Thèses sur le sujet « Daño al ADN »

La radiación ionizante se puede definir como energía que se propaga en forma de partículas o por ondas electromagnéticas que se emite por átomos inestables. La radiación ionizante tiene aplicaciones, una de ellas es en Radioterapia, modalidad terapéutica que produce daño tejidos tumorales utilizando altas dosis de radiación. Los efectos biológicos de la radiación dependen de la interacción con células, principalmente con el ADN, las cuales producen roturas de doble hebra de ADN (DSB), roturas de una sola hebra (SSB) y daño agrupado no DSB (lesiones de base). El I-131 es un emisor de rayos β y γ, con una vida media de 8.05 días. Su energía de rayos β final es 0.606 MeV (89.7%), que tiene un rango máximo de ~ 3 mm en tejido, lo que garantiza un tratamiento local. El objetivo del presente trabajo fue determinar el daño al ADN producido por las emisiones del 131I en células de glioblastoma humano (U87MG) en condiciones de normoxia e hipoxia. En los resultados el ensayo cometa reafirma que las células U87MG son resistentes al I-131 y Lu-177 en condiciones de hipoxia. Estos resultados concuerdan con estudios previamente reportados. Además, dichos estudios sugieren que las células de glioblastoma tienen mecanismos de reparación del ADN más eficientes en hipoxia, que les permiten una mayor tasa de supervivencia celular. Dado que SSBc y DSBc, demuestran resultados más realistas y detallados de los daños en los sitios afectados del ADN, son más comparables a los resultados experimentales del ensayo Open Comet. El ensayo cometa mostró que las emisiones beta y gamma del I-131 producen DSB en el ADN en células U87MG en condiciones de normoxia e hipoxia. En ambos casos, el experimento y la simulación Monte Carlo concuerdan y muestran la radiotoxicidad del 131I en células de glioblastoma humano mostrando el potencial terapéutico In Vitro que tiene el 131I para tratamiento del glioblastoma humano.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana tiene como agente biológico el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en tres formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, presente en los vectores triatominos; tripomastigote, forma no replicativa e infectiva, que se encuentra tanto en el vector como en hospederos mamíferos y finalmente, la forma amastigote, intracelular replicativa, presente en hospederos mamíferos. Trypanosoma cruzi es capaz de sobrevivir frente al daño oxidativo del DNA producido por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) del hospedero mamífero. Este daño podría ser reparado mediante la actividad de la endonucleasa APE1 de la vía de escisión de bases (BER). Sin embargo, sólo hemos identificado APE1 de T.cruzi (TcAP1) en la forma epimastigota del parásito, pero no se ha detectado en las formas tripomastigotes o amastigotes. NL1 de T. cruzi (NL1Tc) es una endonucleasa retrotransposónica de la familia AP que podría realizar la misma función que cumple TcAP1 en epimastigotes, pero en tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi. Se clonó el gen que codifica para NL1Tc y se confirmó su pertinencia por secuenciación. Por otra parte, se generó la proteína recombinante NL1Tc y por modelamiento en 3D por homología se confirmó corresponde a una endonucleasa. La proteína recombinante purificada se empleó para producir un anticuerpo policlonal específico, el cual se utilizó posteriormente para la identificación de NL1Tc en homogeneizados de las distintas formas celulares del parásito y evidenciar su grado de expresión en epimastigotes de la cepa Dm28c tratados con H2O2 200 μM. Se concluye que la proteína NL1Tc se expresa en las tres formas celulares de T. cruzi, y en las condiciones experimentales empleadas, no se observa sobreexpresión de NL1Tc frente a estrés oxidativo, sin embargo no se descarta su participación en la reparación del DNA
Financiamiento: Proyecto Bicentenario Anillo ACT-29, Proyecto Bicentenario Anillo ACT-112, Proyecto RED-07, Proyecto Fondecyt 1090124

Asocia los factores de riesgo ocupacional con el daño en el ADN espermático medido con el ensayo Cometa en base a un modelo descriptivo. Un total de 137 pacientes participaron en el estudio, entre marzo del 2016 y marzo del 2017, a los cuales se les realizó una encuesta. Se realizó el espermatograma y la electroforesis en gel de agarosa de células individuales o ensayo Cometa, encontrando que los pacientes con ocupaciones de alto riesgo (agricultores; cocineros; taxistas; soldadores; electricistas; electrónicos y operarios químicos) tienen mayor daño a nivel de ADN espermático que los pacientes de bajo riesgo (personal de oficina; comerciantes; inspectores; estibadores y docentes), el porcentaje de intensidad fue 44.72±16.07 y 15.55 ± 16.51 respectivamente (p=0.0001). En el caso de los pacientes con ocupaciones de bajo riesgo el porcentaje de intensidad fue 12.04±15.33 para normozoospérmicos y 20.48±17.12 para varones con algún parámetro seminal alterado, encontrándose diferencia significativa (p=0.0175). Además, los pacientes expuestos a más factores de riesgo ocupacional presentan un espdaño mayor a nivel de ADN espermático a diferencia de los no expuestos (momento de la cola: p=0.0167; porcentaje de intensidad: p=0.0334; longitud de la cola: p=0.0167). Se evidenció que, la edad y a más años trabajando en actividades de alto riesgo (p < 0.05), mayor era el daño a nivel de ADN espermático. En la presente investigación no se observaron diferencias significativas a nivel de parámetros seminales y ocupación (p ≥ 0.05). Se concluye que, la suma de los factores de riesgo ocupacional está asociada al daño en el ADN espermático y las ocupaciones de alto riesgo presentan mayor daño, por ello es importante que los varones en edad fértil tengan acceso a la información sobre los riesgos laborales potenciales y a la prevención para evitar la exposición y preservar su salud reproductiva.
Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
Trypanosoma cruzi, un protozoo hemoflagelado, es el agente causal de la enfermedad de Chagas, patología endémica de Latinoamérica que se ha extendido al resto del mundo. Este parásito presenta un ciclo de vida indirecto y se transmite principalmente mediante insectos hematófagos triatominos a distintos hospederos mamíferos, incluyendo el ser humano. Dentro de los mecanismos no vectoriales de transmisión de la enfermedad, los más importantes son la transfusión sanguínea y la infección transplacentaria. La enfermedad cursa en tres fases progresivas: aguda, indeterminada y crónica, pudiendo causar discapacidad e incluso la muerte. Las drogas utilizadas como tratamiento de esta patología son poco eficaces en el tratamiento de la fase crónica, además de generar numerosos efectos colaterales indeseados, siendo necesario desarrollar nuevas drogas más eficientes en la eliminación del parásito y más inocuas para el paciente. Para que se establezca una infección crónica, T. cruzi debe resistir el daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde en el caso de mamíferos la fosforilación de la histona H2AX en el residuo Ser139 sería fundamental. En tripanosomátidos no se han identificado genes ortólogos para H2AX, pero en T. brucei se detectó que la histona H2A canónica es fosforilada en el residuo Thr130 como consecuencia de daño al DNA, residuo que se conserva en otros tripanosomátidos y que en el caso de T. cruzi corresponde a Thr131. La participación de este último en la respuesta al daño del DNA aún no se ha comprobado. Se realizaron tres mutaciones sitio-dirigidas diferentes en la secuencia nucleotídica que codifica para el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi, reemplazándolo por alanina (incapaz de ser fosforilada), ácido glutámico y ácido aspártico (que simulan una fosforilación permanente del sitio). Las secuencias nucleotídicas silvestres y mutantes fueron insertadas en el vector pTREX-HIS8-GFP y expresadas como proteínas de fusión con GFP en epimastigotes de T. cruzi. Se comprobó la expresión exitosa de las proteínas en T. cruzi mediante visualización directa por microscopía de fluorescencia, inmunofluorescencia y mediante ensayos de vi Western blot. Las histonas marcadas con GFP se localizan a nivel de núcleo, lo cual sugiere una asociación con la cromatina del parásito, debiendo confirmarse su incorporación efectiva al nucleosoma mediante estudios posteriores. Otra tarea a futuro consiste en determinar si efectivamente el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi se fosforila como respuesta al daño del DNA. Los resultados permiten concluir que es posible generar líneas de epimastigotes de T. cruzi que expresen de manera estable la histona H2A tanto de fenotipo silvestre como de fenotipos mutantes para el residuo Thr131, utilizando el vector pTREX-HIS8-GFP. Los epimastigotes que expresan estas proteínas se encuentran disponibles para realizar ensayos de viabilidad comparativa frente a la exposición con agentes genotóxicos, lo que podría determinar un posible nuevo blanco terapéutico para la enfermedad de Chagas.
Proyectos Fondecyt 11100053 y 1130113

Resumen: La GST es una familia de enzimas que codifica varios genes polimórficos GSTM1, GSTT1, GSTP1 que apoyan en el proceso de eliminación de la ciclofosfamida (CF), se utiliza en el tratamiento de neoplasias, es un profármaco que requiere ser activado por el CYP450 y biotransformado en mostaza fosforamida, agente alquilante bifuncional, que forma aductos y enlaces cruzados con el ADN. Se ha propuesto que los genes GSTTI, GSTMI, GSTPI influyen en la susceptibilidad a nivel individual en la respuesta al tratamiento. Existen una gran variedad de ensayos para evaluar daños al ADN entre ellos la microelectroforesis unicelular comúnmente llamada ensayo cometa, que en condiciones alcalinas, detecta rupturas y sitios sensibles al álcali generados por agentes genotóxicos. . El objetivo de este trabajo fue investigar que la magnitud del daño al ADN in vitro inducido por la ciclofosfamida en linfocitos de sangre periférica es modulada por los polimorfismos de GSTT1, GSTM1 y GSTP1. En este estudio transversal se procesaron 120 muestras de sangre periférica de individuos sanos de indistinto sexo. Se hizo la inducción del daño al ADN con cliclofosfamida y la genotipificación de los polimorfismos de GST. Los resultados mostraron heterogeneidad entre los individuos en relación al daño inducido por ciclofosfamida. Se identificaron 12 genotipos completos. Se encontró que el genotipo silvestre (TI + / M + / PIb a/a / PIc a/a) que posee mayor actividad metabolizadora es estadísticamente significativa al compararlo con los 11 genotipos restantes. La magnitud del daño al ADN se asocia a la presencia de los polimorfismos de GSTM1, GSTT1 y GSTP1 de manera conjunta. Este es uno de los primeros trabajos en la población mexicana donde se observa que los polimorfismos de GSTM1, GSTT1, GSTP1 influyen en la respuesta a ciclofosfamida en linfocitos de sangre periférica in vitro evaluado mediante el ensayo cometa.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario
Trypanosoma cruzi, es un parásito protozoo, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, patología endémica en Latino América. La transmisión de esta enfermedad es producida por un insecto vector triatomino que, luego de alimentarse de la sangre de un mamífero, deposita sus deyecciones con las formas infectivas del parásito (tripomastigotes) las que ingresan al torrente sanguíneo a través de la lesión cutánea generada por el insecto. Una vez dentro, el parásito invade macrófagos y se divide al adoptar la forma amastigote. Luego de replicarse, los amastigotes retoman nuevamente la forma de tripomastigotes, se liberan del macrófago y por vía sanguínea o linfática invaden corazón, ganglios y otros tejidos. Las drogas usadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son efectivas durante la fase aguda de la infección; sin embargo, su efectividad es sólo parcial en la enfermedad crónica y generan diversos efectos secundarios. Para establecer una infección crónica, algunos parásitos resisten el estrés oxidativo y reparan el daño al DNA, generado por especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS/RNS) producidas por las células del sistema inmune del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde la vía de reparación por escisión de bases (BER) juega un rol fundamental. En el inicio de esta vía participan DNA glicosidasas que reconocen bases nucleotídicas alteradas en el DNA, catalizando la hidrólisis del enlace N-glicosídico, originando un sitio abásico apurínico/apirimidínico. En esta memoria de título se determinó el efecto de la sobreexpresión de las DNA glicosidasas TcNTH1 and TcOGG1 en epimastigotes expuestos a estrés oxidativo. Se crearon dos líneas de epimastigotes de T. cruzi recombinantes para las glicosilasas TcNTH1 y TcOGG1 A diferencia de lo descrito para enzimas ortólogas de humanos, ambas DNA glicosidasas fueron localizadas principalmente en el núcleo del parásito. Por otra parte, no se evidenciaron diferencias significativas en la viabilidad de epimastigotes transfectados y controles expuestos a peróxido de hidrogeno. Nuestros resultados confirman la presencia de la vía BER en T. cruzi. Como ha sido observado en estudios realizados en células de otros organismos eucariontes, la sobrexpresión de DNA glidosidasas no incrementa la viabilidad celular frente a agentes oxidantes. En un futuro cercano se espera purificar y caracterizar ambas DNA glicosidasas, así como estudiar la viabilidad de tripomastigotes transfectados
- FONDECYT 1090124 - FONDECYT 11100053 - Proyecto - Bicentenario Anillo ACT 112

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) generadas por los hospederos mamíferos y vectores triatominos inducen daño oxidativo en el DNA de Trypanosoma cruzi, disminuyendo la viabilidad parasitaria. Para reparar este tipo de daño, este protozoario activa el mecanismo de reparación de escisión de bases del DNA (vía BER). En este proceso juegan un rol fundamental las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (AP). En esta Memoria de Título se determinó la viabilidad de epimastigotes de T. cruzi que sobreexpresan la AP endonucleasa TcAP1 frente a una exposición sostenida a estrés oxidativo, utilizando el sistema glucosa/glucosa oxidasa que origina H2O2. Usando un kit comercial se establecieron las concentraciones de glucosa y glucosa oxidasa necesarias para producir niveles sostenidos y conocidos de H2O2, simulando la exposición sostenida de T. cruzi a agentes oxidantes en ambos hospederos. Este sistema permitió establecer que los epimastigotes que sobreexpresan TcAP1 presentan una mayor viabilidad que parásitos controles, sometidos a estrés oxidativo sostenido. En conclusión, en esta memoria de título se determinó que la endonucleasa TcAP1 participa en la sobrevida de T. cruzi en condiciones que simulan la exposición fisiológica sostenida a agentes oxidantes en ambos hospederos. Estos resultados confirman la participación de la vía BER en la persistencia parasitaria en sus hospederos
Financiemiento: Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, Conicyt, Proyecto Fondecyt 1090124, y Proyecto Fondecyt 11100053

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena de 16,5 kb. En su secuencia existe información para 13 polipéptidos de diferentes subunidades de los complejos de la cadena de transporte electrónico (CTE), para 22 ARNt y para 2 ARNr. Una mutación en cualquiera de estos genes puede provocar que la CTE no funcione correctamente, dando lugar a una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Todo ello puede provocar por un lado un déficit de energía en las células o tejidos, o por otro lado un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Según la demanda energética de cada tejido este déficit de producción de energía será más o menos importante, pudiendo incluso provocar graves trastornos fisiopatológicos.
El incremento de la producción de ROS por parte de la cadena de transporte electrónico puede ser eliminado con ayuda de las defensas antioxidantes celulares. Si la producción de ROS es más importante que la acción de estas defensas, ello puede llegar a provocar lesiones en diferentes componentes celulares tales como lípidos, proteínas o al propio ADNmt. Para profundizar en este campo, en este trabajo en primer lugar se han diagnosticado a cuatro pacientes con enfermedad mitocondrial, portadores de una mutación en su genoma mitocondrial. A partir de plaquetas de estos pacientes se han generado cíbridos transmitocondriales, que se han utilizado como modelo de estudio. Se han estudiado las siguientes mutaciones en genes mitocondriales: T14487C en la subunidad ND6 del complejo I, A3243G en el ARN de transferencia Leu (UUR), A8344G en el ARN de transferencia Lys y G6930A en la subunidad COXI del complejo IV. Analizando la producción de peróxido de hidrógeno como medida de la producción de ROS en estas cuatro líneas, hemos observado que las líneas portadoras de una mutación que afectase al funcionamiento del complejo I y III (descritos ampliamente en la literatura como principales productores de ROS en la mitocondria) es decir A3243G, A8344G y T144874C, sí provocan un incremento de la producción, mientras que la mutación que no afectaba a estos complejos (G6930A) no provocaba incremento. Posteriormente se ha estudiado si este incremento producía daño oxidativo a diferentes componentes celulares, tales como lípidos, proteínas y el propio ADNmt. Previamente, debido a que en la literatura no existía un consenso claro sobre el mejor método de análisis de la peroxidación lipídica, se realizó un pequeño estudio sobre cuál era el mejor inhibidor de la peroxidación lipídica a utilizar y en que concentración, obteniendo que el mejor a utilizar era el BHT a una concentración de 3mM.
En cuanto los resultados de daño oxidativo se observó que en los lípidos solo se observaba daño oxidativo en la línea portadora de la mutación T144874C, mientras que las otras no lo presentaban. En la oxidación de proteínas no se observó daño en ninguna de las cuatro líneas portadoras de la mutación y en cuanto a la oxidación del ADNmt, se observó daño oxidativo en las líneas portadoras de las mutaciones A8344G y T14487C. Con estos resultados se observa que en algunas mutaciones en el genoma mitocondrial la producción de ROS generada es superior a la capacidad detoxificadora de la célula, provocando daño oxidativo, mientras que en otras la producción de ROS no supera la acción de las enzimas antioxidantes.
Mitochondrial encephalomyopathies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are a heterogeneous group of disorders characterized by primary dysfunction of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) with a decrease in ATP production. Clinical and biochemical heterogeneity of mitochondrial disorders is due to the ubiquitous nature of mitochondria and the dual genetic (mitochondrial and nuclear DNA) control of OXPHOS. Some unique features of mitochondrial genetics, such as heteroplasmy and tissue segregation, contribute to this phenomenon. However, the precise mechanisms leading to this heterogeneity are still largely unclear.
Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as toxic by-products of redox-coupled reactions in the electron transport chain (ETC). Inhibition of the ETC in vitro using some respiratory complex inhibitors results in a significant increase in the mitochondrial production of ROS. This increase suggests that when dysfunction of the respiratory chain complexes occurs, electrons can be transferred directly to the molecular oxygen. However, cells are well protected by antioxidant enzymes: the manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and copper-Zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) to eliminate superoxide anion (O2.-) and the glutahione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) to eliminate hydrogen peroxide.
Oxidative stress results when the balance of prooxidants and antioxidants is altered in favour of the prooxidants. In turn, an excess of ROS may contribute to OXPHOS damage. Thus, to define the relationship between mtDNA mutations and production of ROS, several transmitochondrial cell lines (cybrids) carrying different mutations in their mtDNA were obtained from different mitochondrial patients. These included two common and well characterized mtDNA mutations in tRNA genes, the A3243G transition in the tRNALeu(UUR) derived from a patient with MELAS syndrome (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), and the A8344G mutation in the tRNALys, derived from a patient with the MERRF syndrome (myoclonus epilepsy with ragged-red fibers). In addition, another two cybrids cell lines were studied, harbouring the G6930A mutation in the gene encoding the subunit I (COI) of the cytochrome c oxidase (COX). This mutation changes the amino acid glycine into a premature termination codon, resulting in the loss of the last 170 amino acids (33%) of the polypeptide, thus causing a complete disruption in the COX assembly. The last cybrid cell line studied carried the mutation T144874C in the subunit 6 of the complex I of the ETC.
Hydrogen peroxide production was increased in cybrids harbouring tRNA and complex I mutations, but no changes were observed in cybrids harbouring the mutation in complex IV. No oxidative damage to lipids, proteins or mtDNA was detected in cybrids harbouring A3243G and G6930A mutations. In the cybrid cell line harbouring A8344G mutation, only oxidative damage to mtDNA was observed and in the cybrids harbouring the mutation in complex I, mtDNA and lipid oxidative damage were detected.
These results suggest that some mutations in mtDNA may increase the production of hydrogen peroxide (i.e., those mutations which affect complex I or III of the ETC) meanwhile other mutations do not. Furthermore this increase can sometimes override the antioxidant defences of the cells and produce oxidative damage to key cellular components.

Los frutos secos contienen grasas insaturadas susceptibles a la oxidación, pero también contienen sustancias antioxidantes, que podrían contrarrestar su efecto pro-oxidativo. Esta tesis muestra que en ratones sanos, el consumo de piensos enriquecidos con nueces enteras o con piel de nueces, no produjo efectos adversos sobre la peroxidación lipídica plasmática, a pesar de la menor capacidad antioxidante plasmática observada, respecto al grupo control. Además, mediante un estudio clínico, aleatorizado y 12 semanas de intervención en adultos con síndrome metabólico, se observó que consumir una mezcla de frutos secos en el contexto de una dieta cardiosaludable, no produjo efectos deletéreos sobre la capacidad antioxidante, la peroxidación lipídica, ni la función endotelial, respecto al consumo de la misma dieta cardiosaludable. Además, los frutos secos podrían reducir el daño oxidativo al ADN, marcador relacionado con algunas enfermedades crónico-degenerativas. Estos resultados sugieren que consumir frutos secos contribuiría a prevenir el riesgo de enfermedades crónico-degenerativas y sus comorbilidades.
Nuts contain unsaturated fatty acids susceptible to oxidation, but also contain antioxidants, which could counteract their prooxidant effect. This thesis shows that in healthy mice, consumption of feed enriched with whole nuts or walnut skins, produced no adverse effect on plasma lipid peroxidation despite the observed lower plasma antioxidant capacity, compared to the control group. In addition, a clinical trial, 12-week randomized intervention in adults with metabolic syndrome was observed that consumption of a mixture of nuts in the context of a healthy diet did not produce deleterious effects on capcidad antioxidant, peroxidation lipid and endothelial function, in comparison with the consumption of the same healthy diet. In addition, nuts could contribute to reduce oxidative damage to DNA, oxidative marker related to the presence of some chronic degenerative diseases. These results suggest that eating nuts in the context of a healthy diet could prevent the risk of chronic degenerative disease and their comorbities.

Evalúa la correlación de los tres parámetros más reportados del Ensayo Cometa Alcalino (Tail intensity, Tail Length y Olive Tail Moment) usando cuatro dosis de radiación ionizante, para evidenciar la capacidad de cada uno de ellos en la detección de niveles de daño en el ADN de células mononucleares (linfocitos y monocitos). Para este propósito se construyen seis curvas dosis-efecto, por cada parámetro. Las células mononucleares irradiadas (mediante irradiación gamma de una fuente de Co-60 con dosis de 0, 2.5, 5 y 7 Gy) provinieron de muestras sanguíneas extraídas a seis donantes aparentemente sanos. Los resultados muestran una correlación altamente significativa para cada uno de los parámetros. El R2 promedio obtenido con el parámetro Tail Intensity (TI), R2 = 0.977, DE = 0.007 fue superior comparado con los hallados con el Olive Tail Moment (OTM), R2=0.937 DE=0.036 y el Tail Length (TL), R2 = 0.92 DE= 0.075. Del mismo modo, en la variabilidad de las pendientes, el TI fue menor (CV=25.48 %) seguido del OTM (CV=46.6 %) y TL (CV=41.78 %). Se concluye que existe buena correlación entre los parámetros del ensayo cometa y las dosis de radiación ionizante. Entre ellos, los parámetros TI y OTM son los indicadores de daño al ADN que tiene mejor correlación con el aumento de dosis de radiación. El primero es particularmente preferido debido a la menor variabilidad de las pendientes de curvas y las características propias en la expresión de resultados. Se sugiere realizar más estudios para evaluar las limitaciones de la técnica y sus posibles aplicaciones.
Tesis

La fertilidad masculina puede ser medida mediante un espermatograma convencional, sin embargo este examen no incluye la valoración de la integridad del ADN espermático. Esta variable ha sido correlacionada con las tasas de fertilización, viabilidad y desarrollo del embrión, convirtiéndose en una herramienta de importancia clínica tanto para los programas de reproducción animal como los tratamientos de fertilidad asistida. El bioensayo Cometa es capaz de determinar de una manera exacta el valor de la integridad del ADN espermático, lamentablemente este examen no es de uso rutinario por su elevado costo de implementación ya que utiliza microscopia especializada y tinciones fluorescentes para evidenciar la migración del ADN. El objetivo de esta investigación fue evaluar la compatibilidad de las tinciones no fluorescentes Diffquik, Giemsa, de Feulgen y FastBlast en el bioensayo Cometa usando un método visual y automatizado. Se utilizaron 15 eyaculados previamente seleccionados de acuerdo al manual OMS 2010, para luego ser capacitados en búsqueda de homogeneidad adecuada para la experimentación. Cada muestra fue expuesta a una gradiente de Peróxido de hidrogeno (0, 10, 30,60 y 100 mM) por 1 hora a 4°C para luego evaluar el coeficiente de daño mediante el método visual y porcentaje de ADN en la cola mediante el método automatizado. Las pendientes de la regresión lineal en el método visual indican que los valores obtenidos por la tinción control SybrGreen (m=3,69) difieren con Giemsa (m=3,45) y Diffquik (m=2,57). En el método automatizado de igual manera SybrGreen (m=0.83), Giemsa (m=0,79) y Diffquik (m=0,77). Sin embargo SybrGreen es 1,06 veces más efectivo que Giemsa en el visual y 1,05 veces en el automatizado, sugiriendo una compatibilidad con el bioensayo cometa. De igual manera SybrGreen es 1,07 veces más efectivo que Diffquik en el visual y 1,44 veces en el automatizado, concluyendo una compatibilidad solo en el método visual.Male fertility can be measured by a conventional semen analysis, however, this examination does not include the assessment of sperm DNA integrity. This variable has been correlated with fertilization rates, embryo viability and development, becoming a tool of clinical importance for both animal breeding programs and assisted fertility treatments. Comet bioassay is able to determine an exact way the value of sperm DNA integrity, unfortunately this test is not routinely used because of its high cost of implementation because it uses specialized microscopy and fluorescent dyes to demonstrate DNA migration. The objective of this research was to evaluate the compatibility of non-fluorescent dyes Diffquik, Giemsa, Feulgen and Comet FastBlast in the bioassay using a visual and automated method. 15 ejaculates were used previously manually selected according to WHO 2010 and then be trained in finding adequate homogeneity for experimentation. Each sample was exposed to a hydrogen peroxide gradient (0, 10, 30,60 and 100 mM) for 1 hour at 4 ° C and then assess the damage coefficient by visual method and percentage of DNA in the tail by automated method. The slopes of the linear regressions on the visual method indicate that the values obtained by the SybrGreen Control staining (m = 3.69) differ with Giemsa (m = 3.45) and Diffquik (m = 2.57). In the same way automated method SybrGreen (m = 0.83), Giemsa (m = 0.79) and Diffquik (m = 0.77). However SybrGreen is 1.06 times more effective than Giemsa visual and 1.05 times in the automated, suggesting a comet support bioassay. Similarly SybrGreen is 1.07 times more effective than Diffquik visual and 1.44 times in the automated, concluding compatibility only in the visual method. Keywords:

El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres de todo el mundo. Además de los factores genéticos, epigenéticos y hormonales, existen evidencias epidemiológicas y experimentales de que los factores nutricionales y ambientales tienen un papel en la etiología y el desarrollo de esta enfermedad. Los lípidos de la dieta se han relacionado directamente con el cáncer, fundamentalmente, el de mama. El grupo de investigación ha contribuido al mejor conocimiento de los efectos y de los mecanismos de acción de las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz, rico en ácidos grasos poliinsaturados, PUFA n-6, y el aceite de oliva virgen extra, rico en ácidos grasos monoinsaturados, MUFA n-9, y diversos compuestos bioactivos, en el cáncer de mama experimental, obteniendo un efecto estimulador y potencialmente protector, respectivamente. Estas dietas actuaron fundamentalmente sobre la etapa de la promoción de la carcinogénesis. El objetivo de este trabajo ha sido investigar si estos lípidos podían intervenir, además, sobre la iniciación mediante la modulación de la metabolización y/o detoxificación de los agentes iniciadores carcinogénicos, tanto a nivel hepático como de la propia glándula mamaria. Los resultados proceden de dos series experimentales diferentes, desarrolladas en el modelo experimental de cáncer de mama inducido en la rata con el hidrocarburo aromático policíclico 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA). En ambas se estudiaron las enzimas metabolizadoras de xenobióticos (XMEs) de la fase I: CYP1A1, CYP1A2 y CYP1B1, y de la fase II: GSTP1 y NQO1. En la primera serie se evaluó el efecto de los lípidos de la dieta sobre la expresión en hígado y glándula mamaria de las XMEs en edades clave del desarrollo (prepuberal, puberal y postpuberal/adulta). En la segunda, se estudiaron específicamente las horas inmediatamente posteriores a la administración del carcinógeno y se analizó el efecto de los lípidos de la dieta sobre el metabolismo hepático, la generación de compuestos reactivos y el daño genómico provocado en la glándula mamaria. Los resultados han mostrado que los lípidos de la dieta son capaces de modular la expresión de las XMEs en distintas etapas del desarrollo postnatal. Además, la dieta rica en PUFA n-6 incrementó la expresión de las enzimas de fase I, en edades previas a la administración del DMBA, y aumentó la actividad de los CYP1s en las horas inmediatamente posteriores (12 y 24 horas post inducción), al mismo tiempo que disminuyó la actividad enzimática de la fase II, principalmente de NQO1. El número de metabolitos reactivos generados en hígado y el daño genómico en la glándula en los animales alimentados con la dieta rica en aceite de maíz fue mayor que en los otros dos grupos. Por otro lado, la dieta rica en aceite de oliva virgen extra y la dieta control normolipídica presentaron una actividad de fase I y II mejor coordinada, presentando una menor producción de metabolitos reactivos y menor daño en el ADN en la glándula mamaria. La concordancia de estos resultados con los parámetros de la carcinogénesis en ambas series demostró el efecto de los lípidos sobre la iniciación de la carcinogénesis mamaria experimental, además de la ya descrita modulación durante las fases de promoción/progresión. Los resultados de este trabajo, junto con otros previos sobre los efectos de los lípidos durante la maduración sexual y la diferenciación de la glándula mamaria, sugieren que estos nutrientes, en función de la cantidad y del tipo, pueden modificar diferencialmente la susceptibilidad o resistencia de la glándula mamaria al desarrollo del cáncer y, por tanto, modular las ventanas de susceptibilidad frente a la exposición a carcinógenos ambientales.
Breast cancer is the most common malignancy among women all over the World. Besides the genetic, epigenetic and hormonal factors, there are epidemiologic and experimental evidences that nutritional and environmental factors have a role in the etiology and the development of this cancer. The dietary lipids are directly related with cancer, mainly breast cancer. The research group has contributed to the best understanding of the effects and the mechanisms of action of the high corn oil, rich in polyunsaturated fatty acid (PUFA) n-6, and the high extra virgin olive oil diets, rich in monounsaturated fatty acids (MUFA) n-9 and several bioactive compounds, in the experimental breast cancer, resulting in a stimulating and a potentially protective effect, respectively. These diets mostly acted on the carcinogenesis promotion stage. The aim of this work has been to research on the intervention of these lipids, furthermore, over the initiation through the modulation of the bioactivation and/or detoxification of the carcinogenic initiator agents, both in hepatic level and the mammary gland itself. Results proceed from two different experimental series, developed in the experimental breast cancer model induced in the rat with the polycyclic aromatic hydrocarbon 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA). In both series the xenobiotic metabolizing enzymes (XMEs) were studied, CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 from the phase I, and GSTP1 and NQO1 from the phase II. The first series analyzed the effect of the dietary lipids on the XMEs expression in the liver and the mammary gland in critical development ages (prepubertal, pubertal and postpubertal/adult). The second series studied specifically the hours immediately after the carcinogen administration and analyzed the effect of the dietary lipids on its hepatic metabolism, the generation of reactive compounds and the genomic damage in the mammary gland. Results showed that dietary lipids may modulate the XMEs expression in different stages of the postnatal development. Additionally, the diet rich in PUFA n-6 increased the expression of phase I enzymes, in ages previous to DMBA administration, and raised CYP1s activity in the hours immediately after induction (12 and 24 hours), while reducing the enzyme activity of phase II, mainly NQO1. The number of reactive metabolites generated in the liver and the genomic damage in the mammary gland of the animals fed the high corn oil diet was higher than in the other groups. On the other hand, the high extra virgin olive oil diet and the normolipidic control diet exhibit a better coordinated phase I and phase II activity, showing a lower production of reactive metabolites and smaller DNA damage in the mammary gland. Concordance between these results and the carcinogenesis parameters in both series showed the effect of lipids on the initiation of the experimental mammary carcinogenesis, besides the already described modulation during promotion/progression stages. Results of this work, along with previous others on the effects of lipids during sexual maturity and mammary gland differentiation suggest that these nutrients, depending on the amount and type, can differently modify the mammary gland susceptibility or resistance to cancer development, and therefore, modulate the windows of susceptibility over the exposure to environmental carcinogens.

Most human solid tumors present signs of genomic instability. Activated oncogenes have been proposed to induce genomic instability through the generation of replicative stress. In this thesis, we have sown that the expression of a constitutively active form of RAS oncogene promotes accelerated G1/S transition which leads to replicative stress and genomic instability. The resulting DNA damage present in these cells should activate the DDR response, however, RasV12 cells impair DNA damage signaling. Furthermore, RasV12 expression inhibits apoptosis through ERK. RAS is one of the most commonly mutated oncogenes, yet efficient therapies to treat RAS dependent tumors are still lacking. With this in mind, and based on our previous results, we decided to try to exploit the DNA damage present in these cells to selectively target them. In order to do so, we induced extra DNA damage with ionizing radiation and depleted ERK to promote the death of the cells. We used this strategy on RAS dependent tumors both benign and malignant tumors, and successfully targeted and killed tumor cells. We propose that MEK inhibitors, that are being used in the treatment of metastatic melanomas, could be combined with radiation to improve the therapeutic outcomes. Aside from the previously described autonomous effects, we have also observed that RasV12 expression in the wing imaginal discs induces a non-autonomous phenotype. Wild type cells adjacent to RAS cells display signs of DNA damage, apoptosis and autophagy. The role of these non-autonomous effects is not clear; however, we hypothesize that they may play a role in metabolically supporting tumor growth.
La mayoría de tumores sólidos presentan signos de inestabilidad genómica. Se ha propuesto que la activación de oncogenes puede generar inestabilidad genómica mediante la inducción de estrés replicativo. En esta tesis hemos demostrado que la expresión de una forma constitutivamente activa del oncogén RAS en células epiteliales de Drosophila promueve una aceleración de la transición entre las fases G1 y S del ciclo celular. Esto lleva a una inducción de estrés replicativo y deriva en inestabilidad genómica. El daño en el ADN resultante de este proceso debería de activar la respuesta al daño en el ADN, sin embargo, esta se encuentra bloqueada. Además, la expresión de RasV12 inhibe la muerte celular gracias a los altos niveles de activación de ERK. Ras es uno de los oncogenes más comúnmente mutados, sin embargo seguimos sin terapias para tratar tumores dependientes de Ras que sean seguras y efectivas. Con esto en mente, y basándonos en nuestros resultados anteriores, decidimos tratar de explotar en daño en el ADN presente en estas células para destruirlas de forma selectiva. A estos efectos, indujimos más daño mediante irradiación e inhibimos la expresión ERK para promover la muerte de estas células. Usamos esta estrategia tanto en tumores benignos como malignos y en ambos casos logramos destruir de forma selectiva las células tumorales. Proponemos que los inhibidores de MEK, que se usan para el tratamiento de melanomas metastáticos, podrían combinarse con radiación para mejorar los efectos terapéuticos. A parte de los efectos autónomos descritos con anterioridad, también hemos observado que la expresión de RasV12 induce un fenotipo no autónomo. Las células normales adyacentes a las células Ras presentan signos de daño en el ADN, apoptosis y autofagia. El papel de estos efectos no autónomos no está claro, hipotetizamos que podrían jugar un papel en sustentar metabólicamente el crecimiento del tumor.

The maintenance of genome stability is crucial for homeostasis, development and suppression of diverse pathologies that include developmental disorders, premature aging and cancer. The DNA damage response coordinates the appropriate cellular responses following the detection of lesions to prevent genomic instability. The MRE11 complex is a sensor of DNA double strand breaks and plays key roles in multiple aspects of the DNA damage signaling, including the initiation of DNA end resection that is critical for the accurate break repair and the replication fork maintenance. Many studies have implicated the exonuclease EXO1 in DNA resection and shown that the MRE11 complex functions upstream, but the exact influence of EXO1 on double strand break responses remain unclear. In this thesis we examine the genetic relationship between the MRE11 complex and EXO1 during mammalian development and the cellular responses to DNA damage. Our work shows that the deletion of Exo1 in mice expressing a hypomorphic allele of Nbs1, a member of the MRE11 complex, leads to severe developmental defects, embryonic death and chromosomal instability. While EXO1 deficiency does not strongly affect DNA replication, DNA repair or checkpoint signaling in normal cells, our results reveal a crucial role for EXO1 in these functions when the MRE11 complex is compromised.
El mantenimiento de la estabilidad del genoma es esencial para la homeostasis y para la supresión de diversas patologías que incluyen trastornos del desarrollo, el envejecimiento prematuro y el cáncer. La adecuada respuesta al daño del ADN coordina las funciones celulares originadas por la detección de lesiones, para prevenir la acumulación de inestabilidad en el genoma. El complejo MRE11 es un sensor de roturas en el ADN de doble cadena y juega un papel clave en múltiples aspectos de la señalización del daño en el ADN; incluido el inicio de la resección del ADN terminal, que es a su vez fundamental para la reparación precisa de escisiones y el mantenimiento de la horquilla de replicación. La función del complejo MRE11 precede a las funciones de la exonucleasa EXO1, la cual está implicada en la resección del ADN y en las respuestas a los daños del ADN. En esta tesis examinamos la relación genética entre el complejo MRE11 y la proteína EXO1 durante el desarrollo de células de mamífero y las respuestas celulares al daño en el ADN. Nuestro trabajo muestra que la eliminación del gen Exo1 en ratones que expresan un alelo hipomórfico de Nbs1, un miembro del complejo MRE11, conduce a un defecto severo del desarrollo embrionario, la muerte del embrión y la inestabilidad cromosómica. Aún cuando la eliminación de EXO1 no afecta significativamente la replicación o reparación del ADN ni el control de la señalización, en conjunto, nuestros resultados revelan un papel crucial de EXO1 en estas funciones cuando el complejo MRE11 está comprometido.

The DNA Damage response is a crucial signaling network that preserves genome integrity. This network is an ensemble of distinct but often overlapping sub-networks, where participating components exert different functions according to precise spatiotemporal frameworks. To understand how these sub-networks have been assembled and emerged along evolution, we have screened DDR components in 47 selected species covering the tree of life and analyzed their evolutionary and functional properties according to different gene ages and following a variety of classifications. This is the first time a systematic analysis covers the DDR network’s evolution as a whole. Our results indicate that most of the DDR components are ancestral genes, that all the subnetworks contain at least one representative protein traceable to Prokaryota, and that the ancestral core of the DDR machinery is mainly related to repair and is mostly built upon sensor and effector activities. Along evolution the enlargement of the network has occurred through the addition of new components that have evolved to interact and work together with the ancient ones, which may have increased the complexity of the DDR network in terms of fine-tuning and cross-talk to other pathways.
La respuesta al daño en el ADN (DDR) es una red de señalización esencial que mantiene la integridad genética. Esta red es un conjunto de sub-redes distintas, pero a menudo solapantes, donde los componentes que participan desempeñan diversas funciones según marcos espacio-temporales precisos. Para comprender cómo estas sub-redes han surgido a lo largo de la evolución y cómo se han ido ensamblando, hemos buscado componentes de DDR en 47 especies que cubren el árbol de la vida, y hemos analizado sus propiedades evolutivas y funcionales según distintas edades de genes y siguiendo varias clasificaciones. Esta es la primera vez que un análisis sistemático cubre la evolución global de la red de DDR. Nuestros resultados indican que la mayoría de los componentes de la DDR son genes antiguos, que todas las sub-redes contienen al menos un representante trazable hasta procariotas, y que el núcleo ancestral de la maquinaria de DDR está principalmente relacionado con reparación y se construyó sobre actividades de detección y efectores. A lo largo de la evolución, la ampliación de la red ha ocurrido a través de la adición de nuevos componentes que han evolucionado para interaccionar y funcionar junto a los antiguos, lo que puede haber incrementado la complejidad de la red de DDR en términos de precisión y de comunicación con otras redes.

In this thesis we have addressed three different although related topics. First, we studied the post-mortem mutation damage rate of contaminated DNA sequences in ancient human remains focusing on the development of strategies to avoid pre-laboratory derived contaminations. We proposed a guideline to control them consisting in typing every single person involved on the manipulation of the remains, especially when they have not been excavated and washed under controlled conditions. Second, we successfully develop a non-invasive technique to sequence ancient remains but preserving it from the destruction. And third, we sequenced ancient human remains from different evolutionary times (from Paleolithic to post-Neolithic) to make inferences about the peopling of Western Europe focusing mainly in the Iberia peninsula. We found that there is a long term genetic continuity at least since the Neolithic. The only clear genetic discontinuity found is that involving two different human species, H. sapiens and H. neanderthalensis.
En la presente tesis hemos tratado tres temas diferentes aunque muy relacionados. Primero, hemos estudiado la tasa de mutación post-mortem de secuencias de ADN contaminante en restos humanos antiguos centrándonos en el desarrollo de estrategias para evitar que las muestras se contaminen antes de llegar al laboratorio. Proponemos una guía que consiste en el tipado genético de cada persona implicada en la manipulación de los restos, especialmente cuando estos han sido excavados y lavados bajo condiciones no controladas. Segundo, hemos desarrollado una técnica no invasiva para secuenciar DNA de restos humanos antiguos pero sin destruirlos. Y por ultimo, hemos secuenciado restos humanos antiguos pertenecientes a diferentes periodos evolutivos (desde el Paleolitico hasta el post-Neolitico) que nos han permitido hacer inferencias sobre el poblamiento Europeo centrándonos básicamente en la Península Ibérica. Hemos encontrado que ha habido una continuidad genética desde el Neolítico. La única clara discontinuidad genética encontrada es entre dos especies distintas: H. Sapiens y H.neanderthalensis.

[ES] La luz solar puede producir daños en el ADN por absorción directa de luz UVB, o por fotosensibilización tras la absorción de luz UVA por parte de fármacos, que pueden actuar como fotosensibilizadores (PS). La benzofenona (BP), presente en la estructura química de una amplia variedad de fármacos, tiene el potencial de fotosensibilizar daño al ADN, especialmente hacia la base de timina (Thy). Este daño puede dar lugar a dímeros de pirimidina de tipo ciclobutano (CPD) y a fotoproductos (6-4) pirimidina-pirimidona ((6-4)PPs), los cuales pueden causar mutaciones graves, melanomas o incluso la muerte celular. En algunos organismos, los (6-4)PPs pueden repararse de manera eficiente por las fotoliasas, en lo que se podría entender como una reacción Paternò-Büchi (PB) inversa a través de un intermedio de oxetano altamente inestable. Con el fin de profundizar en la fotorreactividad de los derivados BP-Thy y en la ruptura fotoinducida de oxetanos, se sintetizaron por primera vez una variedad de diadas en las que Thy y BP están covalentemente unidas por un espaciador lineal de diferente longitud y naturaleza. La fotorreactividad de los diferentes derivados se investigó por fotólisis de destello láser (LFP) y espectroscopía de absorción transitoria a escala de femtosegundo; además, se aislaron y caracterizaron los principales fotoproductos (PPs) derivados de la irradiación en estado estacionario. Los resultados mostraron un alto grado de quimioselectividad en la longitud y conformación del espaciador. En cuanto a la reactividad fotoquímica, se formaron PPs derivados de la PB y de la abstracción formal de hidrógeno; así, las diadas con el espaciador más largo dieron lugar a la formación de oxetanos y de PPs de abstracción de hidrógeno. Por el contrario, las diadas con espaciadores más cortos formaron un fotoproducto de abstracción formal de hidrógeno y/o polimerización. Por tanto, la fotorreactividad se vio influida por la longitud del espaciador, correlacionándose bien con los tiempos de 3BP*, observándose los tiempos más cortos para las diadas de espaciadores largos. En relación con la fotoapertura de oxetanos, la irradiación de los diferentes regio- y estereoisoméros condujo a la formación de la típica banda de absorción triplete-triplete de BP; por tanto, dicho proceso opera de forma adiabática. La fotólisis del oxetano que resulta de la irradiación de la diada con el espaciador más largo mostró una banda de absorción transitoria sobre 400 nm, atribuida a la formación del exciplejo triplete entre BP y Thy covalentemente unidos. Por otro lado, se investigó la reacción PB y la cicloreversión de oxetanos que surgen de la interacción entre Thy o derivados de uracilo (Ura) y BP. Así, se sintetizó una amplia gama de oxetanos Thy-BP y Ura-BP con diferentes sustituyentes en las posiciones 1 y 5 de la nucleobase, incluyéndose los regioisómeros cabeza-cabeza (HH) y cabeza-cola (HT). Los estudios espectroscópicos (absorción transitoria ultrarrápida y LFP), junto con el análisis teórico, coinciden en que la cicloreversión fotoinducida para los isómeros HH y HT implica la formación de un exciplejo en el estado excitado triplete antes de la ruptura. Generalmente, se observó que la reacción fue completamente adiabática para los regioisómeros HH. En el caso del oxetano HH que surge de la interacción entre 1,3-dimetiltimina (DMT) y BP, se observó la formación de una banda ~400 nm, que se atribuyó al exciplejo triplete 3[DMT···BP]*. Su formación fue altamente regioselectiva, siendo más rápida y eficiente para el isómero HH que para HT. Estos resultados fueron confirmados por análisis computacional. En general, se observó adiabaticidad en el proceso de fotorreversión para todos los oxetanos investigados, con un alto grado de regioselectividad y con la participación de exciplejos triplete.
[CA] La llum solar pot produir danys a l'ADN per absorció directa de llum UVB, o per fotosensibilització després de l'absorció de llum UVA per part de fàrmacs, que poden actuar com fotosensibilitzadors (PS). La benzofenona (BP), present en l'estructura química d'una àmplia varietat de fàrmacs, té el potencial de fotosensibilitzar dany a l'ADN, especialment a la base de timina (Thy). Aquest dany pot donar lloc a dímers de pirimidina de tipus ciclobutà (CPD) i a fotoproductes (6-4) pirimidina-pirimidona ((6-4)PPs), els quals poden causar mutacions greus, melanomes o fins i tot la mort cel·lular. En alguns organismes, els (6-4)PPs poden reparar-se de manera eficient per les fotoliases, en el que es podria entendre com una reacció Paternò-Büchi (PB) inversa a través d'un intermedi d'oxetà altament inestable. Amb la finalitat d'aprofundir en la fotoreactivitat dels derivats BP-Thy i en la ruptura fotoinduïda d'oxetans, es van sintetitzar per primera vegada una varietat de diades en les quals Thy i BP estan covalentment unides per un espaiador lineal de diferent longitud i naturalesa. La fotoreactivitat dels diferents derivats es va investigar per fotòlisi de centelleig làser (LFP) i espectroscopía d'absorció transitòria a escala de femtosegons; a més, es van aïllar i caracteritzar els principals fotoproductes (PPs) derivats de la irradiació en estat estacionari. Els resultats van mostrar un alt grau de quimioselectivitat en la longitud i conformació de l'espaiador. Quant a la reactivitat fotoquímica, es van formar PPs derivats de la PB i de l'abstracció formal d'hidrogen; així, les diades amb l'espaiador més llarg van donar lloc a la formació d'oxetans i de PPs d'abstracció d'hidrogen. Per contra, les diades amb espaiadors més curts van formar un fotoproducte d'abstracció formal d'hidrogen i/o polimerització. Per tant, la fotoreactivitat es va veure influïda per la longitud de l'espaiador, correlacionant-se bé amb els temps de 3BP*, observant-se els temps més curts per a les diades amb espaiadors llargs. En relació amb la fotoapertura d'oxetans, la irradiació dels diferents regi- i estereoisòmers va conduir a la formació de la típica banda d'absorció triplet-triplet de BP; per tant, aquest procés opera de manera adiabàtica. La fotòlisi de l'oxetà que resulta de la irradiació de la diada amb l'espaiador més llarg va mostrar una banda d'absorció transitòria sobre 400 nm, atribuïda a la formació de l'exciplex triplet entre BP i Thy covalentment units. D'altra banda, es va investigar la reacció PB i la cicloreversió d'oxetans que sorgeixen de la interacció entre Thy o derivats d'uracil (Ura) i BP. Així, es va sintetitzar una àmplia gamma d'oxetans Thy-BP i Ura-BP amb diferents substituents en les posicions 1 i 5 de la nucleobase, incloent-se els regioisòmers cap-cap (HH) i cap-cua (HT). Els estudis espectroscòpics (absorció transitòria ultraràpida i LFP), juntament amb l'anàlisi teòric, coincideixen en que la cicloreversió fotoinduïda per als isòmers HH i HT implica la formació d'un exciplex en l'estat excitat triplet abans de la ruptura. Generalment, es va observar que la reacció va ser completament adiabàtica per als regioisòmers HH. En el cas de l'oxetà HH que sorgeix de la interacció entre 1,3-dimetiltimina (DMT) i BP, es va observar la formació d'una banda ~400 nm, que es va atribuir a l'exciplex triplet 3[DMT···BP]*. La seua formació va ser altament regioselectiva, sent més ràpida i eficient per a l'isòmer HH que per a HT. Aquests resultats van ser confirmats per anàlisi computacional. En general, es va observar adiabaticitat en el procés de fotoreversió per a tots els oxetans investigats, amb un alt grau de regioselectivitat i amb la participació d'exciplexes triplet.
[EN] Sunlight light can produce damage to DNA through direct absorption of UVB or, more commonly, by photosensitization upon absorption of UVA light by drugs, that act as a photosensitizer (PS). Benzophenone (BP) as a building-block is present in a wide variety of drugs, and have the potential to photosensitize damage to DNA, specially towards the thymine (Thy) nucleobase. The resulting DNA damage can give rise to bulky dimers, i.e. cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproducts ((6-4)PPs), which can cause severe mutations, melanomas, or even be fatal for the cell. In some organisms, (6-4)PP can be efficiently repaired by photolyase enzymes, in what could be a reverse Paternò-Büchi (PB) reaction through an unstable oxetane intermediate. With the aim of getting deeper insight into the photoreactivity of BP-Thy derivatives and in the photoinduced cleavage of oxetanes, a variety of dyads where Thy and BP are covalently linked by a linear spacer of different lengths and nature were first synthesized. The photochemical reactivity and the photophysical properties of the different derivatives were investigated by means of laser flash photolysis (LFP) and femtosecond transient absorption spectroscopy; besides, the main photoproducts (PPs) arising from steady-state irradiation were also isolated and characterized. The results showed a high degree of chemoselectivity on the linking bridge length and conformation. Concerning the photochemical reactivity, PPs arising from the PB and from formal hydrogen abstraction were formed. In this context, the PB reaction took place for the dyads with the longest spacer with complete regio- and stereoselectivity, along with a hydrogen abstraction process. Finally, the dyads with shorter spacers gave rise to a formal hydrogen abstraction photoproduct and/or polymerization. Accordingly, the overall photoreactivity was proportional to the spacer length and was well correlated with the 3BP* lifetimes, the longer spacers giving rise to shorter lifetimes. In connection to the oxetane photocleavage, irradiation of the different regio- and stereoisomeric oxetanes led to the formation of the typical triplet-triplet absorption band of BP. Accordingly, the photoinduced cycloreversion also operates as an adiabatic process. Photolysis of the oxetane that results from irradiation of the dyad with the longest spacer showed a transient absorption at ~400 nm, which is ascribed to formation of the purported triplet exciplex between BP and Thy covalently linked. Additionally, the PB reaction and the cycloreversion of oxetanes arising from the interaction between Thy or uracil (Ura) derivatives and BP were also investigated. Thus, a wide range of Thy-BP and Ura-BP oxetanes with varying substituents at positions 1 and 5 of the nucleobase were synthesized, including both the head-to-head (HH) and head-to-tail (HT) regioisomers. Spectroscopic studies, including femtosecond transient absorption and LFP results, as well as theoretical multiconfigurational quantum chemistry analysis, agree that the photoinduced cycloreversion for the HH and HT isomers involved the formation of a triplet excited exciplex before the cleavage takes place. Generally, the photochemical reaction was fully adiabatic for the HH regioisomers. In the case of the HH-oxetane arising from the interaction between 1,3-dimethylthymine (DMT) and BP, an absorption band at ca. 400 nm was formed, and was attributed to the triplet exciplex 3[DMT···BP]*. Its formation was highly regioselective towards the HH regioisomer, being faster and more efficient than for the HT isomer. These results were confirmed by computational analysis. In general, adiabaticity was observed in the photoreversion process for all oxetanes, with a high degree of regioselectivity, which falls in line with the theory of the involvement of a triplet exciplex in the process.
Thanks to the Generalitat Valenciana for the finantial support through the Santiago Grisolía grant.
Blasco Brusola, A. (2021). Mechanistic Studies on the Photochemical Formation and Cleavage of Oxetanes Derived from Pyrimidine Bases [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/165256
TESIS

Beta-lapachona ( -lap) es un agente antitumoral que induce apoptosis selectivamente en células tumorales. El mecanismo preciso de citotoxicidad de -lap no es aún completamente comprendido. Aquí reportamos que -lap produce un retraso en la progresión del ciclo celular en la transición G1/S, aumenta la fosforilación de la quinasa de control Rad53p y disminuye la supervivencia celular en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Además, -lap induce la fosforilación de histona H2A en la posición serina 129. Estas respuestas de control de ciclo son reguladas por las quinasas Mec1p y Tel1p. Mec1p se requiere para la fosforilación de Rad53p/histona H2A y supervivencia celular tras tratamiento con -lap en cultivos asincrónicos, pero no para el retraso en la transición G1/S. La mutación tel1 aumenta la sensibilidad a -lap en una cepa defectiva en mec1, y compromete las respuestas de los puntos de control de ciclo. La fosforilación de Rad53p y el retraso en G1/S son completamente dependientes de un complejo Mre11p-Rad50p-Xrs2p (XMR) funcional, y mutantes en el complejo XMR son extremadamente sensibles al tratamiento con -lap. Finalmente, XRS2 y TEL1 trabajan epistáticamente respecto a la sensibilidad a -lap y Xrs2p se fosforila en un modo dependiente de Tel1p tras el tratamiento. El tratamiento con -lap también genera la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la cual es bloqueada eficientemente por dicumarol, un inhibidor de NADH deshidrogenasas (NADH-DH). El tratamiento con dicumarol no afecta a la viabilidad ni a las respuestas de control activadas por la droga. Identificamos un mutante, defectivo en la NADH-DH mitocondrial Nde2p, que es resistente a la toxicidad de -lap. -lap induce la producción de ROS en este mutante, sin afectar la viabilidad o la progresión de ciclo. El mutante nde2 presenta un retraso en la entrada en fase S del ciclo celular, e hipersensibilidad a agentes que dañan el ADN. Nuestros datos indican que Nde2p es un determ
Menacho, MA. (2007). Mecanismos moleculares involucrados en la citotoxicidad del agente antitumoral beta-lapachona [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1877
Palancia

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral.
Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Este trabalho foi desenvolvido em dois momentos, tendo o primeiro o objetivo de avaliar a qualidade microbiológica do leite oferecido aos vitelos pelos produtores e para tal foram recolhidas 61 amostras de leite dado aos vitelos, em 57 explorações portuguesas. Estas incluíam leite de tanque, leite de desperdício, leite de desperdício acidificado e leite de desperdício pasteurizado, sendo a grande maioria constituída por leite de desperdício. Estas apresentaram contagens de bactérias totais viáveis muito variáveis, sendo que 52,7% apresentaram valores superiores a 1.000.000 ufc/mL. O segundo momento foi um ensaio de um produto acidificante de leite (Nova Calforce® - Dinamarca), levado a cabo num grupo de 45 vitelos, cuja alimentação consistiu desde o nascimento em leite de desperdício (22 vitelos), ou leite de desperdício acidificado (23 vitelos) com o objetivo de diminuir a contaminação bacteriana. Foi feito o registo do sexo, tipo de parto, número de partos da mãe, peso ao nascimento, afeções desenvolvidas e terapêutica instituída, dias ao desmame, e peso ao desmame. Os dados permitiram o estabelecimento de relações entre o grupo e as afeções desenvolvidas, e o ganho médio diário de peso (GMD). Apenas se verificou significância estatística na comparação entre grupos (p < 0,05) para a variável de vitelos que foram acometidos por mais de uma afeção ou necessitaram de repetição de terapêutica, tendo os vitelos Nova Calforce® apresentado um melhor desempenho. Das relações estabelecidas de forma a encontrar relação com o GMD a que se mostrou mais influente foi a relação entre os grupos de estudo, apesar de valor de p > 0,05 (p = 0,06095), verificando-se uma média de GMD superior em 71,5 grama diárias nos vitelos Nova Calforce®, em relação aos vitelos controlo. A falha de transferência de imunidade passiva (FTIP) mostrou ter influenciado negativamente o desenvolvimento de diarreia e o GMD.
ABSTRACT - This work was carried out in two stages, the first aim being to understand the microbiological quality of the milk fed to calves by the farmers. Sixty-on samples of milk fed to calves were collected in 57 Portuguese farms, consisting of bulk tank milk, waste milk, acidified waste milk and pasteurized waste milk. Most of the sample were waste milk, which had highly variable viable total bacterial counts, with 52.7% having values higher than 1,000,000 cfu/mL. The second stage consisted on a trial with a milk acidifying product (Nova Calforce® - Denmark), carried out with 45 calves, which were fed with waste milk (22 calves) or acidified waste milk (23 calves) in order to reduce bacterial contamination. Several variables were recorded, including sex, type of calving, dam parity, birth weight, occurrence of diseases, duration of therapy, days at weaning, and weight at weaning. The data allowed the establishment of relations between the group and disease occurrence, and the average daily weight gain (ADG). There was only correlation that was statistically significant in the comparison between groups (p <0.05), which was the occurrence of more than one disease episode or the need for a repeated treatment, leading to the observation that calves fed with milk treated with Nova Calforce® performed better. The comparison of average daily weight gain between the study groups was not significant (p = 0.06095), but there was 71.5 grams advantage on the Nova Calforce® calves when compared to control calves. Failure of transfer of passive immunity had a negative influence in the occurrence of diarrhea and on ADG.
N/A

Submitted by Verena Bastos (verena@uefs.br) on 2015-08-05T21:29:18Z No. of bitstreams: 1 NEVES_JB_2012_R2.pdf: 2142681 bytes, checksum: 2f1f8d4679734685ccd9edf621f7b8c4 (MD5)
Made available in DSpace on 2015-08-05T21:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NEVES_JB_2012_R2.pdf: 2142681 bytes, checksum: 2f1f8d4679734685ccd9edf621f7b8c4 (MD5) Previous issue date: 2013-09-24
Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado de S?o Paulo - FAPESP
The prediction of the reinforced concrete beams behavior under bending is essential to design these elements. Usually the models do not incorporate the concrete stress contribution, which may underestimate the structural element strain that use steel fiber reinforced concrete (SFRC) under permanent or temporary loads. This work presents a variational formulation based on the finite difference energy method (EFDM) in predicting the flexural behavior of concrete beams reinforced, that uses SFRC. The proposed model uses the classical lamination theory (CLT) with a damage model (Mazars, 1984) applied to the SFRC. The reinforcement was considered as a layer of a perfect elastic-plastic material. Comparing the load-displacement numerical results with those of the literature to reinforced concrete beams demonstrates the consistency of the proposed model.
A previs?o do comportamento de vigas de concreto armado sob flex?o ? fundamental para o adequado dimensionamento destes elementos. Usualmente, os modelos n?o incorporam a contribui??o do concreto tracionado, o que pode subestimar as deforma??es no elemento estrutural que utilizem o concreto refor?ado com fibras (CRFA) sob cargas de curta e longa dura??o. No presente trabalho ? apresentada uma formula??o variacional com base no m?todo das diferen?as finitas energ?ticas (MDFE) para a previs?o do comportamento ? flex?o de vigas de concreto simples ou armado refor?adas com fibras de a?o. O modelo proposto combina a teoria cl?ssica de laminados (TCL) com um modelo de dano (Mazars, 1984) aplicado ao concreto. O refor?o (armadura longitudinal) foi considerado como uma l?mina de um material elasto-pl?stico perfeito. A compara??o dos resultados num?ricos com resultados encontrados na literatura para vigas de concreto armado, em termos de cargadeslocamento, demonstra a coer?ncia do modelo proposto.

[ES] El espectro de la luz solar está compuesto por una amplia gama de radiaciones electromagnéticas las cuales tienen diferentes impactos sobre la vida en la tierra. Entre ellas, las pertenecientes a la región ultravioleta toman un papel principal cuando nos referimos a la fotobiología, ya que pueden interactuar con las biomoléculas por medio de procesos tanto directos como fotosensibilizados. Como resultado, estas biomoléculas pueden sufrir modificaciones que no siempre tienen efectos beneficiosos. En este contexto, los daños fotoinducidos al ADN son de gran relevancia ya que están estrechamente relacionados con la creciente incidencia de cáncer de piel. Por ello, es necesario investigar tanto los mecanismos involucrados en dichos procesos como el desarrollo de nuevas estrategias para combatirlos. En la presente tesis se da respuesta a estas necesidades mediante el desarrollo y empleo de grupos protectores fotolábiles (PPG). En una primera parte se avanza en el desarrollo de nuevos PPG basados en filtros solares. Estos ofrecen la ventaja de actuar, una vez liberados, como un escudo protector frente a la radiación ultravioleta. En este contexto, en el Capítulo 3 se profundiza en las propiedades fotofísicas y fotoquímicas de los sistemas formados por la avobenzona como PPG de ácidos carboxílicos, más concretamente del ketoprofeno (KP) y del naproxeno (NPX). En este estudio se analiza por medio de modelado molecular y técnicas espectroscópicas la influencia que tiene la energía relativa del triplete de la avobenzona en su forma dicetónica, 3AB(K)*, respecto a la de los compuestos protegidos en el proceso de liberación. Siguiendo en esta misma línea de trabajo, en el Capítulo 4 se ha desarrollado un nuevo PPG capaz de liberar el filtro solar oxibenzona (OB) junto con compuestos carbonílicos. En una segunda parte, el foco de atención se ha puesto en el concepto de "Caballo de Troya", el cual establece que ciertas lesiones del ADN pueden actuar a su vez como fotosensibilizadores endógenos generando así nuevas lesiones en su entorno. En este contexto, en el Capítulo 5 se han estudiado, mediante métodos tanto experimentales como teóricos, las propiedades fotosensibilizantes de dos de los daños oxidativos del ADN, el 5-formiluracilo (ForU) y la 5-formilcitosina (ForC), poniendo especial énfasis en la capacidad de estos para poblar sus estados tripletes, así como de inducir la formación fotosensibilizada de dímeros ciclobutánicos de pirimidina (CPD). Por último, en el Capítulo 6 se ha desarrollado una nueva alternativa sintética para la incorporación del ForU en oligonucleótidos. Debido a la inestabilidad del grupo aldehído, esta síntesis se lleva a cabo generalmente mediante la incorporación de un precursor el cual es posteriormente convertido en el ForU mediante la acción de un agente oxidante. Por el contrario, en la nueva alternativa planteada el aldehído es protegido con un PPG, de manera que una vez insertado en el ODN, el aldehído es liberado de forma selectiva mediante el empleo de luz. Este trabajo supone un avance en el estudio de las propiedades fotosensibilizantes del ForU ofreciendo una nueva herramienta para la evaluación de las mismas en un entorno más cercano al del ADN.
[CA] L'espectre de la llum solar està compost per una àmplia gamma de radiacions electromagnètiques les quals tenen diferents impactes sobre la vida en la terra. Entre elles, les pertanyents a la regió ultraviolada prenen un paper principal quan ens referim a la fotobiologia, ja que poden interactuar amb les biomolècules per mitjà de processos tant directes com fotosensibilitzats. Com a resultat, aquestes biomolècules poden patir modificacions que no sempre tenen efectes beneficiosos. En este context, els danys fotoinduits a l'ADN són de gran rellevància ja que estan estretament relacionats amb la creixent incidència de càncer de pell. Per això, és necessari tant d'investigar els mecanismes involucrats en els processos com el desenvolupament de noves estratègies per a combatre'ls. En la present tesi es dóna resposta a aquestes necessitats per mitjà del desenvolupament i ús de grups protectors fotolàbils (PPG). En una primera part s'avança en el desenvolupament de nous PPG basats en filtres solars. Estos ofereixen l'avantatge d'actuar, una vegada alliberats, com un escut protector enfront de la radiació ultraviolada. En este context, en el capítol 3 s'aprofundeix en les propietats fotofísiques i fotoquímiques dels sistemes formats per l'avobenzona com PPG d'àcids carboxílics, més concretament del ketoprofé (KP) i del naproxé (NPX). En este estudi s'analitza per mitjà de modelatge molecular i tècniques espectroscòpiques la influència que té en el procés d'alliberament l'energia relativa del triplet de l'avobenzona en la seua forma dicetònica, 3AB(K)*, respecte a la dels compostos protegits. En esta mateixa línia de treball, en el capítol 4 s'ha desenvolupat un nou PPG capaç d'alliberar el filtre solar oxibenzona (OB) junt amb compostos carbonílics. En una segona part, el focus d'atenció s'ha posat en el concepte de "Cavall de Troia", el qual estableix que certes lesions de l'ADN poden actuar al seu torn com fotosensibilitzadors endògens generant així noves lesions en el seu entorn. En este context, en el capítol 5 s'han estudiat, per mitjà de mètodes tant experimentals com teòrics, les propietats fotosensibilitzants de dos dels danys oxidatius de l'ADN, el 5-formiluracil (ForU) i la 5-formilcitosina (ForC), posant especial èmfasi tant en la capacitat d'estos per a poblar els seus estats triplet, com d'induir la formació fotosensibilitzada de dímers ciclobutànics de pirimidina (CPD). Finalment, en el capítol 6 s'ha desenvolupat una nova alternativa sintètica per a la incorporació del ForU en oligonucleòtids. A causa de la inestabilitat del grup aldehid, esta síntesi es duu a terme generalment per mitjà de la incorporació d'un precursor el qual és posteriorment convertit en el ForU per mitjà de l'acció d'un agent oxidant. Al contrari, en la nova alternativa plantejada l'aldehid és protegit amb un PPG, de manera que una vegada inserit en l'oligonucleòtid, l'aldehid és alliberat de forma selectiva per mitjà de l'ús de llum. Este treball suposa un avanç en l'estudi de les propietats fotosensibilitzants del ForU i ofereix una nova ferramenta per a l'avaluació de les mateixes en un entorn més pròxim al de l'ADN.
[EN] The solar spectrum is composed of a wide range of electromagnetic radiations which have different impacts on life on earth. Among them, those belonging to the ultraviolet region are of utmost importance when we refer to photobiology, since they can interact with biomolecules through both direct and photosensitized processes. As a result, these biomolecules can undergo modifications that do not always have beneficial effects. In this context, photoinduced DNA damage is of great relevance as it is closely related to the increasing incidence of skin cancer. Therefore, it is necessary both to investigate the mechanisms involved in these processes and to develop new strategies to avoid them. In this Thesis these issues have been addressed through the development and use of photolabile protecting groups (PPG). The first part of this Thesis involves the development of new PPG based on solar filters. Once released, these PPG offer the advantage of acting as ultraviolet shields. In this context, Chapter 3 looks into the photophysical and photochemical properties of those systems formed by avobenzone as PPG of carboxylic acids, more specifically ketoprofen (KP) and naproxen (NPX). In this study, the influence on the photorelease process of the relative energetic location of the avobenzone triplet manifold in its diketo form, 3AB(K)*, with respect to that of its caged compound, is duly analyzed by means of molecular modeling and spectroscopic techniques. Following this same line of work, a new PPG capable of releasing oxybenzone (OB) solar filter along with carbonyl compounds has been developed in Chapter 4. The second part of this Thesis focuses on the "Trojan Horse" concept, which establishes that certain DNA lesions can act as endogenous photosensitizers, thus generating new lesions in their neighborhood. In this context, in Chapter 5 the photosensitizing properties of two oxidatively generated DNA damages, namely 5-formyluracil (ForU) and 5-formylcytosine (ForC), have been studied by means of experimental and theoretical approaches. Here, special emphasis has been placed on unraveling their capacity to photoinduce the formation of cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). Finally, in Chapter 6 a new synthetic alternative for the incorporation of ForU into oligodeoxynucleotides (ODN) has been developed. Due to the instability of the aldehyde group, this synthesis is generally carried out by incorporating a precursor which is subsequently converted into ForU by the action of an oxidative agent. On the contrary, in the new approach, the aldehyde is protected with a PPG, so that once inserted into the ODN, the aldehyde is selectively released through the use of light. This work entails a step forward in the study of the photosensitizing properties of ForU, offering a new tool for their evaluation within the DNA environment.
Lineros Rosa, M. (2021). Photoremovable protecting groups for carbonyl compounds of biological interest [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167764
TESIS

Mestrado com dupla diplomação com a Universidade Tecnológica Federal do Paraná
A infraestrutura aeroportuária constitui fundamental área dentro do contexto de mobilidade civil. Assim, pode-se afirmar que os pavimentos aeroportuários são essenciais na abordagem sobre esse tema, e por isso influenciam o desenvolvimento econômico das cidades ou países que o utilizam. Desse modo, este trabalho tem como objetivo estudar sobre as características estruturais e o comportamento dos aeródromos ao longo do tempo, de forma a estabelecer possíveis conceitos chave para melhor entendimento do tema e desenvolvimento sobre o assunto. Neste sentido, foi realizado um estudo sobre a capacidade estrutural de um aeródromo localizado na cidade de Bragança e relacionados os resultados para o PCN da pista, ou o Pavement Capacity Number em inglês. Este tem como objetivo retratar a possibilidade de operações de aeronaves no pavimento, conceito bem diferente dos pavimentos rodoviários. Esta definição é caracterizada pela Entidade de Aviação Civil Internacional, ou ICAO em inglês, e está exposto em seus manuais para o ACN (Aircraft Classification Number) dentro do método ACN/PCN. As verificações foram feitas segundo três formas principais: uma delas adotando o programa COMFAA para determinação do PCN, outra utilizando de abordagem feita pelo Laboratório Nacional de Engenharia Civil, ou LNEC, para um fator de dano estrutural na pista e uma última com a formulação do LNEC mas sem aplicação do conceito deste fator. Como o método para determinação do PCN não possui um procedimento padrão internacional, este estudo verifica a possibilidade de preencher os conhecimentos acerca do tema e esclarecer melhor seu significado e aplicação. Assim, a finalidade é fornecer segurança aos utentes de tal estrutura.