediction model supported by a chemometric technique like Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) was developed and validated during seeded batch cooling crystallization. The selective crystallization and stabilization of form II in seeded batch cooling crystallization was optimized by controlling the supersaturation level and the operational temperature. Results demonstrated that maintaining a low temperature (5-10°C) and low supersaturation levels (β = 1.25) extended form II stability for up to 30 min. However, increasing the seed mass did not improve stability, as mechanical stress during seed recuperation generated form I impurities. The application of membrane crystallization by pervaporation for paracetamol polymorphism control revealed that form I crystallized during unseeded operations at different permeation rates and membrane surface to feed volume S/Vc ratios whereas form II stability was around 15 min in supersaturated solution and the SMPT was slowed to at least 49 min during seeded membrane crystallization operations at a supersaturation level of βs=1.1, an operational temperature of 5°C and a seeding temperature of 7.4°C. However, when compared to conventional seeded batch cooling crystallization, form II stability was not improved suggesting a preference form I heterogeneous nucleation which accelerated form II SMPT. The stabilization of form II has been proven to be mainly dependent on the operational and seeding temperatures rather than the permeation rate. On the other hand, membrane crystallization by pervaporation exhibited higher crystallization yields than conventional batch cooling crystallization. The increase of the membrane surface to feed volume (S/Vc) ratio and the permeation rate led to a slight improvement in the antisolvent concentration of almost 5%, which did not affect paracetamol polymorphism but increased the crystallization yield to 43% with no noticeable membrane ageing and irreversible fouling detection for 13 membrane usages

Ce travail est consacré à l'étude de la réduction des nitrates dans différents types de réacteurs (agité, photocatalytique et membranaire). Le catalyseur efficace pour cette réduction est un catalyseur bimétallique comportant un métal noble comme le Pd qui est associé à un métal promoteur tel que le Cu. Ce type de catalyseur déposé sur TiO2 pulvérulent a été étudié en réacteur conventionnel agité et a montré une activité catalytique comparable à la bibliographie. Le même réacteur soumis à un rayonnement UV a permis d'obtenir des performances plus élevées. En présence d'acide formique, qui joue le rôle d'agent sacrificiel, une sélectivité nulle en nitrites a été obtenue. Pour l'étude en réacteur contacteur membranaire, plusieurs membranes ont été préparées. Différents supports ont été étudiés : alumine et oxyde de titane, ainsi que trois diamètres de pores : 5, 10 et 25 nm. Deux configurations ont été mises en oeuvre : le mode interfacial qui a montré une activité limitée, et le mode traversé. Les performances de ce dernier indiquent un comportement inattendu. Sur les membranes de faible diamètre de pores, un effet de polarisation de concentration a été mis en évidence. Ce phénomène se traduit par une accumulation des ions dans les mésopores catalytiques, qui entraîne une augmentation de l'activité quand le débit transmembranaire augmente, c'est-à-dire quand le temps de contact diminue

Ce manuscrit décrit la synthèse et l’étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l’étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d’un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d’un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d’amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l’étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH
This thesis deals with the synthesis and the physico-chemical study of new surfactants used as tools for holding membrane proteins in aqueous media. A first part presents the existing methods that allow the manipulation of the membrane proteins and describes the current issues encountered which lead to its denaturation. In a second chapter, the synthesis of a hemifluorinated lipid with a specific ligand is presented in order to form a film of Langmuir. The stability and fluidity of the monolayer lipid is monitored and used in experiments of cristallisation 2D following the interfacial concept on the recombinant membrane protein SUR1 « his tag » keep soluble in water with hydrocarbonated detergents. The third part defines the term associated to facial amphiphile and presents a synthesis by « click chemistry » of glucosidic surfactants with an aromatic core persubstitued. The alternated and selective substitution on 1,3,5 and 2,4,6 positions of the aromatic ring by respectively hydrophilic heads and hydrophobic tails induces a facial segregation. The last chapter concerns the study of facial amphiphiles behavior and its physico-chemical properties in aqueous solution by using several methods : tensiometry, dynamic diffusion light scattering, HPLC

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

Ce manuscrit décrit la synthèse et l'étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l'étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d'un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d'un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d'amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l'étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH,...

Ce manuscrit décrit la synthèse et l’étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l’étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d’un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d’un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d’amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l’étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH
This thesis deals with the synthesis and the physico-chemical study of new surfactants used as tools for holding membrane proteins in aqueous media. A first part presents the existing methods that allow the manipulation of the membrane proteins and describes the current issues encountered which lead to its denaturation. In a second chapter, the synthesis of a hemifluorinated lipid with a specific ligand is presented in order to form a film of Langmuir. The stability and fluidity of the monolayer lipid is monitored and used in experiments of cristallisation 2D following the interfacial concept on the recombinant membrane protein SUR1 « his tag » keep soluble in water with hydrocarbonated detergents. The third part defines the term associated to facial amphiphile and presents a synthesis by « click chemistry » of glucosidic surfactants with an aromatic core persubstitued. The alternated and selective substitution on 1,3,5 and 2,4,6 positions of the aromatic ring by respectively hydrophilic heads and hydrophobic tails induces a facial segregation. The last chapter concerns the study of facial amphiphiles behavior and its physico-chemical properties in aqueous solution by using several methods : tensiometry, dynamic diffusion light scattering, HPLC

Les virus enveloppés entrent dans les cellules par fusion membranaire, mécanisme qui permet la libération de leur génome dans le cytosol de leur hôte. Le virus de la fièvre jaune est le virus de référence des Flavivirus, famille de virus enveloppés à ARN simple brin de polarité positive. Malgré un vaccin efficace fondé sur une souche atténuée (17D), ce virus cause encore à l'heure actuelle 200 000 contaminations et 30 000 morts chaque année dans les régions subtropicales d'Afrique et d'Amérique du Sud. La protéine d'enveloppe E est impliquée dans deux phénomènes précoces du cycle viral, la liaison au récepteur et la fusion membranaire. C'est pourquoi cette protéine est une cible majeure pour le développement de nouveaux antiviraux et que nous avons cherché à déterminer sa structure cristallographique. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires de l'atténuation du vaccin, nous avons travaillé avec la souche vaccinale 17D-204 et la souche sauvage parentale Asibi. En effet, ces deux souches ne diffèrent que par 12 mutations dans la protéine d'enveloppe, et nous désirions comparer les structures de ces deux protéines. Alors que nous attendions à ne produire que la protéine d'enveloppe, nous avons pu purifier et cristalliser le complexe immature constitué de pr (ectodomaine soluble résultant du clivage de prM en pr +M par la furine) et de l'ectodomaine de E, des souches 17D-204 et Asibi. Après dissociation du complexe, nous avons donc pu caractériser les constantes d'affinités, les déterminants thermodynamiques et fonctionnels de ce complexe. Dans leur ensemble, ces données ouvriront de I nouvelles perspectives dans le développement d'inhibiteur de la fusion membranaire des Flavivirus
Enveloped viruses enter cells by membrane fusion, a mechanism that allows the release in the cytoplasm of the infected cell of their genome. Yellow fever virus is the reference virus for Flavivirus, family of enveloped positive single strand RNA viruses. In spite of an efficient vaccine based on an attenuated strain (17D), this virus still causes 200,000 infections per year with 30,000 deaths, mainly in African and South American subtropical areas. Envelope protein E plays a role in two early phenomena of virus cycle, acting during virus entry for receptor recognition and binding, and during membrane fusion. This is the reason why this protein is the main target for the development of new antivirals. We were so interested in determining the crystal structure of this major pathogen antigen. Wild-type Asibi strain and vaccinal 17D-204 strain only differ one of the other by 32 mutations in the whole polyprotein, 12 of them within E protein. To better I understand molecular mechanisms of the vaccine attenuation, we crystallized both proteins from the wild-type and vaccinal strains. With our expression System, we were expecting to produce only the envelope E protein, as it was experienced for other Flaviviruses. But surprisingly, we co-purified and co-crystallized the immature complex of the virus, consisting in pr result of the cleavage of prM as pr + M by the furin) and E, for both Asibi and 17D-204 strains. After dissociation of the complex, we successfully determined affinity I constants, thermodynamical and functionnal characteristics of the complex. Overall, these results can lead to the development of new fusion inhibitors against Flavivirus

Dans cette thèse est présentée une nouvelle stratégie de purification de SERCA1a après son expression hétérologue chez S. cerevisiae.. La protéine est fusionnée à un domaine accepteur de biotine, biotinylé in vivo par la levure. La procédure de purification, basée sur la forte interaction entre avidine et biotine, permet d'obtenir une protéine active pure à 40-50%. Une étape supplémentaire de filtration sur gel en HPLC a permis d'augmenter la pureté d'environ 70%, tout en conservant une très bonne activité spécifique. Les cristaux obtenus de SERCA1a ainsi purifiée diffractent les rayons X à 3,1Å.
Cette nouvelle méthode de purification a été appliquée avec succès au mutant SERCA1a-E309Q. De petits cristaux de ce mutant ont pu être isolés. Cette méthode a également permis de purifier SERCA3a, bien que le faible taux d'expression de la protéine de fusion chez S. cerevisiae limite la quantité purifiée. En parallèle, des essais d'immunolocalisation cellulaire de SERCA3a dans différentes lignées cellulaires et dans des coupes de peau ont été réalisés

Une nouvelle méthode pour la cristallisation des protéines membranaires (MP) de bicouches amphiphiles interconnectés (IAB) a été récemment mise au point. Dans cette approche protéines cristallisées directement des membranes et il est supposé que la cristallisation est conduite principalement par les propriétés de la mésophase lipidique dans son ensemble, mais pas par des caractéristiques individuelles des détergents. Le détergent joue un rôle de modulateur de ces propriétés. L'application de ce procédé de cristallisation de la vaste gamme des protéines membranaires est très prometteuse car il facilite considérablement la cristallisation. Cependant, il faut effectuer un certain nombre d'expériences pour chaque nouvelle protéine membranaire afin de déterminer les paramètres optimaux de la mésophase lipidique pour la protéine. Pour ce faire avec des quantités limitées de protéines membranaires, en particulier des protéines humaines, qui sont généralement très difficiles à produire en quantité suffisante, l'application des systèmes robotisés de cristallisation à haut débit pour la nano volume cristallisation pourrait être la seule solution. L'objectif principal de ce travail est le transfert de l'approche actuelle pour la cristallisation des protéines membranaires de l'IAB sur les volumes nano. Pour ce faire une grande variété d'expériences cristallisations a été effectuée pour différentes protéines membranaires. Les faits, qui influent des résultats de cristallisation, ainsi que des informations structurelles obtenues ont été analysées avec soin. Il a été démontré que les gros cristaux de protéines membranaires différents adaptés pour cristallographie aux rayons X peuvent être reproductible obtenu par nano volume cristallisation. Le premier chapitre «Introduction» comprend une description générale des protéines membranaires, des approches différentes pour la cristallisation des protéines membranaires, leurs avantages et leurs limites. La vue d'ensemble des protéines membranaires, qui sont étudiés dans ce travail, les informations disponibles et les problèmes non résolus sont présentés. Le deuxième chapitre présente les matériaux et les méthodes utilisées dans l'étude. Le troisième chapitre «Résultats et discussions» est décrit les résultats obtenus et leur interprétation. Pour commencer, la nano volume cristallisation de l'IAB de la bactériorhodopsine et la comparaison avec l'approche présent de cristallisation est présenté. Nano volume cristallisations en présence d'amphiphiles fluorés et les poloxamères ont été effectuées pour la première fois et décrit en détails. L'application de l'approche du nano volume cristallisation du complexe de la rhodopsine sensorielle II de Natronomonas pharaonis avec son transducteur apparenté et les protéines du complexe avec une mutation importante dans le transducteur, ce qui élimine l'action des protéines, est présenté. Résultats de nano volume cristallisation pour un autre complexe de deux protéines membranaires - triple mutant de la bactériorhodopsine, qui fonctionne comme un transducteur de signal, avec transducteur de Natronomonas pharaonis sont décrits. Halorhopsin de Natronomonas pharaonis a également été cristallisé par la nouvelle approche et de cristallisation résultats sont présentés. La première structure de protéine membranaire - enzyme cytidine-5'-triphosphate: inositol-1-phosphate cytidylyltransférase / di-myo-inositol-1 ,3-phosphate-1-phosphate synthéase de hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus a été résolu en utilisant des cristaux obtenus par nano volume cristallisation. Détails de la structure, l'importance et le mécanisme proposé de l'action enzymatique sont discutées. Les conclusions finales ainsi que les perspectives de la méthodique développées sont donnés dans le dernier chapitre de la thèse
A new method for crystallization of membrane proteins (MPs) from interconnected amphiphilic bilayers (IAB) was recently developed. In this approach proteins crystallized directly from the membranes and it is postulated that crystallization is driving mostly by the properties of the lipidic mesophase as a whole but not by individual features of the detergents. The detergent plays a role of the modulator of these properties. Application of this crystallization method to the wide range of MPs is very promising since it dramatically facilitates crystallization. However, one needs to perform a number of screening experiments for each new MP to determine the optimal parameters of the lipidic mesophase for certain protein. To do so with limited amounts of MPs, especially human proteins, which are usually very difficult to produce in sufficient amount, the application of the high throughput robotic systems for nano volume crystallization could be the only solution. The major goal of this work is the transfer of the present approach for large scale crystallization of MPs from IAB to the nano volumes. To do so a large variety of crystallizations experiments were carried out for different MPs. The facts, which influence the crystallization results, as well as structural information obtained were carefully analyzed. It was demonstrated that large crystals of different MPs suitable for X-ray crystallography can be reproducibly obtained using this nano volume crystallization method. The first chapter “Introduction” includes a general description of MPs, different approaches for crystallization of MPs, their advantages and limitations. The overview of membrane proteins, which are studied in this work, the information available and unsolved problems are presented. The second chapter presents the materials and methods used in the study. The third chapter “Results and Discussions” describes the results obtained and their interpretation. To begin with, nano volume crystallization from IAB of bacteriorhodopsin and the comparison with large scale crystallization approach is presented. Detailed nano volume crystallizations in the presence of fluorinated surfactants and poloxamers were performed for the first time and described in details. The application of nano volume approach for the crystallization of the complex of sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis with its cognate transducer and the proteins complex with important mutation in the transducer, which eliminates the action of the proteins, is presented. Nano volume crystallization results for another complex of two MPs – triple mutant of BR, which operates like a signal transductor, together with transducer from Natronomonas pharaonis are described. A light-driven chloride pump halorhopsin from Natronomonas pharaonis was also crystallized by new approach and crystallization results are presented. The structure of new MP – bifunctional enzyme cytidine-5′-triphosphate:inositol-1-phosphate cytidylyltransferase/ di-myo-inositol-1,3-phosphate-1-phosphate synthase from hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus was solved using the crystals obtained by nano volume crystallization from IAB. Structure details, significance and proposed mechanism of the enzymatic action are discussed. The final conclusions as well as the perspectives of the developed methods are given in the last chapter of the thesis

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales. Sa multi résistance aux antibiotiques s'exerce notamment grâce à l'activation de pompes d'efflux membranaires. Il s'agit de systèmes tripartites composés d'une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor) ancrée dans la membrane externe, d'un transporteur de la famille des RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et d'un adaptateur périplasmique de la famille des MFP (Membrane Fusion Protein) qui consolide l'ensemble. Le travail réalisé au cours de cette thèse apporte une contribution à la compréhension des mécanismes d'assemblage et d'ouverture des pompes d'efflux ainsi qu'à leur régulation grâce au développement de nouveaux outils empruntés à la physique, à la biochimie et à la microbiologie. Une première étude a permis de déterminer la stoechiométrie d'interaction entre MexA et OprM par gel bleu natif (Ferrandez, Monlezun et al. 2012). Une deuxième étude a été consacrée, dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de B. Le Pioufle (ENS Cachan), à la caractérisation par électrophysiologie de l'ouverture de la porine OprM, insérée dans une membrane artificielle reconstituée sur une biopuce (Wang, Monlezun et al. 2012). Puis, afin d'étudier cette fois ci, le mécanisme d'ouverture de la porine OprM in vivo, une étude fonctionnelle par complémentation chez Pseudomonas aeruginosa a été initiée. Enfin, dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de P. Plésiat (Laboratoire de Bactériologie, Besançon), deux analyses de mutants cliniques par modélisation ont été réalisées sur le régulateur MexZ de la pompe MexXY/OprM et de la porine d'influx des carbapénèmes OprD.

Le nombre de proteines membranaires dont la structure est connue est tres faible en regard du nombre de structures resolues, ceci en raison des difficultes a obtenir des cristaux de qualite suffisante pour les etudes par diffraction des rayons x. La finalite de ce travail est de comprendre l'implication du detergent, utilise pour solubiliser puis cristalliser les proteines membranaires, dans le processus de cristallisation et dans la qualite des cristaux obtenus. En particulier, on s'est interesse a l'organisation prise par le detergent dans les cristaux, et aux differentes interactions auxquelles il participe. Les structures du detergent dans les cristaux ont ete resolues par cristallographie des neutrons a basse resolution. Les micelles de detergent, pures ou complexees avec les proteines, ont elles aussi ete etudiees, en solution, par diffusion neutronique aux petits angles. Ces deux techniques sont utilisees en combinaison avec la methode de variation de contraste. Les structures formees par le detergent dans deux cristaux de porine (de rhodobacter capsulatus et de escherichia coli) de groupes d'espace differents ont ete modelisees, ainsi que les micelles de detergent presentes dans la solution de cristallisation de l'une de ces porines. On a essaye d'en tirer une analyse generale du role du detergent, dans l'optique d'optimiser la formation de cristaux de proteines membranaires de bonne qualite. En outre les interactions entre la membrane et la proteine, mises en lumiere par la localisation du detergent au niveau de la zone transmembranaire de la proteine, ont ete abordees.

Ce manuscrit presente la synthese et la conception de nouveaux outils concus pour la cristallisation bidimensionnelle de proteines sur film lipidique specifique. Nous avons developpe, pour le cas particulier de proteines solubles a ligand hydrophobe (en l'occurence les recepteurs de l'acide retinoique) deux concepts originaux afin d'eviter l'insertion dans la monocouche d'un tel ligand greffe au support lipidique. Ces deux approches font intervenir respectivement des amphiphiles dits thermoambivalents (avec une temperature de transition de phase comprise entre 4 et 20\c) capables, a faible temperature, d'expulser mecaniquement le ligand de la monocouche et des lipides partiellement perfluores possedant un caractere suffisamment lipophobe pour contraindre le ligand a s'exprimer en phase aqueuse et rester accessible a la proteine. Les deux concepts ont ete valides et nous avons mis en evidence le premier exemple d'immobilisation a l'interface air/eau d'une proteine soluble a ligand hydrophobe. Cependant, jusqu'ici, nos tentatives de cristallisation bidimensionnelle d'un heterodimere rar/rxr ont abouti uniquement a la formation d'arrangements compacts de proteines. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons tente de tirer profit des proprietes de segregation de phases entre fluorocarbures et hydrocarbures, pour developper d'autres supports lipidiques fluores impermeables aux detergents, et ainsi, utilisables dans des protocoles de cristallisation bidimensionnelle de proteines membranaires sur film specifique. La bonne stabilite des amphiphiles prepares en presence de divers tensioactifs a pu etre determinee par ellipsometrie. Par ailleurs, cette technique a permis de montrer sans ambiguite l'adsorption rapide d'une proteine membranaire vegetale (une monooxygenase a cytochrome p450) sur un tel film d'amphiphiles partiellement fluores et nous avons recemment entrepris une serie d'experiences de cristallisation bidimensionnelle de deux enzymes a cytochrome p450 sur les supports lipidiques fluores synthetises.

En raison de leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, les transporteurs ABC de phénotype MDR ont attiré l'attention de la communauté scientifique. Notre projet vise à trouver des conditions dans lesquelles les transporteurs ABC restent fonctionnels en solution pour aboutir à la cristallisation de ces protéines dans une conformation active. Dans ce but, nous avons conçu et développé une nouvelle classe de détergents, à base de calix[4]arène, qui stabilisent ces protéines. Afin de résoudre la structure 3D à résolution atomique du transporteur ABC bactérien "BmrA", responsable de la résistance aux antibiotiques, nous avons utilisé une approche classique utilisant des détergents commerciaux en parallèle à nos détergents innovants. En présence de la Foscholine 12, nous avons obtenu des cristaux diffractant jusqu’à 5 Å de résolution. Cependant, les données de diffraction n’étaient pas suffisantes pour déterminer la structure tridimensionnelle complète de la protéine, seuls les domaines transmembranaires ont été résolus. D'autre part, nous avons atteint l'objectif de l'extraction, la purification et la stabilisation de ce transporteur à l'aide des détergents à base de calix [4] arène. Nous avons également montré que ces détergents promeuvent et améliorent la cinétique de cristallisation de BmrA, une étape que nous sommes en train d’optimiser, pour obtenir des cristaux de meilleure résolution, pour résoudre la structure 3D de BmrA qui sera utilisé pour concevoir des inhibiteurs adaptés
Due to their preponderance in the resistance to chemotherapies, the MDR ABC transporters have drawn the attention of the scientific community. Our project aimed at finding conditions in which ABC transporters are active in solution to lead the crystallization of these proteins in an active conformation. In this purpose, we conceived and developed a new class of detergents, based on calix[4]arene ring, that stabilize these proteins. In order to solve the 3D-structure to atomic resolution of bacterial ABC transporter “BmrA” responsible for antibiotic resistance, we used a classical approach with commercial detergents in addition to the innovative ones. We have crystallized the protein in presence of Foscholine 12 with a diffraction resolution up to 5 Å. The data was incomplete; solving partially the structure of the transmembrane domains. On the other hand, we have reached the objective of extraction, purification and stabilization of this transporter by using calix[4]arene-based detergents. We have also shown that these detergents promote and enhance the kinetics of crystallization of BmrA, a step that we are improving, to get crystals of better resolution, for resolving the BmrA 3D-structure which will be used to design adapted inhibitors

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

Ce projet vise à étudier, par une approche pluridisciplinaire, l'influence des la cristallisation des protéines membranaires (PM) en prenant pour protéine modèle le complexe photosynthétique RC-LH1-pufX de Rhodobacter blasticus. Des cristaux de ce complexe avaient été obtenus en présence de dodécyl-!-maltoside (DDM) et avaient diffractés à 8 Å de résolution. L'objectif final est de pouvoir améliorer, de façon rationnelle, la qualité des cristaux du complexe RC-LH1-pufX grâce à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu. Dans un premier temps, trois tensioactifs dérivés du DDM ont été conçus et synthétisés. L'intérêt est d'augmenter la rigidité et le caractère lipophobe des parties hydrophobes des tensioactifs par rapport au DDM, pour les rendre moins déstabilisants envers la protéine: soit par l'incorporation d'un groupement bicyclohexyle (PCC-maltoside), soit par l'ajout d'un segment fluoré de longueur modulable (F4H5- et F2H9-maltoside). Nous avons inclus également le F8TAC, tensioactif fluoré utilisé depuis une vingtaine d'années pour le maintien en solution des PM, et les "tripodes", amphiphiles faciaux dont la géométrie particulière n'avaient jamais été testée. Nous avons ensuite réalisé la caractérisation physico-chimique, en solution, de ces tensioactifs et du DDM en terme de CMC (concentration micellaire critique), nombre d'agrégation, taille (par diffusion de la lumière dynamique, DLS), facteur de forme (par diffusion des rayons X aux petits angles, SAXS) et facteur de structure (par mesure du second coefficient du viriel, indicateur du potentiel des tensioactifs à initier la cristallisation)afin de déterminer les caractéristiques importantes au maintien en solution et à la cristallisation des PM. Le PCC-malt présentant le même comportement que le DDM,nous l'avons sélectionné pour réaliser une étude en présence de la protéine.Après avoir mis au point une méthode de dosage des tensioactifs par HPTLC (HighPerformance Thin Layer Chromatography) et identifier les lipides présents dans les de Rhodobacter blasticus, nous avons pu quantifier les quantités de lipides et de tensioactifs associés à la protéine en présence de DDM et de PCC-malt.Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des essais de cristallisation du complexe RC-LH1-pufX en présence des tensioactifs sélectionnés pour faire le lien entre les conditions de cristallisation et l'étude physico-chimique des micelles en solution.

Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergent
Our project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent

Le projet de thèse se focalise sur la synthèse de biomolécules et se subdivise en deux parties. La première partie concerne la conception et la synthèse de dérivés de produits naturels d'intérêt thérapeutique nommés aurones en vue de mettre au point de nouvelles molécules à activité antivirale. Récemment, les aurones ont été identifiées comme étant des inhibiteurs de l'ARN-polymérase ARN-dépendante (NS5B) du virus de l'hépatite C (VHC). Cette enzyme, présente chez le virus mais absente chez l'homme, joue un rôle central dans la réplication virale. Suite à ces résultats antérieurs, les efforts ont été poursuivis et, dans le cadre de cette thèse, nous avons entrepris,d'une part, la synthèse d'analogues originaux dont le cycle B des aurones a été remplacé par des hétérocycles et, d'autre part, la synthèse depseudodimères d'aurones dans le but d'affiner les exigences structurales pour améliorer l'effet inhibiteur.L'activité a été évaluée selon des tests enzymatiques et cellulaires et a permis d'identifier quelques candidats doués d'une bonne activité inhibitrice et d'une faible toxicité. La deuxième partie du projet de thèse, sans lien avec la première partie,concerne des aspects plus fondamentaux et porte sur la synthèse de nouveaux surfactants agissant comme agents stabilisants lors des procédures d'extraction et de cristallisation des protéines membranaires. Les surfactants sont des composants clés dans le domaine de la biologie structurale et de la biochimie des protéines membranaire. Ils sont nécessaires pour maintenir les protéines membranaires dans leur état fonctionnel après extraction. La grande majorité des protéines membranaires est riche en résidus basiques à l'interface. Sur la base de cette caractéristique, une nouvelle famille de surfactants est développée et testée sur des protéines membranaires appartenant aux pompes d'efflux ABC multi-résistantes
The PhD project focuses on biomolecules and is divided into two parts. The first part concerns the design and synthesis of natural product derivatives with therapeutic interest in order to develop new molecules with antiviral activity. Recently, aurones were identified as new inhibitors of hepatitis C virus (HCV) NS5B polymerase. Following these results, efforts were continuedand we undertook, on the one hand,the synthesis of original analogues in which the aurone B-ring was replaced by a heterocyclic rings and, on the other hand, the synthesis of aurone pseudodimers in order to refine the structural requirements to improve the inhibitory effect. The potent NS5B inhibitory activity combined with their low toxicity make aurones attractive drug candidates against HCV infection. The second part of the PhD thesis is unrelated to the first part and concerns more fundamental aspects. It focused on the synthesis of new surfactants acting as stabilizing agents during extraction of membrane proteins (PM). Surfactants are required for maintaining PM in their functional state after extraction from membrane lipid matrix. The vast majority of PM shares a net enrichment in basic residues at the interface between membrane and cytoplasm, a property known as the positive inside rule. Based on this feature, a new family of surfactants is developed and tested on membrane proteins belonging to the multidrug ABC efflux pumps family

Les amphipoles (APols) sont devenus des outils importants pour la stabilisation, le repliement, et les études structurales et fonctionnelles in vitro des protéines membranaires (MPs). Les MPs sont les unités fonctionnelles des biomembranes et représentent environ un tiers des protéines qui sont codées par le génome. La première partie de mon travail est dédiée à la cristallisation de MPs piégée par des APol. La cristallisation directe de protéines solubilisées en APol sera d'une grande importance pour la biologie structurale. Cependant, malgré des efforts considérables, il n'est pas certain que les complexes MP/APol peuvent être utilisés pour former des cristaux bien ordonnés utilisables en cristallographie des rayons X. Le premier objectif de cette thèse est de montrer que les MPs piégées par des APol peuvent être cristallisées in meso. Pour faire cela, nous avons utilisé des bicouches amphiliques interconnectées qui sont ajustables pour certaines MPs. Cette méthode a été récemment développée dans notre laboratoire. Nous avons utilisé la bactériorhodopsin (BR) piégée avec APol A8-35 comme système modèle pour nos études cristallographiques. Le premier cristal obtenu diffractait à 3 Å, alors qu'une nouvelle méthode de cristallisation en nanovolume, exploitant des précipitants secs, améliore les pics de diffraction aux rayons X observés jusqu'a 2 Å. La structure de BR a été résolue à 2 Å et s'est révélée identique aux autre structures obtenues précédemment à partir de protéine solubilisée en détergents. Nous suggérons que le protocole proposé, de cristallisation in meso, est applicable aux MPs solubilisées avec des APols.La deuxième partie est liée aux applications des APols pour les études de MPs à l'aide de spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). La spectroscopie SERS a énormément évolué depuis sa découverte en 1970. C'est un outil analytique puissant pour sélectionner les molécules qui adsorbent sur des nanoparticules et des nanostructures à base de métaux nobles, possiblement au niveau de la molécule unique. Malheureusement les études de MPs sont loin de l'application courante du SERS à cause de la difficulté résultante de la nature amphiphilique des MPs. La capacité des APols à piéger les MPs et de les garder solubles, stables et fonctionnelles ouvre la voie pour des applications extrêmement intéressantes des études SERS, éventuellement au niveau de la molécule unique. De plus, le deuxième objectif de ce travail de thèse était de démontrer la faisabilité de l'utilisation de SERS avec des MPs piégées par des APols. Le même modèle (BR/A8-35) a été utilisé pour les études cristallographiques et pour les agrégats de NP d'argent. Cette tâche a été réalisée a un niveau suffisant pour commencer des études de MPs avec la méthode SERS.Le premier chapitre de cette thèse commence avec des informations générales à propos de l'importance des études de MPs et les problèmes inhérents à leur manipulation. Plus loin dans le chapitre, un bref résumé des APols, de leurs propriétés et leurs applications est présenté. La majeure partie de l'introduction est dédiée aux points importants des différentes approches de cristallisation de MPs et de spectroscopie Raman, en particulier SERS spectroscopie, et leurs applications aux protéines. La fin de la partie “Introduction” présente les conclusions à propos des applications des APols pour les études de cristallographie aux rayons X et pour les études de spectroscopie SERS sur les MPs, définissant les objectifs principaux pour ce travail. Le chapitre “Materials and methods” consiste en une description détaillée des matériels et des protocoles utilisés dans cette étude. Le résultat des études de cristallisation et de SERS et leurs interprétations sont présentés comme deux différentes parties dans le dernier chapitre “Results and discussions”. Le chapitre “Conclusions and perspectives est présent dans chaque partie
Amphipols (APols) have become important tools for the stabilization, folding, and in vitro structural and functional studies of membrane proteins (MPs). MPs are the main functional units of biomembranes and represent roughly one-third of the proteins encoded in the genome. The first part of my work was dedicated to crystallization of a MP trapped by APol. Direct crystallization of MPs solubilized in APols would be of high importance for structural biology. However, despite considerable efforts, it is still not clear whether MP/APol complexes can be used to form well-ordered crystals suitable for X-ray crystallography. The first major goal of this PhD thesis work was to show that APol-trapped MP can be crystallized in meso. To perform it we utilized special, flexibly adjustable for a certain MP, interconnected amphiphilic bilayers (IAB) approach which has been recently developed in our laboratory. We used bacteriorhodopsin (BR) trapped with APol A8-35 as a model system for our crystallization studies. The first obtained crystals diffracted to 3 Å, while a new developed type of high throughput nanovolume crystallization, exploiting dry precipitants, shifted the observed X ray diffraction peaks beyond 2 Å. The structure of BR was solved to 2 Å and found to be indistinguishable from previous structures obtained with a detergent-solubilized protein. We suggest that the proposed protocol of in meso crystallization is generally applicable to APol-trapped MPs.The second, to a certain extent, complementary part of the present work was related to application of APols to the surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of MPs. SERS spectroscopy has been developed dramatically since its discovery in the 1970s. It is a powerful analytical tool for selective sensing of molecules adsorbed onto noble metal nanoparticles (NPs) and nanostructures, including at the single molecule (SM) level. Unfortunately, MPs studies are far away from the main stream of SERS applications due to the great handling difficulties resulting from the amphiphilic nature of MPs. The ability of APols to trap MPs and keep them soluble, stable and functional opens the way for highly interesting applications of SERS studies, possibly at the SM level. Thus, the second goal of this PhD thesis work was to prove our concept of feasibility of SERS with MPs trapped by APols. Using the same as in the crystallization studies model BR/A8-35 complexes and silver NP aggregates, the task was fulfilled to a degree enough to start with the SERS studies of MPs.The first chapter of the PhD thesis begins with general information about the importance of MP studies and the problems with their handling. Further in this chapter, a brief overview of APols, their properties and applications is presented. The largest part of the “Introduction” is dedicated to main points of different MP crystallization approaches and Raman spectroscopy, in particular SERS spectroscopy, and their applications to proteins. The end of the “Introduction” part presents the conclusions about APol application for X-ray crystallography and SERS spectroscopy studies of MPs, setting the main goals for the present work. The “Materials and methods” chapter consists of detailed description of the materials and protocols used in this study. The results of crystallization and SERS studies and their interpretations are presented as two different parts in the last “Results and discussions” chapter. The “Conclusions and perspectives” sections accompany each of these parts