Thèses sur le sujet « Degradación de proteínas »

La supervivencia celular frente a los cambios ambientales requiere el mantenimiento de un equilibrio dinámico entre la síntesis y la degradación de proteínas. La degradación de proteínas, además de regular diferentes procesos celulares, tiene como función principal la eliminación de productos que no son útiles para la célula en determinadas situaciones o cuya acumulación puede ser tóxica. Los productos de esta degradación, es decir los aminoácidos, son reutilizados para la síntesis de nuevas moléculas o son metabolizados para la obtención de energía. La alteración de esta proteólisis intracelular puede llevar a la acumulación en el citoplasma de orgánulos defectuosos o de moléculas que se pueden agrupar en agregados insolubles y que pueden así desencadenar diferentes patologías. Aunque se ha avanzado bastante durante los últimos años en los conocimientos sobre la degradación intracelular de proteínas y de sus principales mecanismos, existen bastantes detalles moleculares todavía desconocidos. Por este motivo es necesario aportar nueva información sobre estos procesos que además podría ser relevante para identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar tratamientos más eficaces para las enfermedades derivadas de alteraciones en los mismos. La degradación de proteínas ocurre por diferentes mecanismos que pueden clasificarse generalmente en dependientes o no de unos orgánulos citoplásmicos, los lisosomas. La macroautofagia (a la que se denomina generalmente con el término más simple de autofagia) y el sistema ubicuitina-proteasomas son, respectivamente, los más importantes de esos dos grupos. Básicamente, el sistema ubicuitina-proteasomas consiste en la poliubicuitinación de proteínas que son después degradadas por los proteasomas. La autofagia en cambio se inicia con el secuestro de porciones del citoplasma en estructuras de doble membrana que se cierran formando los autofagosomas. Posteriormente, los autofagosomas se fusionan con endosomas y con lisosomas dando lugar a los autolisosomas, en los que por la acción de las proteasas o catepsinas lisosomales se degrada el material encerrado. La autofagia está regulada por una amplia variedad de vías de señalización que responden a multitud de factores ambientales. Entre estos últimos, la situación de ayuno de nutrientes es la inductora más potente de la autofagia. Durante la privación de nutrientes como los aminoácidos, la célula sufre un estrés energético que debe tratar de reducir produciendo ATP a partir de nuevas fuentes. Para ello activa la autofagia para degradar los componentes de la célula, como las proteínas, hasta producir sus unidades básicas que después son metabolizadas. Por el contrario, se ha demostrado que cuando se proporcionan aminoácidos a la célula la autofagia es inhibida. Aunque el efecto sobre la autofagia de los aminoácidos ha sido estudiado ampliamente en muchos laboratorios, no estaba tan claro ese efecto en el caso de otro nutriente, la glucosa, ya que cuando planteamos ese estudio los datos eran contradictorios. En este trabajo hemos podido establecer claramente que la glucosa tiene un papel inductor sobre la autofagia empleando técnicas muy variadas que incluyen: la cuantificación por ¿Western-blot¿ de los niveles del marcador de autofagia LC3-II en presencia o en ausencia de inhibidores lisosomales, la cuantificación de la proteína degradada, total y por la vía autofágica, mediante experimentos de pulso y caza, la cuantificación morfométrica de estructuras autofágicas (equivalentes a autofagosomas y autolisosomas) por microscopia electrónica y la cuantificación de la masa lisosomal por fluorescencia. Además, hemos comprobado que la glucosa también induce la ubicuitinación de proteínas y la degradación de estas por los proteasomas. Con estos y otros datos obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral, hemos podido concluir que la glucosa induce la autofagia en todos los tipos celulares estudiados y en todas las condiciones ensayadas. Este efecto disminuye o se enmascara cuando están presentes a la vez otros factores que son inhibidores de la autofagia, como los aminoácidos o el suero bovino fetal, lo que podría explicar algunos de los datos contradictorios en la literatura. La glucosa aporta la energía necesaria para el correcto funcionamiento de la autofagia a partir de unos niveles mínimos de ATP. Un descenso en la disponibilidad energética a través de la inhibición de la glucólisis reprime la autofagia inducida por la glucosa. Sin embargo, la estimulación de la autofagia por glucosa no parece depender únicamente de la disponibilidad de ATP, sino que hemos identificado una vía de señalización en la que no interviene AMPK a pesar de responder al descenso de los niveles de ATP y al aumento de los niveles de calcio durante la incubación en un medio carente de glucosa. Esta vía tampoco implica a mTORC1 y en ella sí interviene en cambio la MAPK p38¿, como hemos comprobado con diferentes inhibidores de esta quinasa, con el uso de siRNAs o empleando MEFs p38-/-. Consideramos que estos resultados contribuyen a clarificar más la regulación de la autofagia por nutrientes y, más concretamente, por uno tan relevante como es la glucosa.
Moruno Manchón, JF. (2013). Regulación de la degradación intracelular de proteínas por glucosa [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34775
TESIS

Magíster en bioquímica, área de especialización en bioquímica de proteínas y biotecnología
Memoria de título de bioquímico
La autofagia es un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular frente a diferentes tipos de estrés. Este proceso degradativo consiste en el reclutamiento de proteínas, lípidos y organelos completos en vesículas de doble membrana para la posterior degradación lisosomal de su contenido. Una de las proteínas más importante en la regulación de la autofagia es Beclin-1/ATG6. En condiciones basales, Beclin-1 se encuentra unido a Bcl-2/Bcl-XL. La disociación de estas proteínas es indispensable para la activación de la autofagia. Tanto Beclin-1 como Bcl-2 son reguladas por modificaciones post-traduccionales que permiten su disociación. Dentro de estas modificaciones la poli-ubiquitinación en Lys63 de Beclin-1 promueve su disociación de Bcl-2 y la activación de la autofagia. Por otra parte, tanto la generación de estrés de retículo endoplasmático (RE) como la acumulación de agregados proteicos inducen autofagia. La respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) restablece el normal funcionamiento del RE mediante distintas vías de señalización como la vía de degradación de proteínas del RE (ERAD), la cual elimina las proteínas mal plegadas dentro del RE al ser retrotranslocarlas hacia el citoplasma y poli-ubiquitinarlas para su degradación proteosomal. La acción del ERAD ocurre a través de un complejo formado por diferentes proteínas, entre ellas Herp y la ubiquitina ligasa Hrd-1/Synoviolina. El sistema ubiquitina-proteosoma modifica post-traduccionalmente proteínas, uniéndolas covalentemente a una pequeña proteína denominada ubiquitina. La unión de varias subunidades de ubiquitina unidas por su Lys48 es conocida como poli-ubiquitinación en Lys48 y está generalmente asociada a la degradación proteosomal de la proteína marcada. Por otra parte, otros tipos de cadenas de poli-ubiquitina unidas por su Lys63 tendrían funciones de señalización. Herp es una proteína integral de membrana asociada al RE, la cual aumenta significativamente sus niveles en respuesta al estrés del RE y activarse la vía UPR. Herp posee un dominio análogo a ubiquitina (ULD), el cual lo vincularía al ERAD. El dominio ULD de Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación dependiente de Hrd-1 y de esta manera aumenta la degradación de sustratos específicos de esta enzima. Estudios recientes en nuestro laboratorio mostraron que Herp actúa como un regulador negativo de la autofagia y que los niveles de Beclin-1 aumentan significativamente en su ausencia. El objetivo de esta tesis fue establecer el mecanismo a través del cual Herp regula negativamente la autofagia. Con este fin se prepararon células HeLa “knock-down” (KD) para Herp mediante la expresión de un shRNA específico. También se utilizaron siRNA específicos para Herp con el fin de reducir los niveles de esta proteína en células HeLa “wild-type”. Los resultados obtenidos muestran que Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1. Ni la privación de glucosa ni la disminución de Hrd-1 mediante un siRNA específico produjeron diferencias en la poli-ubiquitinación de Beclin-1. La inhibición del proteosoma con MG132 indujo un aumento en la cantidad de Beclin-1 en células controles, mientras que las células Herp KD no presentaron diferencias con respecto al control, sugiriendo que la poli-ubiquitinación por Lys48 de Beclin-1 conduce a su degradación proteosomal. Sin embargo al activar la autofagia por privación de glucosa las células tratadas con el siRNA de Herp o siRNA de Herp y Hrd-1 en conjunto mostraron una tendencia al aumento en la autofagia, mientras que las células transfectadas con el siRNA de Hrd-1 mostraron una disminución de la activación de la autofagia. En conclusión los resultados solo comprueban parcialmente la hipótesis propuesta. Si bien se observó que Herp regula negativamente la autofagia mediante la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1 y su consiguiente degradación proteosomal, la ubiquitin ligasa Hrd-1 no sería la encargada de la poli-ubiquitinación en Lys48 dependiente de Herp.
Autophagy is a key physiological process for cell survival under different types of stress. This process consists in the recruitment of various cytoplasmatic components such as proteins, lipids and organelles into double-membrane vesicles which fuse with lysosomes enabling the degradation of its content. One of the most important regulatory proteins in autophagy is Beclin-1/ATG6. In basal conditions, Beclin-1 interacts with its repressor protein Bcl-2/Bcl-XL. The dissociation of these two proteins is indispensable for autophagy initiation and development. Both Beclin-1 and Bcl-2 are subjected to different post-translational modifications, which regulate their dissociation. Among these modifications, the Lys63 poly-ubiquitination of Beclin-1 promotes dissociation from Bcl-2 and autophagy activation. The generation of endoplasmic reticulum (ER) stress and the subsequent accumulation of misfolded proteins is a well known autophagy activating signal. In order to maintain homeostasis to the ER during stress, the unfolded protein response (UPR) is activated. The UPR accomplishes this task by a series of signaling pathways such as ER-associated protein degradation (ERAD), which degrades misfolded proteins inside the ER by retro-translocation of them to the cytoplasm and poly-ubiquitination for proteosomal degradation. ERAD is controlled by a series of proteins in the ER such as Herp and the ubiquitin-ligase Hrd-1/Synoviolin. The ubiquitin-proteasome system modifies proteins by the attachment of the small protein ubiquitin. Attaching several subunits of ubiquitin to each other by their Lys48 is called Lys48 poly-ubiquitination and is normally recognized as a signal for proteasome degradation. In the other hand, Lys63 poly-ubiquitination of proteins is related to other signaling process. Herp is an integral ER protein, whose levels are significantly increased during ER stress and UPR activation. Herp contains an ubiquitin-like domain (ULD) which has been associated with ERAD. Herp ULD domain controls Hrd-1 dependant poly-ubiquitination, increasing the poly-ubiquitination and proteasomal degradation of specific substrates of Hrd-1. Our recent studies have shown that Herp is a novel negative regulator of autophagy and Beclin-1 levels are up-regulated in the absence of Herp. The aim of the present work was to establish how Herp negatively regulates autophagy. To this end, Herp knock-down (KD) HeLa cells were prepared by expressing a specific shRNA. Specific siRNA were also used to silence Herp expression in HeLa wild-type cells. Our results show Herp positively regulates Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination. Both glucose deprivation and Hrd-1 siRNA treatment did not have any effect in Beclin-1 poly-ubiquitination. Proteasome inhibition with MG132 induces Beclin-1 levels in control cells, while Herp KD cells do not show any differences. These data suggest that Beclin-1 lysine-48 poly-ubiquitination leads to its proteasome degradation. Glucose deprivation showed an increase in autophagy activation cells treated with a Herp siRNA or Hrd-1 and Herp siRNA treated cells. However, Hrd-1 siRNA treatment alone showed impaired autophagy activation. In conclusion, our results only prove the hypothesis partially. The results suggest Herp negatively regulates autophagy through Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination and consequent proteasomal degradation, but the ubiquitin ligase Hrd-1 would not be responsible Herp mediated Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination.
Fondap

Ingeniero Civil en Biotecnología
El cultivo de células animales ha crecido continuamente en los últimos años, debido al avance en las técnicas de cultivo y al entendimiento de los procesos celulares. La venta de productos obtenidos a partir de estas técnicas deja importantes utilidades y la obtención de nuevos medicamentos deja grandes ganancias sociales. Dentro de los factores que ayudan a mejorar la productividad, se ha estudiado la posibilidad de intervenir los procesos de apoptosis y degradación de proteínas. En este contexto es donde cobra relevancia la obtención de modelos que estudien estas vías. En este documento se busca estudiar y modelar la degradación de proteínas via lisosomal. Para ello se realiza una investigación bibliográfica, se eligen los componentes del modelo, se plantean reacciones para poder deducir ecuaciones y simularlas. Se obtienen gráficos que describen diferentes procesos del sistema. Uno de los proncipales resultados fue la ratificación de que la degradación via lisosoma es más lenta que el replegamiento de proteínas. Las proteínas son degradadas entre 16 y 30 minutos luego de comenzada la simulación. Se logra describir tanto la generación de autolisosoma como la degradación de este. Se propone y realiza una simplificación de la formación del complejo Atg12Atg5Atg16, la que no altera visiblemente la degradación de autolisosoma. Por otra parte, se propone en un futuro modificar las condiciones gatillantes del estrés celular, con el fin de robustecer el modelo Finalmente se destaca la utilidad que puede tener un modelo de degradación de proteínas agregadas vía lisosomal. La aplicación de este podría generar utilidades y posicionar a la industria en un nivel más competitivo.

Las vías de degradación intracelular de proteínas, son numerosas y diferentes según la proteína, célula y situación metabólica. El proteasoma se considera una de las principales vías implicadas en estos procesos y esta Tesis Doctoral se ha centrado en averiguar algunos aspectos, todavía poco claros, en relación con esta vía proteolítica. Investigamos la posible existencia de poblaciones de proteasomas, en diversas localizaciones celulares que difieran en su composición en subunidades. Encontrando que tanto en hígado de rata como en células cultivadas de mamífero los proteasomas se localizan sobre todo en el citosol, pero también en el núcleo y asociados a la cara externa de la membrana del retículo endoplásmico. Además, las subunidades del proteasoma 20S y de sus complejos reguladores no se encuentran libres en las células en cantidades apreciables. Aunque los diferentes proteasomas se encuentran en todas esas localizaciones, la proporción de proteasomas 26S asociada al retículo endoplásmico es mayor que la de los proteasomas 20S y que los inmunoproteasomas y los proteasomas PA28 se encuentran en cantidades pequeñas en el núcleo.Determinamos en cultivos celulares, fibroblastos humanos, en diferentes condiciones de crecimiento, la contribución de los proteasomas y de otras vías proteolíticas a la degradación general de proteínas intracelulares. Encontrando que los inhibidores MG132 y ALLN, que han sido utilizados ampliamente como inhibidores específicos de los proteasomas, son también inhibidores muy eficaces de las vías proteolíticas lisosomales. Las principales vías proteolíticas en la degradación intracelular de proteínas de vida media corta y larga son los proteasomas y los lisosomas, que son responsables de un 80% o más de toda la degradación. Las distintas vías proteolíticas están reguladas de forma distinta ya que se activan o inhiben de manera diferente en las diferentes condiciones de crecimiento. Así por ejemplo, la macroautofagia se activa en ausencia de suero y/o de aminoácidos y su importancia disminuye en el ayuno prolongado, mientras que otras vías lisosomales diferentes a la macroautofagia se activan en células confluentes y su importancia aumenta en el ayuno prolongado. En cuanto a los proteasomas, son más activos en ausencia de suero probablemente debido a un incremento en la cantidad de proteínas ubicuitiladas y son menos activos en confluencia debido a la sustitución del complejo regulador 19S y de las subunidades intercambiables del proteasoma 20S por el complejo regulador PA28 y las subunidades del inmunoproteasoma, respectivamente. Analizamos el papel de los proteasomas en la degradación de una proteína específica de membrana plasmática, el receptor de LDL, y estudiamos si una de las mutaciones más frecuente en población española, la C358Y, que produce Hipercolesterolemia Familiar (HF), afecta a las vías degradativas de este receptor. Encontrando que la forma madura del receptor humano de LDL se degrada mayoritariamente por proteasomas, pero también por lisosomas y que la mutación C358Y del receptor humano de LDL retrasa su maduración provocando que parte de la forma precursora sea degradada por lisosomas y disminuye la estabilidad del receptor humano maduro de forma que su degradación transcurre a través de una vía casi exclusivamente lisosomal. Nuestros resultados suponen, por tanto, una cooperación de las dos principales vías degradativas en la degradación de una proteína específica. Además, una mutación puntual (C358Y) puede determinar que la vía de degradación del receptor cambie ya que en el caso del receptor mutante (C358Y) la vía degradativa pasa a ser mayoritariamente lisosomal. Es decir, los dos sistemas proteolíticos mayoritarios cooperan en la degradación de una misma proteína y su importancia relativa puede variar por mutaciones puntuales en la secuencia de la misma.
The results demonstrate that different regulatory complexes and subpopulations of proteasomes have different distributions within mammalian cells. They were mainly found in the cytosol but were also present in the nucleus and associated with the endoplasmic reticulum. The 19S regulatory complexes were found to be relatively enriched in endoplasmic reticulum fractions from rat liver and the PA28 regulatory complexes were found to be localized predominantly in the cytoplasm. The contributions of the main proteolytic pathways to the degradation of long-lived and short-lived proteins in human fibroblasts grown under different conditions were also investigated. The effects of various commonly used pharmacological inhibitors of protein degradation were first analysed in detail. By choosing specific inhibitors of lysosomes and proteasomes, it was observed that both pathways accounted together for 80% or more of the degradation of cell proteins. With lysosomal inhibitors, it was found that serum withdrawal or amino-acid deprivation strongly stimulated macroautophagy but not other lysosomal pathways, whereas confluent conditions had no effect on macroautophagy and slightly activated other lysosomal pathways. With proteasomal inhibitors, it was found that, in exponentially growing cells in the absence of serum, activity of the ubiquitin-proteasome pathway increases, whereas under confluent conditions the contribution of proteasomes to degradation decreases, especially in cells deprived of amino acids. Interestingly, in confluent cells, the levels of two components of the 19 S regulatory complex and those of an interchangeable beta-subunit decreased. This was associated with a marked increase in the levels of components of PA28-immunoproteasomes. A mutation (C358Y) in the low-density lipoprotein receptor (LDLR), which is the most prevalent in a sample of familial hypercholesterolemia patients from Valencia (Spain) was finally investigated. Post-translational processing of the mutant LDLR precursor to the mature form was apparently retarded and part of this precursor was degraded by a lysosomal pathway. Also, the mature form of the mutant LDLR undergoes rapid degradation when compared to the wild type LDLR. The mature forms of wild-type LDLR and mutant C358Y are mainly degraded by proteasomes and lysosomes, respectively. Thus, a single mutation in the LDLR changes the degradative pathway of this protein.

Describe el mecanismo de liberación, activación y acción de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs), para que suceda la degradación del tejido pulpar. Actualmente, los estudios moleculares de las enfermedades buco dentales han llevado a un mejor conocimiento de determinadas enzimas, como es el caso de las metaloproteinasas de la matriz (MMP). Los hallazgos sobre estas enzimas en relación con las enfermedades dentales no sólo nos permiten conocer más a fondo su etiopatogenia a través de mecanismos moleculares, sino que además pueden ser un punto de partida muy valioso para desarrollar enfoques terapéuticos nuevos, al menos prometedores, en la lucha contra distintas patologías.La pulpa es un tejido conectivo especializado, de origen mesenquimático, ricamente inervado y vascularizado que se encuentra dentro del espacio central del diente y rodeado por dentina. Ésta se encuentra conformada por una población heterogénea de células, incluyendo odontoblastos, fibroblastos, linfocitos T y macrófagos, todas dentro de una matriz extracelular rica en colágeno. La matriz extracelular (MEC) del tejido conectivo es altamente organizada y consiste en adhesiones de colágeno, fibras elásticas y glucoproteínas. Su resistencia estructurales es muy delicada y depende del balance de diferentes enzimas proteolíticas y de sus activadores e inhibidores. Las enzimas proteolíticas se pueden clasificar en dos grandes grupos: peptidasas (exopeptidasas) y proteinasas (endopeptidasas). Las peptidasas actúan sobre los enlaces peptídicos de los extremos de la cadena y pueden ser aminopeptidasas o carboxipeptidasas. Las proteinasas actúan en el interior de la cadena y se clasifican de acuerdo con la identidad del residuo catalítico primario. Así, pueden ser: serinproteinasas, cisteinilproteinasas, aspartilproteinasas, y metaloproteinasas. Una de las características principales en la inflamación pulpar es la degradación de la matriz de proteínas, estos cambios suceden en presencia de dichas endopeptidasas las cuales actúan a su vez sobre una diversidad de proteínas que conforman los tejidos presentes en la pulpa.
Trabajo académico

El alcohol es un compuesto neurotóxico y su abuso puede causar daño cerebral y neurodegeneración. Sin embargo, los procesos neuropatológicos que producen estos efectos no se conocen con exactitud. Nuestro grupo demostró por primera vez que el etanol induce gliosis, neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración mediante la activación del sistema inmune innato en cerebro a través de los receptores TLR4 de las células gliales. Además, evidencias recientes apuntan a que el alcohol altera los procesos de degradación de proteínas en patologías como la hepatopatía alcohólica, pero se desconoce si estos procesos proteolíticos también participan en el daño cerebral inducido por el consumo de alcohol. Mediante esta tesis, pretendemos evaluar la relación de los dos principales complejos proteolíticos, el sistema ubicuitina-proteasoma y la vía de la autofagia, con el daño producido por el alcohol en el cerebro, así como la implicación de los receptores TLR4 en este proceso. Para ello, usaremos ratones WT y TLR4-/- tratados crónicamente con etanol en agua durante 5 meses y los compararemos con los respectivos controles mediante técnicas como el western blot, PCR cuantitativa, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría. Del mismo modo, trabajaremos también con cultivos primarios de células gliales para evaluar el efecto del alcohol en dosis agudas in vitro. Nuestra hipótesis de partida es que al activar la señalización por TLR4, el etanol causa inflamación en el cerebro, estrés oxidativo y acumulación de proteínas por disfunción de los sistemas proteolíticos. Esta acumulación de agregados proteicos podría a su vez estimular la activación de los receptores TLR4, amplificando los efectos del etanol en la producción de daño cerebral y neurodegeneración.
Pla Rodríguez, A. (2014). IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA NEURODEGENERACIÓN CAUSADA POR EL ABUSO DE ALCOHOL: PAPEL DE LOS RECEPTORES TLR4 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36532
TESIS

DYRK1A is the most studied member of the DYRK family of protein kinases, because is one of the human chromosoma 21 proteins for which changes in gene dosage result in neuropathological alterations. DYRKs are activated by autophosphorylation on a tyrosine residue in the activation loop, a one-off event that takes place during translation. Accordingly, DYRK1A would be constitutively active once is synthesized. However, DYRK1A is extremely sensitive to gene dosage, and thus it is predictable that not only its activity but also its actual protein amounts have to be tightly regulated by mechanisms not yet characterized. In the present study, the protein kinase NLK has been identified as a novel regulator of DYRK1A protein stability. DYRK1A interacts with NLK in physiological conditions. The interaction results in the phosphorylation of DYRK1A at multiple sites, which have been identified by mass spectrometry analysis. These phosphorylation events promote DYRK1A proteasome-dependent degradation. Moreover, DYRK1A degradation is induced by stimulating cells with Wnt1 or Wnt3a, or overexpressing elements of the Wnt signaling cascade such as the Frizzled-1 receptor or NLK activators such as HIPK2. In addition, DYRK1A interacts with and phosphorylates -catenin and TCF-4 and enhances -catenin-dependent transcriptional activity, at least by phosphorylation of -catenin. Thus, these results suggest that DYRK1A acts as a positive factor in the Wnt--catenin signaling pathway and NLK acts as a negative regulator by targeting both DYRK1A and TCF/LEF transcription factors for proteasome-mediated degradation.
DYRK1A es el miembro más estudiado de la familia de proteína quinasas DYRK, porque es una de las proteínas de la cromosoma humano 21 para la que cambios en la dosis génica dan lugar a alteraciones neuropatológicas. Las quinasas DYRK se activan por autofosforilación en un residuo tirosina localizado en el lazo de activación, un evento único que ocurre durante la traducción. Como consecuencia, DYRK1A sería constitutivamente activa una vez se ha sintetizado. Sin embargo, DYRK1A es extremadamente sensible a la dosis génica, y por tanto es predecible que no sólo su actividad, pero también los niveles de proteína han de estar estrictamente controlados por mecanismos reguladores que todavía no han sido caracterizados. En este trabajo, la proteína quinasa NLK ha sido identificada como un nuevo regulador de la estabilidad de DYRK1A. DYRK1A interacciona con NLK en condiciones fisiológicas, y la interacción tiene como resultado la fosforilación de DYRK1A en residuos serina/treonina, varios de los cuales han sido identificados por espectrometría de masas. La interacción con NLK y la subsecuente fosforilación promueven la degradación de DYRK1A vía el proteasoma. Además, la degradación de DYRK1A es inducida por estimulación de la células con Wnt1 o Wnt3a, o por sobreexpresión de miembros de la cascada de señalización de Wnt, como el receptor Frizzled-1 o de un activador de NLK como HIPK2. Finalmente, se ha demostrado que DYRK1A se une y fosforila -catenina y TCF-4. La fosforilación de, al menos, -catenina es responsable del incremento de la actividad transcripcional dependiente de esta proteína en presencia de DYRK1A. Todos estos resultados sugieren que DYRK1A actúa como un factor positivo en la vía de señalización Wnt--catenina y NLK actúa como un regulador negativo al inducir la degradación vía proteasoma no sólo de los factores de transcripción TCF/LEF sino también del modulador positivo DYRK1A.

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico
Las proteínas son los polímeros más complejos sintetizados en la naturaleza, estas deben plegarse y adoptar complicadas estructuras tridimensionales para cumplir su función. Más aún, algunas proteínas requieren enhebrar su cadena principal formando un nudo para llegar a su estructura final. Entender como estos nudos (o topologías anudadas) afectan las propiedades y función de las proteínas ha sido un tema de gran interés en biofísica. Así como una cuerda obtiene una nueva función o comportamiento con un nudo, las proteínas anudadas podrían tener propiedades únicas, muy distintas a su contraparte desanudada. Simulaciones moleculares realizadas con polímeros con similar grado de compactación de las proteínas, indican que si el plegamiento de una proteína fuera un proceso al azar la probabilidad de que estas formen un nudo puede llegar a ser de un 90%. Sin embargo sólo un 0,5% de las estructuras de proteínas conocidas poseen un nudo. En consecuencia, se ha propuesto que las proteínas con topologías anudadas han sido seleccionadas negativamente durante la evolución. La presente tesis tiene como objetivo dilucidar si las topologías anudadas en proteínas dificultan procesos biológicos asociados a la translocación de proteínas. Los procesos de translocación de proteínas son fundamentales para la viabilidad celular, ya que permiten la correcta localización celular de proteínas así como también su degradación selectiva. Experimentos in silico muestran que los nudos podrían obstruir el paso de las proteínas que los contienen obstruyendo su translocación a través de canales o poros estrechos. Para poner a prueba esta hipótesis se utilizó la proteasa ATP dependiente ClpXP de Escherichia coli como un modelo para ensayar la translocación y degradación de proteínas anudadas tipo 31. Esta proteasa se encarga de degradar selectivamente sustratos proteicos, desplegándolos mecánicamente para luego translocarlos a través de su estrecho poro central. Si las topologías anudadas dificultan estos procesos se podría explicar su baja representación en la naturaleza. Se encontró que la proteína anudada MJ0366, de Methanocaldococcus jannaschii, se degrada fácilmente por ClpXP cuando su degradación comienza desde su extremo C-terminal. Sin embargo, cuando se agregó la proteína fluorescente verde (GFP), que normalmente es degradada por ClpXP, al extremo libre de MJ0366 (extremo N-terminal), la proteasa es incapaz de degradar este sustrato multidominio liberando un producto parcialmente degradado. El peso molecular de este producto corresponde a GFP más 48 aminoácidos, este tamaño sugiere que el nudo de MJ0366 se aprieta contra el dominio plegado de GFP, protegiéndola de la degradación. No obstante, cuando se incrementa la distancia entre GFP y MJ0366, mediante la inserción de un polipéptido desplegado, la protección de GFP disminuye dramáticamente. Estos resultados indican la existencia de dos posibles vías para la degradación de sustratos anudados multidominio: i) el nudo se desliza y aprieta contra GFP deteniendo la degradación, o ii) el nudo es translocado por ClpXP cuando este se aprieta antes de llegar GFP. En este último caso ClpXP puede degradación de todo el sustrato. Para estudiar en mayor detalle el mecanismo de degradación de los sustratos multidominio anudados, se realizaron ensayos de degradación in singulo en pinzas ópticas de alta resolución. Esta metodología permitió estudiar los eventos de desplegamiento y translocación separadamente. Resultados preliminares, muestran que el nudo no afecta la estabilidad mecánica de MJ0366, sino que afecta la eficiencia de translocación de MJ0366 y la capacidad de ClpXP para desplegar GFP. Estos resultados son la primera evidencia experimental de que las topologías anudadas pueden detener procesos asociados a la translocación y describen por primera vez, in vitro, la dinámica del movimiento de un nudo en una cadena polipeptídica
Proteins are the most complex polymers synthesized by the nature, they have to fold and adopt intricate three-dimensional structures to fulfill its functions. Even more, some proteins need to thread its main chain and form a knot to achieve its native state. How these knots (or knotted topologies) affect the properties and functions of proteins is a subject of great interest in biophysics. In the same way that a knot can give new functions or behaviors to a rope, knotted proteins could have unique properties, very different from unknotted ones. Molecular simulations have shown that randomly compacted protein polymers have a high probability to form knots. However, only 0.5% of the protein structures in the protein data bank present a knot in their structures, in consequence it has been proposed that knotted topologies have been negatively selected by evolution. The aim of this thesis is to determine if knotted topologies in proteins hinder biological processes associated with protein translocation. Translocation of proteins is a fundamental process for cell viability; it allows the correct localization of proteins in the cell and the control of protein levels through degradation. Molecular dynamics have shown that knots in proteins can obstruct narrow pores during translocation, but there is no experimental evidence yet. To test this hypothesis, we used the ClpXP ATP dependent protease of Escherichia coli to study the translocation of knotted proteins. To degrade its protein substrates, ClpXP needs to mechanically unfold them and translocate their polypeptide chain through its narrow pore. If knotted topologies can obstruct protein degradation, it could explain why there are so few knotted proteins. It was found that ClpXP easily degrade a knotted protein of Methanocaldococcus jannaschii, MJ0366, when a degradation tag is added to its C-Terminal end. However, when the green fluorescent protein (GFP), a normally degradable domain, is added to the N-Terminal end of MJ0366, ClpXP is unable to degrade this multidomain substrate releasing a partially degraded product with an intact GFP domain. The molecular weight of this partially degraded product suggests that the knot tightens against the folded domain of GFP, protecting it from degradation. However, when the distance between MJ0366 and GFP increased, by the insertion of an unfolded polypeptide, the degree of protection of GFP decrease dramatically. This results indicates two possible outcomes for multidomain knotted substrate degradation: i) the knot can slide and tighten against GFP, thus stopping degradation, or ii) the knot is translocated through ClpXP pore when the knot tightening occurs before reaching GFP, leading to complete substrate degradation. To study the mechanism of degradation of the knotted multidomain substrates in detail, in singulo degradation assays where performed in high resolution optical tweezers. This approach allowed the characterization of the impact of the knotted topologies in the unfolding and translocation steps. Preliminary results show that the knot does not affect the mechanically stability of MJ0366, but can generate pauses during translocation and even stalls ClpXP for minutes when trying to unfold GFP. These results are the first experimental evidence of knotted topologies impairing a biological process associated with translocation and describe, in vitro, the dynamic of knot movement on a polypeptide chain
Fondecyt 1151274; CONICYT

Protein homeostasis (proteostasis) results from the fine regulation of synthesis and degradation. The nuclear cofactor DOR/TP53INP2 was identified originally as a protein expressed in PML of nuclear bodies. However, in response to cellular stress, DOR/TP53INP2 exits the nucleus, localizes to early autophagosomes and regulates autophagy. Recent data from our laboratory has demonstrated that DOR promotes muscle wasting by the activation of basal autophagy in skeletal muscle. Aim of this project is to analyze the role of DOR/TP53INP2 in combining the regulation of autophagy with other muscle homeostatic processes like the Ubiquitin- Proteasome System. Our results indicate that DOR is a negative regulator of the proteasome activity in C2C12 cells and skeletal muscle. Our data suggest that this upregulation of the proteasome activity in DOR-deficient cells is modulated by an induction of some subunits of the proteasome such as PSMD4 and PSMD11, subunits of the 19S regulatory particle involved in the recognition of Ub and proteasome assembly. Moreover, results suggest that DOR is also a negative regulator of protein synthesis. The comprehension of DOR function in regulating proteostasis will potentially identify new targets against muscle atrophy. Indeed, DOR expression is repressed in wasting conditions such as diabetes and cancer cachexia.
La homeostasis de proteinas (proteostasis) resulta de una buena regulación de la síntesis y degradación proteica. El cofactor nuclear DOR/TP53INP2 fue identificado originariamente como una proteina expresada en PML de nuclear bodies. Sin embargo, en respuesta a estrés celular, DOR/TP53INP2 sale del núcleo, localiza con autofagosomas tempranos y regula la autofagia. Datos recientes de nuestro laboratorio han demostrado que DOR/TP53INP2 promueve la perdida de masa muscular por la activación de autofagia basal en el músculo esquelético. El objetivo de este proyecto es analizar el papel de DOR/TP53INP2 como regulador que interconecta la autofagia con otros procesos homeostáticos como el sistema de ubiquitina proteasoma (UPS) en el músculo esquelético. Nuestros resultados indican que DOR/TP53INP2 es un regulador negativo de la actividad de la acividad del proteasoma en celulas C2C12 y en el musculo esqueletico. Nuestros datos sugieren que ese incremento de la actividad del proteasoma en células deficientes para DOR/TP53INP2 está modulado por un aumento de algunas subunidades de la parte regulatoria 19S del proteasoma como PSMD4 y PSMD11, las cuales estan implicadas en el reconocimiento de proteinas ubiquitinadas y en el ensamblaje del proteasoma respectivamente. Además, los resultados sugieren que DOR/TP53INP2 es tambien un regulador negativo de la síntesis proteica. El conocimiento de la funcion de DOR/TP53INP2 en regular la prteostasis nos ha permitira identificar nuevas dianas contra la atrofia muscular. De hecho, la expresión de DOR/TP53INP2 está reprimida en condiciones de pérdida muscular así como en diabetes y caquexia cancerosa.

Los viroides, los agentes infecciosos más simples de la escala biológica, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario de aproximadamente 250-400 nucleótios (nt) que no codifica proteína alguna. A pesar de esta simplicidad estructural, los viroides son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y en muchos casos causar enfermedades en sus plantas huéspedes. Las infecciones producidas por viroides representativos generan la acumulación de pequeños RNAs viroidales (vd-sRNAs) de 21-24 nt con características similares a los pequeños RNA interferentes (siRNAs), la huella dactilar del silenciamiento mediado por RNA. La identificación de los vd-sRNAs implica que los viroides son diana de la primera barrera de silenciamiento mediado por RNA, formada por las RNasas ‘Dicer-like’ (DCLs). Para examinar si los vd-sRNAs se unen a las proteínas AGOs —el componente clave del complejo RISC (‘RNAinduced silencing complex’) que constituye la segunda barrera del silenciamiento mediado por RNA— hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) se agroinfiltraron con nueve de las diez proteínas AGOs de Arabidopsis thaliana. Inmunoprecipitaciones a partir de los halos agroinfiltrados y análisis ‘Western-’ y ‘Northern-blot’ han mostrado que todas las AGOs se expresaron y, a excepción de AGO6, AGO7 y AGO10, unieron vd-sRNAs: AGO1, AGO2 y AGO3 los de 21 y 22 nt, mientras que AGO4, AGO5 y AGO9 también mostraron afinidad por los de 24 nt. La secuenciación masiva mostró que las AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 agroexpresadas unen los PSTVd-sRNAs en función de su tamaño y nucleótido 5’-terminal, y que los perfiles de los correspondientes vd-sRNAs cargados en las AGOs adoptan una distribución específica a lo largo del genoma viroidal. La agroexpresión de AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 en hojas de N. benthamiana infectadas con PSTVd atenuó la acumulación de los RNAs genómico viroidales, indicando que éstos, o sus precursores, también son diana de RISC. En contraste con los ribovirus, la infección de PSTVd en N. benthamiana no afectó de forma significativa la regulación mediada por miR168 de la AGO1 endógena, que carga vd-sRNAs con especificidad similar a su homóloga de A. thaliana. Mientras se conoce bien la biogénesis de los RNA viroidales, su degradación está restringida a algunos datos que implican al silenciamiento mediado por RNA. En el curso de nuestros estudios sobre el PSTVd, hemos observado consistentemente un patrón de 6-7 RNAs subgénomicos (sgRNAs) de polaridad (+) que aparecen junto con los RNAs monoméricos circulares y lineares en berenjena, un huésped experimental de este viroide. Hibridaciones ‘Northern-blot’ con sondas de tamaño parcial y completo, mostraron que los sgRNAs (+) de PSTVd derivan de diferentes regiones del RNA genómico y que algunos son parcialmente solapantes. Parte de los sgRNAs (+) de PSTVd se observaron también en N. benthamiana y tomate, donde han pasado desapercibidos a causa de su menor acumulación. El análisis por extensión de cebador de sgRNAs (+) de PSTVd representativos excluye que sean productos de terminaciones prematuras de la transcripción, pues carecen del extremo 5’ común que cabría esperar si ésta empezara en una posición específica. Ulteriores análisis mediante 5’- y 3’-RACE indican que los sgRNAs (+) de PSTVd tienen extremos 5’-OH y 3’-P, que probablemente resultan de cortes endonucleolíticos de precursores más largos catalizados por RNasas típicas que generan este tipo de extremos. Análisis de sgRNA (-) de PSTVd, que también se acumulan en berenjena infectada, mostraron que presentan características estructurales muy similares a los sgRNA (+). Nuestros resultados proporcionan una nueva visión de cómo ocurre la degradación in vivo de los RNAs viroidales, posiblemente durante su replicación, y sugieren que síntesis y degradación de las cadenas de PSTVd están conectadas, como se ha observado en los mRNAs.
Minoia, S. (2015). Degradación in vivo de un viroide de replicación nuclear: rutas catalizadas por proteínas Argonauta cargadas con pequeños RNAs viroidales y por otras ribonucleasas que generan RNAs subgenómicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48553
TESIS

El sistema de producción de carne de vacuno en España es muy específico. Es un sistema totalmente desligado de la tierra, con animales sacrificados jóvenes y alimentados durante todo el engorde a base de piensos concentrados ricos en cereales, produciendo la característica carne rosada. En los últimos años, ha cobrado interés la inclusión de leguminosas grano en estas dietas, con el problema de que estos suplementos están relativamente poco caracterizados en estas condiciones alimentarias, ya que la degradabilidad de suplementos proteicos puede reducirse en dietas concentradas. Por otra parte, la cebada y el maíz son los cereales más utilizados y aunque tienen diferentes velocidades de degradación ruminal del almidón, se han realizado pocos esfuerzos para sincronizar su degradación con fuentes proteicas de similares características y así maximizar la eficiencia de la fermentación ruminal.
En el marco de la falta de información sobre la fermentación ruminal de terneros jóvenes alimentados con dietas concentradas nos planteamos los siguientes objetivos:
a) Caracterizar la fermentación ruminal y la degradabilidad de la proteína de suplementos vegetales durante todo el engorde.
b) Estudiar los efectos de la sincronización de la degradabilidad ruminal del almidón de la cebada y el maíz con dos fuentes proteicas, sobre la fermentación ruminal y sobre los parámetros productivos y el comportamiento de ingestión.
En el primer experimento con un diseño de medidas repetidas estudiamos como evolucionaba la fermentación ruminal y la degradación de la proteína de 4 suplementos vegetales (dos leguminosas y dos subproductos de la extracción de aceite) en 6 terneras en crecimiento entre los 80 y los 250 kg alimentadas con dietas concentradas con distinta proporción de fibra. Una dieta contenía un 12% de paja de cebada y la otra un 30% de alfalfa deshidratada, y ambas eran isoenergéticas e isoproteicas. Observamos que aunque en ambas dietas la actividad celulolítica, estimada a través de la degradación ruminal de la FND de una muestra de heno de alfalfa incubada in situ, era muy baja, fue ligeramente superior en la dieta que tenía mayor proporción de forraje. La dieta con un 30% de alfalfa deshidratada también presentó mayor degradabilidad ruminal de las dos leguminosas grano (guisante y altramuz) incubadas in situ. Con la edad aumentó la ingestión total de carbohidratos no fibrosos y la fermentación se volvió más amilolítica y proteolítica, aumentando la concentración de AGV totales, la proporción de propionato y la degradabilidad efectiva de la proteína de los suplementos incubados, a excepción de la harina de soja. Estas mismas dietas se administraron en el segundo experimento a 4 terneras de 300 kg de peso vivo, asignadas a un diseño de cross-over para estudiar el efecto del nivel de fibra de la dieta sobre la fermentación ruminal y la degradación proteica de 7 suplementos proteicos de origen vegetal en la última fase de engorde. El perfil de fermentación ruminal no se vio afectado por el nivel de fibra de la dieta, siendo un perfil básicamente amilolítico. La degradación de la FND del heno de alfalfa también fue muy baja (25,5%) y la degradación de las leguminosas grano fue más baja que los valores aportados por los sistemas de referencia, siendo los valores obtenidos más adecuados para estas condiciones de producción. Los valores de degradación de la harina de soja y la harina de girasol fueron similares a los aportados por las tablas de referencia, sin verse afectados por el nivel de fibra de la dieta.
Para el estudio de la sincronización de la degradabilidad ruminal entre fuentes de energía y de proteína, combinamos la cebada y el maíz con dos fuentes proteicas, harina de soja y harina de girasol, que demostraron tener diferente velocidad de degradación ruminal en los experimentos 1 y 2. De estas combinaciones resultó una dieta sincronizada para una fermentación rápida (cebada-girasol); una dieta sincronizada para una fermentación lenta (maíz-soja) y dos dietas desincronizadas con un componente de fermentación rápida y uno de fermentación lenta (cebada-soja y maíz-girasol). Las 4 dietas eran isoproteicas e isoenergéticas y con una relación forraje:concentrado cercana a 10:90. In vitro, con el sistema de fermentadores de doble flujo continuo observamos una potenciación de la fermentación ruminal por efecto de la sincronización, sin que se viera afectada por el pH ruminal que se mantuvo constante a 6,2 o fluctuante, 12 h a 5,8 y 12 h a 6,4, simulando una acidosis crónica, frecuente en este tipo de dietas. In vivo, estas dietas fueron asignadas a 4 terneras de 132 kg en un diseño de cuadrado latino 4 x 4, sin observar ningún efecto de la sincronización sobre la fermentación ruminal ni sobre la digestibilidad de todo el tracto. El tipo de carbohidrato afectó a la ingestión, siendo mayor en los tratamientos que contenían maíz. Los animales que recibían la dieta sincronizada para una fermentación rápida (cebada-girasol) redujeron su ingestión y rumiaron durante más tiempo el forraje sin que sufrieran problemas de acidosis ruminal.
Beef production in Spain is very specific. The production system is completely detached from the land and calves are fed high concentrate diets based on cereals from weaning to slaughtering at a young age, producing a tender and pink meat. The use of legume seeds in these high concentrate diets is increasing, although these protein supplements are poorly characterized in these feeding conditions and protein degradation can be reduced in such diets. Moreover, barley and corn are the main cereal grains used in high concentrate beef cattle diets. These cereals differ in their starch content and in their fermentation rate and extent of rumen degradation, but few efforts have been made to synchronize their degradation with protein supplements of similar degradation characteristics and maximize the efficiency of ruminal fermentation.
Due to the lack of information about ruminal fermentation in young beef cattle fed high concentrate diets, the following objectives were proposed:
a) To characterize ruminal fermentation and estimate ruminal nitrogen degradability of plant protein supplements during the fattening period.
b) To study the effects of synchrony of ruminal degradability of corn and barley starch with protein sources of different rates and extents of degradation, on ruminal fermentation, animal performance and feeding behavior.
In the first experiment, six Holstein heifers growing from 80 to 250 kg were used in a repeated measures trial to study the changes in ruminal fermentation and protein degradation of four plant protein supplements (two legume seeds and two by products from the oil industry). Heifers were fed two isoenergetic and isonitrogenous high concentrate diets with different fiber content. One diet contained 12% barley straw and the other 30% dehydrated alfalfa as forage source. Cellulolytic activity, estimated as NDF degradation of alfalfa hay incubated in situ, was very low in both diets, but it was slightly higher in the diet with 30% dehydrated alfalfa. In situ nitrogen degradability of legume seeds (peas and lupin seeds) was also higher in the diet with a higher proportion of forage. With age, gross nonstructural carbohydrate intake increased and ruminal fermentation became more amilolytic and proteolitic, increasing total VFA concentration, propionate proportion and nitrogen effective degradability of protein supplements, except for soybean meal. These two diets were assigned in the second experiment to four 300-kg growing heifers in a cross-over design to study the effect of dietary fiber level on ruminal fermentation and in situ nitrogen degradability of seven protein supplements (5 legume seeds) at the end of the fattening period. The ruminal fermentation pattern was basically amilolytic in both diets, and was not affected by dietary fiber content. Neutral detergent fiber degradation of alfalfa hay was also very low (25.5%) and values of effective degradation on legume seeds were lower than values reported by reference feeding systems, the values obtained in the present experiment being more adequate for beef cattle fed high concentrate diets. Effective degradation of soybean meal and sunflower meal were similar to values reported by feeding systems and not affected by NDF content of diets.
To study the effects of synchrony of rumen degradability between energy and protein sources, barley and corn and two protein sources, soybean meal, SBM, and sunflower meal, SFM, differing in their rate and extent of rumen degradation were combined. This resulted in a synchronized rapid fermentation diet (barley-SFM), a synchronized slow fermentation diet (corn-SBM) and two unsynchronized diets with a rapidly and slowly fermenting component (barley-SBM and corn-SFM). All diets were isoenergetic and isonitrogenous with a forage to concentrate ratio close to 10:90. In vitro, with a dual flow continuous culture system, ruminal fermentation was enhanced in synchronized diets (Barley-SFM and corn-SBM). No effect of ruminal pH, which was held constant at 6.2 or fluctuant 12 h at 5.8 and 12 h at 6.4, simulating subclinical acidosis frequently associated with these diets, was observed. In vivo, these diets were fed to four 132-kg heifers assigned to a 4 x 4 Latin square design, but synchronization had no effect on ruminal fermentation or on apparent total tract digestibility. The type of carbohydrate affected intake, being higher for corn than barley based diets. Heifers fed the rapid synchronized diet (barley-SFM) reduced intake and increased time spent chewing per unit of forage intake, avoiding problems of ruminal acidosis.

Tesis para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo y al grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias, mención en Producción Animal
En la Estación Experimental Oromo, Departamento de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile, se llevó a cabo una investigación que tuvo como objetivo cuantificar el efecto de incluir carbohidratos con distinta tasa de degradación en la dieta de vacas lactantes pastoreando una pastura con alto contenido de proteína degradable, sobre parámetros ruminales, sanguíneos y lácteos, así como también determinar el efecto de este tipo de suplementación sobre el uso de la energía metabolizable para sintetizar urea en desmedro de la producción de leche. Se utilizaron 24 vacas Holstein Neozelandés, 4 de las cuales contaban con cánula ruminal y fueron distribuidas en 4 tratamientos con diseño de cuadrado latino 4x4, las 20 vacas restantes fueron dispuestas al azar en 4 grupos de 5 vacas cada uno. Los tratamientos fueron T1: Sin suplementación, T2: 20% maíz y 80% avena, T3: 50% maíz y 50% avena y T4: 80% maíz y 20% avena. La cantidad de suplemento entregado fue de 4 Kg día-1 ajustándose a cada tratamiento en base a T2, de manera que las raciones fuesen isoenergéticas. La pastura base de la dieta presentó un contenido promedio de proteína de 22,3%. El coeficiente “a” de degradabilidad de la materia seca (MS) fue un 81% mayor en la avena respecto al maíz, siendo esta diferencia significativa (P<0,05). La fracción lentamente degradable (coeficiente “b”) fue mayor en el caso del maíz superando a la avena en un 73% (P<0,05). La suma de los coeficientes “a” y “b” fue mayor para el caso del maíz alcanzando un 99,8%. Por su parte la tasa de degradación de la MS (coeficiente “c”) fue mayor en la avena respecto del maíz (P<0,05). En el caso de las mezclas de grano formuladas, la fracción soluble fue mayor en la mezcla 20M80A (P<0,05). La fracción lentamente y potencialmente degradable presentó diferencias significativas (P<0,05) siendo mayor en la mezcla 80M20A. La tasa de degradación de la MS (coeficiente “c”) fue superior para la mezcla 50M50A e inferior y similares en las mezclas 80M20A y 20M80A. En cuanto a la degradabilidad de la MS de la pastura de ballica, la fracción soluble “a” fue de 39,1% en promedio, en tanto que la fracción lentamente degradable “b” y la degradabilidad potencial de la MS fueron de 57,0% y 96,1% en promedio respectivamente. La tasa de degradación fue del orden de 0,064 % h-1. Los coeficientes “a” y “b” de la degradabilidad de la proteína bruta de la pastura de ballica, fueron de 57% y 11% respectivamente. La fracción potencialmente degradable fue en promedio de 71%. Por su parte la tasa de degradación fue de 0,24% h-1 en promedio. El consumo diario de materia seca no presentó diferencias significativas (P>0,05) entre tratamientos, pero si entre periodos (P<0,05) siendo mayor durante los periodos 3 y 4, lo mismo sucedió con el consumo de energía y proteína. 2 Tanto el amoniaco ruminal, plasmático y urea plasmática fueron mayores en el tratamiento sin concentrado (P<0,05), del orden de 19,83, 0,22 y 14,24 mg dL-1 respectivamente. Estos mismos parámetros presentaron diferencias significativas entre periodos (P<0,05) siendo siempre mayores en el periodo 4. La producción de urea en la orina fue de 1,05 g día-1 W-1 en promedio (P>0,05), presentando diferencias significativas entre periodos experimentales, siendo mayor en el periodo 4 (P<0,05). El peso vivo y cambio de peso vivo fueron mayores en el tratamiento 80M20A (537,8 y 1,32 Kg respectivamente), siendo significativo solo el peso vivo (P<0,05). En cuanto a la condición corporal esta no presentó diferencias significativas entre tratamientos (P>0,05). La producción de leche fue mayor en el tratamiento 50M50A (P<0,05), con un contenido graso y proteico mayor en el tratamiento sin concentrado (P<0,05). En cuanto a los periodos estos no presentaron diferencias significativas para las variables nombradas (P>0,05). La urea en leche fue mayor en el tratamiento sin concentrado (0,085 mg dL-1PV-1) (P<0,05), y durante el periodo 4 (P<0,05). Los requerimientos de energía metabolizable para producción de leche, cambio de peso vivo y requerimientos totales no presentaron diferencias significativas entre tratamientos (P>0,05), no así para los requerimientos de energía metabolizable de mantención, siendo menores para el tratamiento sin concentrado (P<0,05). La eficiencia de uso de la energía (EMm*100/EMT) fue mayor en los tratamientos 50M50A y 20M80A (P<0,05). Los requerimientos energéticos de mantención presentaron correlaciones altamente significativas con la concentración de urea en la leche (r=0,4028; P<0,001) y urea en plasma (r=0,4204; P<0,001), pero no con el amoniaco plasmático (r=0,207; P>0,05). La energía (MJ día-1) utilizada para la síntesis de urea láctea no presentó diferencias significativas (P>0,05), en promedio 0,15 MJ día-1. Al expresar dicha energía en términos de producción de leche fueron del orden de 44 g de leche diarios que, en términos porcentuales, no supera el 0,3% de la producción diaria de leche. No se encontraron efectos en los niveles productivos de las vacas atribuibles a una mayor disponibilidad de energía neta a raíz de una menor síntesis de urea por el uso de carbohidratos de distinta tasa de degradación en las dietas de las vacas.
In order to quantify the effects of including different carbohydrate sources having different degradation rates in the diet of lactating cows grazing a pasture rich in highly degradable protein on ruminal parameters, blood and milk urea and ammonia, and also to estimate the effect of supplements on the quantity of metabolizable energy spent on urea synthesis, a research was carried out, at the Oromo Experimental Station, Animal Production Department, Faculty of Agricultural Sciences. Twenty four New Zealand Holstein cows, four of them rumen fistulised were used. Twenty of them were randomly assigned to the following treatments: T1: Not supplemented; T2: 80% corn and 20% oats; T3: 50% corn plus 50% oat and T4: 20% corn plus 80% oats. Four kg animal-1day-1 was offered. Pasture was composed of annual rye grass and white clover with 23% of crude protein. The four fistulised cows were randomly assigned to the treatments in a 4 x 4 Latin square design. The dry matter degradability coefficient “a” of oat was 81% higher than corn (P<0,05). Coefficient “b” was 73% higher in corn than in oat (P<0,05). Potential degradable fraction (a+b) was 98% higher for corn (P<0,05) The constant rate of degradation “c” was higher in oats than corn (P<0,05). The mix of grain (20%C; 80%O) had a higher fraction “a” than the others mix. However the fraction “b” was significantly higher in mix 80%M; 20%C. Constant degradation rate “c” was significantly higher (P<0,05) in the mix 50%C, 50%O) and similar between the others mix. Dry matter degradability of pasture was characterized by a fraction “a” of 39,1%; a fraction “b” of 57% , a potential degradable fraction of 96,1% and a constant rate of degradation “c” of 0,064%/h . The fraction “a” and “b” of pasture crude protein was 57% and 11% respectively and the constant ”c” was 0,24% h-1. No differences were found for dry matter, protein and energy intake (P>0.05) among treatments but it was among periods (P<0.05) being higher during periods 3 and 4. Ruminal, plasma ammonia and plasma urea were higher (P<0,05) for the treatments without supplements (T1) with values of 19.3; 0,22 and 14,24 mg dL-1 respectively. All of these parameters had differences among periods being higher in period 4. Urea excreted in urine was 1,05 g day-1W-1 on average (P>0,05), being greater in period 4 (P<0,05) . Body weight and weight changes were higher in T2 (80%C; 20%O) (P<0,05) with 537,8 kg and 1,32 kg day-1 respectively. Body condition was not affected by treatments. Milk production was higher in T3 (50%C and 50%O) but fat and protein milk content was higher in T1. Urea in milk was higher in T1 with 0,085 mg dL-1 (P<0,05) and during the period 4. Metabolizable energy for milk production, weight changes and total requirements did no differ (P>0,05) among treatments, but energy requirements for maintenance was lower (P>0,05) for T1 (P<0,05) . The efficiency of energy use (EMM*100/EMT) was higher for treatments T2 and T3 (P<0,05). Maintenance energy requirements showed a highly significant correlation with urea en milk (r= 0,4028; P<0,01) and with urea in 4 plasma (0,4204; P<0,01) but not with plasma ammonia (r= 0,207; P<0,05). The energy (MJ d-1) used for milk synthesis. When this energy was expressed in terms of milk production it was 44 g, equivalent to 0,3% of energy deposited as milk. It was not possible to detect the effects of different carbohydrate sources increased the net energy availability for milk production since the synthesis of urea was diminished.

Las pérdidas causadas por podredumbres durante la post-cosecha de frutos cítricos suelen suponer entre un 5 y un 10 % de la producción, siendo Penicillium digitatum el principal hongo patógeno, responsable de hasta el 80 % de las pérdidas causadas por podredumbres en frutos almacenados a temperatura ambiente. A pesar de la importancia económica de este patógeno nuestro conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad/ virulencia son muy escasos, en contraste con el avance experimentado en los últimos años en el conocimiento de las respuestas de defensa del fruto a la infección por este patógeno. Así, en el grupo de Fisiología y Biotecnología Postcosecha del IATA se está trabajando en la caracterización a nivel bioquímico y molecular de las respuestas de los frutos cítricos frente a la infección por P. digitatum y en el proceso de inducción de resistencia en frutos cítricos frente a la infección. Por este motivo en esta Tesis se han desarrollado un conjunto de herramientas esenciales para poder abordar la caracterización funcional de genes involucrados en virulencia/patogenicidad: transformación de P. digitatum mediada por Agrobacterium tumefaciens, utilización de la proteína verde fluorescente como marcadora, metodología para la obtención de mutantes de deleción de genes específicos, incluyendo mutantes nulos ¿ku80, vectores para silenciamiento génico mediante RNAi y la construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum. Se ha secuenciado y analizado el factor de transcripción PacC, que controla la expresión de un grupo de genes regulados por el pH ambiental. En P. digitatum se produce una acidificación del medio para adaptarlo al pH óptimo de su arsenal de enzimas. Se han obtenido mutantes de expresión constitutiva de PacC que presentan una disminución la capacidad infectiva en un 20 %. Mediante el empleo de técnicas de alto rendimiento se ha construido una genoteca substractiva de cDNA para obtener fragmentos de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección de frutos de naranja y se ha analizado la expresión génica de los mismos y se ha elaborado una macromatriz conteniendo más de 1330 clones de la genoteca. El grupo de genes con mayor representación en la genoteca y con altos valores de inducción, corresponde a genes que codifican cinco proteasas diferentes. Además, en la genoteca substractiva también hay una alta representación de genes que codifican enzimas de degradación de la pared celular, y otras proteínas implicadas en glucólisis, respuesta a estrés o detoxificación. La ya demostrada importancia de las enzimas de degradación de la pared celular en la virulencia de hongos fitopatógenos, su abundancia y niveles de inducción en la macromatriz nos llevaron a estudiar más en profundidad algunos de estos genes (dos poligalacturonasas y una pectin liasa). Para comprobar su implicación en el proceso de infección se secuenciaron y se obtuvieron mutantes de P. digitatum en los que se eliminó el gen. La disminución de la virulencia de estos mutantes sobre frutos de naranja con respecto a la cepa silvestre fue de aproximadamente un 25 %. Del conjunto de genes relacionados con el metabolismo redox se seleccionó por su patrón de expresión el gen ris1, que codifica una naftaleno dioxigenasa posiblemente implicada en la detoxificación de compuestos aromáticos. A diferencia de los mutantes nulos en los genes de las poligalacturonasas o de la pectin liasa, los mutantes nulos ¿ris1 no presentaron ninguna alteración en su capacidad patogénica.
López Pérez, M. (2013). Estudio de los factores de patogenicidad/virulencia de Penicillium digitatum sobre frutos cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34176
TESIS

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014
Las modificaciones postraducción de proteínas son importantes para la regulación de la fisiología de la célula ya que contribuyen significativamente a la diversidad estructural y funcional de las proteínas. Una de estas modificaciones es la arginilación, la cual consiste en la unión covalente de un residuo de arginina en el extremo NH2 de proteínas aceptoras, específicamente sobre ácido aspártico, ácido glutámico, o cisteína. Esta reacción es catalizada por la enzima arginil-ARNt transferasa (Ate1) tanto en el citosol como en el núcleo celular. En nuestro laboratorio se ha establecido previamente que calreticulina (CRT), una proteína mayoritariamente residente del retículo endoplásmico (RE), se retrotransloca al citoplasma donde es uno de los sustratos de la arginilación. Además, se demostró que en condiciones de estrés que conducen a una disminución de los niveles intracelulares de Ca2+, CRT arginilada (R-CRT) se asocia a gránulos de estrés (GSs) que son complejos de ARNm y cuya función se correlaciona con una reducción selectiva de la traducción proteica. En el presente trabajo se describe la función de la arginilación de CRT en relación a la tasa de recambio ("turnover") de CRT citoplasmática, la cual modularía la estabilidad de la proteína. Además, se establece la vía de degradación de R-CRT en relación al rol que desempeña la arginilación. En este estudio se demuestra que tanto R-CRT como CRT se degradan por la vía proteosomal, aunque R-CRT tiene menor susceptibilidad que CRT a ser degradada por el proteosoma. Se determinó que la vida media de R-CRT es el doble que la de CRT citoplasmática sin arginilar. Cuando se sobre expresaron ambas proteínas en células knockout para la enzima Ate1 (células ATE1–/–), se confirmó que R-CRT es degradada de manera menos eficaz que CRT por el proteosoma. También, se encontró que CRT es degradada por una vía independiente de ubiquitina (Ub), mientras que la degradación de R-CRT es vía dependiente de Ub. En nuestro laboratorio recientemente se demostró que la arginilación de CRT promueve un alto grado de dimerización. En este sentido, la sobre expresión de una mutante de CRT (C146A-CRT-EGFP) que impide la formación de homodímeros, muestra niveles menores de R-CRT respecto de los encontrados cuando se sobre expresa CRT de tipo salvaje (wt), indicando que la dimerización de RCRT es en parte responsable de su estabilización. Por último, se encontró que tanto la expresión citoplasmática de R-CRT como la inhibición del proteosoma incrementan los niveles de R-CRT en la superficie celular. En su conjunto, estos resultados indican que una vez que CRT alcanza el citoplasma, la misma puede ser degradada por el proteosoma a través de una vía independiente de Ub o puede ser modificada por la enzima Ate1 formando R-CRT, la cual también es susceptible a la degradación proteosomal pero por vía dependiente de Ub, mostrando una vida media más larga que la CRT no modificada. Por otra parte, la estabilización de CRT por medio de su arginilación y dimerización, le permitiría a CRT participar en diferentes funciones en el citoplasma e incluso en otros compartimientos subcelulares a los que podría acceder desde el citoplasma.
Fil: Goitea, Víctor Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Hallak, Marta Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Hallak, Marta Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Alvarez, Cecilia Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Pérez, Mariela Fernanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina.
Fil: Pérez, Mariela Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.
Fil: Maccioni, Hugo José. Fernando Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Maccioni, Hugo José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Rossi, Mario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Trasnacional; Argentina.

Este trabajo de tesis pretende profundizar el conocimiento de las vacuolas asociadas a la senescencia (VAS) a través de tres temáticas: - el desarrollo, entendido como la variación temporal de las VAS, su biogénesis y el efecto de moduladores de la senescencia; - la caracterización de la actividad biológica de las VAS participando en el desmantelamiento del aparato fotosintético; - y la relación entre el mecanismo de autofagia y el desarrollo de las VAS. En general, para abordar estos objetos de estudios se empleó un sistema sencillo y frecuentemente empleado en trabajos sobre senescencia foliar. El modelo de senescencia inducida permite trabajar en un sistema relativamente homogéneo y reproducible. Consiste en separar las hojas de la planta, tratarlas con un precursor de la hormona etileno, denominado etefón, y almacenarlas en oscuridad. De esta manera, la senescencia es inducida por el corte y la oscuridad, y sincronizada a nivel tisular por el tratamiento hormonal.