Letteratura scientifica selezionata sul tema "Cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)"

Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultes
In mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP

Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultes
In mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP

En 2006 et 2007, les équipes de Yamanaka et Thomson réalisent la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en cellules souches pluripotentes à partir de deux cocktails de gènes : OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) et OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). Les cellules souches à pluripotence induite générées (iPS) partagent les propriétés fondamentales des cellules souches embryonnaires : l’auto-renouvèlement, le maintien de la pluripotence et la capacité de différenciation. Ces cellules laissent entrevoir des applications considérables tant en recherche fondamentale (compréhension des mécanismes de développement et de pathologies, développement de modèles) qu’en recherche appliquée (médecine régénérative, toxicologie prédictive, criblage de médicaments). L’avantage majeur de l’utilisation des iPS réside dans leur origine non embryonnaire. Les contraintes d’ordre éthique sont écartées et une grande diversité de types cellulaires à partir de n’importe quel donneur a priori est disponible pour une reprogrammation. L’établissement d’une banque d’hiPS issus de donneurs sains ou de patients, serait d’une grande utilité pour la communauté scientifique se consacrant à l’étude des mécanismes physiopathologiques ou de développement et une source considérable pour la dérivation à des fins de thérapie cellulaire. Dans le but de mettre en place une telle banque, nous avons développé avec la société Vectalys des rétrovirus de reprogrammation contenant les cassettes polycistroniques ONSL et OSKM. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole de reprogrammation robuste à l’aide des rétrovirus RV-ONSL. Nous avons ensuite mis en évidence la synergie entre les facteurs ONSL et OSKM, la combinaison équimolaire de RV-ONSL et RV-OSKM permettant d’atteindre 2% d’efficacité de reprogrammation. Nous avons également entrepris la reprogrammation propre par transfections d’ARNm polycistroniques ONSL et OKM mettant à profit cette incroyable synergie
In 2006 and 2007, Yamanaka and Thomson teams achieved the reprogramming of mouse and human somatic cells into pluripotent stem cells through the transfection of two cocktails of genes: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) and OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). The generated cells, called induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) share the same fundamental properties of ESC : self-renewing, pluripotency maintenance and capacity of differentiation into the three germ layers and suggest the same application potential in basic research (developmental and epigenetic biology) as well as in therapy (regenerative medicine, disease modeling for drug development). One of the major advantages of iPSC lies in their non-embryonic origin. Indeed, the use of iPSC resolves the ethical constraints and offers the possibility to work with extensive cell types directly from the patient to treat. Stéphane Viville’s research team aims to develop a hiPSC bank from patient suffering from genetic or other diseases which will be available for the scientific community. We are experienced in human primary fibroblasts reprogramming especially with the use of two polycistronic cassettes: ONSL encoding Thomson’s cocktail and OSKM encoding Yamanaka’s cocktail separated with 2A peptides. Thanks to the combination of RV-ONSL and RV-OSKM retroviral vectors (developed with Vectalys) we are yielding more than 2% of reprogramming efficiency in a highly reproducible way. Indeed, we demonstrated the reprogramming synergy of ONSL and OSKM combination. We are now focusing our effort on non-integrative strategies (ie mRNA) which are more appropriate for clinical usage

La surdité neurosensorielle est définie par une atteinte de l’oreille interne, il résulte principalement d’une perte de cellules ciliées (CC). Chez les mammifères, ce processus est malheureusement irréversible. Le développement de la thérapie cellulaire a fait naître de nouveaux espoirs pour le traitement des surdités neurosensorielles. Les cellules souches d’origine embryonnaire ou adulte seraient capables de se différencier in vitro en progéniteurs otiques et de restaurer partiellement les fonctions auditives in vivo après transplantation. Cependant, les protocoles de différenciation in vitro des CC à partir de cellules souches sont insatisfaisants, et les signaux qui contrôlent ce phénomène restent mal connus. Ainsi, l’objectif de ce travail de thèse était d’étudier in vitro la différenciation des CC à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous nous sommes intéressés à deux voies de signalisation majeures impliquées dans le développement de l’oreille interne in vivo, la voie Notch et la voie Wnt. Dans une première partie, nous avons montré que l’inhibition tardive de la voie Notch favorise la différenciation des hiPSC en CC. Dans une seconde partie, nous avons étudié le rôle de la voie Wnt dans la différenciation des hiPSC en cellules otiques. Nos résultats indiquent que l'inhibition de la voie Wnt durant la première phase d’induction favorise l'expression des marqueurs de la placode otique et initie la spécification des CC.Les travaux présentés dans cette thèse améliorent ainsi les protocoles de différenciation des hiPSC et suggèrent que ce type de cellules serait parfaitement adapté pour traiter les surdités neurosensorielles
Neurosensory hearing loss is associated to inner ear disorders and degeneration of hair cells (HCs). Unfortunately, this process is irreversible in mammals. Currently, no curative treatment allows these cells to regenerate. For this reason, the development of cell therapy arose new hopes for the treatment of neurosensory hearing loss. Stem cells, either of embryonic or adult origin, seem able to differentiate in vitro into otic progenitors and to partially restore auditory functions in vivo. However, current protocols for in vitro differentiation of stem cells into HCs are unsatisfactory, and the signals that control this phenomenon remain poorly understood. Thus, the objective of this thesis was to study in vitro HC differentiation from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). We were particularly interested in two major signaling pathways involved in vivo in inner ear development, the Notch and Wnt signaling pathways.In a first part, we demonstrated that Notch inhibition during late otic differentiation enhances hiPSC differentiation into hair cell-like cells. In a second part, we studied the role of the Wnt signaling pathway during otic induction and HC specification. Our results indicate that Wnt inhibition during early otic induction promotes the expression of otic placode markers and initiate HC specification. The work presented here thus propose improved protocols to obtain HCs from hiPSCs, and suggest that this cell type is perfectly adapted for the treatment of neurosensory hearing loss

Le syndrome de DiGeorge ou microdélétion 22q11.2, est la délétion chromosomique la plus fréquente chez les êtres humains. Cette délétion est liée à la recombinaison homologue non-allélique au cours de la méiose induisant la perte d’en moyenne 40 gènes. Les études de corrélation génotype/phénotype chez les patients ont révélé des différences phénotypiques entre individus et cela indépendamment de la taille des microdélétions. L’hypothèse de l’implication des mécanismes épigénétiques dans la variabilité phénotypique observée a été soulevée mais reste encore inexplorée. C’est dans ce contexte que nous nous intéressons à l’étude des mécanismes épigénétiques au cours du développement, dans cette pathologie à travers l’utilisation d’un modèle de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSs). En particulier, nous avons ciblé nos travaux sur le rôle de la chaperonne d’histone HIRA dont le gène est localisé dans la région délétée. HIRA est impliquée dans la déposition du variant d’histone H3.3, une histone majeure dans le cerveau. Afin de comprendre l’implication de HIRA dans les manifestations neurologique du syndrome de DiGeorge et en particulier dans la schizophrénie, nous avons développé et optimisé un nouveau protocole pour la différenciation de cellules hiPSCs en progéniteurs neuronaux, neurones corticaux et neurones dopaminergiques. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives pour la modélisation d’un grand nombre de pathologies, et dans le contexte du laboratoire, pour l’exploration des mécanismes épigénétiques associés à la variabilité phénotypique dans différentes maladies génétiques
The DiGeorge syndrome also known as 22q11.2 microdeletion syndrome, is the most common deletion in humans. This deletion is linked to a non-allelic homologous recombination that occurs during meiosis and involves sequences called LCRs for "Low Copy Repeats". Depending on the LCRs involved, different deletions are observed, inducing the loss of approximately 40 genes. The absence of genotype/phenotype correlation in patients and the phenotypical differences regardless of the size of the microdeletion suggests the involvement of additional parameter. The hypothesis of epigenetic changes associated with the onset or variability of symptoms has been suggested but never investigated. In order to tackle this question, we decided to focus our attention of the role of the HIRA histone chaperone encoded by a gene located in the 22q11.2-deleted region. HIRA is involved in the deposition of the H3.3 histone variant, one of the main histone in the brain. In order to determine whether HIRA is implicated in the neurological manifestations in DiGeorge patients and particularly in schizophrenia, we developed and optimized a new protocol for the direct differentiation of human induced pluripotent stem cell (hiPSCs) into neural progenitors, cortical and dopaminergic neurons. In parallel, we developed a new protocol for hiPSCs differentiation toward the skeletal muscle lineage and the production of multinucleated muscle fibers. Altogether, these results open new perspectives for the modeling of a large number of pathologies, and in the context of our laboratory, the exploration of epigenetic mechanisms associated with phenotypic variability in different genetic diseases

L’objectif de cette thèse a été d’évaluer certains paramètres physiques et épigénétiques impliqués dans la différenciation cardiaque de cellules souches humaines pluripotentes induites. Un premier paramètre physique souvent sous-évalué a été étudié, celui de la rigidité. Classiquement, les cellules souches sont cultivées et adaptées à des rigidités in vitro allant de 1-10 GPa très éloignées des valeurs physiologiques, de l’ordre du kPa. L’impact de support de culture à 3, 12 et 25 kPa a été évalué sur les cellules souches initiales. Les résultats montrent que des rigidités inférieures à 25 kPa ne permettent pas le maintien de la pluripotence au bout de 6 passages. De plus, les colonies cellulaires se développent en 3D et créent leur propre microenvironnement. Un second paramètre étudié concerne les microRNAs appartenant à la famille let-7 dont la fonction exacte au niveau cardiaque reste à définir. Les résultats montrent qu’au cours de la différenciation son expression se caractérise par une augmentation transitoire précoce au moment de la formation du mésoderme, puis s’éteint pour ne ré-augmenter que plus tard lors de la maturation des cardiomyocytes. Des modulations via des mimics ou des inhibiteurs dans différents contextes cellulaires suggèrent qu’initialement let-7 contribue à une future spécification cardiaque, mais que plus tard cette famille devra être réprimée pour générer des progéniteurs cardiaques. À l’opposé, miR-1, spécifique au cœur, contribue toujours à la progression en cardiomyocytes. Ensemble, ces recherches contribuent à la recherche fondamentale sur le développement du cœur humain et à la recherche appliquée en ingénierie tissulaire cardiaque
The objective of this thesis was to evaluate some physical and epigenetic parameters involved during cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells. Environmentally, an often undervalued physical parameter remains, the stiffness defined by the Young’s modulus. Commonly stem cells are cultured and adapted to in vitro rigidities ranging between 1-10 GPa very far from physiological values, for instance 10-15 kPa for the heart. The impact of soft culture substrates with 3 kPa, 12 kPa and 25 kPa was studied on the initial stem cells. Globally, results indicated that rigidities lower than 25 kPa were not suited for total pluripotency maintenance after 6 passages. Also, cellular colonies started to grow in 3D suggesting that softness drove them to build their own microenvironment. Epigenetically, the exact role of one of the first discovered microRNAs, the let-7 family has not yet been fully elucidated. Throughout differentiation its expression was characterized by an early transient peak at the time of mesoderm formation, after which their expression extinguished to only gradually re-increase later in the course of cardiomyocytes maturation. Modulation experiments involving mimics or inhibitors of the let-7 family on different cellular contexts suggested that initially let-7 acted on future cardiac specification but later, this family had to be repressed in order for cardiac progenitors to emerge. Oppositely, the cardiac specific miR-1 always contributed to their progression into cardiomyocytes. Together these researches contribute to fundamental research on human heart development and to applied research on human engineered cardiac tissues

Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) prédispose les porteurs de variations pathogènes de TP53 à un large spectre de tumeurs dès l’enfance. La variabilité phénotypique du LFS complique la prise en charge des patients et peut s’expliquer en partie par le type de variations de TP53, mais également par l'influence de facteurs modificateurs génétiques. Afin d’évaluer ces facteurs modificateurs, il est nécessaire de mettre au point des tests fonctionnels adaptés.L’activité des isoformes de p53 suggère qu’elles pourraient agir comme facteurs modificateurs du LFS. C’est pourquoi nous avons mis au point des techniques pour l’analyse des transcrits alternatifs, présentées dans la première partie de ces travaux de thèse. Si nos résultats ont montré que ces techniques n’étaient pas adaptées pour répondre à cette hypothèse, elles nous ont néanmoins permis d’identifier un nouveau transcrit physiologique, non décrit dans la littérature, augmenté chez une patiente porteuse d’une variation située sur le site accepteur d’épissage du dernier exon de TP53. Ce transcrit démontre l’existence d’un épissage alternatif du dernier exon de TP53 avec un exon terminal alternatif situé à plus de 2 kb en aval.Afin d’aider à la classification des variations de TP53, notre laboratoire évalue l’activité transcriptionnelle de p53 dans le contexte génétique du patient. Ce test ne permet donc pas de s’affranchir de l’influence potentielle des facteurs modificateurs génétiques individuels. C’est pourquoi, dans la deuxième partie de ces travaux de thèse, nous avons mis au point un modèle cellulaire de cellules souches pluripotentes induites humaines permettant d’étudier les variations de TP53 insérées par CRISPR-Cas9 dans un fond génétique commun. Ces travaux soulignent l’importance de l’expression de TP53, notamment pour l’étude des variations dont la pénétrance est moindre par rapport aux variations « hot-spot ». Par ailleurs, nous montrons que les variations en phase exercent un impact différentiel sur l’activité fonctionnelle de p53, selon le domaine protéique dans lequel elles se situent. L’avantage de notre modèle réside également sur son hétérozygotie pour PEX4 sur lequel nous avons pu insérer une seconde variation, ici le polymorphisme p.(Pro47Ser) inséré en trans d’une variation pathogène. Nos résultats soulignent l’importance du contexte génétique dans l’analyse des variations de TP53. L’ensemble de ces travaux de thèse mettent en lumière la nécessité d’étudier l’activité transcriptionnelle de p53 dans un contexte physiologique, sans surexpression, dans le but de mieux comprendre ce syndrome et d’optimiser la prise en charge des patients LFS
Li-Fraumeni Syndrome (LFS) predisposes carriers of pathogenic TP53 variants to a wide spectrum of cancers throughout life. The phenotypic variability of LFS complicates patient management and can be partly attributed to the type of TP53 variant, as well as the influence of genetic modifier factors. To evaluate these modifier factors, it is essential to develop suitable functional tests.The activity of p53 isoforms suggests that they may act as modifier factors in LFS. Consequently, we developed assays for analyzing alternative transcripts, as presented in the first part of this work. While our results demonstrated that these assays were not well-suited to addressing this specific hypothesis, they nevertheless led us to the discovery of a novel physiological transcript not previously described in the literature. This transcript was found to be increased in a patient carrying a variant located at the splice acceptor site of TP53’s last exon, revealing an alternative splicing event involving TP53’s final exon and an alternative terminal exon located more than 2 kb downstream.To facilitate the classification of TP53 variants, our laboratory evaluates p53’s transcriptional activity in the patient’s specific genetic context. However, this approach does not allow us to fully disentangle the potential influence of individual genetic modifier factors. Therefore, in the second part of this work, we developed a human-induced pluripotent stem cell model to study TP53 variants introduced by CRISPR-Cas9 within a standardized genetic background. Our findings highlight the importance of physiological TP53 expression, particularly for studying variants with lower penetrance compared to "hot-spot" variants. Additionally, we show that in-frame variants exert differential impacts on p53’s functional activity, depending on the protein domain in which they are located. The advantage of our model also lies in its heterozygosity for PEX4, into which we were able to insert a second variant, in this case, the p.(Pro47Ser) polymorphism, inserted in trans with a pathogenic variant. Our results highlight the importance of the genetic context in the analysis of TP53 variants. This thesis work emphasizes the necessity of studying p53 transcriptional activity in a physiological context, without overexpression, with the aim of improving our understanding of this syndrome and optimizing the management of LFS patients

La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd’hui l’opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l’accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l’appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l’orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu’il n’existait jusqu’alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d’étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique
Reprogramming technology of somatic cells in induced pluripotent stem cells (iPS) now offers the opportunity to model neurodegenerative diseases and to study patient’s neurons. We used this technology for generating two models of neurodegenerative diseases: the muccopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) and the ALS2 form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the MPSIIIB model, we have shown that iPS and neurons of patients had characteristic defects of the disease such as the accumulation of storage vesicles. Alterations of the Golgi apparatus in these cells were also highlighted. Transcriptome analysis of MPSIIIB neural precursors showed transcriptional changes involving particularly genes implicated in cell-extracellular matrix interactions. Thus, in a subsequent study, alterations of migration and orientation of MPSIIIB mutant mouse cells and MPSIIIB patients’ cells have been demonstrated. These alterations may be responsible for the disruption of neurogenesis and neuritogenesis in sick children. In the ALS2 model, we have shown that patients’ neurons had defects including decreased endosomes’ surface and abnormal neurite outgrowth. As there was previously no relevant cellular model reproducing the disease, this model will now allow the study of physiopathological processes involved in the disease. In conclusion, the generation of iPS cells allows to model neurodegenerative diseases and to study associated physiopathological processes on cultured human neurons. These cell models could allow in the near future the screening of molecules of potential therapeutical interest

La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd'hui l'opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l'accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l'appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l'orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu'il n'existait jusqu'alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d'étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique

Malgré les avancées majeures en recherche, les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de décès dans le monde. Les arythmies cardiaques résultent principalement des canalopathies généralement causées par des mutations dans des gènes codant pour des canaux ioniques. Des mutations du récepteur cardiaque de la ryanodine de type 2 (RyR2) conduisent à des troubles du rythme tels que la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (CPVT) et la mort subite cardiaque dans des conditions de stress. L'association de mutations RyR2 avec la tachycardie ventriculaire polymorphe à couplage court (SC-PMVT) au repos n'est pas claire. De plus, l'implication du RyR2 dans la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) conduisant à des arythmies ventriculaires a également été rapportée. Cependant, les connaissances en physiologie et physiopathologie cardiaques ont été considérablement développées en utilisant des modèles d'expression hétérologues et des modèles de souris transgéniques qui ne récapitulent pas toujours le phénotype observé chez les patients. Par conséquent, les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrent de grandes possibilités de travailler avec les cellules appartenant aux patients, d'élucider des mécanismes importants responsables des maladies cardiaques notamment et de tester de nouveaux composés thérapeutiques.L’objectif principal de ma thèse était de modéliser le SC-PMVT en utilisant des cardiomyocytes (CM) dérivés de hiPSC « patient-specific » et la technologie CRISPR / Cas 9 pour aller au-delà du travail réalisé par Cheung, Meli et al., en 2015 avec le nouveau canal mutant RyR2-H29D. Mon travail a contribué à élucider le fait que les canaux mutants RyR2-H29D sont responsables d’une homéostasie calcique anormale, des propriétés contractiles et électriques anormales et un remodelage du complexe macromoléculaire RyR2. Ces anomalies ont été complètement supprimées lors de l'inversion de la mutation RyR2-H29D avec la technologie CRISPR / Cas9. De plus, nous avons constaté que la Flecaïnide et les stabilisateurs du RyR2 S107 sont efficaces pour prévenir la libération anormale de calcium (Ca2+) dans les RyR2-H29D hiPSC-CMs, contrairement au Verapamil et au Propanolol.Mon deuxième sujet de thèse portait sur la modélisation de la CMD associée à la DMD à l'aide de hiPSC-CMs « patient-specific » exploités à partir d'une cohorte de patients. Nos résultats préliminaires suggèrent que 3 mutations indépendantes de la dystrophine induisent une fuite de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS) et des propriétés contractiles anormales dans les DMD hiPSC-CMs dans des conditions physiologiques et de stress.Dans l’ensemble, mon travail de thèse a contribué à valider l'utilisation de hiPSC-CMs « patient-specific » pour modéliser des ryanopathies directement induites par des mutations ponctuelles et indirectement par d'autres conditions physiopathologiques. Ce travail de thèse renforce l’intérêt croissant que suscitent les hiPSC-CMs « patient-specific » pour élucider les mécanismes physiopathologiques des ryanopathies et proposer à terme une médecine personnalisée
Despite major advances in the field of research, the cardiovascular diseases remain the leading cause of death worldwide. Cardiac arrhythmias are mainly the results of channelopathies which are normally caused by mutations occurring in genes coding for ion channels. Mutations of the cardiac ryanodine receptor type 2 (RyR2) lead to arrhythmogenic disorders such as the catecholamine polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) and sudden cardiac death under stress conditions. The association of RyR2 mutations with the short-coupled polymorphic ventricular tachycardia (SC-PMVT) at rest is unclear. Moreover, the implication of the RyR2 in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD) leading to ventricular arrhythmias was also reported. However, the knowledges in the cardiac physiology and physiopathology have been significantly made using either the heterologous expression or transgenic mouse models which do not always recapitulate the phenotype observed in patients. Therefore, the human induced pluripotent stem cells (hiPSC) offer great opportunities to work with human somatic cells, to elucidate important mechanisms driving cardiac disease and to test novel therapeutic compounds.The main aim of my PhD thesis was to model the SC-PMVT using patient-specific hiPSC-derived cardiomyocytes (CMs) and CRISPR/Cas 9 technologies to go beyond the work achieved by Cheung, Meli et al., in 2015 with the novel RyR2-H29D mutant channels. My work contributed to elucidate that the RyR2-H29D mutant channels exhibit abnormal intracellular calcium (Ca2+) homeostasis, abnormal contractile and electrical properties and RyR2 macromolecular complex remodeling. These abnormalities were fully abolished when reversing the RyR2-H29D mutation with CRISPR/Cas9 technology. Moreover, we found that the Flecainide and RyR2 stabilizer S107 are potent to prevent the abnormal release of Ca2+ in RyR2-H29D hiPSC-CMs while Verapamil and Propanolol do not.My second thesis objective was focused on modeling the DCM associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD) using patient-specific hiPSC-CMs exploited from a local cohort of DMD patient. Our preliminary results suggested that 3 independent dystrophin mutations induce sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ leak and abnormal contractile properties in DMD hiPSC-CMs under both physiological and stress conditions.My thesis work contributed to validate the use of patient-specific hiPSC-CMs to model ryanopathies directly induced by single-point mutations and indirectly by other pathophysiological conditions. Overall, my thesis work highlighted the increasing interest in patient-specific hiPSC-CMs to decipher the pathophysiological mechanisms behind ryanopathies and orientate toward personalized medicine