Thèses sur le sujet « P2X7- Rezeptor »

P2X-Rezeptoren treten aufgrund ihrer Präsenz in verschiedensten Organsystemen des menschlichen Körpers zunehmend in den Mittelpunkt zahlreicher Forschungsansätze. Besonderes Interesse gilt dabei u.a. den P2X2/3-Rezeptoren, da in ihnen ein neuer Angriffspunkt für die Entwicklung von Schmerztherapeutika gesehen wird. Trotz enormer Fortschritte in diesem Bereich, bleiben die Vorgänge und strukturellen Gegebenheiten, die zur Öffnung der Ionenkanäle führen, weiterhin spekulativ. In der vorliegenden Arbeit wurden mithilfe einer Mutagenese einzelne Aminosäuren des hP2X2-Rezeptors, welche sich in geringer Entfernung zueinander zwischen zwei Untereinheiten befanden, durch Cysteine substituiert. Die Auswahl der Aminosäuren erfolgte dabei anhand eines Homologiemodells des hP2X2-Rezeptors und des Aminosäureabgleichs zwischen den hP2X2- und hP2X3-Rezeptoren. Auf diese Weise sollte deren Interaktion über eine mögliche Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Untereinheiten untersucht werden. Die Rezeptorfunktion wurde anschließend mittels der whole-cell patch-clamp-Technik charakterisiert. Der Rezeptor reagierte bei allen untersuchten Varianten mit einem Funktionsverlust, ein spontan öffnender Kanal konnte somit nicht generiert werden. Durch die Kombination der verschiedenen hP2X2-Rezeptor-Cysteinmutanten mit einer hP2X3-Rezeptor-Cysteindoppelmutante, konnte gezeigt werden, dass sich die verschiedenen Untereinheiten im heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptor nicht soweit annähern, dass eine Disulfidbrücken-Bildung zwischen den Untereinheiten möglich wird. Es konnte allerdings verdeutlicht werden, dass für die Aktivierung des heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptors zwei funktionelle Bindungsstellen zur Kanalaktivierung ausreichen.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

P2X7-Rezeptoren stellen Schlüsselmoleküle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung proinflammatorischer Zustände, chronischer Schmerzen sowie der neuroglialen Kommunikation dar. Ihre Aktivität wird durch eine Vielzahl zellbiologischer Mechanismen beeinflusst. Dazu gehört die allosterische Modulation durch extrazelluläre niedermolekulare Stoffe. Die Entwicklung selektiver und potenter P2X7-Modulatoren ist darum Gegenstand intensiver Forschung. Bisher sind jedoch keine Pharmaka für die klinische Anwendung verfügbar. Die Untersuchung zugelassener pharmakologischer Substanzen in einem akademischen Screening erbrachte eine hohe Trefferrate für P2X7-Rezeptoren. In dieser Arbeit wird die P2X7-Wirkung einiger der potentesten allosterischen Modulatoren genauer charakterisiert. Das Antihistaminikum Clemastin stellt dabei einen positiven allosterischen Modulator dar, der den Rezeptor gegenüber niedrigeren ATP-Konzentrationen sensibilisiert. Ivermectin, ein häufig angewendetes Anthelminthikum, konnte als potenzierender Modulator des humanen P2X7-Rezeptors charakterisiert werden. Mit den Phenothiazinen Prochlorperazin und Trifluoperazin zeigen sich schließlich ZNS-gängige Inhibitoren der ATP-induzierten P2X7-Aktivität, die für weiterführende in vivo-Untersuchungen hilfreiche pharmakologische Werkzeuge darstellen können.

Neurodegenerative Erkrankungen sind wegen steigender Prävalenz ein zunehmendes Problem in Industrieländern. In diversen Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen neurodegenerativen Vorgängen und purinerger Signalübertragung aufgezeigt. Insbesondere die Rezeptoruntereinheit P2X7R ist durch seine apoptotische Wirkung bei verschiedenen Krankheiten involviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die funktionelle Präsenz des P2X7R an neuralen Progenitorzellen untersucht, die von der Subventrikularzone (SVZ) der Maus isoliert wurden. Mittels Calcium-Imaging wurde die intrazelluläre Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) erfasst. Der P2X7R-Agonist BzATP führte in einem Mg2+-freiem Milieu zu einer deutlichen [Ca2+]i-Steigerung. Selektive (A438079, BBG) und unselektive (PPADS) Antagonisten des P2X7R sowie unterschiedliche Kationen (Zn2+, H+) inhibierten den agonistischen [Ca2+]i-Anstieg. Desweiteren bewirkte Ivermectin (IVM), ein allosterischer Modulator sowohl von P2X4R als auch von P2X7R, eine signifikante Wirksteigerung des niedrigdosierten BzATP. Dieser Effekt war an Progenitorzellen, welche P2X7R-defizienten (P2X7-/-R) Mäusen entnommen waren, nicht nachzuweisen. Weitere purinerge Antagonisten (NF449, TNP-ATP) hatten keine signifikante Wirkung an den Zellen der Wildtyp-Maus. Ebenso war der P2X1-3R-Agonist α,β-meATP wirkungslos. Ein extrazelluläres Ca2+- freies Milieu wurde zur Untersuchung der Zellen auf P2Y-R genutzt und führte zum fast vollständigen Verschwinden des agonistischen Effektes an den murinen Zellen. Allerdings zeigten P2X7-/-R-Zellen nach Entfernen von Ca2+ aus der extrazellulären Flüssigkeit eine deutliche Wirkung von BzATP, welches auf Aktivität von P2Y-R hindeutet. Zusammenfassend konnte somit durch Applikation von Agonisten, Antagonisten und Modulatoren eine Aktivität des P2X7R an den murinen Progenitorzellen der SVZ gezeigt werden, welcher möglicherweise zur Regulation der Zellproliferation beiträgt. Weitere purinerge Rezeptoren (P2X1-4R, P2Y-R) waren an den Vorläuferzellen der Wildtyp-Maus nicht sicher nachweisbar, während an murinen P2X7R-/--Zellen Aktivität von P2Y-R zu erkennen war.

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.

Purinerge P2X3-Rezeptoren spielen eine bedeutende Rolle in der Vermittlung chronischer Schmerzen, welche ein führendes Problem des Gesundheitswesens mit vielen sozioökonomischen Konsequenzen darstellen. Die Tatsache, dass P2X3-Rezeptoren fast ausschließlich von nozizeptiven Neuronen exprimiert werden, macht sie trotz ihres besonderen Desensitisierungsverhaltens zu vielversprechenden Angriffspunkten zukünftiger Schmerztherapien, beispielsweise mithilfe kompetitiver Antagonisten an diesen Rezeptoren. Zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Agonist und kompetitivem Antagonist wird meist der Schild-Plot benutzt. Jedoch ist dieser im Falle der sehr schnell desensitisierenden P2X3-Rezeptoren ungeeignet, da die Vorbedingung eines stabilen Gleichgewichts zwischen Agonist und Antagonist aufgrund der Desensitisierung nicht erfüllt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Methode zur Analyse der Interaktion kompetitiver Antagonisten mit ihrer Bindungsstelle am Beispiel des P2X3-Rezeptors zu entwickeln und so für die Antagonistenbindung bedeutende Aminosäuren der Bindungsstelle zu identifizieren. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden die Effekte der Antagonisten A-317491, TNP-ATP und PPADS auf die vom P2X1,3-Rezeptor-selektiven Agonisten α,β-MeATP induzierten Ströme am P2X3-Wildtyp-Rezeptor und an fünf Rezeptormutanten mit veränderter Ligandenbindungsstelle untersucht. Alle Rezeptoren wurden in HEK293-Zellen exprimiert. Anhand der gemessenen Daten wurde ein Hidden Markov Model (HMM) erstellt, welches die sequentiellen Übergänge des Rezeptors von geschlossen zu offen und desensitisiert in An- und Abwesenheit des Antagonisten miteinander kombiniert. Die am P2X3-Rezeptor induzierten Ströme konnten mithilfe dieses Modells korrekt gefittet und die für die Antagonistenbindung wichtigen Aminosäuren innerhalb der Bindungsstelle bestimmt werden. Als Resultat dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das HMM eine geeignete Methode zur Analyse der Wirkung kompetitiver Antagonisten an schnell desensitisierenden Rezeptoren darstellt. Die untersuchten Antagonisten A-317491 und TNP-ATP haben einen kompetitiven Wirkmechanismus, während PPADS eine pseudoirreversible Blockade verursacht.

Für die Ätiopathogenese der Atherosklerose spielen eine Vielzahl von Mediatoren eine Rolle. Dabei werden durch das Endothel sowohl protektive als auch schädliche Mediatoren sezerniert. High Density Lipoproteine (HDL) stellen einen bedeutenden protektiven Marker für das kardiovaskuläre Risiko dar, u.a. durch die Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS). HDL besteht zu 50 % aus Proteinen und zu 50 % aus Lipiden. Welche Komponenten des HDL für die eNOS Aktivierung verantwortlich sind, ist nicht bekannt gewesen. Im ersten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die Lysophospholipide, Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Sphinsosylphosphorylcholin (SPC), die strukturelle Bestandteile der Lipidfraktion von HDL darstellen, für einen Teil der HDL induzierten eNOS Aktivierung durch Stimulation des S1P3-Rezeptors verantwortlich sind. Diese eNOS Aktivierung wird durch den intrazellulären Einstrom von Calcium und durch die Aktivierung der Akt-Kinase induziert. Im zweiten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte nachgewiesen werden, dass das oral verfügbare Lysophospholipid-basierte Medikament, FTY720, das ein strukturelles Analogon des S1P ist, den HDL induzierten Signaltransduktionsweg der eNOS Aktivierung in gleicher Weise induziert. Im dritten Abschnitt dieser Promotionsarbeit konnte ein neuartiges endothelabhängig sezerniertes gemischtes Dinukleosidpolyphosphat, Uridin-Adenosin-Tetraphosphat (Up4A), identifiziert werden. Up4A ist ein Agonist an den P2X- und P2Y-Purinrezeptoren. Up4A induziert bei Applikation in eine isoliert perfundierte Rattenniere hauptsächlich über die Aktivierung des P2X1-Rezeptors und des P2Y2/P2Y4-Rezeptors eine starke Vasokonstriktion im renalen Perfusionsgebiet mit einhergehender Erhöhung des mittleren renalen Perfusionsdrucks. Die direkte Infusion von Up4A in vivo in eine WKY-Ratte führt zu einer signifikanten Erhöhung des mittleren arteriellen Blutdrucks.
In the pathogenesis of atherosclerosis many mediators are included. Therefore the endothelium plays a crucial part by secreting protective but also deleterious factors. High density lipoproteins are an established protective factor in the risk profile of cardiovascular events especially by activating the endothelial NO synthase (eNOS). HDL is composed of 50 % proteins and 50 % lipids. Which component of HDL is responsible for the eNOS activation was not known. In the first part of this dissertation it could be shown, that the lysophospholipids, sphingosine-1-phosphate (S1P) and sphingosylphosphorylcholine (SPC), which are structural compounds of the lipid fraction of HDL, are responsible for a significant part of the HDL induced eNOS activation by stimulating the specific S1P3 receptor. In the signal transduction mechanism the activation of Akt kinase and an influx of calcium is involved. In the second part of this dissertation it could be shown, that the orally active lysophospholipide based drug FTY720, which is a structural analogue of S1P, is able to induce the same signal transduction mechanism activated by HDL including the stimulation of the S1P3 receptor. In the last part of this dissertation a new endothelium dependent vasoconstrictor, the dinucleoside polyphosphate uridine-adenosine-tetraphosphate (Up4A), could be for the first time identified. Up4A is a potent agonist of the P2X- and P2Y-purinoceptors. Via activating the P2X1 receptor and the P2Y2/P2Y4 receptor Up4A induce a strong vasoconstriction in the renal perfusion system in the model of the isolated perfused rat kidney with an adjacent increase of the mean perfusion pressure. By injection of Up4A in vivo in a Wistar Kyoto rat the mean arterial pressure also increase significantly.

Adulte Neurogenese steht im fokus der Neurowissenschaften. Die Neurogenese im Hippokampus spielt eine wichtige Rolle nach verschiedenen pathophysiologischen Ereignissen, z.B. nach epileptischen Anfällen. ATP ist ein wichtiger extrazellulärer Botenstoff, der auch im Gehirn verschiedene Prozesse beinflusst. Es wurden funktionelle P2X7- und P2Y1-Rezeptore an den Vorläuferzellen nachgewiesen. Unsere Hypothese lautet: nach einen epileptischen Anfall kommt es zur massiven Ausströmung von ATP, welches durch P2Y1-Rezeptore die Neurogenese fördert. Dieser Prozess wird durch die Aktivierung der P2X7-Rezeptoren entegegengesteuert, indem der Zelltod der neuen Zellen eingeleitet wird.

P2X7-Rezeptoren stellen Schlüsselmoleküle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung proinflammatorischer Zustände, chronischer Schmerzen sowie der neuroglialen Kommunikation dar. Ihre Aktivität wird durch eine Vielzahl zellbiologischer Mechanismen beeinflusst. Dazu gehört die allosterische Modulation durch extrazelluläre niedermolekulare Stoffe. Die Entwicklung selektiver und potenter P2X7-Modulatoren ist darum Gegenstand intensiver Forschung. Bisher sind jedoch keine Pharmaka für die klinische Anwendung verfügbar. Die Untersuchung zugelassener pharmakologischer Substanzen in einem akademischen Screening erbrachte eine hohe Trefferrate für P2X7-Rezeptoren. In dieser Arbeit wird die P2X7-Wirkung einiger der potentesten allosterischen Modulatoren genauer charakterisiert. Das Antihistaminikum Clemastin stellt dabei einen positiven allosterischen Modulator dar, der den Rezeptor gegenüber niedrigeren ATP-Konzentrationen sensibilisiert. Ivermectin, ein häufig angewendetes Anthelminthikum, konnte als potenzierender Modulator des humanen P2X7-Rezeptors charakterisiert werden. Mit den Phenothiazinen Prochlorperazin und Trifluoperazin zeigen sich schließlich ZNS-gängige Inhibitoren der ATP-induzierten P2X7-Aktivität, die für weiterführende in vivo-Untersuchungen hilfreiche pharmakologische Werkzeuge darstellen können.:1. Bibliographische Beschreibung 4 2. Abkürzungsverzeichnis 5 3. Einleitung 6 Überblick über die purinerge Signalübertragung 6 Pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptors 8 Speziesspezifische Eigenschaften des P2X7-Rezeptors 10 P2X7-Rezeptoren in der Pharmakotherapie 10 Rationale der Studie 11 Clemastin 12 Ivermectin 12 Die Neuroleptika Prochlorperazin und Trifluoperazin 13 4. Publikationen 15 5. Zusammenfassung der Arbeit 64 6. Literaturverzeichnis 68 7. Anlagen 74 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 74 Lebenslauf 75 Danksagung 76

Heteromere P2X2/3-Rezeptoren befinden sich neben homomeren P2X3-Rezeptoren an peripheren und zentralen Endigungen von nozizeptiven Spinalganglienneuronen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von akuten und chronischen Schmerzen, die im Rahmen von Verletzungen, Entzündungen, Tumorerkrankungen und Neuropathien auftreten. Bislang ging man davon aus, dass P2X2/3-Rezeptoren eine festgelegte Untereinheitenstöchiometrie von (P2X2)1/(P2X3)2 aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wird an transient mit der cDNA von hP2X2 und hP2X3 transfizierten HEK293-Zellen untersucht, inwiefern sich heteromere P2X2/3-Rezeptoren in Abhängigkeit vom gewählten Transfektionsverhältnis P2X2/P2X3-1:2 und -4:1 in Bezug auf ihre pharmakologischen Eigenschaften funktionell unterscheiden und somit wahrscheinlich auch in einer alternativen Untereinheitenstöchiometrie von (P2X2)2/(P2X3)1 vorkommen. Die Ergebnisse der durchgeführten Ca2+-Imaging-Experimente legen die Schlussfolgerung nahe, dass bei P2X2/3-Rezeptoren abhängig vom jeweiligen Expressionslevel der beteiligten P2X-Subtypen beide Untereinheitenstöchiometrien 1:2 und 2:1 existieren, dass sie sich aber in ihren funktionellen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterscheiden. Diese Erkenntnisse tragen zur Vervollständigung des Wissens über P2X2/3-Rezeptoren bei, die ein potenzielles Target für die Entwicklung neuer, analgetisch wirksamer Arzneimittel darstellen.:I Bibliographische Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.1 Das purinerge Signalsystem (engl. purinergic signalling) . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.2 Purinerge Rezeptoren als pharmakologisches Target . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 6 1.3 P2X-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3.1 Aufbau einer P2X-Untereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3.2 3D-Struktur, ATP-Bindung und Kanalöffnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.3 Desensitisierung und allosterische Modulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.3.4 Homo- und Heterotrimere . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3.5 ATP-Bindungsstellen in Heteromeren und Untereinheitenstöchiometrie . . .12 1.4 Der P2X2/3-Rezeptor und seine Rolle im nozizeptiven System . . . . . .. . . . . 13 1.5 Pharmakologische Eigenschaften von P2X2, P2X3 und P2X2/3 . . . . . . . . . . 15 1.6 Das Ziel meiner Arbeit . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2 Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1 Zellkultur . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.1 HEK293-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.3 Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.1.4 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2 Ca2+-Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.2.1 Fura-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3 Datengewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.1 Arbeitsplatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.2 Ablauf eines Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4 Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3 Ergebnisse . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.1 Nomenklatur zur Untereinheitenstöchiometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.2 Versuchskomplex I: Experimente mit hP2X2- und hP2X3-Mutanten . . . . . . . 27 3.2.1 Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Wildtyp-Rezeptorvarianten . . . . . . 28 3.2.2 Inaktivität der verwendeten Mutanten in homomeren Konstellationen . . . . 30 3.2.2.1 P2X2-Mutanten K69A und K307A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.2.2 P2X3-Mutanten K63A und K299A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.3 Mutationen im NBS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.4 Mutationen im NBS4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts34 3.3.1 Applikation von αβ-meATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.3.2 Applikation von 2-MeSATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.4 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 mit αβ-meATP . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.1 Nullhypothese und Arbeitshypothese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2 Transfektionsverhältnis und resultierende Untereinheitenstöchiometrie .. . . 40 4.3 Versuchskomplex I: Experimente mit inaktiven hP2X2- und hP2X3-Mutanten 40 4.4 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts43 4.4.1 Vergleich mit den Ergebnissen der Patch-Clamp-Methode . . . . . . . . . . 44 4.4.2 Pathophysiologischer Aspekt von saurem pH in der extrazellulären Matrix 45 4.5 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 . . . . 45 4.6 Zusammenfassung und Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 47 5 Ergänzende Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 6 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 7 Abbildungsverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 8 Tabellenverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 55 9 Zubehör . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 10 Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 II Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 III Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 IV Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

Neurodegenerative Erkrankungen sind wegen steigender Prävalenz ein zunehmendes Problem in Industrieländern. In diversen Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen neurodegenerativen Vorgängen und purinerger Signalübertragung aufgezeigt. Insbesondere die Rezeptoruntereinheit P2X7R ist durch seine apoptotische Wirkung bei verschiedenen Krankheiten involviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die funktionelle Präsenz des P2X7R an neuralen Progenitorzellen untersucht, die von der Subventrikularzone (SVZ) der Maus isoliert wurden. Mittels Calcium-Imaging wurde die intrazelluläre Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) erfasst. Der P2X7R-Agonist BzATP führte in einem Mg2+-freiem Milieu zu einer deutlichen [Ca2+]i-Steigerung. Selektive (A438079, BBG) und unselektive (PPADS) Antagonisten des P2X7R sowie unterschiedliche Kationen (Zn2+, H+) inhibierten den agonistischen [Ca2+]i-Anstieg. Desweiteren bewirkte Ivermectin (IVM), ein allosterischer Modulator sowohl von P2X4R als auch von P2X7R, eine signifikante Wirksteigerung des niedrigdosierten BzATP. Dieser Effekt war an Progenitorzellen, welche P2X7R-defizienten (P2X7-/-R) Mäusen entnommen waren, nicht nachzuweisen. Weitere purinerge Antagonisten (NF449, TNP-ATP) hatten keine signifikante Wirkung an den Zellen der Wildtyp-Maus. Ebenso war der P2X1-3R-Agonist α,β-meATP wirkungslos. Ein extrazelluläres Ca2+- freies Milieu wurde zur Untersuchung der Zellen auf P2Y-R genutzt und führte zum fast vollständigen Verschwinden des agonistischen Effektes an den murinen Zellen. Allerdings zeigten P2X7-/-R-Zellen nach Entfernen von Ca2+ aus der extrazellulären Flüssigkeit eine deutliche Wirkung von BzATP, welches auf Aktivität von P2Y-R hindeutet. Zusammenfassend konnte somit durch Applikation von Agonisten, Antagonisten und Modulatoren eine Aktivität des P2X7R an den murinen Progenitorzellen der SVZ gezeigt werden, welcher möglicherweise zur Regulation der Zellproliferation beiträgt. Weitere purinerge Rezeptoren (P2X1-4R, P2Y-R) waren an den Vorläuferzellen der Wildtyp-Maus nicht sicher nachweisbar, während an murinen P2X7R-/--Zellen Aktivität von P2Y-R zu erkennen war.

Der ATP-getriggerte Ionenkanal P2X7 ist als purinerger Oberflächenrezeptor besonders auf Zellen des Immunsystems und auf Gliazellen im Nervensystem exprimiert. Seine Aktivierung führt zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie zu einer Beeinflussung des Zellzyklus. Zwar konnte eine Beteiligung des Rezeptors an verschiedenen entzündlichen und degenerativen Erkrankungen nachgewiesen werden, allerdings bestehen nach wie vor viele Unstimmigkeiten darüber, ob P2X7 im Einzelfall protektiv oder schadend wirkt. Eine therapeutische Modulation des Rezeptors gestaltet sich daher bis heute schwierig. Weiterhin wurde trotz intensiver Bemühungen um selektive, potente P2X7-Modulatoren bisher kein Wirkstoff über Phase-II-Studien hinaus entwickelt. Der erste Teil der Arbeit beschreibt eine Studie zur Identifikation neuer P2X7-Modulatoren und deren Charakterisierung hinsichtlich Potenz, Bindeverhalten und Speziesspezifität. Ziel dieser Studie war es, die Basis für die Entwicklung möglicher neuer Therapeutika zu legen, für die ein hoher Bedarf besteht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung des P2X7-Rezeptors an den pathophysiologischen Vorgängen nach einem Hirninfarkt untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag dabei auf dem Einfluss, den der Rezeptor auf die Bildung eines begleitenden, oftmals fatalen Hirnödems ausübt. In einer Wirkstoffbibliothek enthaltene zugelassene Pharmaka und Naturstoffe wurden auf ihre Wirksamkeit am rekombinant exprimierten humanen P2X7-Rezeptor (hP2X7) getestet. Dazu wurde gemessen, inwiefern diese Wirkstoffe den P2X7-vermittelten Ca2+-Einstrom modulieren können. Für potenziell selektive Substanzen wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt. Für den potenten Inhibitor Tanshinon II A-Sulfonat (TIIAS) und den chemisch verwandten Wirkstoff Tanshinon II A (TIIA) erfolgte diese Untersuchung auch an den rekombinant exprimierten P2X7-Rezeptoren von Maus (mP2X7) und Ratte (rP2X7). Weiterhin erfolgte eine detaillierte, auf elektrophysiologischen Untersuchungen basierende Darstellung der pharmakodynamischen Eigenschaften von TIIAS. Die Selektivität der Wirkung gegenüber P2X2 und P2X4 wurde mithilfe entsprechender Zelllinien geprüft. Die Wirkung modulierender Pharmaka am nativen Rezeptor wurde in humanen, aus peripheren Blutmonozyten gereiften Makrophagen überprüft, wozu neben der Darstellung des Ca2+-Einstroms auch ein IL-1β-ELISA eingesetzt wurde. In allen Experimenten wurde die Beteiligung von P2X7 über bekannte Antagonisten verifiziert. Um zu klären, inwiefern P2X7 die pathophysiologischen Abläufe nach Hirninfarkt beeinflusst, wurde bei 20 P2X7-defizienten Mäusen (P2X7-/-) und bei 22 zugehörigen Wildtyp-Mäusen (WT) eine zerebrale Ischämie induziert, indem die mittlere Zerebralarterie mit einem dünnen Faden für 60 Minuten transient verschlossen wurde (middle cerebral artery occlusion, MCAO). In den folgenden 72 Stunden wurde über klinische Methoden und Magnetresonanzuntersuchungen die Entwicklung neurologischer Defizite, der Infarktgröße und des begleitenden Hirnödems evaluiert. Nach schmerzloser Tötung und Hirnentnahme wurden immunhistologisch die Aktivierung und Verteilung von Mikroglia und Astrozyten sowie der Zustand des Gefäßendothels untersucht. Sham-operierte Tiere dienten in allen Experimenten als Kontrollen. TIIAS hemmte hP2X7 mit einer IC50 von 4.3 μM, während die Potenz an mP2X7 geringer war und rP2X7 kaum geblockt wurde. TIIA modulierte P2X7 nicht. TIIAS hemmte als allosterischer Antagonist die Öffnung des Ionenkanals und band vermutlich an eine intrazelluläre Bindestelle. Die Wirkung von TIIAS wurde in humanen Makrophagen bestätigt, in denen der Wirkstoff den Ioneneinstrom und die IL-1β-Freisetzung hemmte. Obwohl die neurologische Untersuchung von P2X7-/-- und WT-Mäusen nach MCAO keine signifikanten Unterschiede ergab, zeigte sich in der bildgebenden Diagnostik, dass P2X7-/--Mäuse binnen 24 Stunden nach der OP ein signifikant stärkeres Hirnödem entwickelten, welches nicht durch Unterschiede in der Infarktgröße bedingt war. Der Infarkt führte in beiden Gruppen zu einer Gliaaktivierung, die im Fall der Mikroglia in Abwesenheit von P2X7 allerdings reduziert war. Differenzen hinsichtlich der Aktivierung von Astrozyten und der Expression von Laminin im Kapillarendothel wurden nicht festgestellt. Im Gegensatz zu TIIA, das häufig als gleichwertiger Wirkstoff eingesetzt wird, blockt TIIAS hP2X7 speziesspezifisch mit einer hohen Potenz. Maus und Ratte scheiden aufgrund der geringen Wirkung von TIIAS leider als Tiermodelle aus, um die Wirkung von TIIAS in vivo zu prüfen. Weitere Arbeiten sind notwendig, um die Potenz von TIIAS in anderen Spezies zu evaluieren oder Alternativen zum Tierversuch zu finden und eine mögliche therapeutische Anwendung bei Erkrankungen mit P2X7-Beteiligung zu testen. P2X7 beeinflusst die pathophysiologischen Vorgänge nach einem Hirninfarkt und begrenzt die Entwicklung eines zytotoxischen Hirnödems, nicht aber die des vasogenen Hirnödems, das sich zeitversetzt einstellt. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt bieten die unterschiedlichen Funktionen, die Gliazellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie übernehmen. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass verschiedene Tiermodelle des zerebralen Infarkts nicht in allen Punkten vergleichbar sind.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66
ATP-gated ion channel P2X7 is a purinergic cell surface receptor which is mainly expressed on immune and glia cell. Upon activation of P2X7, proinflammatory cytokines are released, reactive oxygen species are generated and the cell cycle may be altered. In this regard, it has been shown that P2X7 plays a role in diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease and multiple sclerosis. However, results regarding protective or detrimental effects mediated by P2X7 under particular conditions are often inconsistent. Thus, up to now, any therapeutic modulation of the receptor remains a challenge. Although intensive research has been conducted to find selective, potent P2X7-modulators, no active compound has been developed beyond phase II clinical trials. The first part of this work describes a study realized to identify new P2X7 modulators and to characterize them in terms of pharmacodynamic properties like potency and species specificity. This study was aimed at providing a basis for the development of new therapeutic agents, which are urgently needed. During the second part of this work, the involvement of P2X7 in pathophysiological processes after cerebral infarction was examined. Particular attention was paid to the influence of the receptor on the development of an accompanying and often fatal brain edema. A compound library containing approved drugs and natural compounds was screened for modulators of the recombinantly expressed human P2X7 receptor (hP2X7). Therefor, their effect on P2X7-mediated Ca2+ influx was evaluated. Concentration-response-curves were established for potentially selective compounds. Tanshinone II A sulfonate (TIIAS) turned out to be a potent inhibitor of P2X7. Both TIIAS and tanshinone II A (TIIA), the natural compound TIIAS has been derived from, were also tested on recombinantly expressed mouse and rat P2X7 (mP2X7 and rP2X7, respectively). Furthermore, electrophysiological assays were conducted for a detailed characterization of mechanisms of P2X7 inhibition. Antagonist selectivity was revised using cell lines expressing purinergic receptors P2X2 and P2X4. Human monocyte-derived macrophages were used in fluorometric calcium and dye-uptake assays as well as an IL-1ß ELISA to evaluate the effects of modulating compounds on native P2X7. In all experiments, involvement of P2X7 was verified using established P2X7 antagonists. In order to evaluate whether modulation of P2X7 may affect the outcome after cerebral infarction, cerebral ischemia was induced in 20 P2X7-deficient mice (P2X7-/-) and 22 mice of their corresponding wild type (WT) by transiently occluding their middle cerebral artery for 60 minutes with a thin filament (middle cerebral artery occlusion, MCAO). During 72 hours following surgery, neurological deficits, infarct size and edema development were monitored, applying clinical examinations and magnetic resonance measurements. After humane killing and brain removal, different antibodies were used in order to evaluate the distribution and activation state of microglia and astrocytes as well as the condition of the vascular endothelium. Sham-operated animals were used as negative controls in all experiments. TIIAS blocked hP2X7 with an IC50 of 4.3 μM, whereas it proved to be less potent at mP2X7 and poorly modulated rP2X7. TIIA did not modulate P2X7. TIIAS acted as an allosteric antagonist and reduced the opening of the ion channel; it presumably bound to an intracellular binding site. The effect of TIIAS could be confirmed in human macrophages. In these cells, TIIAS inhibited the ATP-induced Ca2+ entry, dye-uptake and release of IL-1β. Although neurological examinations did not reveal significant differences between P2X7-/- and WT mice that underwent MCAO, diagnostic imaging revealed that P2X7-/- mice developed significantly more severe brain edema within 24 hours after surgery, a development that was not due to differences in infarct sizes. Both groups displayed clear signs of activation of glia cells, but only microglia activation was attenuated in the absence of P2X7. Differences regarding the activation state of astrocytes or the expression of laminin by capillary endothelial cells could not be detected. TIIAS species specifically blocks hP2X7 with a high potency. TIIA does not convey this effect although both compounds are frequently used interchangeably. Due to the low potency TIIAS displays at mP2X7 and rP2X7, these species unfortunately cannot be used as animal models to evaluate the drug’s effect in vivo. Further research is necessary to evaluate the potency of TIIAS at other species’ P2X7 receptors or to find alternativespurinerge Signaltransduktion, P2X7, Tanshinon II A-Sulfonat, zerebrale Ischämie, Hirnödem to animal testing in order to study possible therapeutic applications of TIIAS in P2X7-related diseases. P2X7 does affect pathophysiological events following cerebral ischemia and restricts cytotoxic brain edema development, but does not limit vasogenic cerebral edema formation, which develops at a later stage of the disease. The different functions fulfilled by glia cells at distinct points in time after infarction may provide an explanation for this interesting fact. The results presented also imply that diverse animal models of cerebral ischemia may not be entirely comparable due to differences regarding the pathogenesis of brain edema.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66

Purinerge P2X3-Rezeptoren spielen eine bedeutende Rolle in der Vermittlung chronischer Schmerzen, welche ein führendes Problem des Gesundheitswesens mit vielen sozioökonomischen Konsequenzen darstellen. Die Tatsache, dass P2X3-Rezeptoren fast ausschließlich von nozizeptiven Neuronen exprimiert werden, macht sie trotz ihres besonderen Desensitisierungsverhaltens zu vielversprechenden Angriffspunkten zukünftiger Schmerztherapien, beispielsweise mithilfe kompetitiver Antagonisten an diesen Rezeptoren. Zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Agonist und kompetitivem Antagonist wird meist der Schild-Plot benutzt. Jedoch ist dieser im Falle der sehr schnell desensitisierenden P2X3-Rezeptoren ungeeignet, da die Vorbedingung eines stabilen Gleichgewichts zwischen Agonist und Antagonist aufgrund der Desensitisierung nicht erfüllt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Methode zur Analyse der Interaktion kompetitiver Antagonisten mit ihrer Bindungsstelle am Beispiel des P2X3-Rezeptors zu entwickeln und so für die Antagonistenbindung bedeutende Aminosäuren der Bindungsstelle zu identifizieren. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden die Effekte der Antagonisten A-317491, TNP-ATP und PPADS auf die vom P2X1,3-Rezeptor-selektiven Agonisten α,β-MeATP induzierten Ströme am P2X3-Wildtyp-Rezeptor und an fünf Rezeptormutanten mit veränderter Ligandenbindungsstelle untersucht. Alle Rezeptoren wurden in HEK293-Zellen exprimiert. Anhand der gemessenen Daten wurde ein Hidden Markov Model (HMM) erstellt, welches die sequentiellen Übergänge des Rezeptors von geschlossen zu offen und desensitisiert in An- und Abwesenheit des Antagonisten miteinander kombiniert. Die am P2X3-Rezeptor induzierten Ströme konnten mithilfe dieses Modells korrekt gefittet und die für die Antagonistenbindung wichtigen Aminosäuren innerhalb der Bindungsstelle bestimmt werden. Als Resultat dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das HMM eine geeignete Methode zur Analyse der Wirkung kompetitiver Antagonisten an schnell desensitisierenden Rezeptoren darstellt. Die untersuchten Antagonisten A-317491 und TNP-ATP haben einen kompetitiven Wirkmechanismus, während PPADS eine pseudoirreversible Blockade verursacht.

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.:Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite Abkürzungen …………………………………………………………………………………. 5 1. Einführung in die Thematik.......................................................................... 7 1.1. Freisetzung von Nukleotiden und ihre Metabolisierung im Extrazellulärraum …7………………………………… 1.2. P2X-Rezeptoren…………………………………………………………………….. 9 1.3. P2Y-Rezeptoren……………………………………………………………………. 12 1.4. P2-Rezeptoren und Schmerz……………………………………………………... 14 1.5. P2-Rezeptoren und neuronale Entwicklung; embryonale undadulte neurale Vorläuferzellen……………………………………………………. 17 1.6. Referenzen………………………………………………………………………….. 19 2. Wissenschaftliche Ergebnisse……………………………………………………… 23 2.1. Komplex I. Struktur-Wirkungs-Zusammenhänge bei rekombinanten, humanen P2X3- und P2X2/3-Rezeptoren in Expressionssystemen…………. 24 2.1.1. Amino acid residues constituting the agonist binding site of the human P2X3 receptor……………………………………………………………… 24 2.1.2. ATP binding site mutagenesis reveals different subunit stoichiometry of functional P2X2/3 and P2X2/6 receptors……………………………………... 26 2.1.3 Flexible subunit stoichiometry of functional human P2X2/3 heteromeric receptors……………………………………………………………... 28 2.2. Komplex II. Vorhandensein und Wirkung von P2X7-Rezeptoren an kultivierten adulten, neuralen Vorläuferzellen und Astrozyten………….. 29 2.2.1. P2X7 receptors at adult neural progenitor cells of the mouse subventricular zone………………………………………………………………… 29 2.2.2. Co-expression of functional P2X4 and P2X7 receptors at adult neural precursor cells of the mouse subventricular zone……………………… 31 2.2.3. Functional P2X7 receptors at cultured hippocampal astrocytes but not neurons…………………………………………………………………….. 32 2.3. Komplex III. Vorhandensein und Wirkung von P2Y-Rezeptoren an embryonalen neuralen Vorläuferzellen und dedifferenzierten kultivierten striatalenNeuronen... 33 2.3.1. Increase of intracellular Ca2+ by adenine and uracil nucleotides in human midbrain-derived neuronal precursor cells…………... 33 2.3.2. Regulation of intracellular Ca2+ by P2Y1 receptors may depend on the developmental stage of cultured rat striatal neurons…………………... 35 2.3.3. Modulation by D1 and D2 dopamine receptors of ATP-induced release of intracellular Ca2+ in cultured rat striatal neurons 36 3. Zusammenfassung und Ausblick………………………………………… ………... 37 4. Erklärungen, Danksagung…………………………………………… 38 Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit………… 38 Erklärung über den eigenen Anteil an den einzelnen Arbeiten…………….. 39 Danksagung………………………………………………………………… 42