Tesi sul tema "Diseño molecular"

En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo social frente al uso de OMGs en la industria agroalimentaria, mediante la demostración y el desarrollo de un nuevo concepto sobre el uso de las técnicas de biología molecular en la obtención de levaduras modificadas genéticamente, el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular. La idea básica de este nuevo concepto es simple y se basa en imitar a la propia naturaleza en su constante evolución, pero acelerando y dirigiendo el proceso evolutivo con el objeto de seleccionar en un corto periodo de tiempo aquellos cambios genéticos que específicamente hayamos diseñado a escala molecular. Las levaduras no son una entidad invariable en el tiempo, al contrario, como todos los organismos vivos evolucionan con el tiempo. Mediante esta nueva metodología que hemos desarrollado, se consigue acelerar el proceso evolutivo, pues las modificaciones genéticas que hemos introducido se podrían haber efectuado espontáneamente por la levadura en su entorno natural como consecuencia de procesos de recombinación, duplicación o eliminación de elementos genéticos a lo largo de su ciclo reproductivo, aunque indudablemente se habrían perdido sin la presencia de determinadas condiciones de selección y, dada la baja probabilidad de que esos eventos ocurrieran, habrían necesitado de un inmenso periodo de tiempo. Se ha demostrado el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, mediante la construcción e integración cromosómica de un casete de selección basado en la sobreexpresión del gen YAP1, que da origen a un marcador dominante que confiere resistencia a diversos compuestos tóxicos para las levaduras, tales como cicloheximida y cerulenina. Para el desarrollo de dicho casete de selección nos hemos impuesto y respetado las siguientes condiciones: 1) Utilización de la capacidad de recombinación homóloga de las levaduras del género Saccharomyces; 2) Utilización de material genético procedente exclusivamente de la propia cepa de levadura a evolucionar; 3) El material genético no ha de sufrir ningún paso intermedio de clonaje o expresión en otros sistemas biológicos. Una vez cumplidas todas estas condiciones, las cepas resultantes no deberían responder a la definición oficial de organismos modificados genéticamente de la Unión Europea: ¿organismos en los que su material genético ha sido alterado de una manera que no sucede de forma natural mediante los procesos de reproducción sexual y/o recombinación natural¿. Para alcanzar el objetivo fundamental del proyecto, hemos trabajado inicialmente con un sistema modelo más sencillo, como es el caso de una cepa de una levadura de laboratorio, y a continuación hemos abordado la misma aproximación experimental pero trabajando con una levadura que se emplea en la producción industrial de cerveza tipo ¿lager¿. La metodología experimental que se ha diseñado ha consistido en obtener, sólo mediante reacciones de PCR, una construcción que, posteriormente a su inserción cromosómica mediante recombinación homóloga, pone al gen YAP1 bajo el control de un promotor fuerte de un gen de la ruta de la glicólisis, el promotor del gen PGK1. Se determinó si la sobreexpresión del gen YAP1 en la cepa cervecera evolucionada, era capaz de disminuir la aparición espontánea de mutantes deficientes en respiración (¿petites¿) durante la fermentación del mosto cervecero. La continuada reutilización industrial de la levadura cervecera está asociada con un incremento en la frecuencia de la aparición de ¿petites¿, con el consiguiente efecto negativo sobre el proceso fermentativo. Según los resultados obtenidos, la cepa evolucionada, presenta claramente una menor formación de ¿petites¿ durante su reutilización a lo largo de 10 microfermentaciones sucesivas, con respecto a la cepa parental. Una vez demostrada la viabilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, el paso siguiente consistió en la aplicación de dicha metodología al desarrollo de levaduras con características de interés industrial. Se han diseñado reorganizaciones cromosómicas sobre 3 tipos de levaduras industriales: a) Una levadura de producción de cerveza tipo¿ lager¿ evolucionada para dar lugar a una baja producción de diacetilo; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen ILV5 que codifica para una isomerorreductasa que convierte el ¿-acetolactato en ¿-ß-dihidroxivalerato. De esta forma, se evita la acumulación de ¿-acetolactato en la cerveza y se acorta sensiblemente el proceso de maduración al haberse reducido la producción de diacetilo. La cepa evolucionada consigue disminuir en más de 10 días con respecto a la cepa parental el tiempo necesario para que la concentración de diacetilo esté al nivel que la práctica industrial considera aceptable para dar por finalizado el proceso de ¿lagering¿. b) Una levadura en la que se ha aumentado notablemente su actividad pectinolítica, lo que presenta aplicaciones para su uso en el procesado industrial de material vegetal rico en pectina; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen PGU1 que codifica para una endopoligalacturonasa. Se obtuvieron dos nuevas variantes de la cepa parental, una conteniendo el casete de selección y otra en la que dicho casete se eliminó mediante un proceso denominado ¿pop out¿, permitiendo de esta forma la reutilización de dicho casete en sucesivos diseños de reordenación genómica sobre la misma cepa. Ambas variantes presentan un notable incremento de la actividad hidrolítica sobre la pectina sin perjuicio de su producción de etanol ni de su capacidad fermentativa. c) Una levadura vínica comercial que se ha evolucionado en busca de una mejor tolerancia frente a bajas temperaturas. Se ha intentado obtener el fenotipo deseado mediante inactivación del gen INP51 que codifica una enzima inositol polifosfato 5- fosfatasa, implicada en la homeostasis del inositol 4, 5-difosfato, cuya pérdida de función provoca la acumulación de dicho metabolito y, según se ha descrito en la literatura, un aumento de la tolerancia al frío. Se han obtenido nuevas cepas en las que se ha inactivado bien una copia del gen INP51 de la cepa industrial, bien ambas copias. Sin embargo, y contrariamente a lo descrito para la cepas de laboratorio, la inactivación del gen INP51 no aumenta la capacidad de crecimiento frente a bajas temperaturas de la cepa industrial evolucionada. Todos estos ejemplos de aplicación de la metodología desarrollada demuestran la utilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular en la mejora de las cepas de levaduras industriales del género Saccharomyces
Sani, D. (2013). Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34325
TESIS

A través de la Historia, la tuberculosis ha sido una de las epidemias que más muertesha causado. Hoy en día, tanto la tuberculosis como las infecciones ocasionadas por elcomplejo M. avium constituyen un reto de salud pública sin par, no sólo por la gravedad delas mismas sino por la dificultad que entraña su tratamiento.Con esta motivación, y haciendo uso de la topología molecular, iniciamos el diseño yselección de nuevos compuestos potencialmente activos frente a Mycobacteriumtuberculosis (MTBC) y frente al complejo Mycobacterium avium (MAC).La topología molecular sirve para encontrar relaciones cuantitativas entre unapropiedad física, química o biológica y estructuras moleculares, basándose en lacaracterización numérica de las mismas a través de unos índices o descriptores topológicos(IT), es decir, se trata de obtener las funciones topológicas: P(IT) = A0 + ΣAi (IT), donde Prepresenta la propiedad, A0 y el conjunto de términos Ai los coeficientes de regresión.Con objeto de mejorar la eficacia de las funciones, fueron introducidas 4 nuevasfamilias de descriptores, particularmente derivados de índices de conectividad de Kier yHall, así como de índices de carga. Una vez calculados los IT de 45 compuestos conactividad antituberculosa contrastada, fueron obtenidas las funciones de predicción de docepropiedades farmacológicas de cada uno de los compuestos activos, y las de clasificaciónque nos permitieron discriminar entre compuestos activos e inactivos frente a estos dosgrupos de patógenos. A continuación se diseñaron los modelos de actividad antituberculosa,haciendo uso de las funciones seleccionadas, y fueron aplicados a bases de datos deestructuras químicas para la selección de sustancias potencialmente activas. Finalmente,realizamos los ensayos microbiológicos in vitro encaminados a determinar la concentraciónmínima inhibitoria (CMI) para detectar la posible actividad antituberculosa de loscompuestos seleccionados.Las conclusiones obtenidas fueron las siguientes:1. Los nuevos IT aportan una mejora de más de un 30% en las funciones de predicciónsobre los ya descritos, y una gran eficacia para discriminar entre compuestos activos einactivos frente a MTBC y frente al MAC.2. Las funciones obtenidas utilizando IT, han demostrado que es posible predecireficazmente la CMI y otras propiedades farmacológicas de los compuestos activos.3. Se han obtenido modelos útiles para la selección de compuestos activos frente a MTBCy frente al MAC.4. Entre los nuevos compuestos seleccionados a través de los modelos discriminantes deactividad:· 10 son activos frente a MTBC: cloruro de benzalconio (BAK), dinitrocresol, DOCA,linezolid, paromomicina, pentamidina, reserpina, ribavirina, TPEN y trifluoperazina,siendo los más activos linezolid y pentamidina con una CMI inferior a 4 µg/mL.· 6 son activos frente a MAC: BAK, linezolid, paromomicina, TPEN, trifluoperazina ypentamidina, siendo los más activos BAK, paromomicina, TPEN y trifluoperazinacon una CMI comprendida entre 4 y 8 µg/mL.5. Se han seleccionado 6 nuevas pirimidinas sustituidas sintetizadas en la Universidad deGerona. Sus ensayos in vitro ponen de manifiesto que la CMI frente a MTBC estácomprendida entre 32 y 64 µg/mL. Los resultados obtenidos con las funciones depredicción informan que teóricamente presentan un buen perfil farmacológico, lo quenos induce a considerar a estas moléculas como posibles cabezas de serie para el diseñode nuevos antituberculosos.
Molecular topology, MT, has been used to select new active compounds against Mycobacterium tuberculosis (MTBC) and Mycobacterium avium complex (MAC). MT has proved to be a useful formalism to find quantitative structure-activity relations (QSAR), based on the numeric characterization of the molecules through topological indices (TI), that is to say, to obtain the topological functions: P(TI) = A0 + Ai(TIi), where P represents the property, A0 the intercept and Ai the regression coefficients. In order to the effectiveness of the functions, four new families of TI were introduced. Once calculated the TI of forty five active compounds, the predictive functions as well as the discriminant functions allowing us to discriminate among active and inactive compounds, were achieved. Next the molecular models were designed using the selected functions, and they were applied to databases of chemical structures for the selection of potentially active substances. Finally, we carried out the in vitro assays in order to check the minimal inhibitory concentration (MIC) of the selected compounds. Conclusions: 1. The new TI contribute to improve in more than 30% of the predictive functions on those already described, and also to a significant effectiveness to discriminate among active and inactive compounds against MTBC and MAC. 2. The obtained functions have demonstrated that it is possible to predict efficiently the MIC and other pharmacological properties of the active compounds.3. Useful models have been obtained for the selection of active compounds against MTBC and MAC.4. After in vitro tests at the laboratory, the following results stand out:· 10 compounds were active against MTBC (MIC≤16g/mL): BAK, DNOC, DOCA, linezolid, paromomycin, pentamidine, reserpine, ribavirin, TPEN and trifluoperazine.· 6 were active against MAC (MIC≤16g/mL): BAK, linezolid, paromomycin, TPEN, trifluoperazine and pentamidine.· Six new substituted pirimidines synthesized at the University of Gerona were selected. Theoretically they present a good pharmacological profile and their in vitro assays demonstrated that the MIC against MTBC were between 32 and 64 g/mL, what induces us to consider these structures as new leads as antituberculosis agents.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Química
La electrónica molecular es una rama de la nanotecnología cuya finalidad es la utilización de moléculas individuales como componentes electrónicos. Si consideramos que una molécula es la estructura estable más pequeña, alcanzar este grado de miniaturización sería el objetivo final en la búsqueda de dispositivos electrónicos más eficientes. Para esto, es necesario entender cómo las propiedades intrínsecas de una molécula afectan el desempeño de estos dispositivos, con el fin de desarrollar sistemas moleculares que posean propiedades interesantes y sean capaces de formar contactos robustos y confiables. El objetivo de esta tesis es el diseño y estudio de sistemas moleculares que puedan ser utilizados en la construcción de dispositivos basados en electrónica molecular. Considerando esto, los sistemas curcuminoides son posibles candidatos para electrónica molecular debido a que presentan una estructura altamente conjugada y versatilidad sintética que permite modificar químicamente su estructura, modulando así las propiedades observadas. En este sentido, se propusieron dos líneas de trabajo para esta tesis: 1) la modificación de los anillos aromáticos terminales con el fin de utilizarlos como grupos de anclaje; y, 2) la modificación del grupo -dicetona central con el fin de modular sus propiedades opto-electrónicas. Durante esta tesis se obtuvieron 11 ligandos orgánicos (ligandos curcuminoides 1-6; derivados heterocíclicos 1a, 2a, 4a y 4aa; y un ligando pseudo-curcuminoide 7), y 16 compuestos de coordinación (complejos con BF2 1b, 2b, 4b, 6b y 7b; y complejos con metales de transición I-IX), estudiándose sus propiedades opto-electrónicas mediante espectroscopia UV-Vis y electroquímica, para finalmente realizar estudios de conductancia molecular en un dispositivo MCBJ. A partir de los resultados obtenidos queda manifestada la relevancia de los grupos de anclaje al permitir el acoplamiento molécula-electrodo; por otro lado, las modificaciones al grupo -dicetona, mediante la formación de heterociclos o compuestos de coordinación, permite modular la conductancia molecular debido a los cambios producidos en la estructura electrónica. Se espera que los resultados obtenidos en esta tesis contribuyan a expandir el conocimiento sobre la relación existente entre la estructura electrónica de las moléculas y su conductancia molecular, y así en el futuro poder desarrollar dispositivos basados en electrónica molecular.
Molecular electronics is a branch of nanotechnology which aims to use single molecules as electronic components. If we consider that a molecule is the smallest stable structure, achieving this degree of miniaturization is the ultimate goal in the search for more efficient electronic devices. To accomplish this is necessary to fully understand how the intrinsic properties of a molecule affect the performance of such devices, aiming to develop molecular systems with interesting properties and with the ability to form strong and reliable contacts. The purpose of this thesis is to design and study molecular systems which could be applied in the development of devices based on molecular electronics. Considering this, curcuminoid systems are candidates for molecular electronics because they exhibit a highly conjugated system and synthetic versatility allowing to chemically modify its structure, thereby modulating the properties of these systems. In this sense, two research lines were proposed: 1) the modification of the terminal aromatic rings to use them as anchoring groups; and, 2) the modification of the central -diketone moiety in order to modulate its opto-electronic properties. For this thesis 11 organic ligands (curcuminoid ligands 1-6; heterocyclic derivatives 1a, 2a, 4a and 4aa; and a pseudo-curcuminoid ligand 7), and 16 coordination compounds (BF2 complexes 1b, 2b, 4b, 6b and 7b; and transition metal complexes I-IX) were obtained, their opto-electronic properties were studied through UV-Vis spectroscopy and electrochemistry, to finally perform single-molecule conductance measurements in a MCBJ device. From the results obtained, the relevance of the anchoring groups is clear, allowing the molecule-electrode coupling; on the other hand, the modifications to the -diketone group, through the formation of heterocycles or coordination compounds, allows the modulation of the molecular conductance due to the changes produced in the electronic structure. It is expected that the results obtained in this thesis will contribute to expand the knowledge related with the dependance between the electronic structure of the molecules and their molecular conductance, and in the future development of devices based on molecular electronics
Conicyt

La presente tesis se ha desarrollado en la frontera de diferentes disciplinas tales como la Química de Coordinación, Química Supramolecular y la Ciencia de Materiales. El objetivo de la misma ha consistido en el diseño y construcción de puertas moleculares, entendiendo estas como mecanismos básicos que pudieran modular el acceso a determinados sitios y cuyo estado (abierto o cerrado) pudiera ser controlado a voluntad por ciertos estímulos externos tales como estímulos iónicos, electroquímicos, fotoquímicos, etc. Se trata de matrices silíceas mesoporosas, tipo MCM-41, que han sido convenientemente funcionalizadas con poliaminas para que mediante el control de parámetros macroscópicos como el pH o la presencia de determinadas especies en el medio de reacción sea posible "abrir o cerrar" a voluntad el acceso a los poros del material. Además de la síntesis y caracterización de este nuevo tipo de materiales híbridos, también se ha ensayado su aplicación, como por ejemplo, sistemas sensores de especies aniónicas en agua, sensores y materiales para liberación controlada. También se ha aplicado el concepto de puertas moleculares nanoscópicas desarrollado en los materiales híbridos como una nueva aproximación al diseño de procesos de reconocimiento óptico en disolución acuosa. La idea implica procesos de coordinación selectiva "poliamina-anión" acoplados a un control del transporte de masa (colorante). Finalmente, también se ha diseñado un material que presenta doble funcionalidad: la detección y la adsorción simultaneas de mercurio(II) en disoluciones acuosas. Este proceso permite extraer mercurio al mismo tiempo que se detecta su presencia en la disolución.
Casasús Lis, R. (2009). Diseño de puertas moleculares controladas a nivel nanoscópico [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8510
Palancia

Un termociclador es un equipo utilizado en biología molecular para amplificar fragmentos del ADN, a través del proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El desarrollo de la presente tesis comprende la mejora del diseño de un prototipo previamente desarrollado, de los componentes del sistema termo-mecánico de un termociclador, entre los que cabe mencionar: bandeja portamuestras, células peltier, disipador, ventilador, carcasa y tapa. Para el diseño de los componentes, se tendrán en cuenta los estudios previos con el objetivo general de realizar las mejoras del diseño del sistema termo-mecánico de un termociclador, para especificar un modelo integral de buen funcionamiento. La metodología seguida consta de cuatro etapas importantes, siendo la primera la identificación de las necesidades del equipo para lograr el proceso. Seguidamente se identificó los posibles parámetros de mejora con respecto al prototipo desarrollado, en donde lo más resaltante fue el nuevo concepto de una tapa y una carcasa con una serie de características que satisfagan las necesidades identificadas, para lo cual se realizaron cálculos analíticos del nuevo diseño. Además para esta etapa se verificó que los componentes previamente diseñados puedan ser reutilizados para la elaboración de un nuevo prototipo mediante cálculos analíticos, encontrando que la mayoría de componentes ya analizados, a excepción del disipador, satisface las necesidades actuales. En la tercera etapa, mediante la ayuda de herramientas de simulación se corroboró los cálculos analíticos desarrollados en la etapa previa y se corroboró que el modelo de diseño mejorado propuesto satisface las necesidades. Finalmente se elaboraron planos del diseño mejorado propuesto para establecer una lista de materiales y estimar el costo de fabricación del mismo, así como las recomendaciones para su fabricación y posterior ensamblaje
Tesis

En este trabajo se presenta el proyecto molUDLAP, un simulador de Acoplamiento Molecular (AC) de tipo académico. Primero se presentan algunos de los aspectos más importantes del AC considerados para el diseño de este sistema; después se trata el procedimiento para la realización de dicho proyecto, para el cual se usaron distintos tipos de APIS en Java de tipo open source. Se presenta una breve descripción de cada herramienta (API) utilizada, también se describen los objetivos por los que ha sido utilizada cada una, se hacen algunas observaciones del trabajo que se ha realizado. Para el diseño de la aplicación se utilizó como lenguaje de programación Java debido principalmente a su versatilidad de ser multiplataforma; también se hizo uso de "Jmol", el cual es un visor Java de código abierto que se utiliza para visualizar las moléculas en 3D, los archivos de estas se descargan de la base de datos mundial "Protein Data Bank" (PDB).
(cont.) Para los procesos necesarios en la preparación de las moléculas (proteínas y ligandos), en parte de la simulación se utilizo "Chemistry Development Kit" (CDK); que consiste en una API en Java con herramientas para el desarrollo de aplicaciones de tipo bioinformatico, que brinda utilidades en la carga de archivos .pdb, .sdf, y para la implementación de cargas de Gasteiger, etc. Para el cálculo de la energía entre las moléculas se propuso e implemento una fórmula que hace uso de las interacciones que se dan entre las moléculas; finalmente para la simulación se implemento un algoritmo genético para recorrer las configuraciones posibles entre la proteína y el ligando en el espacio de búsqueda con lo que se obtiene la mejor configuración posible. En la elaboración de la aplicación se estudiaron algunos de los distintos métodos (algoritmos) computacionales que existen para llevar a cabo la simulación del Acoplamiento Molecular, es conveniente mencionar que en este caso en particular se hizo énfasis en las técnicas usadas para el acoplamiento de tipo "proteína-ligando". Finalmente se Analizaron algunas de las herramientas disponibles que se usan en modelado del Acoplamiento Molecular con la finalidad de tener parámetros de la entrada y la salida, en este caso se uso a Docking Server (http://www.dockingserver.com). .

El estudio de la unión de un ligando con un receptor es de particular relevancia en el desarrollo de fármacos, donde se persigue encontrar un ligando con elevada afinidad hacia un determinado receptor. El ligando se une al receptor en el denominado “sitio de unión”. El proceso de unión puede dividirse en 2 etapas: i) difusión del ligando a través del receptor hasta el sitio de unión, y ii) la selección de aquella conformación (bioactiva) que cumple con las características geométricas y fisicoquímicas que le permiten unirse al receptor. En la presente memoria se ha estudiado la difusión molecular del ligando a través de la matriz proteica hasta el sitio de unión, así como la selección de la conformación bioactiva implicada en el reconocimiento ligando-receptor. En la primera parte se ha desarrollado una metodología Multinivel que proporciona un método eficiente para la exploración conformacional de moléculas tipo fármaco, permitiendo identificar estructuras estables y su población relativa. Hace uso de una exploración conformacional a nivel RM1 y posterior refinamiento a nivel más robusto de teoría: B3LYP y MP2. Se consigue así un buen balance costo/calidad para la estimación precisa de la población relativa de los confórmeros relevantes. Para compuestos en solución se utiliza la metodología de solvente continuo MST. Esto hace necesario derivar una nueva versión parametrizada del modelo MST para el hamiltoniano RM1. El modelo parametrizado ha probado proveer estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos neutros. El tratamiento de compuestos iónicos es más delicado, dado que existe una dependencia fuerte entre el factor de escalado utilizado para modular la frontera electrostática entre el solvente y el soluto y el grupo ionizable. El uso de un factor de escalado adaptado al entorno químico provee una estrategia computacional viable para obtener estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos cargados. Los resultados obtenidos para la histamina neutra son alentadores considerando la complejidad conformacional y tautomérica que presenta y coinciden con la mayoría de los estudios previos. En la segunda parte, se ha estudiado el impacto de las distorsiones de la planaridad del grupo hemo en la afinidad por O(2). Se halló que éstas pueden modular la afinidad de una globina por ligandos bimoleculares. Las distorsiones resultan en una disminución de la afinidad por O(2).con excepción del modo breathing, que implica la compresión-expansión del grupo hemo en el plano. El “breathing” positivo del hemo de la protoglobina “Methanosarcina Acetivorans” (MaPgb) podría contribuir a la alta afinidad por O(2) reportada dado que no presenta efecto distal, habitualmente responsable de la alta afinidad hallada en otras globinas. Por otra parte, la accesibilidad del ligando a esta proteína se logra a través de un sistema de túneles novedoso definido entre las hélices G y B (túnel 1) y B y E (túnel 2). El túnel 2, a diferencia del 1, está siempre abierto. Phe(145)G8 se halla en 2 conformaciones: abierta y cerrada, que regula la migración de ligandos a través del 1. La dimerización y la presencia de ligando unido al hemo facilitan la apertura del 1. La presencia del ligando unido al hemo es detectada por Phe(93)E11, y transmitida a Phe(145)G8 a través del cambio de las hélices B y E. Esto proporciona una explicación a los estudios cinéticos de Cristiano Viappiani. Cabe pensar que las conformaciones de ligación lenta y rápida reflejan la apertura del túnel 1 cuando se ha fijado un primer ligando en el grupo hemo. MaPgb podría participar en un proceso bimolecular, donde la entrada de un ligando facilitara de un segundo.
The study of ligand-receptor interaction is relevant to drug design. In this work we have studied: ligand diffusion through the receptor to the active site and selection of the bioactive conformation implied in ligand-receptor recognition In the first part we have developed a Multilevel methodology to efficiently explore the conformational space of drug-like molecules. It is based on a conformational search at a RM1 level and a “a posteriori” refinement with B3LYP and MP2. For molecules in solution a parametrization of the MST solvation model for RM1 was needed. Precise free energies of solvation have been obtained with the new set of parameters for neutral compounds. For ionic compounds there is a strong dependence with the scale factor used to modulate the electrostatic frontier between solvent and solute. The use of environment-adapted scale factor provides a suitable strategy. The results obtained for neutral histamine are encouraging considering its conformational and tautomeric complexity and agree with most of the previous studies. In the second part, we have studied the impact of heme distortions on its O2 affinity. Distortions reduce affinity with the exception of the breathing mode (compressionexpansion) Positive breathing found in “Methanosarcina Acetivorans” protoglobin (MaPgb) could contribute to the reported high O(2) affinity since there is no distal effect, generally responsible of high affinity in globins. A new tunnel system defined between G and B helices (tunnel 1) and B and E helices (tunnel 2) allows ligand access. Contrary to tunnel 1, tunnel 2 is always open. Phe(145)G8 is found in open and closed conformations that regulate migration through tunnel 1. Dimerization and the presence of a heme-bound ligand facilitate opening of tunnel 1. The bound ligand is detected by Phe(93)E11 and transferred to Phe(145)G8 through changes in helices B and E. This could shed light on the kinetic studies by Cristiano Viappiani. Slow and fast conformations could reflect the opening of tunnel 1 when another ligand is bound. MaPgb could be involved in a bimolecular process where the entrance of a ligand would facilitate binding of a second one.

L'objectiu del projecte és el desenvolupament de nous processos químics per a la modificació dels subproductes obtinguts en la producció del biodiésel, per obtenir ésters de propietats millorades com lubricants. Les tres propietats més importants que ha de tenir un fluid per al seu ús com lubricant són: viscositat, propietats en fred i estabilitat oxidativa. Els biolubricants de 1ª generació mostren una sèrie de limitacions quan són comparats amb els seus equivalents en base petroli. A causa de les condicions d'operació, els lubricants han de suportar altes temperatures (estabilitat química i oxidativa), igual que tenir unes bones propietats en fred (punt de fluència i de terbolesa). Aquestes propietats estan intrínsecament lligades a l'estructura química dels àcids grassos utilitzats en els biolubricants de 1a generació, on les insaturacions infereixen bones propietats en fred però una baixa estabilitat oxidativa degut a la seva alta reactivitat. Per obtenir biolubricants de 2ª generació es requereix la substitució de les insaturacions per ramificacions per tal d'augmentar l'estabilitat oxidativa dels compostos mantenint unes bones propietats en fred. En el present treball s'ha desenvolupat una nova via sintètica en tres passos utilitzant l'estratègia de epoxidació-obertura de les insaturacions, per obtenir compostos on les insaturacions han estat substituïdes per ramificacions éster-éster asimètriques. S'han caracteritzat els nous productes sintetitzats (densitat, viscositat, punt de fluència ...) per tal d'estudiar la relació estructura propietats. L’introducció de la ramificació produeix una millora substancial de l'estabilitat oxidativa dels compostos mantenint unes bones propietats en fred, la viscositat cinemàtica experimenta un notable increment a causa del procés de ramificació i algunes propietats poden ser modulades mitjançant la longitud de la ramificació. Les propietats dels nous compostos han estat comparades amb les propietats d'altres biolubricants de 2ª generació descrits a la bibliografia mostrant la gran diferència que produeix l'ús d'enllaços tipus èter o èster i la simetria o asimetria en les ramificacions. Un estudi computacional mitjançant dinàmica molecular dels diferents tipus de ramificació possibles, ha permès la racionalització del comportament dels diferents tipus de ramificació a nivell molecular. Finalment s'ha realitzat un estudi sobre la possibilitat d'obtenir aquests productes mitjançant tècniques de biotecnologia blanca, concretament l'esterificació d'alcohols altament impedits utilitzant lipases. Els resultats han mostrat que és possible obtenir compostos amb un alt valor afegit mitjançant un procés que millori els processos basats en la química tradicional.
El objetivo del proyecto es el desarrollo de nuevos procesos químicos para la modificación de los subproductos obtenidos en la producción del biodiésel, para obtener ésteres de propiedades mejoradas como lubricantes. Las tres propiedades más importantes que debe tener un fluido para su uso como lubricante son: viscosidad, propiedades en frío y estabilidad oxidativa. Los biolubricantes de 1ª generación muestran una serie de limitaciones cuando son comparados con sus equivalentes en base petróleo. Debido a las condiciones de operación, los lubricantes deben soportar altas temperaturas (estabilidad química y oxidativa), al igual que tener unas buenas propiedades en frío (punto de fluencia y de turbidez). Estas propiedades están intrínsecamente ligadas a la estructura química de los ácidos grasos utilizados en los biolubricantes de 1ª generación, donde las insaturaciones infieren buenas propiedades en frío pero una baja estabilidad oxidativa debido a su alta reactividad. Para la obtención de biolubricantes de 2ª generación se requiere la sustitución de las insaturaciones por ramificaciones con el fin de aumentar la estabilidad oxidativa de los compuestos manteniendo unas buenas propiedades en frío. En el presente trabajo se ha desarrollado una nueva vía sintética en tres pasos utilizando la estrategia de epoxidación-apertura de las insaturaciones, para obtener compuestos donde las insaturaciones han sido sustituidas por ramificaciones éster-éster asimétricas. Se han caracterizado los nuevos productos sintetizados (densidad, viscosidad, punto de fluencia…) con el fin de estudiar la relación estructura propiedades. La introducción de la ramificación produce una mejora sustancial de la estabilidad oxidativa de los compuestos manteniendo unas buenas propiedades en frío, la viscosidad cinemática experimenta un notable incremento debido al proceso de ramificación y algunas propiedades pueden ser moduladas mediante la longitud de la ramificación. Las propiedades de los nuevos compuestos han sido comparadas con las propiedades de otros biolubricantes de 2ª generación descritos en la bibliografía, mostrando la gran diferencia que produce el uso de enlaces tipo éter o éster y la simetría o asimetría en las ramificaciones. Un estudio computacional mediante dinámica molecular de los distintos tipos de ramificación posibles, ha permitido la racionalización del comportamiento los distintos tipos de ramificación a nivel molecular. Finalmente se ha realizado un estudio sobre la posibilidad de obtener estos productos mediante técnicas de biotecnología blanca, concretamente la esterificación de alcoholes altamente impedidos utilizando lipasas. Los resultados han mostrado que es posible obtener compuestos con un alto valor añadido mediante un proceso que mejore los procesos basados en la química tradicional.
The project aims to develop new chemical processes for the modification of the byproducts obtained in the production of biodiesel in order to obtain esters with improved properties as lubricants. The three most important properties that an oil should have to be used as a lubricant are: viscosity, cold properties and oxidative stability. The 1st generation biolubricants show some limitations when compared with their petroleum based counterparts. Due to the operating conditions, lubricants must withstand high temperatures (chemical and oxidative stability), as well as having good cold properties (pour point and turbidity). These properties are inherent to the chemical structure of the fatty acids used in 1st generation biolubricants, where the good cold properties are inferred by the unsaturations while giving low oxidative stability because of their high reactivity. To obtain 2nd generation biolubricants, it requires the unsaturation replacement by branches in order to increase the oxidative stability of the compounds while maintaining good cold properties. In this work we have developed a new synthetic pathway in three steps using the strategy of epoxidation-ring opening of unsaturations, in order to obtain compounds where the unsaturations have been replaced by ester-ester asymmetric branches. We have characterized the new synthesized products (density, viscosity, pour point ...) in order to study the relationship between structure properties. The introduction of branching produces a substantial improvement of the oxidative stability of the compounds while maintaining good cold properties, kinematic viscosity substantially increases due to branching and some properties can be modulated by the length of the branch. The properties of the new compounds have been compared with the properties of other 2nd generation bio-lubricants described in the literature, showing the difference produced by the use of ether or ester bonds and the symmetry or asymmetry of the branches. A computational study using molecular dynamics of different possible types of branching, has allowed the rationalization of the behavior of different types of branching at the molecular level. Finally, we have conducted a study on the possibility of obtaining such products through white biotechnology techniques, namely the esterification of hindered alcohols using lipases. The results have shown that it is possible to obtain compounds with high added value through a process which improves the available processes based on traditional chemistry.

El objetivo de la presente tesis es el de aportar conocimiento sobre la bioquímica y la farmacología de los receptores de adenosina, así como entender las relaciones entre estructura química y actividad farmacológica de los ligandos existentes para estos receptores. Con este objetivo se han empleado distintas técnicas y metodologías del diseño de fármacos asistido por ordenador. Los resultados presentados en este trabajo incluyen:

· El desarrollo de una estrategia original para la selección de una muestra que cubra adecuadamente la diversidad molecular existente en una base de datos de compuestos químicos
· La construcción de un modelo de la región transmembrana del receptor A1 humano de adenosina, en el que se ha localizado y caracterizado un sitio de unión de agonistas compatible con los datos experimentales.
· Predicciones teóricas de las energías de unión de ligandos, realizadas a partir de los complejos agonista-receptor predichos sobre el modelo mencionado, obteniendo un grado de acuerdo con los datos experimentales que resulta esperanzador
The goal of the present thesis is to gain knowledge about the biochemistry and pharmacology of adenosine receptors, as well as to understand structure-activity relationships for the existing ligands for this receptors. In order to achieve this goal, we have used several techniques and methodologies from the computer-aided drug design field. Results presented in this work include:

· The development of an original strategy of selection of a maximum diversity sample that adequately covers the original molecular diversity contained in a compound database
· The building of the transmembrane region of a human A1 adenosine receptor model. In such a model, an agonists binding site has been located and characterized, showing agreement with experimental data.
· The resulting ligand-receptor complexes have been studied with computational approaches for the prediction of ligand-binding free energies. A nice correlation with experimental results was observed

ABC (ATP-binding cassette) transporters are involved in translocate a wide spectrum of molecules across the lipid bilayer and some of them are associated with various diseases. They also have an important role in multidrug resistance (MDR) in cancer, which has been a major obstacle in cancer chemotherapy and in the treatment of leishmaniasis. While diverse transporters may confer MDR phenotype in bacteria, in human it is mainly achieved by five ABC proteins, among them P-glycoprotein/(ABCB1). To understand the structural basis of P-gp inhibitory activity, to determine the ligand binding sites within P-gp and to guide the design of more potent P-gp inhibitors, we performed i) a 3D-QSAR model using CoMSIA on a set of sesquiterpenes, ii) molecular docking simulations of various compounds in a homology model of LMDR1, a P-gp-like transporter belonging to the Leishmania ABC family and iii) and a complete study of sesquiterpenes interaction with human P-gp.
Los transportadores ABC (ATP binding cassette), encargados de transportar un amplio espectro de moléculas a través de la bicapa lipídica, pueden estar asociados con diversas enfermedades. Juegan un papel importante en la multirresistencia a fármacos (MDR), obstáculo importante en la quimioterapia del cáncer y en el tratamiento de leishmaniasis. En bacterias varios transportadores pueden conferir el fenotipo MDR, en humanos son principalmente cinco, entre ellos la glicoproteína P/(ABCB1). Para comprender la base estructural de la actividad inhibidora de P-gp, determinar los sitios de unión de los ligandos a P-gp y diseñar inhibidores de P-gp más potentes, se realizó i) un modelo 3D-QSAR usando CoMSIA en un conjunto de sesquiterpenos, ii) simulaciones de acoplamiento molecular de varios compuestos en un modelo de homología de LMDR1, transportador de la P-gp perteneciente a la familia ABC de Leishmania y iii) un estudio completo de interacción entre sesquiterpenos y la P-gp humana.

La investigación genética y epidemiológica de las enfermedades infecciosas requiere actualmente grandes cantidades de datos. En un laboratorio de tamaño medio, la información necesaria para realizar estudios de investigación suele almacenarse de forma independiente en diferentes formatos y lugares, lo que dificulta su gestión y análisis. Esta organización de la información conlleva que el trabajo habitual en un laboratorio se realice de forma lenta y desordenada. En esta situación, la integración de la información es de vital importancia para poder llevar a cabo estos trabajos de forma eficiente, sistematizada y común a todos los investigadores del laboratorio. La principal motivación de esta tesis fue cubrir la necesidad de un sistema de gestión y análisis de datos de forma sencilla, flexible y fiable. El objetivo principal de esta tesis consistió en el desarrollo de un sistema de información orientado al área de epidemiología molecular de patógenos infecciosos, que permitiese almacenar y analizar de forma centralizada la información clínica de pacientes junto con la información molecular de los patógenos de interés. En los últimos años, la bioinformática se ha convertido en una parte esencial de las soluciones eficientes de integración, transformación y creación de nueva información. epiPATH, la plataforma bioinformática que presentamos en esta tesis, consta de dos grupos de herramientas diferenciadas pero, a su vez, diseñadas para interactuar entre sí facilitando el manejo y análisis de grandes cantidades de datos. Por un lado, diseñamos y desarrollamos una base de datos junto con varias aplicaciones que facilitan su gestión y, por otro lado, integramos y desarrollamos diferentes aplicaciones de análisis que permitiesen realizar estudios epidemiológicos, evolutivos y poblacionales de las secuencias moleculares de los patógenos. El almacenamiento conjunto de datos clínicos de pacientes y de datos moleculares de patógenos en una base de datos centraliza la búsqueda y la gestión de información, facilitando comparaciones entre ellos y estudios sobre infecciones múltiples. Además, permite el estudio de la variación que existe dentro de los distintos patógenos y los cambios que registran a lo largo de su evolución, hasta su distribución en distintos pacientes con diferentes afecciones y cuadros clínicos. En este sentido, epiPATH también facilita la vigilancia epidemiológica basada en señales específicas de la enfermedad, mediante la identificación de regiones patógenas a través de la comparación de secuencias cuyos pacientes tengan un perfil clínico determinado. epiPATH incluye información desde el momento en que un paciente acude a un centro de salud hasta el análisis molecular del patógeno en el laboratorio. La información que recoge esta base de datos comienza en los lugares donde se puede encontrar un patógeno. Después, se puede recoger información clínica del paciente cuando acude al médico, se le realizan pruebas clínicas y se puede obtener información sobre el tipo de transmisión. Posteriormente, se aplica un tratamiento y se recogen muestras del patógeno que siguen un procesado de laboratorio. En el laboratorio, se obtienen secuencias que corresponden a un patógeno determinado asociado, en algunos casos, a un brote epidemiológico. Por otro lado, las secuencias pueden analizarse con métodos filogenéticos y publicarse en distintos trabajos generando una bibliografía. La integración de herramientas de análisis junto con la información almacenada en la base de datos facilita las tareas del flujo de trabajo habitual en un laboratorio y en colaboraciones con otras instituciones, preservando la información del acceso público. Además, los programas de análisis de genética poblacional y evolutiva desarrollados en esta tesis (epiPATH-tools) son de gran utilidad y permiten el análisis masivo de datos. Las epiPATH-tools incluyen el cálculo de parámetros relevantes en el estudio de la divergencia, posiciones sinónimas y no-sinónimas, pruebas de neutralidad y estudio de polimorfismos.
Large volumes of data are currently needed in genetics research and infectious diseases epidemiology studies. In a medium size laboratory, information needed in research studies is usually stored independently within different formats and places, which makes information management and data analysis a difficult task. This organization of information involves that the common laboratory workflow is made in a slow and disorganized way. In this situation, information integration is of vital importance to perform these kind of studies in an efficient, systematized and common manner for all the researchers in a laboratory. The main aim of this thesis was to cover the necessity of a data management and analysis system for molecular epidemiology studies of infectious diseases, that allow researchers to store and analyze clinical information of patients together with molecular data of pathogens in a centralized way. epiPATH, the bioinformatics platform that is presented in this thesis, has two different groups of tools designed to interact between them in order to ease the management and analysis of huge amounts of data. We designed and developed a database together with data management applications, and we also integrated and developed different analysis applications to perform molecular epidemiology, population and evolutionary genetics studies. From the moment a patient arrives to a hospital until the processing and analysis of molecular sequences obtained from infectious pathogens in the laboratory, lots of information is collected from different sources. Our database covers many aspects of samples, laboratory processes, molecular sequences, clinical information, treatments, pathogens, transmissions and outbreaks information. epiPATH allows researchers to perform comparisons between pathogens and multiple infections studies. Moreover, it allows studies from variability within pathogens and evolutionary changes to their distribution among patients with different clinical conditions. In this respect, our platform is also useful for the facilitation of surveillance based on either syndromic or disease-specific signals. We also developed the epiPATH-tools, a group of applications for population and evolutionary genetics that calculate parameters relating to a large amount of sequences. They include parameters of interest in the study of population divergence, synonymous and non-synonymous positions, neutrality tests and polymorphism studies.

Con el fin de relacionar la estructura y la actividad de series de compuestos, es importante usar descriptores moleculares relevantes. Los descriptores GRIND y VolSurf pertenecen a una nueva familia de descriptores llamado libre de alineamiento. Es decir, que no necesitan alinear los compuestos con el fin de comparar sus campos de interacciones molecular. En este estudio se ha aplicado esos descriptores para la selección de reactivos químicos a partir de una amplia base de datos. La selección se ha echo mediante un protocolo que permite maximizar la diversidad de la muestra y así obtener unos compuestos muy informativos. También se ha desarrollado nuevos descriptores de forma que están basado en los cambios de curvatura de la superficie molecular. Los resultados obtenidos indican que los nuevos descriptores de forma se integran muy bien en los descriptores GRIND originales y que permiten identificar los efectos de forma tanto favorable como desfavorable. Además, se ha desarrollado nuevos descriptores libre de alineamiento llamado 'anchor-GRIND' que usan un átomo de cada molécula como punto de referencia para la comparación de los campos de interacciones molecular. Los descriptores 'anchor-GRIND' permiten una descripción mas precisa y mas sencilla que los descriptores GRIND lo que los hace mas relevante para el análisis de ciertas familias de compuestos.
In order to correlate the differences of structure with the differences of activity of series of compounds, it is important to use relevant molecular descriptors. The GRIND and VolSurf descriptors belong to the so-called alignment-free descriptors family. In other words, they do not require to align the compounds in order to compare its molecular interaction fields. In this study, we applied these descriptors to the selection of chemical reagent from a database of compounds. The selection has been done following a protocol which allows to maximize the diversity of the sample and so to obtain some compounds highly informative. In addition we developed new shape descriptors which are based on the changes of curvature of the molecular surface. The results obtained show that the new shape descriptors are well integrated in the original GRIND descriptors. Furthermore, we designed new alignment-free descriptors called 'anchor-GRIND' which use one atom of each molecule as a reference point for the comparison of the molecular interaction fields. The 'anchor-GRIND' descriptors allow a more precise and more simple description than the GRIND descriptors, which makes them more relevant for the analysis of some families of compounds.

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Desarrolla una técnica de PCR para identificar la mutación 904_906delGAG/907_909delGAG del gen TORSINA1A. Utilizando 5 muestras de personas saludables (controles negativos) y 2 muestras de pacientes DYT1 (controles positivos). Se estandarizó dos protocolos de PCR convencional, uno con 4 y otro con 2 cebadores. Los cebadores fueron diseñados con el programa AmplifX. Los ensayos in vitro revelaron una baja especificidad de los cebadores 3 y 4 en el primer protocolo. El protocolo con 2 cebadores, mostró una banda adicional con un patrón de migración semejante a un fragmento de 250 pb, solo presente en controles positivos, y consistente con los resultados de PCR-RFLP, técnica estándar de oro para identificar esta deleción. Utilizando el protocolo PCR con dos cebadores, se identificó la deleción 904_906delGAG/907_909delGAG en 5 de 25 pacientes (20%) con sospecha de DYT1 atendidos en el servicio de Neurogenética del INCN. Un protocolo basado en PCR convencional con dos cebadores permite discriminar la presencia de la mutación 904_906delGAG/907_909delGAG del gen TORSINA1A vinculada a DYT1. Estudios posteriores que analicen la banda adicional obtenida con los cebadores 1 y 2, permitirían validar este procedimiento para diagnóstico en la práctica clínica.
Tesis

Construye un sistema de adquisición de datos con la interfaz Arduino Mega 2560 para el estudio de fenómenos físicos, para ello haremos la programación en bloques con el software LabVIEW. Se realizaron tres adquisiciones de datos, la primera se refiere a la carga de un capacitor luego sobre la absorción de radiación, y por último referente al periodo de un péndulo. Es importante notar que estas adquisiciones de datos son en tiempo real y sus gráficas correspondientes son corroboradas con las teorías respectivas de cada tema. Se utilizó una laptop i7 Toshiba Ram 16gb 2T DD en la cual previamente se instaló el software LabVIEW 2017, VISA, VIP, LINX y ARDUINO 1.6. Una vez configurados los softwares conectamos la tarjeta mediante el puerto USB. LabVIEW presenta un panel frontal (controla el proceso de adquisición de datos) y un diagrama de bloques (es la programación en sí).
Tesis

La aplicación de métodos de dinámica molecular (MD) para el estudio de sistemas biológicos. Esta tesis se centra en la aplicación tanto de dinámica molecular clásica como perturbación de energía libre (FEP) para estudiar sistemas biológicos tales como los receptores acoplados a proteínas G y los inhibidores de BACE1. La tesis se divide en 5 secciones, en primer lugar, una introducción donde se explica la evolución de la metodología de MD, en segundo lugar, una sección sobre métodos utilizados en esta tesis, la tercera sección se centra en el uso de simulaciones de MD para estudiar dos aspectos diferentes de los GPCR, oligomerización del tetrámero formado por receptores de adenosina y el mecanismo de activación por ligandos alostéricos dirigidos al receptor metabotrópico de glutamato 2. La cuarta sección se centra en la aplicación de FEP con el objetivo de diseñar nuevos inhibidores de BACE1 y poner en práctica esta metodología en un proyecto de desarrollo de fármacos realizado en colaboración con Janssen Pharmaceutica. La última sección resume las conclusiones alcanzadas. En general, se demuestra que los métodos de Dinámica Molecular, puede ser de gran valor para comprender los escenarios descritos a nivel molecular, y, en particular, las interacciones y los procesos dinámicos que se producen. Esto a su vez ayudará a la comprensión más detallada de la biología básica y el diseño de fármacos. El trabajo justifica aplicaciones futuras en estas áreas y continua la exploración de forma detallada de la influencia que los métodos MD y FEP pueden alcanzar.
Application of Molecular Dynamics (MD) methods to the study of biological systems. This thesis is focused on the application of both classical MD and free energy perturbation (FEP) to study biological systems such as G protein-coupled receptors and BACE1 inhibitors. The thesis is divided into 5 sections, firstly an introduction where a timeline and evolution of MD methodology is explained, secondly a second section on Methods, the third section focuses on the use of MD simulation to study two different aspects of GPCRs, oligomerization of the tetramer formed by Adenosine receptors and the mechanism of activation by allosteric ligands targeting the metabotropic glutamate 2 receptor. The fourth section is focused on the application of FEP with the aim of designing new BACE1 inhibitors and to implement this methodology into a real drug discovery project performed in collaboration with Janssen Pharmaceutica. The final section summarizes the conclusions reached. Overall, it is shown that state of the art MD simulations, and hence modern computational methodology, can be of value to understand the described scenarios at the molecular level, and in particular the interactions and dynamic processes which occur. This in turn will help with more detailed understanding of basic biology and drug design. The work justifies future applications in these areas and continued deeper exploration of the limits of the impact which MD and FEP methods can reach.

El terme infeccions de transmissió sexual (ITS) inclou una sèrie de síndromes causats per agents patògens que poden ser adquirits mitjançant l'activitat sexual am un augment de la seva als últims anys. Sota el concepte d'ITS s'agrupen tant les malalties venèries clàssiques (uretritis, sífilis, chancroide i limfogranuloma veneri) i aquelles en què la via sexual no és l'únic (hepatitis B i C, l'amebiasis intestinal en HSH, la infecció per virus de la immunodeficiència humana (VIH) i algunes parasitosis). Els patògens més importants engloben Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, VIH i altres microorganismes emergents com el Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum i Ureaplasma parvum. El correcte diagnòstic de les ITS té importància tant com a problema de salut pública com per les complicacions que poden produir en aquells pacients no diagnosticats. A la pràctica clínica moltes vegades les ITS són diagnosticades sindrómicament bé per no disposar de proves sensibles, bé per la manca en alguns laboratoris d'aquestes eines. La Tesi té 3 objectius principals que s'han abordat en tres articles diferents. El primer objectiu és l'avaluació d'una tècnica de avidesa per a la identificació d'infecció recent pel VIH 1 utilitzant un immunoassaig automatitzat de quimioluminiscència (QLIA). RITA de l'anglès Recent Infection Testing Algorithm és un nom genèric per a una sèrie de tècniques de laboratori que distingeixen la infecció recent pel VIH. L'estudi indica que l'assaig d'avidesa avaluat és un mètode fiable per identificar infeccions recents per VIH-1 i podria ser utilitzat dins un algoritme RITA per estimar la incidència d'infecció per VIH-1 en la població. El segon objectiu de la Tesi va ser descriure la utilitat d'una tècnica automatitzada Vitros Syphilis TPA (assaig treponèmic per QLIA) per fer el diagnòstic de la sífilis comparant-lo amb tècniques de enzimoimmunoanàlisi, així com a primer pas de el nou algoritme revers de la sífilis en relació a les proves clàssiques, Rapid Plasma Reagin (RPR) i Treponema Pallidum hemagglutination assay (TPHA). Aquesta tècnica permet actuar com a tècnica de cribratge en laboratoris amb alta càrrega de treball gràcies al seu alt valor predictiu negatiu. Per completar l'estudi de les ITS, el tercer objectiu de la Tesi va ser estudiar i avaluar una nova tècnica de biologia molecular mitjançant PCR multiplex, a partir de diferents tipus de mostres provinents de poblacions seleccionades i estudiades prèviament per altres tècniques. Aquest mètode permetria detectar a partir d'una sola mostra, set diferents agents causals d'ITS (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis i Mycoplasma genitalium). Les dades obtingudes de sensibilitat, especificitat i valors predictius al comparar-los amb les tècniques convencionals utilitzades en el nostre laboratori van ser molt bons, permetent per tant, l'adopció d'aquests mètodes com a tècnica per al diagnòstic de les MTS. Un altre punt fort va ser la possibilitat de detecció de Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis i Mycoplasma genitalium. La seva controvertida detecció, sobretot dels tres primers, encara avui, presenta algunes ombres que esperem poder aclarir a mesura que anem coneixent. Les noves tècniques moleculars i immunològiques avaluades en aquesta Tesi han resultat útils per a la detecció d'agents causals d'ITS. En general, els assajos de PCR són molt sensibles i específics en comparació amb altres tècniques com els cultius. D'altra banda, la introducció d'estratègies basades en PCR múltiples permetria identificar pacients amb coinfeccions i també explicar errors en tractaments.
The term sexually transmitted infections (STIs) includes a number of syndromes caused by pathogens that can be acquired through sexual activity with a high incidence in recent years. Under the concept of STI are grouped both classical venereal diseases (urethritis, syphilis, chancroid and lymphogranuloma venereum) and others with different ways of transmission (hepatitis B and C, MSM intestinal amebiasis, infection with human immunodeficiency virus (HIV) and some parasites). Encompass the most important pathogens Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, HIV and other emerging organisms like Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. The correct diagnosis of STIs is important for public health problem and because the complications that can occur in patients undiagnosed. In clinical practice often STIs have a syndromeic diagnosis, sometiems by the lack of sensitive of the diagnostic tests employed or by the lack of these tools in some laboratories. The Thesis has three main objectives that have been addressed in three different articles. The first objective is to evaluate an avidity technique to identifying recent infection by HIV 1 using an automated chemiluminescence immunoassay (QLIA). Recent Infection Testing Algorithm (RITA) is a generic name for a variety of laboratory techniques that distinguish the recent HIV acquisition. The study indicates that the test is a reliable method to identify recent HIV-1 infection and could be used in a RITA algorithm to estimate the incidence of HIV-1 infection in the population. The second objective of the Thesis was to describe the use of an automated technical VITROS Syphilis TPA (treponemal QLIA assay) for diagnosis of syphilis compared to other enzymeimmunoassays, as well as the classic reaginic test, and its use as a first step in the new reverse algorithm comparing with the classic Rapid Plasma Reagin (RPR) with subsequent confirmation with Treponema Pallidum hemagglutination assay (TPHA). The easy use of this automatic system can be implemented as a screening test in laboratories with high workload due to its high negative predictive value. To complete the study of STIs, the third aim of the Thesis was to study and evaluate a new biology molecular technique using PCR multiplex with different types of samples from selected populations previously studied by other techniques. This method allows the detection of seven major pathogens of STI (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium) from a single sample. The data obtained were compared with the conventional methods performed in our laboratory. The sensitivity, specificity and predictive values obtained were highly significant, allowing the adoption of this technique for the diagnosis of STIs. Another objective was the ability to detect Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium. His controversial presence, still presents some shadows that hopefully we can clarify as we know them. New molecular and immunological techniques evaluated in this Thesis have been useful for detecting causative agents of STI. In general, PCR assays are highly sensitive and specific when compared with other techniques such culture or wet mounts examinations. Furthermore, the introduction of multiple PCR based strategies would identify patients with coinfections and also explain failures in treatments.

Three-dimensional ligand-based virtual screening methods have been used for many years in drug discovery, with a variable success depending on different factors, such as the complexity of the target system or the suitability of the molecular descriptors. New approaches are still necessary to cover the broad spectrum of relationships that a drug-like molecule may establish with the organism. In spite of the complexity of processes that modulate the activity of a drug, most tools are primarily focused on the use of shape or electrostatic descriptors. In contrast, since the importance of lipophilicity in pharmacodynamics and pharmacokinetics process, an exact representation of the 3D pattern of hydrophobic/hydrophilic regions can be a valuable guideline to enhance the molecular similarity studies. In this scenario, PharmScreen was conceived as a tool to exploit lipophilic 3D similarity. Exploiting the MST contributions to octanol/water partition coefficients, the capacity to perform correct molecular overlays and distinguish between active and inactive molecules is discussed. The overlap algorithm is validated against the AstraZeneca test, which comprises 121 experimentally derived sets of molecular overlays. The results point out the suitability of the MST-based hydrophobic parameters for generating molecular overlays, as correct predictions were obtained for 94%, 79%, and 54% of the molecules classified into easy, moderate, and hard sets, respectively. Moreover, the results point out that this accuracy is attained at a much lower degree of identity between the templates used by hydrophobic/HB fields and electrostatic/steric ones. On the other hand, the topological hydrophobic descriptors proposed are applied over 3D-QSAR models. In this context, the Miertus–Scrocco–Tomasi-derived hydrophobic descriptors have been shown to provide models for structure–activity relationships with a predictive accuracy comparable to traditional techniques based on electrostatic/steric parameters. The results reported support the assumption that lipophilicity, supplemented by HB acceptors/donors, provides a useful signature to enrich the information that can be retrieved from (i) molecular alignment and (ii) QSAR models, complementing the results obtained traditionally from electrostatic and steric properties. Taken together, lipophilicity is presented as a valuable alternative for the molecular similarity study. In addition, the applicability of our descriptors in structure-based methods has been explored in order to re-evaluate the complexes constituted by docking techniques (in our case, Glide). Since (de)solvation is fundamental for the establishment of the ligand-receptor complex, it can be expected that the docked ligands in the same pocket share lipophilic characteristics, even if there are several binding modes. However, approximations that affect solvation contribution are applied in the docking score functions, and by extension, some docking programs show problems performing VS especially in hydrophobic binding pockets. Specific binding typically requires the formation of key interactions between targets and ligands. Thus, 3D similarity relative to experimental binding modes could be sufficient to distinguish active compounds from decoys. In view of the results obtained the similarity descriptors proposed are introduced as a valid scoring function for discerning between active and inactive compounds. These findings support the usefulness of lipophilicity as driver descriptors in molecular similarity studies promoting their use in virtual screening campaigns considering LB approaches or in combination with SB. As conclusion, results obtained from the analysis of hydrophobic/hydrophilic descriptors presented in this thesis opens a new window to explore the vast chemical space, complementing the information derived from traditional descriptors in ligand- and structure-based approaches.
El fet d'assumir que molècules estructuralment semblants donaran lloc a activitats biològiques similars ha estat una idea àmpliament explotada en el disseny de fàrmacs. Aquesta premissa subjau en la majoria de les aplicacions pràctiques en recerca química i farmacèutica. No obstant això, el concepte de similitud molecular és subjectiu i la seva interpretació pot variar segons l’ús que se’n vulgui derivar. La quantificació d’aquesta mesura de semblança molecular depèn de la representació de les característiques químiques presents en l'estructura molecular mitjançant descriptors 1D, 2D o 3D, la ponderació d'aquests descriptors i l'expressió matemàtica de la funció de similitud. En l’àmbit de les característiques químiques utilitzades en els mètodes tridimensionals de similitud molecular, les propietats electrostàtiques i estèriques han estat dominants tradicionalment. Tanmateix, això oculta el paper fonamental exercit per altres contribucions a l'afinitat d'unió, com els canvis en la (de)solvatació del lligant i del receptor. Malgrat la seva rellevància, la lipofilicitat ocupa aparentment un paper secundari com a descriptor principal del reconeixement lligand-receptor. Sota aquesta premissa s’ha desenvolupat una eina de cribratge virtual 3D basada en lligands (PharmScreen) que explota les relacions de similitud entre topologies hidrofòbiques derivades del model continuo de solvatació Miertus – Scrocco – Tomasi (MST). Els estudis reportats al llarg d’aquesta tesis recolzen la utilitat de les contribucions atòmiques a la lipofilicitat com a descriptors fonamentals en estudis de similitud, complementant la informació derivada dels descriptors tradicional. PharmScreen es presenta, així, com una eina competitiva per aplicar en campanyes de cribratge virtual basada en lligand o en combinació amb tècniques basades en proteïna, obrint una nova finestra en l’ampli espai químic.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular.
Durante la maduración de los frutos, existen cambios a nivel fisiológico y bioquímico, como son: variaciones en la respiración, textura, color y acidez; como consecuencia de la remodelación de la pared celular, síntesis y degradación de pigmentos y variaciones en la acumulación de azúcares y ácidos orgánicos. Los dos últimos, son utilizados por las células vegetales como sustratos respiratorios, y particularmente los ácidos orgánicos como el ácido cítrico y málico tienden a ser degradados a lo largo de la maduración. En contraposición a lo anterior, estudios previos realizados en nuestro laboratorio en frutos de Annona cherimola var. Concha Lisa, se encontró mayores niveles de ácido cítrico, mayor actividad citrato sintasa y una mayor acumulación de transcrito codificante para la enzima citrato sintasa (CS) en el estado de madurez de consumo en comparación con el estado analizado en cosecha. Considerando lo anterior, la enzima CS parece tener un rol importante en la acumulación de citrato en frutos de chirimoya. Como una primera aproximación al estudio de su posible función, este seminario de título tiene por objetivo general caracterizar Ac-mCS mediante su localización subcelular en N. tabacum y la transformación estable de S. lycopersicum, a través de dos estrategias enfocadas en la expresión heteróloga de la enzima mCS de A. cherimola var. Concha lisa. Se observó mediante microscopía confocal, que la enzima Ac-mCS posee localización mitocrondial en hojas de Nicotiana tabacum. Por otro lado, para la transformación de tomate se construyeron y utilizaron dos vectores para la expresión heterologa de Ac-mCS bajo el control del promotor CaMV 35S y de un fragmento del promotor de poligalacturonasa de tomate (PG), sometiéndose los explantes de tomate a la transformación y organogénesis somática, pero sin lograr obtener plantas transgénicas adultas.
During fruit ripening, biochemichal and phisiological changes occur, such as variations in respitarory rate, texture, colour, and acidity; as a consequence of the cell wall remodelation, pigments synthesis and degradation, and variations in the accumulation of sugar and organic acids. The latter ones, are vegetable cell metabolic substrates, and particularly organic acids such as citric and malic acid, tend to be degraded during ripening. However, previous studies held in our laboratory in Annona cheriloma cv Concha Lisa fruits, showed increased levels in citric acid, increased citrate synthase activity and large mitochondrial citrate synthase (Ac-mCS) transcript accumulation at consumption maturity compared to the analyses performed at harverst. Considering all these points, citrate synthase seems to account for an important role in the citrate accumulation in cherimola fruit. As a first approach to the potential function of this enzyme, the main objective of this work was to characterize Ac-mCS by subcellular localization in N. tabacum, and stable transformation of S. lycopersicum, using two strategies, both of them focused in the mCS enzyme heterologue expression from A. cherimola cv. Concha lisa. Confocal microscopy in Nicotiana tabacum leaves revealed that the Ac-mCS enzyme has a mitochondrial localization. On the other hand, two expression vectors were built and used to express Ac-mCS under the transcriptional control of the CaMV 35S promoter or the tomato polygalacturonase promoter fragment (PG).Tomato explants were, subjected to the transformation process, and somatic organogenesys, but no adult transgenic plants were obtained.

La introducción de la nanomedicina en el ámbito de la farmacología ha revolucionado la administración de fármacos, con la aparición de nuevos tratamientos con mayor especificidad, aumentando el rendimiento biológico y farmacológico, ofreciendo así alternativas interesantes para formular nuevas moléculas. El presente trabajo tiene como finalidad el diseño de NPs poliméricas y liposomas para su aplicación en la “Terapia Ocular” y el “Diseño de inhibidores del HIV-1”. En la primera parte de este estudio se desarrollaron formulaciones que contienen Flurbiprofeno, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), que se utiliza en la cirugía de cataratas. Para ello se siguieron dos estrategias de preparación distintas: 1) NPs derivatizadas en la superficie con PEG y péptidos, abreviadas como PLGA-NPs-PEG-Péptido, 2) y la síntesis de copolímeros PLGA-PEG-Péptido con posterior preparación de las NPs, abreviadas como PLGA-PEG-Péptido-NPs. De todas las formulaciones desarrolladas, las PLGA-PEG-Péptido-NPs, en específico las PLGA-PEG-POD-NPs, han presentado los mejores resultados, obteniéndose una estrecha distribución de tamaño de partícula, una alta eficiencia de encapsulación del Flurbiprofeno y una liberación más sostenida. Asimismo, su morfología esférica se pudo comprobar mediante las técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica. Estas presentaron un tamaño de partícula apropiado, y mejoraron la biodisponibilidad y el tiempo de residencia del Flurbiprofeno en el saco conjuntival. Su menor tamaño de partícula fue un aspecto importante que condujo a una óptima tolerancia ocular y una mayor respuesta antiinflamatoria. En la segunda parte de este proyecto se estudiaron péptidos derivados de las proteínas de envoltura (E1 y E2) del virus GBV-C. Con aras de aumentar la capacidad anti-HIV-1 del péptido P6-2 (perteneciente a la proteína E2) se realizaron diferentes modificaciones químicas de su estructura: incorporación de un ácido graso en el extremo amino terminal (Pal-P6-2), obtención de NPs poliméricas del tipo PLGA-PEG-NPs-P6-2 y liposomas con diferentes composiciones, del tipo LUV, que contienen los péptidos P6-2 y la molécula quimérica resultante de la unión de este último péptido y el péptido VIR, previamente reportado por su capacidad anti-HIV-1 (VIR-P6-2). Paralelamente se han obtenido nanopartículas de PLGA derivatizadas con el péptido de fusión del HIV-1 (NPs PLGA-PF-HIV-1). Este esfuerzo atendió al creciente interés del estudio de interacción de péptidos provenientes de la proteína E1 del GBV-C. El péptido E1P8 cíclico es un fragmento de la proteína E1 del GBV-C que ha mostrado tener una elevada capacidad inhibitoria. La técnica de Diferencia de la Transferencia de Saturación (RMN-STD) ha mostrado una gran utilidad para llevar a cabo estudio de interacción receptor-ligando. Este estudio nos permitió afirmar que existe una interacción entre el péptido E1P8 cíclico y las NPs PLGA-PF-HIV-1, obteniéndose mayor intensidad en las señales de STD. La intensidad de la señales se traduce como una escala de proximidad de las distintas zonas de la estructura peptídica (E1P8 cíclico) a las NPs PLGA-PF-HIV-1, manifestando que existe interacción a nivel atómico.
In this work, polymeric nanoparticles (NPs) and liposome were designed to be used in two lines of research: “Ocular delivery” and “Peptide inhibitors of HIV-1”. Peptide for ocular delivery (POD) and human immunodeficiency virus transactivator were conjugated with biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)–polyethylene glycol (PEG)-nanoparticles (NPs) in an attempt to improve ocular drug bioavailability. The NPs were prepared by the solvent displacement method following two different pathways. One involved preparation of PLGA NPs followed by PEG and peptide conjugation (PLGA-NPs-PEG-peptide); the other involved self-assembly of PLGA-PEG and the PLGA-PEG-peptide copolymer followed by NPs formulation. The conjugation of the PEG and the peptide was confirmed by a colorimetric test and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy. Flur¬biprofen was used as an example of an anti-inflammatory drug. The physicochemical properties of the resulting NPs (morphology, in vitro release, cell viability, ocular tolerance and in vivo anti-inflammatory efficacy) were studied. Taken together, these data demonstrate that PLGA-PEG-POD NPs are promising vehicles for ocular drug delivery. GBV-C has the beneficial effect of retarding the progression of AIDS in people who are coinfected with both the GBV-C and HIV viruses. In previous works, peptides derived from the envelope proteins (E1 and E2) of GBV-C virus were studied. In order to increase the anti-HIV-1 activity of the peptide P6-2 (belonging to the E2 protein), different chemical modifications of its structure were made: addition of a fatty acid, conjugation to NPs and liposome containing P6-2 peptide and the chimeric molecule resulting from the binding of the latter peptide and VIR peptide (VIR-P6-2), previously reported by their anti-HIV-1 activity. Liposomes containing peptide VIR-P6-2 showed an increase inhibitory activity in the order of 3-6 times. On the other hand, E1P8 cyclic peptide (belonging to the E1 protein) has demonstrated a higher anti-HIV-1 activity. Saturation transfer difference (STD)-NMR is a method that allows to screen the binding of compounds to a receptor and to characterize the binding epitope. STD-NMR results indicate that E1P8 cyclic peptide is able to interact with the peptide fusion of HIV-1 and open new perspectives to design new GBV-C peptide based entry inhibitors.

El diseño enzimático es el área basada en el descubrimiento y/o optimización de biomoléculas para el desarrollo de reacciones químicas no naturales. Es un área que se encuentra en su mayor crecimiento y constituye uno de los puntos clave en la transición de la química hacia alternativas más ecológicas. Una manera elegante de sintetizar nuevos biocatalizadores es mediante la inclusión de cofactores organometálicos en estructuras biológicas, dando lugar a lo que se conoce como Metaloenzimas Artificiales (ArMs). Estos híbridos combinan la versatilidad catalítica de los compuestos organometálicos con la especificidad de los receptores biológicos. El diseño de ArMs ha crecido exponencialmente en las últimas dos décadas gracias al desarrollo de áreas como la biología estructural y la catálisis organometálica. La modelización molecular trata de guiar los diseños proporcionando información estructural para la construcción de catalizadores óptimos. Sin embargo, a pesar de los avances en rendimiento computacional y de nuevas técnicas computacionales, la complejidad del trato de sistemas que contienen metales de transición hace que el área de los ArMs no sea propiamente explorado por los modelizadores. El grupo InSiliChem, dónde se ha desarrollado este Ph.D., se centra en el desarrollo de estrategias para el estudio y el diseño de ArMs. En particular, se basa en el desarrollo de estrategias computacionales multinivel que incluyen una gran variedad de técnicas computacionales. Este Ph.D. trata de aumentar el potencial de la plataforma computacional para el diseño de ArMs 1) mediante la incorporación de distintas técnicas como la simulación de Dinámica Molecular (MD) y 2) validando el procedimiento mediante el diseño de casos enzimáticos reales. Los resultados obtenidos se resumen en los siguientes puntos: • Se ha descrito el mecanismo catalítico de dos nuevas ArMs. Estas son: una hidratasa basada en el receptor LmrR (Lactococcus Multidrug Resistance Regulator) que incluye un cofactor de Fenantrolina unida a cobre; y una variedad de mutantes de complejos de Streptavidina-Noyori capaces de realizar la reducción de iminas cíclicas. Este estudio revela la importancia de la contribución de las simulaciones MD como parte del protocolo computacional para la decodificación del mecanismo catalítico de los nuevos enzimas, así como el impacto de la segunda esfera de coordinación en las tendencias catalíticas. (Capítulo 4) • Basándonos en la misma metodología, se han modelizado nuevas hidratasas basadas en la inclusión de amino acidos no naturales (UAA). Primero, aplicados a la proteína LmrR, para la que fueron computacionalmente propuestos nuevos mutantes más eficaces en cuanto a la enantioselectividad del sistema (fueron después experimentalmente validados). Después, basándonos en la experiencia adquirida, el concepto de novo fue expandido al diseño de Metalopéptides Artificiales. (Capítulo 5) • La última parte del trabajo se centra en descifrar variables moleculares que en los estudios previos han resultado de gran relevancia. Entre ellos, la relación entre la configuración estructural del centro activo y la actividad catalítica del ArM. En particular, se ha estudiado la adaptabilidad de una variedad de complejos LmrR-hemo claves para el transcurso de la reacción de ciclopropanación. Los resultados sugieren que la flexibilidad del receptor es un punto crítico para que los ArMs basados en el grupo hemo adquieran actividad catalítica. Con el objetivo de profundizar más en la importancia de esta variable molecular, este estudio se ha expandido, además, a proteínas naturales reconocedoras del grupo hemo. (Capítulo 6) En conclusión, este Ph.D. representa un paso adelante en el desarrollo metodológico del diseño computacional de Metaloenzimas Artificiales. El trabajo realizado clarifica la importancia de la cooperación a nivel molecular entre los compuestos basados en metales de transición y sus receptores biológicos. Ésto facilita el camino hacia nuevos diseños de biocatalizadores basados en Metaloenzimas Artificiales.
Enzyme design is the scientific field that aims at discovering and/or optimizing biomolecules to reach new-to-Nature reactions. It is an area in wild expansion and constitutes one of the cornerstones of the transition of chemical practices towards greener alternatives. An elegant way to construct novel biocatalysts is through the embedding of organometallic cofactors into biological scaffolds, leading to the so-called Artificial Metalloenzymes (ArMs). These hybrids bridge the catalytic versatility of the organometallic compound with the substrate and spatial specificity of the biological host. The design of ArMs has spread increasingly during the last two decades taking clear advantage of the major expansion of structural biology and the maturity of organometallic catalysis. Molecular modelling aims to help designers to provide with structural information that could serve for constructing optimum biocatalysts. However, despite the increasing improvement of the computation performance and the exponential development of new simulation techniques, the complexity of dealing with transition metal including systems has promoted modellers not to explore the ArM constructs. The InSiliChem group, in which this Ph.D. has been performed, has focused on developing a specific framework for the study and design of ArMs. In particular, this has been based on the development of in silico multiscale strategies including standard computational methods. This Ph.D. aims at increasing the potentiality of our computational platform for ArM design by 1) including classical Molecular Dynamics simulations into the integrative computational framework and 2) testing the validity of the methodology for the design of real case ArMs. The results obtained could be summarize as follows: • The catalytic mechanism of two novel ArMs were decoded using the updated computational pipeline. These were a copper-Phenanthroline containing hydratase based on the Lactococcus Multidrug Resistance Regulator (LmrR) and a variety of novel mutants based on Streptavidine-Noyori complexes for cyclic imine reduction reaction. The study revealed the importance of the contribution of the MD simulations to decode the catalytic mechanism of these ArMs and to assess the impact of second sphere mutations on the catalytic tendencies. (Chapter 4) • Using the same approach, calculations were carried out for the in silico design of hydratases, but in this case based on the inclusion of a novel unnatural amino acid. This was first applied to the LmrR scaffold, for which mutants suggested via computation for optimum enantiomeric excess (ee) were then experimentally assessed with success. Next, based on the experience obtained, we expanded the de novo exercise towards the design of Artificial Metallopeptides. (Chapter 5) • The final part of the work focused on deciphering molecular variables that our previous studies showed to be far more complex than expected. This was the impact of the active site configuration to define the catalytic activity of the ArMs. In particular, we decoded the rearrangement of a variety of LmrR-heme complex for the cyclopropanation reaction to proceed. From this study it clearly appeared that the flexibility of the receptor is key for the porphyrin based ArMs to reach their catalytic activity. To further assess the importance of this molecular variable, we expanded this work to the study of distinct naturally occurring heme binding proteins. (Chapter 6) Overall, this Ph.D. represents a step forward on the methodological development of the computer based enzyme design. Furthermore, it sheds light on how transition metal compounds could cooperate with biological scaffolds at the molecular level with the focus on the de novo design of new biocatalysts.

La piriculariosis del arroz, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, es la enfermedad que más pérdidas genera devastando miles de hectáreas de cultivo anualmente. Los tratamientos antifúngicos frente a esta enfermedad suelen ser de poca utilidad y se vuelven ineficaces en poco tiempo debido a la alta tasa de variación del hongo. Además, dentro del contexto legislativo actual a nivel europeo, se está restringiendo cada vez más la utilización de compuestos antifúngicos de amplio espectro debido a los posibles daños que pueden ocasionar sobre el ecosistema y la salud humana. Una alternativa prometedora al uso de los antifúngicos convencionales son los péptidos antimicrobianos, y más concretamente los péptidos dirigidos capaces de bloquear un proceso esencial para la infección del patógeno. Un paso fundamental en el proceso infectivo del hongo M. oryzae es la formación del apresorio, cuya finalidad es romper la superficie foliar y así penetrar en el mesófilo de la hoja. El desarrollo de compuestos capaces de bloquear específicamente este proceso sin afectar al ciclo vital del hongo constituiría una estrategia ventajosa en el control de la piriculariosis, a priori no tóxica para otros organismos incluido el ser humano. En este trabajo, hemos abordado este objetivo mediante dos aproximaciones, el cribado de una biblioteca combinatoria de péptidos y la modificación de secuencias de AMPs naturales mediante diseño racional. Gracias al conocimiento que se tiene sobre la secuencia y el modo de acción de los péptidos antimicrobianos, hemos diseñado una serie de péptidos capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis mediante inhibición específica de la formación del apresorio en M. oryzae, pero sin afectar a la viabilidad celular. Nuestros resultados indican que péptidos pequeños, como el heptapéptido PAF104, son capaces de reprimir la expresión de los genes MoMSB2 y MoMST11, implicados en la ruta de señalización de la MAPK Pmk1 imprescindible para la formación del apresorio en M. oryzae. Además, demostramos un comportamiento diferencial frente a distintas estructuras infectivas (i.e., apresorio, estructuras similares al apresorio e hifopodios), lo que apoya la idea propuesta por otros investigadores de que los mecanismos moleculares que regulan estás estructuras no son exactamente iguales. Mediante microscopía confocal mostramos que el tratamiento del hongo con MgAPI16 da lugar a apresorios aberrantes y no funcionales. En conclusión la principal aportación de esta investigación es el diseño de una serie de péptidos sintéticos, los heptapéptidos diseñados de novo PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47, y el péptido MgAPI16 derivado del péptido antimicrobiano natural CecA, capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis en arroz mediante la inhibición específica de la formación del apresorio. Este trabajo contribuye por tanto al diseño de estrategias de control en protección vegetal basadas en péptidos dirigidos, las cuales deberían ser sostenibles y respetuosas con el medio ambiente.
Rice blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae is the most devastating rice disease, causing losses and ravaging thousands of hectares every year. Antifungal treatments are often ineffective and become useless soon due to the high fungus variation rate. Furthermore, within the current legislative framework at European level, it is increasingly restricting the use of broad-spectrum antifungal compounds because of the potential damage that can cause to the ecosystem and human health. One promising alternative to conventional antifungal compounds are the use of antimicrobial peptides, and in particular the target-orientated peptides able to block an essential infective process. A basic step on the development of rice blast diseases is the formation of appressoria, necessary to break the leaf surface and penetrate the mesophyll. To develop novel compounds able to block this process without affecting the life cycle of the fungus could be a promising alternative to control rice blast diseases, a priori no toxic to other organisms including humans. In this work, we board this objective by performing two approaches, the screening of a peptide combinatorial library and the rational design of natural known antimicrobial peptides. We have design a set of peptides able to control the infection caused by M. oryzae by specific inhibition of appressorium formation, but without a lytic effect. Our results show that small peptides, such as the heptapeptide PAF104, represses the gene expression of MoMSB2 and MoMST11, involved in the Pmk1 MAPK pathway essential to M. oryzae appressorium formation. Moreover, the designed peptides showed a differential effect on some infective structures (i.e., appressoria, appressorium-like structures and hyphopodia), supporting that the molecular regulation of these structures is different, an idea previously proposed by other researchers. By confocal microscopy we showed that the appressoria treated with MgAPI16 present aberrant physical and not functional structures. As a conclusion, the main contribution of this work is the design of a set of synthetic peptides, de novo designed heptapeptides PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47 and the peptide MgAPI16 derived from the natural antimicrobial peptide Cecropin A, which are able to control rice blast development through the specific inhibition of the appressorium formation in M. oryzae. Therefore, this work contributes to the design of novel strategies based in targeted-orientated peptides for plant protection, which should be environmentally friendly.

Els resultats presentats en aquesta tesi estan dividits en dos capítols en funció dels enzims estudiats: quitina desacetilases i glicosintases. Les de-N-acetilases de quitina (CDAs) són un grup d'enzims que catalitzen la hidròlisi dels grups acetamido dels residus GlcNAc de quitina, quitosà i oligosacàrids de quitina (COS). Les CDAs pertanyen a la família 4 de les esterases de carbohidrats (CE4), la qual també inclou esterases de acetilxilà i desacetilases de petidoglucà. Els quitosans són una família de polisacàrids de N-acetil-glucosamina i glucosamina. Els COS i derivats parcialment desacetilats (paCOS) han demostrat ser molècules bioactives en un ampli rang d'aplicacions com poden ser antimicrobians, immunoestimulants, nano formulacions per drug o gene delivery, promotors de creixement vegetal, promotors de la cicatrització de ferides, etc. La majoria de les activitats biològiques associades als paCOS semblan dependre no només del grau de polimerització (DP) i de acetilació (DA), sinó també del patró de acetilació (PA). Aquesta relació estructura funció remarca el paper crucial de les CDAs. Els objectius d'aquesta tesi comprenen els estudis de la relació estructura funció dins el marc del Subsite capping Model. La presència de diversos loops envoltant el centre actiu, els quals varien en mida i estructura en funció de la CDA, defineixen els subllocs accessibles en el solc catalític i, a la vegada, també són responsables de definir el patró de desacetilació. En aquesta tesi es reporta la validació d'una metodologia analítica HPLC-MS per a la monitorització de l'activitat de las CDAs, la demostració experimental del Subsite Capping Model usant la desacetilasa de quitooligosacàrids de Vibrio cholerae i els resultats del disseny racional dels loops per a la modulació de l'especificitat de substrat. Diverses generacions de mutants van ser estudiades obtenint com a resultat un enzim altament optimitzat. L'altre capítol inclou el treball realitzat en el camp de les glicosintases. Aquests enzims s'han convertit en unes eficients eines per a la síntesi d'oligosacàrids, glicoconjugats i polisacàrids. Es deriven de glicosidases amb retenció de conformació anomérica en què l'activitat hidrolítica ha estat abolida per la mutació del nucleòfil catalític però que catalitzen eficientment reaccions de transglicosilació quan es proporcionen donadors activats amb fluorur amb la configuració anomérica oposada a la del substrat del enzim hidrolític parental. Millorar el rendiment de les glicosintases actuals (i futures) i l'enginyeria de l'especificitat per substrats artificials estan sent afrontades per metodologies d'evolució dirigida. Aquestes aproximacions depenen en gran mesura en mètodes d'alta eficiència de cribratge. En aquest treball es presenta un mètode de cribratge independent de l'especificitat del enzim per al cribratge de biblioteques de glicosintases basat en un sensor químic fluorescent de fluorur capaç de traduir l'activitat glicosintasa a fluorescència. Es descriu el desenvolupament i validació de l'assaig així com la seva aplicació a una biblioteca de saturació del residu nucleòfil a la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. A més, es troba un nou i sorprenent mutant que és posteriorment caracteritzat, el mutant E134D. Aquesta nova glicosintasa proporciona coneixement sobre el papel dels residus adjacents en la reacció catalítica de les glicosintases.
Los resultados presentados en esta tesis están divididos en dos capítulos en función de los enzimas estudiados: quitina desacetilasas y glicosintasas. Las de-N-acetilasas de quitina (CDAs) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de los grupos acetamido de los residuos GlcNAc de quitina, quitosano y oligosacáridos de quitina (COS). Las CDAs pertenecen a la familia 4 de las esterasas de carbohidratos (CE4), la cual también incluye esterasas de acetilxilano y desacetilasas de petidoglucano. Los quitosanos son polisacáridos de N-acetil-glucosamina y glucosamina. Los COS y derivados parcialmente desacetilados (paCOS) han demostrado ser moléculas bioactivas en un amplio rango de aplicaciones como pueden ser antimicrobianos, inmunoestimulantes, nano formulaciones para drug o gene delivery, promotores de crecimiento vegetal, promotores de la cicatrización de heridas, etc. La mayoría de las actividades biológicas asociadas a los paCOS parecen depender no solo del grado de polimerización (DP) y de acetilación (DA), sino también del patrón de acetilación (PA). Esta relación estructura función remarca el rol crucial de las CDAs. Los objetivos de esta tesis comprenden los estudios de la relación estructura-función dentro del marco del Subsite Capping Model. La presencia de varios loops rodeando el sitio activo, los cuales varían en tamaño y estructura en función de la CDA, definen los subsitios accesibles en el surco catalítico y, a su vez, también son responsables de definir el patrón de desacetilación. En esta tesis se reporta la validación de una metodología analítica HPLC-MS para la monitorización de la actividad de CDAs, la demostración experimental del Subsite Capping Model usando la desacetilasa de quitooligosacáridos de Vibrio cholerae y los resultados del diseño racional de los loops para la modulación de la especificidad de sustrato. Varias generaciones de mutantes fueron estudiadas obteniéndose como resultado un enzima altamente optimizado. El otro capítulo incluye el trabajo realizado en el campo de las glicosintasas. Estas enzimas se han convertido en unas eficientes herramientas para la síntesis de oligosacáridos, glicoconjugados y polisacáridos. Se derivan de glicosidasas con retención de conformación anomérica en las que la actividad hidrolítica ha sido abolida por la mutación del nucleófilo catalítico pero que catalizan eficientemente reacciones de transglicosilación cuando se les proporcionan donadores activados con fluoruro con la configuración anomérica opuesta a la del sustrato del enzima hidrolítico parental. Mejorar el rendimiento de las glicosintasas actuales (y futuras) y la ingeniería de la especificidad por sustratos artificiales están siendo afrontadas por metodologías de evolución dirigida. Estas aproximaciones dependen en gran medida de métodos de alta eficiencia de cribado. En este trabajo se presenta un método de cribado independiente de la especificidad del enzima para el cribado de bibliotecas de glicosintasas basado en un quimiosensor fluorescente de fluoruro capaz de transducir la actividad glicosintasa a fluorescencia. Se describe el desarrollo y validación del ensayo así como su aplicación a una biblioteca de saturación del residuo nucleófilo en la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. Además, se encuentra un nuevo y sorprendente mutante que es posteriormente caracterizado, el mutante E134D. Esta nueva glicosintasa proporciona conocimiento mecanistico sobre el rol de los residuos adyacentes en la reacción catalítica de las glicosintasas.
The results presented in this thesis are divided in two chapters depending on the enzymes studied: chitin deacetylases and glycosynthases. Chitin de-N-acetylases (CDAs) are a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of the acetamido groups of GlcNAc residues of chitin, chitosan, and chitin oligosaccharides (COS). CDAs belong to the family 4 of carbohydrate esterases (CE4), which also includes acetylxylan esterases and peptidoglycan deacetylases. Chitosans are a family of polysaccharides of N-acetyl-glucosamine and glucosamine. COS and their partially deacetylated derivatives (paCOS) have proven to be bioactive molecules in a broad variety of applications such as antimicrobials, immunostimulants, nanoformulations for drug and gene delivery, plant growth promoters, wound healing activity, etc. Most of the biological activities associated with paCOS seem to be largely dependent not only on the degree of polymerization (DP) and degree of acetylation (DA), but also on the specific acetylation pattern (PA). This structure-function relationship highlights the key role of the CDAS. The objectives of this thesis comprises the studies of structure-function relationships in the frame of the Subsite Capping Model. The presence of several loops surrounding the active site, which vary in size and structure depending on the CDA, define the accessible binding subsites of the catalytic cleft and seem to be responsible of defining the deacetylation pattern. In this thesis it is reported the validation of an analytical HPLC-MS methodology for CDA activity monitoring, the experimental demonstration of the Subsite Capping Model using the Vibrio cholerae chitin oligosaccharide deacetylase as reference and the results of the rational engineering of loops for the modulation of substrate specificity. Several generations of mutants were studied resulting in a greatly optimized enzyme. The other chapter is the work developed with glycosynthases, these enzymes have become efficient tools for the enzymatic synthesis of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They derive from retaining glycosidases in which the hydrolase activity has been abolished by mutation of the catalytic nucleophile but efficiently catalyse transglycosylation reactions when using activated glycosyl fluoride donors with the opposite anomeric configuration than the substrate in the parental hydrolase enzyme. Improving the performance of current (and new to come) glycosynthases and engineering specificity for non-natural substrates is being addressed by enzyme directed evolution. These approaches largely depend on efficient high throughput screening methods. In this work it is presented a general screening assay independent of the enzyme specificity for the screening of glycosynthase libraries based on a fluoride fluorescent chemosensor that transduces glycosynthase activity into fluorescence. This work describes the development and validation of the assay and its application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, In addition, a new and surprising mutant was found and furtherly characterized, the E134D mutant. This new glycosynthase provides mechanistic insights on the role of neighbouring residues in the glycosynthase catalytic reaction.

El presente trabajo tiene como objetivo el diseño y desarrollo de un módulo básico que permita la replicación de ADN empleando el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocido como PCR por sus siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction. Para ello el módulo debe ser capaz de controlar de manera precisa un juego de temperaturas configurables por el usuario, con la finalidad de lograr un proceso eficiente. No es parte de la presente tesis el desarrollo de la fuente de alimentación del sistema. Este módulo básico constituye un primer aporte a la intención de desarrollar equipos termocicladores de producción nacional. Los termocicladores se usan en laboratorios de investigación de Biotecnología Moderna y análisis genéticos. Para este objetivo se hace uso de los dispositivos de efecto termoeléctrico conocidos como Celdas Peltier, modelos CP 1.4-127-10L y CP 0.8-254-06L, componentes que permiten obtener cambios de temperatura de manera muy rápida. Para el control de dichas temperaturas se selecciona el sensor YSI 44018, por sus características físicas y de precisión y así garantizar que las muestras de ADN a replicar no se degeneren. Los elementos de potencia y de control utilizados permiten el cumplimiento de las exigencias del protocolo de PCR. Todos los componentes electrónicos son manejados digitalmente por el microcontrolador PIC 16F877 que se programó en lenguaje ensamblador. Las interfaces de entrada-salida las constituyen el teclado matricial y la pantalla LCD respectivamente. Para hacer las pruebas de funcionamiento fue necesaria la construcción de un bloque metálico de plata y el aprovisionamiento de un bloque de aluminio que actuaron como bandeja porta-muestras del módulo diseñado. Con estos elementos se construyó el módulo básico, que alcanzó una rampa de temperatura de 0.4C/s con una precisión de ±0.8C.
Tesis

The photoactivation of metal complexes with potential anticancer activity is a hot topic of current research, as it may lead to the development of more selective and efficient drugs. Photoactivated chemotherapy (PACT) with coordination compounds is usually based on photochemical processes taking place at the metal center. In contrast, an innovative ligand-mediated photoactivation approach that exploits the outstanding photochemical properties of diarylethenes has been developed in the present PhD thesis. Platinum(II) complexes from dithienylcyclopentene-based photoswitchable ligands have been designed and prepared. These systems exhibit two thermally stable, interconvertible photoisomeric forms, which present clearly distinct properties. The photochemical behavior of all ligands and metal complexes has been examined by means of 1H NMR and UV-Vis spectroscopies, and a number of crystal structures have been determined. Additionally, DFT calculations have been performed to analyze the effect produced by the attachment of different metal-binding units on the photochemical performance of the diarylethene synthon. Subsequently, the interaction of each photoisomer of the platinum(II) complexes with DNA has been thoroughly investigated using different techniques. These studies revealed that the light-triggered transformation of these systems effectively translates into different DNA binding modes and affinities, as desired for a photoactivatable drug. The antiproliferative activity of the complexes prepared has then been evaluated through various cell viability in vitro assays, which validated the potential applications of such diarylethene-based photoswitches for the development of a new class of photochemotherapeutic metallodrugs.
La fotoactivació de complexos metàl·lics amb potencial activitat antitumoral és un camp de recerca amb un interès creixent, que persegueix el desenvolupament de tractaments més selectius i eficients. Tradicionalment, la quimioteràpia fotoactivada (PACT) basada en compostos de coordinació inorgànics s'ha centrat en els processos fotoquímics que tenen lloc en el centre metàl·lic. En canvi, en aquesta tesi doctoral s'ha desenvolupat una estratègia alternativa enfocada en la fotoactivació dels lligands, aprofitant les excel·lents propietats fotoquímiques dels diariletens. Amb aquest objectiu, s'han dissenyat i preparat diferents complexos dinuclears de Pt(II) amb lligands basats en l'estructura del ditienilciclopentè. Aquestes molècules presenten dues formes fotoisomèriques interconvertibles i tèrmicament estables, que a més difereixen notablement en les seves propietats. El comportament fotoquímic dels lligands i complexos sintetitzats s'ha estudiat per mitjà d'espectroscòpia 1H RMN i UV-Vis, i d’altra banda també s'han resolt diverses estructures cristal·lines. Addicionalment, s'han emprat càlculs computacionals DFT per tal d'analitzar l'efecte sobre l'activitat fotoquímica del fragment diariletè produït per l'acoblament de diferents grups funcionals. Seguidament, s'ha investigat la interacció amb ADN de cadascun dels fotoisòmers dels complexos de Pt(II) preparats, mitjançant diferents tècniques. Els estudis realitzats han posat de manifest que la fotointerconversió d'aquest tipus de sistemes dóna lloc a diferents modes d’unió i graus d'afinitat envers l'ADN, tal i com és desitjable per un fàrmac fotoactivable. En darrer lloc, l'activitat antiproliferativa dels compostos ha estat avaluada a través de diferents assaigs cel·lulars in vitro, que han permès corroborar el gran potencial dels sistemes basats en diariletens per ser aplicats en el disseny de fàrmacs.

This thesis describes the synthesis, characterization and properties of a novel family of cuboidal homo- and heterobimetallic molybdenum chalcogenide clusters. The synthetic strategy employed to prepare these novel cluster species is based on the chemical functionalization of the trimetallic Mo3Q4 (Q = S, Se) core by varying the nature of the outer ligands or by incorporating a second transition metal fragment to obtain cubane-type heterobimetallic clusters. Both strategies are directed towards the isolation of functional molecular complexes with potential applications in catalysis, molecular electronic or as building blocks of higher nuclearity materials. In this regard, the immobilization of tailor functionalized molecular clusters into mesoporous silica is also presented. Three different approaches have been undertaken towards the functionalization of Mo3Q4 (Q = S, Se) cluster complexes. The first one is based on the substitutional reactivity of the Mo-halide functional groups. The second one consists on the incorporation of a second transition metal to access cubane-type heterobimetallic Mo3M’Q4 (M’ = Fe, Cu; Q = S) compounds. Finally, the third one is based on the coordination of diphosphane ligands of different nature.

Esta tesis doctoral contempla dos objetivos. El primero consiste en el estudio de relaciones estructura-actividad en diseño de fármacos, que en su mayoría incluyen el grupo adamantano debido a sus propiedades estructurales y fisicoquímicas, sobre la enzima 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1. El interés en dicho enzima obedece al papel que desempeña en el contexto de enfermedades metabólicas como la diabetes y el síndrome metabólico, además de proporcionar un nuevo enfoque en el tratamiento de las disfunciones cognitivas relacionadas con la edad, incluyendo la enfermedad de Alzheimer. Así, en la tesis se describen las aproximaciones realizadas para el diseño de compuestos implicados en la inhibición de dicho enzima desde la perspectiva del trabajo realizado en modelización molecular y estudio del modo de unión de los inhibidores propuestos. Dicha investigación ha sido realizada en colaboración con diversos Departamentos, entre ellos el de Farmacología, Toxicología y Química Terapèutica de la Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación de la Universidad de Barcelona, donde se llevó a cabo la síntesis de los compuestos, obteniéndose resultados prometedores para diferentes conjuntos de compuestos. El segundo objetivo se centra en el estudio del proceso de migración de ligandos en globinas concretamente en el caso particular de citoglobina, cuarto miembro de la familia de la globinas. El interés principal ha radicado en el estudio mediante trabajos de modelización molecular del efecto que provoca la temperatura en el transporte de ligandos sobre citoglobina. En particular, se ha examinado la relación entre estructura, dinámica y función comparando la citoglobina humana con la del pez Chaenocephalus aceratus y Dissostichus mawsoni haciendo énfasis en la influencia de la temperatura sobre la topología de sus cavidades internas. Asimismo, también se realizó un análisis cualitativo sobre la migración de O2 a través de los diferentes sistemas estudiados. Dicho estudio ha puesto en evidencia la vital importancia del enlace (o la ausencia del mismo) de hidrógeno entre la serina 30 y el triptófano 151 como factor clave en la estabilidad de la proteína y la formación, tamaño y continuidad de sus canales.
This doctoral thesis has two objectives. The first is the study of structure-activity relationships in drug design, which mostly include the adamantane group due to its structural and physicochemical properties, on the enzyme 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. The interest in this enzyme is due to the role that it plays in the context of metabolic diseases such as diabetes and metabolic syndrome, and provides a new approach in the treatment of age-related cognitive dysfunctions, including Alzheimer's disease. Accordingly, the thesis describes the approximations made for the design of compounds involved in the inhibition of this enzyme from the perspective of the work done in molecular modeling and of the predicted binding mode of the proposed inhibitors. This research has been carried out in collaboration with several Departments, among them Pharmacology, Toxicology and Therapeutical Chemistry of the Faculty of Pharmacy and Food Sciences of the University of Barcelona, where the synthesis of the compounds was carried out, obtaining promising results for different sets of compounds. The second aim involves the study of the migration process of ligands in globins focusing on the particular case of cytoglobin, fourth member of the globin family. The main interest has been focused in the study, by means of molecular modelling, of the effect of temperature on the transport of ligands in cyoglobin. The relationship between structure, dynamics and function has been examined by comparing human cytoglobin with the Chaenocephalus aceratus and Dissostichus mawsoni, with emphasis on the influence of temperature on the topology of its internal cavities. A qualitative study on the migration of O2 through the different systems was also carried out, disclosing the vital importance of hydrogen bonding (or lack thereof) between serine 30 and tryptophan 151 as a key factor in the stability of the protein and the conformation, size and continuity of its internal tunnel cavities.

The relevance of structural stability in drug design has been shown by the use of DUck in virtual screening campaign, as reported previously. The method provides a fast and easy way to assess hydrogen bond-based structural stability of a complex. However, the cause and consequences of structural stability in molecular recognition remain unknown. DUck still has some limitations and requires previous knowledge about the system to be applied successfully. GENERAL OBJECTIVE: The general objective of this work is to deepen the knowledge of the role and origin of structural stability in molecular recognition and extend its applicability in drug design. We wanted to test DUck on a large and diverse set of protein-ligand complexes and apply it in a more general scenario without detailed knowledge about the simulated system. DETAILED OBJECTIVES: The specific objectives were the following: 1. Investigate the role of structural stability in biomolecular complexes: • Perform a large-scale assessment of hydrogen bond based structural stability on a set of highly trustworthy structures of protein- ligand and protein-fragment complexes. • Compare the binding patterns for different classes of proteins • Investigate how robust hydrogen bonds are organised in complex’s structure. • Draw useful conclusions for drug design. • Explain the cause of structural stability. 2. Extend the applicability domain of Dynamic Undocking: • Combine docking with rDock and post-docking evaluation of poses with DUck into binding mode prediction protocol. • Test the protocol on the set of complexes of proteins with drug-like molecules and fragments.

La medicina personalitzada i les teràpies dirigides són, avui dia, estratègies emergents en les companyies farmacèutiques. L’objectiu global, a llarg termini, és desenvolupar tractaments dirigits cap a mecanismes moleculars desregulats únicament en les cèl•lules afectades, reduint així els problemes de toxicitat d’aquests compostos. Aquest procés és llarg i costós però la introducció de les tècniques de disseny racional de fàrmacs ha permès reduir de manera considerable el temps d’identificació de molècules actives, agilitzant així les etapes inicials. Les teràpies antitumorals dirigides a promoure l’apoptosi i/o a controlar el procés de proliferació cel•lular es troben avui dia en ple desenvolupament. A més, les oportunitats d’intervenció terapèutiques en aquesta línia s’incrementen a mesura que augmenta el coneixement de les proteïnes involucrades en aquests processos. Avui dia els principals problemes dels compostos identificats radiquen però en la seva selectivitat i el gran nombre d’efectes secundaris que presenten, pel que el disseny del molècules selectives és un camp de recerca molt actiu. El present projecte es basa en la cerca de nous fàrmacs anticancerígens mitjançant la modelització molecular. D’una banda es tracta d’identificar inhibidors per a les proteïnes de la família Bcl-2 per a restablir els nivells normals d’apoptosi i, de l’altra, per a les proteïnes CDK4 i CDK6, importants reguladores del cicle cel•lular. L’objectiu plantejat a llarg termini en aquesta tesi és identificar compostos actius amb potència i selectivitat cap a aquestes proteïnes per tal de convertir-los en caps de sèrie que finalment puguin arribar a ser fàrmacs comercials. La utilització de compostos mimètics del domini BH3 per inhibir la funció dels membres antiapoptòtics de la família Bcl-2 és una de les estratègies més emprades per al control de l’apoptosi. En aquest marc, en funció de la selectivitat que presenten envers els pèptids BH3, podem trobar dues subfamílies de proteïnes antiapoptòtiques: Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w d’una banda i Mcl-1 i A-1 de l’altra. Diferents estudis suggereixen que per a produir la mort cel•lular és necessari intervenir al menys un membre de cadascuna de les subfamílies. Per tant, sota aquesta premissa, es van analitzar les interaccions establertes entre les proteïnes antiapoptòtiques i dominis BH3 tant pel cas de pèptids que s’uneixen amb igual afinitat a tota la família, com per a pèptids selectius de cadascun dels subgrups. Nombrosos estudis apunten a que la helicitat en els pèptids mimètics dels domini BH3 incrementa notablement l’afinitat d’enllaç. Sota aquesta premissa s’ha tractat de dissenyar pèptids derivats de la proteïna proapoptòtica Bak substituint alguns dels residus prescindibles per l’aminoàcid no natural Aib, inductor de conformacions helicoïdals. Actualment tots els inhibidors coneguts per a les CDKs, actuen sobre el lloc d’unió de l’ATP. Donat que existeix una gran quantitat de dades experimentals sobre aquests compostos es va decidir avaluar diferents algoritmes de docking i predicció d’afinitats experimentals amb cinc inhibidors coneguts de CDK6. Finalment, s’ha proposat també un desenvolupament metodològic que enfoca el problema del disseny de fàrmacs des d’una perspectiva més amplia: la quimiogenòmica. Amb la seqüenciació del genoma humà s’ha pres consciència de que resulta inviable avaluar el gran número de compostos químics coneguts actualment sobre totes les possibles dianes terapèutiques identificades en el genoma humà. Per aquest motiu és imprescindible desenvolupar mètodes teòrics més senzills per a la caracterització i comparació de molècules que permetin predir la seva activitat biològica. Així doncs, amb la realització d’aquesta tesi, queda patent que l’aplicació de mètodes teòrics pot contribuir de manera eficient al disseny de fàrmacs. D’aquesta manera es possible reduir el cost i temps necessari per al descobriment de compostos actius.
Nowadays, personalized medicine and directed therapies have emerged as appealing strategies for pharmaceutical companies. The long-term goal is developing new treatments to target molecular pathways altered only in affected cells, thus reducing undesired side effects and toxicity problems. This is a tedious and long process although the incorporation in its framework of rational drug design techniques has reduced the time needed to identify new active molecules. The knowledge of molecular mechanisms involved in a given pathology allows finding a point of the process that can be targeted, usually a protein, restoring the normal cell behavior. Once identified the therapeutic target it is possible to find compounds that reproduce interactions between this protein and the corresponding natural regulations by means of molecular modeling techniques. In principle, these compounds are expected to mimic the biological effect of the natural regulators. Antitumoral therapies oriented to promote apopotosis or control the cell proliferation process are gaining importance nowadays. In addition, opportunities for therapeutic intervention in this context are growing with the discovery of new proteins involved in these pathways. In fact, the drawback of compounds known at date relies on selectivity problems and, thus, the huge number of undesired side effects of these treatments. Hence, development of selective treatments is a very active research field. The goal of the present PhD project is to identify new anticancer agents using molecular modeling techniques. On the one hand, it has been tried to identify inhibitors of the Bcl-2 protein family in order to restore normal apoptosis levels in tumoral cells and, on the other hand, for the CDK4 and CDK6 proteins, key regulators of eukaryotic cell cycle. All these proteins are deregulated in many types of cancer and thus, are presented as interesting targets for the cancer treatment. The identification of compounds with potency and selectivity for these proteins that can be used as lead compounds that finally will become commercial drugs is seeked.

L’objectiu d’aquesta tesi és trobar principis generals que permetin relacionar l’estructura i les propietats funcionals dels circuits moleculars de transducció de senyals two-component systems (TCS) i his-asp phosphorelays (PR). La tesi s’inicia revisant els mètodes usats per a l’estudi de principis de disseny en sistemes moleculars i alguns dels resultats obtinguts fins ara, i discutint la importància de l’estudi dels principis de disseny. A continuació, explorem els proteomes seqüenciats de més de 7000 organismes i fem un inventari dels diferents tipus d’organització en operons i proteïnes multidomini dels dominis proteics que intervenen en TCS i PR. A partir d’aquesta informació deduirem alternatives existents en la natura pel que fa al disseny d’aquests circuits moleculars. Per acabar, comparem mitjançant modelització matemàtica el comportament dinàmic de 3 circuits diferents de TCS, i trobem que un tercer component que modula l’activitat de la histidina quinasa o bé el response regulator pot modificar l’espai paramètric on el sistema es comporta de forma biestable.
El objectivo principal de esta tesis es la búsqueda de principios de diseño que relacionen la estructura y la función de redes bioquímicas de transducción de señales, concretamente en two-component systems (TCS) y phosphorelays (PR). La tesis se inicia con una revisión de los métodos usados para el estudio de principios de diseño en sistemas moleculares y algunos de los resultados obtenidos hasta ahora, seguida de una discusión sobre la importancia del estudio de dichos principios de diseño. A continuación, exploramos los proteomas secuenciados de más de 7000 organismos y hacemos un inventario de los distintos tipos de organización en operones o proteínas de los dominios proteicos implicados en TCS y PR, con el objetivo de deducir el repertorio de estructuras existentes en la naturaleza para estos circuitos moleculares. Para terminar, comparamos mediante modelización matemática las propiedades dinámicas de tres circuitos distintos de TCS, y observamos que una proteína adicional que interacciona con la histidina quinasa o con el response regulator modifica el espacio de valores de los parámetros del sistema en el cual existe biestabilidad.
The ultimate goal of this thesis is to set the stage for finding general design principles underlying the relationship between network design and network function in two-component (TCS) and His-Asp phosphorelay (PR) signal transduction systems. This thesis starts with a review of the methods for and results from the study of design principles in molecular systems, and a discussion about the importance of studying those design principles. Next, a survey of the fully sequenced and annotated genomes and proteomes of more than 7000 different organisms is performed in order to identify different types of organizations of the TCS/PR protein domains in operons and multidomain proteins. From this data, the existing diversity of TCS/PR circuit designs will be inferred. Finally, we compare through mathematical modeling the dynamic properties associated with three types of TCS circuit designs, and find that a third component that binds to and modulates the activity of either the sensor kinase or the response regulator can modify the parameter space in which bistability in the system’s response is possible.

El disseny molecular de sistemes d’interès per a la química mèdica i per al disseny de fàrmacs sempre s’ha trobat molt lligat a la disponibilitat sintètica dels resultats. Des del moment que la química combinatòria s’incorpora dins de l’esquema sintètic, canvia el paper que ha de jugar la química computacional: la diversitat d’estructures possibles a sintetitzar fa necessària la introducció de mètodes, com el cribratge virtual, que permetin avaluar la viabilitat de grans quimioteques virtuals amb un temps raonable. Els mètodes quimioinformàtics responen a la necessitat anterior, posant a l’abast de l’usuari mètodes eficaços per a la predicció teòrica d’activitats biològiques o propietats d’interès. Dins d’aquests destaquen els mètodes basats en la relació quantitativa d’estructura-activitat (QSAR). Aquests han demostrat ser eficaços per l’establiment de models de predicció en l’àmbit farmacològic i biomèdic. S’ha avaluat la utilització de mètodes QSAR no lineals en la teràpia fotodinàmica del càncer, donat que és una de les línies de recerca d’interès del Grup d’Enginyeria Molecular (GEM) de l’IQS. El disseny de fotosensibilitzadors es pot realitzar a partir de la predicció de propietats fisicoquímiques (com l’espectre d’absorció i la hidrofobicitat del sistema molecular), i de l’estudi de la seva localització subcel•lular preferent, la qual ha demostrat recentment jugar un paper molt important en l’eficàcia del procés global. Per altra banda, les xarxes neuronals artificials són actualment un dels mètodes més ben valorats per a l’establiment de models QSAR no lineals. Donat l’interès de disposar d’un programari capaç d’aplicar aquests mètodes i que, a més, sigui prou versàtil i adaptable com per poder-se aplicar a diferents problemes, s’ha desenvolupat el programari ArIS. Aquest inclou els principals mètodes de xarxes neuronals artificials, per realitzar tasques de classificació i predicció quantitativa, necessaris per a l’estudi de problemes d’interès, com és la predicció de l’activitat anti-VIH d’anàlegs de l’AZT, l’optimització de formulacions químiques o el reconeixement estructural de grans sistemes moleculars
El diseño molecular de sistemas de interés para la química médica y para el diseño de fármacos siempre ha estado condicionado por la disponibilidad sintética de los resultados. Desde el momento en que la química combinatoria se incorpora en el esquema sintético, cambia el papel de la química computacional: la diversidad de estructuras que pueden sintetizarse hace necesaria la introducción de métodos, como el cribado virtual, que permitan evaluar la viabilidad de grandes quimiotecas virtuales en un tiempo razonable. Los métodos quimioinformáticos responden a la necesidad anterior, ofreciendo al usuario métodos eficaces para la predicción teórica de actividades biológicas o propiedades de interés. Entre ellos destacan los métodos basados en la relación cuantitativa de estructura-actividad (QSAR), que han demostrado ser eficaces para establecer modelos de predicción en el ámbito farmacológico y biomédico. Se ha evaluado la utilización de métodos QSAR no lineales en terapia fotodinámica del cáncer, dado que es una de las líneas de investigación de interés del Grup d’Enginyeria Molecular (GEM) del IQS. El diseño de fotosensibilizadores se puede realizar a partir de la predicción de propiedades fisicoquímicas (como su espectro de absorción o su hidrofobicidad) y del estudio de su localización subcelular preferente, la cual ha demostrado recientemente jugar un papel muy importante en la eficacia del proceso global. Por otro lado, las redes neuronales artificiales son actualmente uno de los métodos mejor valorados para establecer modelos QSAR no lineales. Es por ello que resulta muy interesante disponer de un programa capaz de aplicar estos métodos y que, además, sea lo suficientemente versátil y adaptable como para poder aplicarse a distintos problemas, según las necesidades del usuario. Por este motivo se ha desarrollado el programa ArIS, el cual incluye los principales métodos de redes neuronales artificiales para realizar tareas de clasificación y predicción cuantitativa, necesarios para el estudio de problemas de interés como la predicción de la actividad anti-VIH de análogos del AZT, la optimización de formulaciones químicas o el reconocimiento estructural de grandes sistemas moleculares.
Molecular modelling of interesting systems for medicinal chemistry and drug design highly depends on availability of synthetic results. Since combinatorial chemistry was incorporated into the synthetic scheme, the role of computational chemistry has changed: the structural diversity of candidates to be synthesized requires the introduction of computational methods which are able to screen large virtual libraries. Answering to this requirement, chemoinformatics offers many kinds of different methods for predicting biological activities and molecular properties. One of the most relevant techniques among them is Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR), which can be used to establish prediction models for both, pharmacological and biomedical sectors. The use of non- linear QSAR methods has been evaluated in photodynamic therapy of cancer, one of the research areas of the Grup d’Enginyeria Molecular (GEM) at IQS. Molecular design of photosensitizers can be performed by computational studies of their physicochemical properties (absorption spectra or hydrophobicity, for example) and subcellular localization, which becomes a key factor in the efficacy of the overall process. Furthermore, artificial neural networks are nowadays rated as one of the very best methods for establishing non-linear QSAR models. Developing software that includes all these methods would be certainly interesting. Implemented algorithms should be versatile and easily adaptable for their use in any problems. We have developed ArIS software, which includes the most important methods of artificial neural networks for classification and quantitative prediction. ArIS has been used to predict anti-HIV activity of AZT-analogues, for optimization of chemical formulations and for structural recognition in large molecular systems, among others.

The work of this thesis was focused on the development of high-performance algorithms for a new generation of molecular descriptors, with many advantages with respect to its predecessors, suitable for diverse applications in the field of drug design, as well as its implementation in commercial grade scientific software (Pentacle). As a first step, we developed a new algorithm (AMANDA) for discretizing molecular interaction fields which allows extracting from them the most interesting regions in an efficient way. This algorithm was incorporated into a new generation of alignmentindependent molecular descriptors, named GRIND-2. The computing speed and efficiency of the new algorithm allow the application of these descriptors in virtual screening. In addition, we developed a new alignment-independent encoding algorithm (CLACC) producing quantitative structure-activity relationship models which have better predictive ability and are easier to interpret than those obtained with other methods.
El trabajo que se presenta en esta tesis se ha centrado en el desarrollo de algoritmos de altas prestaciones para la obtención de una nueva generación de descriptores moleculares, con numerosas ventajas con respecto a sus predecesores, adecuados para diversas aplicaciones en el área del diseño de fármacos, y en su implementación en un programa científico de calidad comercial (Pentacle). Inicialmente se desarrolló un nuevo algoritmo de discretización de campos de interacción molecular (AMANDA) que permite extraer eficientemente las regiones de máximo interés. Este algoritmo fue incorporado en una nueva generación de descriptores moleculares independientes del alineamiento, denominados GRIND-2. La rapidez y eficiencia del nuevo algoritmo permitieron aplicar estos descriptores en cribados virtuales. Por último, se puso a punto un nuevo algoritmo de codificación independiente de alineamiento (CLACC) que permite obtener modelos cuantitativos de relación estructura-actividad con mejor capacidad predictiva y mucho más fáciles de interpretar que los obtenidos con otros métodos.

En esta tesis se presentan las Interfaces Proteína-­Proteína como un Nuevo Tipo de Diana Terapéutica a explotar, a través del estudio de un sistema de dos proteínas implicado en la quimiotaxis bacteriana: CheA/CheY. En la segunda parte de la tesis, presentamos la regulación alostérica por fosforilación en HDAC8, a través de esta proteína poco conocida todavía, queremos vislumbrar el método de propagación que sigue a la entrada del fosfato en el lugar alostérico, y cómo en última instancia esto genera la inhibición de la función desacetilasa de la proteína. Para la primera parte de la tesis, primeramente, se elige un sistema tipo de dos proteínas, en base a un cribado inicial del PDB en busca de cavidades capaces de unir moléculas pequeñas tipo fármaco, que reúnan una serie de características, y posterior caracterización de la cavidad a estudiar. Tras estre cribado, se eligió el sistema CheA/CheY como sistema tipo. Paralelamente, otros miembros del grupo, seleccionaron compuestos comerciales capaces de unirse a la interfaz, mediante programas de docking como rDock, a fin de seleccionar compuestos con posible acción estabilizadora del complejo (compuestos con acción PP-­‐glue). Más adelante, también se adquirieron 4 fragmentos derivados de la benzen-­‐sulfonamida. La afinidad del complejo y cómo los compuestos le afectaban, fue estudiado: mediante técnicas biofísicas, como SPR y Termoforesis. Mediante la primera técnica, caracterizamos la afinidad del complejo y ensayamos los más de 100 compuestos que se adquirieron, en busca de compuestos activadores, que actuasen como PP-­‐ glue. Una vez encontrados, estos se estudiaron más a fondo mediante Termoforesis a fin de saber cuál es la afinidad de cada uno de ellos por cada una de las proteínas del sistema, cómo afecta a la Kd del complejo la adición de estos, y si esta es dependiente de la concentración. Una vez seleccionados los compuestos activadores, se quiso comprobar mediante cristalografía que el luegar de unión de estos era el predicho mediante técnicas computacionales. Para ello, primeramente se obtuvo la estructura cristal del sistema de dos proteínas a 2,5Å. Posteriormente, se buscó obtener la estructura cristal del mismo complejo, esta vez en presencia de los compuestos activadores y fragmentos, mediante co-cristalización y soaks. También realizamos una serie de experimentos in vivo, aprovechando la implicación del sistema en la quimiotaxis bacteriana y que la alteración del mismo puede traducirse en un cambio en la motilidad bacteriana, apreciable macroscópicamente. Para ello, realizamos una batería de cultivos en agar motil, en presencia de atractantes, repelentes, dichos compuestos, y observamos la distancia recorrida en cada uno de los casos. Para la segunda parte de la tesis y el estudio del alosterismo en HDAC8, realizamos una serie de mutaciones estratégicas, determinadas mediante dinámicas moleculares previas, realizadas por miembros del grupo, y observamos mediante Western Blot, cómo afectan estas mutaciones al nivel de fosforilación final de la proteína, y mediante ensayos in vitro observamos su correlación con la actividad desacetilasa final de cada uno de los mutantes.

Tesis por compendio de publicaciones
Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is highly resistant to all current modalities of cancer therapy, including cytotoxic drugs as methotrexate (MTX), an antifolate widely used in clinical oncology against many cancer types. Recently, our lab discovered a new melanoma-specific mechanism of MTX resistance by which folate receptor α (FR-α)–mediated endocytotic transport of MTX facilitates melanosomal drug sequestration and cellular export in melanoma cells, thereby reducing the accumulation of MTX in intracellular compartments. That low MTX intracellular concentration is just able to induce cell growth arrest, but not cell death in melanoma cells. Particularly, we found that melanoma treatment with MTX induces cell cycle arrest without inducing apoptosis, activates melanin synthesis and melanosome biogenesis, and accelerates melanosomal export; but the cellular and molecular processes by which MTX mediates all these effects had not been elucidated. The Main Objective of the present PhD Thesis was the identification of the molecular basis of the cell cycle arrest, the activation of melanogenesis and the acceleration of melanosome transport induced by MTX treatment that, collectively, protect melanoma cells against MTX-induced apoptosis. The Secondary Objective, was the development of new therapeutic strategies combining MTX with drugs directed against molecular targets that are key components of the mechanisms of melanoma resistance to MTX. Regarding the Techniques and Instrumentation, we used several experimental models, including melanoma and non melanoma cell lines, an artificial skin melanoma model, and mice melanoma xenografts. We also employed a battery of cell biology techniques (viability, apoptosis and migration assays; electronic and optical microscopy; flow citometry; immunohistochemistry, immunofluorescence, etc.); biochemistry techniques (western blotting, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, enzymatic activity determination by UV-VIS espectroscopy, etc.); molecular biology techniques (nucleic acid extraction, PCR, RT-qPCR, chromatin immunoprecipitation, etc.). The Results of the implementation of these techniques were subjected to the appropriate statistical tests and are summarized bellow. Since the ability of cells to delay cell cycle progression and halt DNA synthesis represents a defensive mechanism that spares potential toxicity, firstly we focused on deciphering the molecular basis of the MTX-induced cell cycle arrest. We identified the transcription factor E2F1 and the checkpoint kinase 1 (Chk1) as key mediators of this mechanism of resistance. The results indicated that MTX stimulated the transcriptional activity of E2F1 on the promoters of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), which lead to an increase in the dTTP levels, instead of dTTP depletion as occurs in MTX-sensible cells. Since dTTP is an allosteric inhibitor of ribonucleotide reductase, which is necessary for the synthesis of all the dNTPs, dTTP excess induced DNA replication fork stress that activates the ATR/Chk1 DNA damage signaling pathway. Under these conditions, melanoma cells were protected from apoptosis by arresting their cell cycle in early S-phase. However, abrogation of this checkpoint by CHEK1 silencing or by UCN-01 (7-hydroxystaurosporine)-mediated Chk1 inhibition, rapidly triggered MTX-induced cell death, suggesting that inhibition of Chk1 in combination with this kind of antimetabolite chemotherapy is a viable therapeutic strategy to overcome melanoma resistance. Secondly, we focused on the study of the activation of melanogenesis observed after MTX treatment. Our results showed that Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) that normally acts as a master regulator of melanocyte development, function and survival, is responsible for the activation of melanogenesis in melanoma after MTX treatment. In fact, MTX treatment increases the expression of this transcription factor which in turn induces the expression of melanocytic differentiation genes driving melanin production and melanosome biogenesis as tyrosinase (TYR). The increased TYR expression in response to MTX-mediated MITF activation provided an opportunity to design a two step strategy consisting in the combination of MTX with a prodrug that our group had previously designed to be activated by TYR. This prodrug is a compound called 3-O-(3,4,5-trimethoxybenzoyl)-(-)-epicatechin (TMECG) that inhibits the enzyme DHFR with high affinity. The combination of MTX and TMECG was able to induce depletion of thymidine pools, double-strand DNA breaks, and highly efficient E2F1-mediated apoptosis in vitro and in vivo. Recently, it has been recognized that MITF acts as a melanoma rheostat in determining tumor subpopulation identity. In melanomas, reduced MITF expression leads to G1 arrested, invasive cells with stem-like properties including the ability to initiate tumors with high efficiency. By contrast, elevated MITF leads to activation of differentiation genes. In between, intermediate levels of MITF allow the proliferation of melanoma cells. Consequently, tumors comprise a mix of MITF-positive and negative melanoma cells. Therefore, the increase of MITF expression by MTX treatment would drive heterogeneous populations of tumor cells to a differentiated and less invasive phenotype and, at the same time, would sensitize these differentiated cells to the TYR-processed prodrug TMECG in a cell-specific fashion. In a different approach, we explored the molecular basis of the activation of the transport of melanosomes observed after MTX treatment with the aim of designing a therapeutic strategy driven to block the MTX export within melanosomes. We identified a new MTX-activated molecular pathway involved in the export of melanosomes, in which the motor protein MyosinVa (MyoVa) plays a key role. Our results demonstrated that melanoma treatment with MTX leads to Akt2-dependent MyoVa phosphorylation, which enhances its ability to interact with melanosomes and accelerates their exportation. Due to these findings, we designed a combined therapy driven to block this MyoVa/Akt2 pathway. Because UCN-01 is also a potent inhibitor of PDK1, which activates Akt by phosphorylation, we hypothesized that the inhibition of this Akt2 phosphorylation by UCN-01 may result in the disruption of MTX stimulated melanosome transport. In fact, MTX/UCN-01 combined therapy prevented MTX export by blocking melanosome transport and was able to induce a highly efficient E2F1-mediated apoptosis in culture and in vivo. In summary, we observed that the combination of MTX and UCN-01 may represent a therapeutic option for the treatment of this evasive disease
El melanoma es el tipo de cáncer de piel más agresivo y muestra una alta resistencia frente a todas las terapias anticancerígenas disponibles en la actualidad, incluyendo agentes citotóxicos como el metotrexato (MTX), un antifolato ampliamente utilizado en oncología clínica. Recientemente, nuestro laboratorio ha descubierto un nuevo mecanismo de resistencia al MTX específico de las células de melanoma por el cual, la endocitosis de esta droga mediada por el receptor de fólico α (FR-α) conduce al secuestro del MTX en los melanosomas y a su expulsión al exterior celular, reduciendo así la acumulación de esta droga en los compartimentos intracelulares. Esta baja concentración de MTX en el interior celular es capaz únicamente de inducir un arresto del crecimiento, pero no de inducir la muerte de las células de melanoma. Por tanto, se sabía que el tratamiento con MTX es capaz de inducir arresto del ciclo celular sin inducir apoptosis, de activar la síntesis de melanina y la biogénesis de melanosomas, y de acelerar el transporte de melanosomas, pero los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el MTX mediaba estos efectos era desconocido. El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral fue la identificación de las bases moleculares del arresto del ciclo celular, de la activación de la melanogénesis y de la aceleración del transporte melanosomal inducidos por el tratamiento con MTX que, en conjunto, protegen a las células de melanoma de la apoptosis inducida por el MTX. El Objetivo Secundario fue el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas combinando el MTX con agentes dirigidos frente a dianas moleculares clave en los mecanismos de resistencia. En cuanto a las Técnicas e Instrumentación, se emplearon como modelos experimentales varias líneas celulares de melanoma y de otros tipos de cáncer, un modelo de melanoma de piel artificial y un modelo de xenoinjerto de melanoma en ratón. Además, empleamos una batería de técnicas de biología celular (ensayos de viabilidad, apoptosis y migración; microscopía óptica y electrónica; inmunohistoquímica; inmunoflorescencia, etc.); técnicas de bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, determinación de actividad enzimática mediante espectroscopía UV-VIS, etc.); técnicas de biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, PCR, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina, etc.) Los Resultados de la implementación de las citadas técnicas fueron sometidos a las pruebas estadísticas apropiadas y se resumen a continuación: Dado que se ha descrito que la capacidad de las células de detener la síntesis de ADN constituye un mecanismo de defensa que evita posibles daños, en primer lugar nos centramos en descifrar las bases moleculares del arresto del ciclo celular inducido por el MTX. Así, identificamos al factor de transcripción E2F1 y a la quinasa Chk1 como mediadores de este mecanismo de resistencia. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con MTX estimulaba la actividad transcripcional de E2F1 sobre los promotores de los genes de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidilato sintasa (TS). Esto conducía a un incremento en los niveles de dTTP, en lugar de a una depleción de dTTP, como ocurre en células sensibles al MTX. Puesto que el dTTP es un inhibidor alostérico de la ribonucleótido reductasa que es necesaria para la síntesis de todos los dNTPs, este exceso de dTTP inducía un estrés en las horquillas de replicación capaz de activar la vía de señalización del daño al ADN mediada por ATR/Chk1. En estas condiciones, las células de melanoma evitan la apoptosis mediante el arresto de su ciclo celular al inicio de la fase S. Sin embargo, la eliminación de este checkpoint mediante el silenciamiento genético de CHEK1 o mediante la inhibición de esta quinasa con UCN-01 (7-hidroxistaurosporina) tras el tratamiento con MTX desencadena rápidamente la muerte celular, sugiriendo que la inhibición de Chk1 en combinación con este tipo de antimetabolitos es una estrategia terapéutica eficaz para vencer la resistencia del melanoma. En segundo lugar, nos centramos en el estudio de la activación de la melanogénesis por el MTX. Nuestros resultados demostraron que el factor de transcripción MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) que, en melanocitos normales actúa como un regulador clave del desarrollo, función y supervivencia, era el responsable de la activación de la melanogénesis tras el tratamiento con MTX. De hecho, el MTX incrementa la expresión de este factor de transcripción el cual, a su vez, induce la expresión de genes implicados en la diferenciación melanocítica que conducen a la producción de melanina, como la enzima tirosinasa (TYR), y a la biogénesis de melanosomas. Este aumento en la expresión de TYR en respuesta a la activación de MITF mediada por MTX nos permitió diseñar una estrategia terapéutica basada en la combinación de MTX con una prodroga activada por TYR que había sido sintetizada previamente en nuestro laboratorio. Esta prodroga es el compuesto denominado 3-O-(3,4,5-trimetoxibenzoil)-(-)-epicatequina (TMECG), capaz de inhibir a la enzima DHFR con una alta afinidad. La combinación MTX/TMECG fue capaz de inducir el agotamiento de las reservas de timidina, roturas de doble cadena en el ADN y la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficacia, tanto in vitro como in vivo. Recientemente se ha descrito que MITF actúa como un reóstato en melanoma, determinando la identidad de las distintas subpoblaciones tumorales. Según este modelo, bajos niveles de MITF dan lugar a células arrestadas en G1, altamente invasivas con propiedades de célula madre, incluyendo una alta capacidad de iniciar tumores. Por el contrario, niveles elevados de MITF conducen a la activación de genes de diferenciación. Entre ambos, niveles intermedios de MITF permiten la proliferación de las células de melanoma. En consecuencia, los tumores suponen una mezcla de células con distintos niveles de MITF. Por tanto, el aumento de la expresión de MITF por el tratamiento con MTX conduciría a las poblaciones heterogéneas de células tumorales hacia un fenotipo común, diferenciado y menos invasivo, y, al mismo tiempo, sensibilizaría a estas células diferenciadas a una prodroga activada por TYR como el TMECG. En una aproximación diferente, estudiamos las bases moleculares de la activación del transporte de melanosomas inducida por el tratamiento con MTX. En este sentido, identificamos una nueva vía molecular implicada en la exportación de melanosomas en la que juega un papel esencial la proteína motora Miosina Va (MyoVa). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento del melanoma con MTX conduce a una fosforilación de MyoVa mediada por Akt2 que incrementa la capacidad de esta proteína de interaccionar con los melanosomas y acelera su exportación. En vista de estos hallazgos, diseñamos una terapia combinada encaminada a bloquear la activación del transporte mediada por esta vía. Dado que se ha descrito que el UCN-01 es un potente inhibidor de PDK1, la cual activa a Akt por fosforilación, diseñamos una terapia de MTX combinado con UCN-01 para bloquear el transporte melanosomal. Efectivamente, la terapia combinada MTX/UCN-01 logró evitar la exportación de MTX mediante el bloqueo del transporte melanosomal y fue capaz de inducir la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficiencia tanto in vitro como in vivo.

El desarrollo de quimiosensores para la detección eficaz de aniones y cationes es un área de gran relevancia en el campo de la Química Supramolecula, debido al importante papel que juegan estas especies en procesos biológicos, ambientales y químicos. Paralelamente, ha ido emergiendo el diseño y aplicación de los receptores heteroditópicos preorganizados para la detección simultánea de especies aniónicas y catiónicas. Dentro de este contexto, los objetivos de esta tesis doctoral se centran en el diseño, síntesis y estudio del comportamiento sensor de diferentes tipos de receptores aza-heterocíclicos que contienen una unidad de señalización y, al menos, un anillo de imidazol como unidad de reconocimiento, covalentemente unidos. Además, la fusión angular de unidades azaheterocíclicas adicionales al imidazol permiten mejorar la capacidad de reconocimiento de estos receptores poli-azaheterocíclicos. Así, el primer objetivo de esta tesis está relacionado con el diseño y estudio de un receptor basado en el ferroceono en el que éste se encuentra unido a una unidad imidazo[4,5-f]quinoxalina. La fusión angular de la quinoxalina al anillo de imidazol genera una cavidad en la que los átomos de nitrógeno de ambos anillos pueden cooperar en el reconocimiento de cationes, mientras que el grupo NH del imidazol quedaría disponible para el reconocimiento de aniones. Este receptor, se comporta como sensor electroquímico y colorimétrico de cationes Zn2+, Cd2+, Hg2+ y Pb2+. El siguiente objetivo trata de la síntesis y estudio de 2-ferrocenil-1H-imidazo[4,5-f]quinoxalinas 7,8-disustituidas que contienen grupos fenilo, piridilo, furanilo o tiofenilo. El receptor difenil-sustituido se comporta como sensor redox, cromogénico y fluorescente selectivo de catión Pb2+, mientras que el receptor dipiridil-sustituido muestra capacidad para detectar selectivamente cationes Hg2+. Por otro lado, la funcionalización de la quinoxalina con anillos de tiofeno o furano contribuye a mejorar la eficacia del reconocimiento. Ambos receptores muestran una mayor afinidad por los aniones HSO4- y H2PO4- en presencia de los cationes Zn2+, Pb2+, Cd2+, Mg2+ o Ni2+. Se comportan como sensores de pares iónicos mediante una fuerte perturbación de su potencial redox y un incremento significativo de la intensidad de emisión. El siguiente objetivo propuesto se basa en la fusión de fenantreno, fenantrolina o pireno al sistema imidazoquinoxalina, para mejorar la selectividad y sensibilidad de los anteriores receptores. Así, los receptores derivados de las unidades dipirido-imidazo-fenacina e imidazo-fenantro-fenacina actúan como sensores selectivos redox, colorimétricos y fluorescentes de Hg2+, mientras que el derivado de la unidad dibenzo-imidazo-fenacina actúa como sensor altamente selectivo de Pb2+ en una mezcla acuo-orgánica. Además, se han sintetizado otros receptores 2-ferrocenil-benzobisimidazol 7-sustituidos por otra unidad de ferroceno, 2,4-dinitrobenceno o pireno. El receptor 2,7-ferrocenil disustiutuido actúa como sensor redox y fluorescente selectivo de Hg2+ y HSO4-. Por otro lado, el receptor ferrocenil-2,4-dinitrofenilo-bisimidazol se comporta como sensor redox y cromogénico de AcO-, H2PO4- y SO42- y los cationes Zn2+, Pb2+ y Hg2+, permitiendo la detección “a simple vista”. Por último, el ferroceil-pirenil-bisimidazol muestra un fuerte incremento de la intensidad de emisión en presencia de anión H2PO4-. Además, se ha descrito un receptor altamente preorganizado que combina las propiedades redox del ferroceno, las propiedades fotoemisivas del pireno y la capacidad coordinativa del anillo de imidazol. Esta diada ferrocenil-imidazopireno se comporta como sensor de pares iónicos separado, ya que es capaz de detectar un catión y un anión simultáneamente a través de dos canales: electroquímico y fluorescente. Finalmente, se ha descrito una familia de receptores basados en la unidad imidazo[4,5-e]-2,1,3-benzotiadiazol, diferentemente funcionalizados con otros anillos azaheterocíclicos con objeto de mejorar las propiedades frente al reconocimiento (pirrol, piridina, imidazol) o el carácter luminiscente (7-azaindol, benzo[g]indol). Esta familia de receptores exhibe un marcado solvatofluorocromismo y una intensa fluorescencia tanto en estado sólido como en disolución. Además, el receptor sustituido con una unidad de pirrol actúa como sensor luminiscente de compuestos nitroaromáticos, en particular, presenta una respuesta selectiva hacia el ácido pícrico. Por otro lado, el receptor funcionalizado con una unidad de piridina se comporta como sensor de las sales de Cd(AcO)2 y Zn(AcO)2 tanto en disolución como en estado sólido. Curiosamente, la formación de estos complejos en disolución permite la extracción selectiva de la sal de Zn2+ en presencia de la sal de Cd2+ tanto en disolución de cloroformo como en éter etílico.
The development of specific chemosensors for the efficient detection of anions and cations is an important subject in the field of Supramolecular Chemistry due to their fundamental roles in biological, environmental and chemical processes. Simultaneously, an emerging field within this area is based on the design and application of preorganized heteroditopic receptors for the simultaneous sensing both cationic and anionic guest species. In this context, the main objectives of this PhD thesis are focused on the design, synthesis and study of sensor behavior of several kinds of azaheterocyclic receptors containing a signal unit and, at least, a covalently linked amphoteric imidazole ring as binding unit. In addition, the angular annelation of additional azaheterocyclic units to the imidazole ring have been also carried out in order to improve the binding ability of the resulting poly-azaheterocycle receptors. Another common structural motif in the design of these receptors is the ferrocene unit that displaying remarkable electrochemical-sensing properties. Therefore, first objetive of this PhD Thesis is related to the design and study of a ferrocene-based heteroditopic receptor in which the ferrocene moiety is attached to an imidazo[4,5-f]quinoxaline. The presence of a quinoxaline ring, angularly fused to a imidazole unit, create a cavity where the N atoms present could synergistically cooperate in recognizing cationic species, while the NH group of the imidazole ring would be available for the recognition of anionic. In fact, this receptor behaves as a dual electrochemical and optical chemosensor molecule for Zn2+, Cd2+, Hg2+ y Pb2+ metal cations The second objetive is based on the design and study of 7,8-disubstituted 2-ferrocenyl-1H-imidazo [4,5-f]quinoxalines containing phenyl, pyridyl, furanyl or thienyl units. The 7,8-diphenyl substituted receptor behaves as a highly selective redox, chromogenic and fluorescent chemosensor molecule for Pb2+ cations in MeCN solution, while the receptor bearing two additional pyridine rings as substituents, exhibits ability for sensing Hg2+ cations in the same medium. On the other hand, the functionalization of the quinoxaline ring with furane o thiophene rings contributes to improve the efficiency of the recognition processes. Thus, both receptors show a dramatic enhancement in the binding of HSO4- and H2PO4- anions when are co-bound with Zn2+, Pb2+, Cd2+, Mg2+ o Ni2+ cations, whereas no affinity of the free receptors by HSO4- anion and Ni2+ or Mg2+ cations individually is observed. These receptors behave as ion-pair chemosensors by strong perturbation of the redox potential of the ferrocene unit and a remarkable enhancement of the fluorescence in the presence of an anionic and cationic species. Another objetive of this PhD Thesis is based on the annulation of an additional policyclic ring, such as phenanthrene, phenanthroline or pyrene. to the imidazoquinoxaline core, in order to improve the selectivity and sensitivity of this set of receptors. Thus, the dipyrido-imidazo-phenazine and imidazo-phenanthro-phenazine based receptors act as a selective molecular probe of Hg2+ cation through three different channels: electrochemical, colorimetric and fluorescent. However, dibenzo-imidazo-phenazine based receptor behaves as a highly selective redox/chromogenic/fluorescent chemosensor molecule for Pb2+ cations in MeCN/H2O (9/1). In addition, we have synthesized other type of multichannel chemosensor molecules based on the 2-ferrocenil-7-substituted benzobisimidazol system, decorated with another ferrocene, 2,4-dinitrobenzene or pyrene unit. The bisferrocene-benzobisimidazole acts as a dual highly selective redox and fluorescent molecular sensor for Hg2+ cation and HSO4- anion probably through initial proton transfer followed by hydrogen bond formation and subsequent anion coordination. The ferroceyl-2,4-dinitrophenyl-bisimidazole behaves as a redox and chromogenic chemosensor molecule for AcO-, H2PO4- and SO42- anions and Zn2+, Hg2+ and Pb2+ cations the recognition process being accompanied by a colour change which allows their “naked eye” detection. On the other hand, the ferroceyl-pyrenyl-bisimidazole shows a strong increase of the monomer emission band only in the presence of H2PO4-. In the same way, we have also described the synthesis and binding properties of a receptor in which the redox activity of the ferrocene group, the fluorogenic behaviour of pyrene and the binding ability of the imidazole ring are combined in a highly preorganized system. This ferrocenil-imidazopryrene dyad behaves as a host separated ion pair sensor which is able to simultaneously recognize an anion and a cation through two different channels: electrochemical and fluorescent. Finally, a set of imidazo[4,5-e]-2,1,3-benzothiadiazole multifunctional receptors, differently functionalized with other heterocyclic rings to improve the sensing properties (pyrrol, pyridine, imidazole) or the luminescent character (7-azaindole, benzo[g]indole) have also been synthesized. These receptors display solvatofluorochromism and intense fluorescence both in solution and in the solid state. Moreover, the receptor that contain a pyrrol unit as substituent, acts as luminescent molecular chemosensors for the detection of nitroaromatic compounds, particularly exhibiting a selective response towards picric acid. On the other hand, the receptor functionalized with a pyridine unit behaves as an ion-pair receptor of Cd(AcO)2 and Zn(AcO)2 either in solutions or in the solid state. Interestingly, the formation of the ion-pair complexes in solution, allows the selective extraction of the Zn2+ in the presence of the Cd2+ salt, either by a chloroform or diethyl ether solution of the receptor.

Designing novel drugs is a complex process which requires finding molecules in a vast chemical space that bind to a specific biomolecular target and have favorable physio-chemical properties. Machine learning methods can leverage previous data and use it for new predictions helping the processes of selection of molecule candidate without relying exclusively on experiments. Particularly, deep learning can be applied to extract complex patterns from simple representations. In this work we leverage deep learning to extract patterns from three-dimensional representations of molecules. We apply classification and regression models to predict bioactivity and binding affinity, respectively. Furthermore, we show that it is possible to predict ligand properties for a particular protein pocket. Finally, we employ deep generative modeling for compound design. Given a ligand shape we show that we can generate similar compounds, and given a protein pocket we can generate potentially binding compounds.
El disseny de drogues novells es un procés complex que requereix trobar les molècules adequades, entre un gran ventall de possibilitats, que siguin capaces d’unir-se a la proteïna desitjada amb unes propietats fisicoquímiques favorables. Els mètodes d’aprenentatge automàtic ens serveixen per a aprofitar dades antigues sobre les molècules i utilitzar-les per a noves prediccions, ajudant en el procés de selecció de molècules potencials sense la necessitat exclusiva d’experiments. Particularment, l’aprenentatge profund pot sera plicat per a extreure patrons complexos a partir de representacions simples. En aquesta tesi utilitzem l’aprenentatge profund per a extreure patrons a partir de representacions tridimensionals de molècules. Apliquem models de classificació i regressió per a predir la bioactivitat i l’afinitat d’unió, respectivament. A més, demostrem que podem predir les propietats dels lligands per a una cavitat proteica determinada. Finalment, utilitzem un model generatiu profund per a disseny de compostos. Donada una forma d’un lligand demostrem que podem generar compostos similars i, donada una cavitat proteica, podem generar compostos que potencialment s’hi podràn unir.

Esta tesis se ha hecho principalmente para estudiar e investigar polímeros impresos (MIPs) con la intención de usarlos como sensores de larga vida. La línea de investigación de esta tesis es la dirigida a conseguir la integración de estas formaciones impresas dentro de una lengua electrónica (ET), que es la rama de especialización en la que se ha desarrollado principalmente este proyecto. Después de hacer una revisión de la literatura, que inicialmente se centraba en la aplicación de MIPs a un equipo electroquímico, un sensor voltamétrico impreso y un procedimiento sensitivo complementario, el procedimiento se creó a través de una combinación de protocolos tomados de la literatura. Este sensor, descrito en el Artículo 1, presentaba una buena selectividad hacia el analito primario, teofilina, además de la especificidad requerida frente a sus análogos estructurales. Aunque el diseño del sensor permitía una mejor regeneración de la superficie respecto a otros sistemas parecidos encontrados en la literatura, el comportamiento de los polímeros usados en el MIP retardaba la tasa de transferencia de electrones en la superficie del sensor. Por culpa de este fenómeno, la sensibilidad del sensor se reducía. Justo después de estos experimentos iniciales, se hizo una colaboración con el grupo del Profesor Sergey Piletskey en la Universidad de Leicester (UoL) de Reino Unido. Durante este período, se realizó un estudio intensivo del proceso de diseño de impresión molecular asistido por un sistema computacional de modelización molecular ‘inhouse’. Se puso énfasis en el diseño de un receptor impreso para la molécula de baja solubilidad melanina, que se toma como ‘template modelo’. El MIP resultante se caracterizó y usó para la detección de melanina en muestras de leche, tal y como se describe y detalla en el Artículo 2. Más tarde, utilizando los conocimientos adquirido durante la estancia en Leicester, se desarrollaron nuevas técnicas de modelización computacional para la evaluación de los métodos utilizados en la modelización de MIPs, con el objetivo de obtener una técnica de evaluación virtual para el diseño de receptores impresos, optimizados para los requerimientos necesarios para su posterior aplicación en un sensor ET, tal como se detalla en el Artículo 3. Tal y como se detalla en el capítulo final de esta tesis, la experiencia y conocimientos adquiridos durante la investigación, se usaron para diseñar un grupo de sensores que funcionan asociados a ET. Este desarrollo podría ampliarse profundizando en la selección computacional de polielectrolitos, que luego serían inmovilizados en la superficie de un electrodo voltamétrico mediante una tinta de grafito conductora, de elevada robustez y estabilidad. En este sentido, también se proponen otras recomendaciones para lograr la mejora de la capacidad de regeneración de los MIPs utilizados, por ejemplo mediante la separación de MIP y electrodo. Finalmente, se presentan algunas sugerencias para colaboraciones institucionales, con el propósito de crear un sistema ET móvil, que permita recoger y analizar muestras en campo.
This thesis was predominantly undertaken to study and investigate molecular imprinted polymers (MIPs) with a view to their use as high longevity sensing elements in sensor arrays. The research line of the thesis was intended to lead to the integration of these imprinted arrays into an Electronic Tongue (ET) sensing system which is the area of expertise of the research group in which this project was primarily executed. Having initially executed a review of the literature, focusing initially on the application of the MIPs to an electrochemical device, an imprinted voltammetric sensor and a complimentary sensing procedure was developed using a combination of protocols extracted from the literature. This sensor, described in Article 1, had good selectivity toward the primary analyte, theophylline, and specificity against structural analogues. Though the design of the sensor allowed for significantly improved regeneratibility of the sensor relative to similar systems in the literature, the insulating nature of the polymers used in the MIP reduced the electron transfer rate at the sensor surface and thus resulted in a reduction in sensitivity. Following this initial experimental study, a secondment was undertaken in the University of Leicester under the supervision of Professor Sergey Piletsky. During this period, an intensive study of the design process of molecular imprinting, aided by an in-house computational molecular modelling platform, was conducted focusing on the design of an imprinted receptor for the low solubility 'model template', melamine. This MIP was successfully synthesised, characterised and used in the detection of melamine in milk samples, as detailed in Article 2. Further development of computational modelling techniques for the evaluation of MIP modelling techniques was also achieved with a view to create a virtual evaluation technique for the design of imprinted receptor sites optimised for the requirements of their application to an ET sensor array using the skills acquired during the Leicester secondment as detailed in Article 3. As detailed in the final chapter of this thesis, the insight into the imprinting process which was acquired during the research has been used to design a sensor array system which meets the specifications of ET experimental runs. This takes the form of the introduction of the research topic computationally selected polyelectrolytes, immobilised onto a voltammetric electrode surface via highly robust conducting graphite ink. Additional recommendations are also made to further enhance the on-going MIP projects within the laboratory, such as the separation of the MIP and the electrode to increase MIP regeneratibility. Some final suggestions for some other inter-institutional collaboration are also presented which aim to creating portable ET system for in-field sample collection and analysis.

Gene translation is a central process in all cells, in which messenger RNA (mRNA) is decoded by the ribosome to produce a specific amino acid chain, that will later fold into an active protein. This process is facilitated by transfer RNAs (tRNAs), which carry the specific amino acids, and bind with its complementary anticodon sequences to that of the mRNA. The correct charging of the tRNA is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetases, and thus, are responsible for stablishing the genetic code. Despite the central role of tRNAs in protein translation, the connections between tRNA gene population dynamics and genome evolution have rarely been explored. In this work we have characterized the evolution of genomes through the study of its tRNA populations. We find that its evolution is linked to the appearance of diverse strategies to maximize translation efficiency. Indeed, these diverse strategies rise due to the appearance of two tRNA modification enzymes, which cause a selective enrichment of specific tRNA isoacceptors, and consequently, the phenomenon of codon usage bias. Furthermore, we have characterized with greater detail the gene translation machinery of Plasmodium falciparum, the most deadly form of the Plasmodium genus causing malaria. To decipher novel compounds that inhibit parasite growth, we have designed and tested several drug design strategies both in slico and in vitro, finding some promising molecules that kill the parasite without damaging human cells, and that show in vivo activity against P.yoelii-infected mice.
La traducción de proteinas es un proceso central en todas las células, en el cual el ARN mensajero es descodificado en el ribosoma para producir una cadena aminoacídica, que después se plegará dando lugar a una proteina activa. Este proceso está facilitado por los ARN de transferencia (ARNt), que llevan unidos covalentemente amino ácidos específicos. La unión precisa de cada amino ácido a su ARNt está catalizada por las aminoacil-ARNt sintetasas, y por tanto, estas enzimas son las responsables de establecimiento del código genético. A pesar del papel central de los ARNt en la traducción de proteinas, las conexiones entre la dinámica de la población de genes de ARNt y su evolución a través de los distintos genomas no se ha estudiado. En este trabajo hemos caracterizado la evolución de las especies desde el estudio de sus poblaciones de ARNt, encontrando que su evolución está ligada a la aparición de distintas estrategias de maximización de la eficiencia de traducción. A su vez, estas distintas estrategias surgen por la aparición de distinas enzimas de modificación del ARNt en diversos puntos de la evolución, causando en gran medida el fenómeno del uso desigual de codones entre las distinas especies, y entre los genes dentro de una misma especie. Además, en este trabajo se ha caracterizado con mayor detalle la maquinaria de traducción de Plasmodium falciparum, la especie causante del mayor número de muertes anuales por malaria. Para intentar encontrar fármacos que inhiban al parásito, hemos diseñado distintas estrategias de diseño de fármacos, y hemos testeado varias librerias contra eritrocitos infectados por este parásito, encontrando algunas prometedoras moleculas que inhiben al parásito sin causar citotoxicidad en células humanas, y que funcionan también funcionan in vivo en modelos de ratón.

Chez les mammifères, le contrôle de la reproduction est médié par un réseau hypothalamique qui intègre divers stimuli pour réguler la sécrétion de la Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH). Ces neurones à GnRH naissent dans la placode olfactive et migrent vers le cerveau le long des axones vomeronasaux et terminaux au cours du développement embryonnaire. Bien que ce processus a bien été étudié chez les rongeurs, sa caractérisation complète chez l'homme reste inachevée. Il est largement admis que des perturbations dans le développement ou dans la sécrétion de GnRH sont associées chez l’homme à un hypogonadisme hypogonadotrope congénital (CHH), qui est un trouble caractérisé par un retard ou une absence de la puberté conduisant à l'infertilité.Les systèmes GnRH et olfactif ont des liens complexes au cours du développement, le syndrome de Kallmann (KS) représente un trouble qui associe l'hypogonadisme dû à une déficience en GnRH et l'anosmie. Le CHH et le KS sont des troubles oligogéniques, les mutations génétiques sous-jacentes n’expliquent que 50% des cas cliniques.Dans cette étude, nous avons entrepris une caractérisation complète du processus migratoire des neurones à GnRH au cours du premier trimestre de gestation sur une grande série d'embryons et de fœtus humains, ce qui nous a permis d’élaborer le premier atlas chronologique et quantitatif de la distribution de GnRH. En effet, l'utilisation d’une nouvelle approche de transparisation des tissus embryologiques humains par de solvants organiques, a permis d’établir pour la première fois, une véritable représentation des neurones dans leur contexte natal in vivo.De plus, les résultats de cette étude ont non seulement révélé que le nombre de neurones GnRH chez l'homme était significativement plus élevé que prévu, mais aussi que ces derniers migrent vers plusieurs régions du cerveau extra-hypothalamique, en plus de l'hypothalamus. Leur présence dans ces régions soulève l'hypothèse qu’ils pourraient exercer des rôles non reproductifs, créant de nouvelles pistes pour la recherche sur les fonctions du système GnRH dans les processus cognitifs, comportementaux et physiologiques.Le second objectif de ce travail a visé à caractériser un nouveau gène candidat impliqué dans le développement du système GnRH: L'hormone Anti-Müllerienne (AMH), connue pour son rôle dans la différenciation de la gonade bipotentielle chez les mâles. Néanmoins, une récente étude menée par notre équipe a mis en évidence son rôle extragonadique sur les neurones à GnRH en période post-natale.Le séquençage complet d'une large cohorte de patients européens a révélé plusieurs nouvelles mutations faux-sens dans le gène de l’AMH chez les patients atteints de CHH et KS, non retrouvés dans la cohorte des témoins. L’évaluation de la pertinence fonctionnelle de ces mutations a ensuite été effectuée par diverses analyses biochimiques in vitro de la bioactivité des mutations, ainsi que par la caractérisation d'une lignée de souris transgénique. Ce qui a entraîné une diminution de la sécrétion de l'AMH et une diminution de la bioactivité de la protéine sécrétée dans les études in vitro; Conduisant à une éventuelle réduction de la capacité migratoire. Cela suggère fortement que ces mutations pourraient avoir un effet pathogène.En outre,nous montrons que le récepteur AMHR2 est exprimé le long des fibres olfactives et par les neurones à GnRH pendant le processus migratoire GnRH. L'analyse pathohistologique des souris Amhr2 -/- a révélé une altération de la migration embryonnaire des neurones à GnRH vers le cerveau antérieur basal, entraînant une réduction significative du nombre total de neurones GnRH dans les cerveaux adultes de ces animaux, conduisant à une fertilité réduite. L’ensemble de ces travaux indiquent que l'insuffisance de signalisation AMH contribuerait à la pathogenèse des troubles de CHH chez l’homme, et met en évidence un nouveau rôle de l'AMH dans développement et la fonction des neurones GnRH
The control of mammalian reproduction is mediated by a hypothalamic network that integrates various stimuli to regulate the periodic secretion of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). GnRH neurons, originate in the olfactory placode and enter the brain along vomeronasal and terminal axons during embryonic development. This process has been well studied in rodents, however, a full characterisation in humans was lacking. Alterations either in the development of this system or in the secretion of GnRH are associated with congenital hypogonadotropic hypogonadism (CHH) in humans, a condition characterized by failure of sexual competence. Due to the inextricable links in the development of the olfactory and GnRH systems, there also exists the developmental condition, Kallmann syndrome (KS), associating hypogonadism due to GnRH deficiency and anosmia. Both CHH and KS are oligogenic disorders, with the underlying genetic mutations only explained in 50% of the clinical cases.At the heart of this study, we have undertaken a full characterisation of the GnRH migratory process during the first trimester of gestation in a large series of human embryos and foetuses and provide the first chronological and quantitative atlas of GnRH distribution. This has been aided by the novel application of organic solvent based tissue clearing techniques to human embryological tissue. This allows, for the first time, a true representation and appreciation of cells in their native, in vivo context. The results of this study have revealed not only that the number of GnRH neurons in humans is significantly higher than previously thought, but that GnRH cells migrate into several extrahypothalamic brain regions in addition to the hypothalamus. Their presence in these areas raises the possibility that GnRH has non-reproductive roles, creating new avenues for research on GnRH functions in cognitive, behavioural and physiological processes.The second aim of this work has been to characterise a novel candidate gene responsible for the development of the GnRH system. Anti-Müllerian hormone (AMH), best known for its role in facilitating the differentiation of the bipotential gonad in males, has recently been shown by our lab to exert significant effects on GnRH neurons postnatally. Here we have undertaken whole exome sequencing of a large cohort of European CHH and KS patients, identifying several novel missense mutations in the Amh gene that are not present in the control cohort. Various in vitro and biochemical analyses of mutations bioactivity as well as analysis of a transgenic mouse line have been used to assess the functional relevance of these mutations.Mutations in Amh resulted in impaired secretion of AMH and reduced bioactivity of the secreted protein in in vitro studies; eventually leading to reduced migratory capacity. This strongly suggests that these mutations could have a pathogenic effect. We also show that its receptor AMHR2 is expressed along the olfactory fibres and by GnRH neurons during the GnRH migratory process. Pathohistological analysis of Amhr2-/- mice revealed defective embryonic migration of GnRH cells to the basal forebrain, leading to a significant reduction in the total number of GnRH neurons in the adult brains of these animals resulting in reduced fertility. We therefore propose that AMH signalling insufficiency contributes to the pathogenesis of human CHH conditions and highlights a novel role for AMH in the correct development and function of GnRH neurons

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 122.pdf: 1194114 bytes, checksum: b0b0d31b9027bb954f6bb3ca83a18349 (MD5) Previous issue date: 2007
Os enterococos são patógenos com considerável capacidade de expressar resistência a vários antimicrobianos. Sua natureza ubiqüitária e resistência às condições ambientais adversas explicam sua habilidade para colonizar diferentes habitats e seu potencial para se disseminar com facilidade através da cadeia alimentar. No presente estudo avaliamos a distribuição das espécies e a susceptibilidade aos antimicrobianos entre enterococos isolados a partir de alimentos de origem animal (carne de frango e leite pasteurizado) obtidos de supermercados e feiras livres no Rio de Janeiro / RJ, Brasil. As seguintes espécies foram identificadas, entre 167 amostras isoladas obtidos de carne de frango e 127 obtidas de leite pasteurizado: E. faecalis (184 – 62,6%), E. casseliflavus (51 – 17,3%), E. durans (19 – 6,5%), E. gallinarum (9 – 3%), E. gilvus (7 – 2,4%), E. faecium 6 – 2%), E. hirae (4 – 1,4%) e E. sulfureus (3 – 1%). Os percentuais de resistência aos antimicrobianos entre os isolados foram: 32,1% à tetraciclina; 23,3% à eritromicina; 11,3% à estreptomicina; 0,7% ao cloranfenicol; 3,9% à gentamicina, 2,1% ao imipenem; 1,1% à norfloxacina; 0,7% à ciprofloxacina, nitrofurantoína e penicilina e 0,4% /à ampicilina. Resistência intermediária foi detectada em percentuais que variaram de 0,5% para a linezolida até 62% para a eritromicina. Nenhuma das amostras bacterianas apresentou resistência aos glicopeptídeos testados, vancomicina e teicoplanina. Resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos foi observada em 13,1% dos isolados. Multirresistencia aos antimicrobianos foi observada nas espécies E. faecalis, E. casseliflavus, E. faecium, E. gallinarum, E. durans e E. gilvus. Entre os enterococos isolados de carne de frango e leite pasteurizado foi possível detectar a presença do gene ermB, responsável pela resistência à eritromicina entre E. faecalis, E. casseliflavus, E. gallinarum e E. durans. Os genes tetL, tetM e tetO, foram detectados nas espécies E. faecalis, E. casseliflavus e E. gallinarum isoladas a partir carne de frango. A diversidade genética de E. faecalis (54 isolados) apresentando características de multirresistencia aos antimicrobianos, procedentes de carne de frango e de leite pasteurizado foi avaliada através da análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico utilizando a endonuclease de restrição SmaI e eletroforese em campo pulsado (PFGE). Foi detectado um número elevado (39) de diferentes perfis de fragmentação do DNA cromossômico. Deste total, a maioria (30) foi constituída por apenas um isolado, revelando um elevada diversidade genética.
The enterococci are important nosocomial pathogens with a remarkable capacity of expressing resistance to several antimicrobial agents. Their ubiquitous nature and resistance to adverse environmental conditions take account for their ability to colonize different habitats and for their potential for easy spreading through the food chain. In the present study we evaluated the distribution of species and antimicrobial susceptibility among enterococcal isolates recovered from food obtained in retail stores in Rio de Janeiro, Brazil. The following species were identified among 167 isolates obtained from poultry meat and 127 from pasteurized milk: Enterococcus faecalis (62.6%), Enterococcus casseliflavus (17.3%), Enterococcus durans (6.5%), Enterococcus gallinarum (3.0%), Enterococcus gilvus (2.4%), Enterococcus faecium (2.0%), Enterococcus hirae (1.4%), and Enterococcus sulfureus (1.0%). The overall percentages of antimicrobial resistant isolates were: 31.2 % to tetracycline, 23.8% to erythromycin, 11.3% to streptomycin, 4.3% to chloramphenicol, 3.9% to gentamicin, 1.4% to norfloxacin, 1.1% to imipenem, 0.7% to ciprofloxacin, nitrofurantoin, and penicillin and 0.4% to ampicillin. Intermediate resistance was detected in frequencies varying from 0.5% for linezolid to 58.2% for erythromycin. None of the isolates showed resistance to glycopeptides. High-level resistance to aminoglycosides was observed in 13.1% of the isolates. Multiresistance was observed in E. faecalis, E. casseliflavus, E. faecium, E. gallinarum, E. durans and E. gilvus. The presence of the gene ermB, coding for the resistance to erythromycin, was detected by PCR in E. faecalis, E. casseliflavus, E. gallinarum and E. durans. The presence of the genes tetL, tetM and tetO, associated with resistance to tetracycline, were detected by PCR, among E. faecalis, E. casseliflavus, and E. gallinarum isolatede from poultry meat. The genetic diversity among multiresistant E. faecalis (54 isolates) from poultry meat and pasteurized milk, was evaluated by the analysis of the cromossomic DNA fragmentation profile by PFGE after cleavage with SmaI by PFGE. A variety (39) of different cromossomic DNA fragmentation profile or clonal complexes was found among multiresistant E. faecalis from poultry meat and milk, indicating a high level of genetic diversity.

El primer capítulo de esta Tesis trata del diseño de imanes quirales basados en cianuros bimetálicos. Se presenta la síntesis y caracterización de diez análogos del azul de Prusia del tipo Ni3Fe2 y Cu3Fe2 obtenidos con los ligandos trans-chxn, trans-(1S,2S)-chxn, trans-(1R,2R)-chxn y cis-chxn (chxn = ciclohexano-1,2-diamina): [Ni(trans-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (1), [Ni(cis-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (2), [Ni(trans-(1S,2S)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (3), [Ni(trans-(1R,2R)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (4), [Cu(cis-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·7H2O (5), [Cu(trans-(1S,2S)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·4.5H2O (6), [Cu(trans-(1R,2R)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·4.5H2O (7), [Cu(cis-chxn)]3[Fe(CN)6]2·6H2O (8), [Cu(trans-(1S,2S)-chxn)]3[Fe(CN)6]2·nH2O (9) y [Cu(trans-(1R,2R)-chxn)]3[Fe(CN)6]2·nH2O (10). Los productos (1)-(4) y (8)-(10) exhiben orden ferromagnético de largo alcance. Las estructuras de los compuestos (1), (3), (4) y (8), bidimensionales, confirman que el ligando voluminoso chxn da lugar a distancias interlaminares grandes y modula el comportamiento magnético global estabilizando la fase ferromagnética.El estudio magnético detallado de los compuestos trans de NiIIFeIII, tanto en muestras policristalinas como en monocristales orientados, ha puesto de manifiesto la importancia de la anisotropía magnética en la dinámica lenta de los dominios en la fase ordenada.En los sistemas de CuIIFeIII, el control estequiométrico del entorno de coordinación del cobre ha permitido obtener compuestos con orden magnético. El empleo de los precursores bisdiamino [Cu(L)2]2+ (L = cis-chxn, trans-(1S,2S)-chxn y trans-(1R,2R)-chxn) dio lugar a los compuestos monodimensionales (5)-(7), cuyo comportamiento es prácticamente paramagnético. El empleo de los precursores diamino [Cu(L)]2+ permitió obtener los compuestos (8)-(10), que se ordenan ferromagnéticamente. (8) es el primer ferromagneto de CuIIFeIII caracterizado estructuralmente del que hay constancia.Por otra parte, el compuesto (5) parece experimentar una transición estructural a bajas temperaturas, detectada por las medidas de Mössbauer.Finalmente, el empleo de los ligandos quirales trans-(1S,2S)-chxn y trans-(1R,2R)-chxn ha dado lugar a los imanes quirales (3), (4), (9) y (10). La quiralidad se ha confirmado mediante RX y dicroísmo circular.El segundo capítulo de la Tesis trata del diseño de agentes de contraste para imagen por resonancia magnética (IRM). Se presenta la síntesis y la caracterización de cuatro complejos de gadolinio tipo DOTA y TETA sustituidos con radicales libres nitronil e imino aminoxilo ((8), (9), (12) y (13)) y de sus precursores ((2)-(7), (10) y (11)).Los compuestos se caracterizaron mediante espectroscopia IR, RMN, absorción electrónica y ESI-MS. Además, se realizaron medidas magnéticas y EPR de los complejos de Gd3+. Éstos presentan un comportamiento quasi paramagnético, con débiles interacciones intermoleculares antiferromagéticas a muy bajas temperaturas, aunque no se descarta la existencia de interacciones metal-radical.La caracterización de los compuestos de Gd3+ se completó con un estudio relaxométrico preliminar. Se realizaron medidas de relaxividad en función del campo (perfiles NMRD), del pH y de la temperatura. Éstas apuntan a que los productos (8) y (9) podrían ser buenos agentes de contraste para IRM. Sus relaxividades son superiores a las de otros complejos de gadolinio actualmente utilizados en la práctica médica como el [Gd-DOTA(H2O)]- (Dotarem®), [Gd-DTPA(H2O)]2- (Magnevist®) y [Gd-DTPA-BMA (H2O)] (Omniscan®). La sustitución de uno de los brazos del DOTA y el TETA por un sintón electrónicamente activo (un radical nitronil o imino aminoxilo) aumenta el espín electrónico de estos sistemas, lo que se espera contribuya de manera positiva a la relaxividad.La relaxividad del derivado de ciclam (9) a pH 5 /5.5 es significativamente mayor que la del derivado de ciclen (8).Por otra parte, las medidas de relaxividad en función de la temperatura indican que el intercambio protónico no es limitante en ninguno de los complejos estudiados.Por último, la relaxividad de los dos compuestos es muy sensible al pH, característica que ayuda a diferenciar por IRM partes de un tejido que presentan diferente pH como consecuencia de una patología.
The first chapter of this Thesis deals with the design of chiral magnets based on bimetallic cyanides. The synthesis and characterization of ten Prussian blue analogues of Ni3Fe2 and Cu3Fe2 type obtained from trans-chxn, trans-(1S,2S)-chxn, trans-(1R,2R)-chxn and cis-chxn (chxn = cyclohexane-1,2-diamine) is given. These are compounds [Ni(trans-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (1), [Ni(cis-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (2), [Ni(trans-(1S,2S)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (3), [Ni(trans-(1R,2R)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·2H2O (4), [Cu(cis-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·7H2O (5), [Cu(trans-(1S,2S)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·4.5H2O (6), [Cu(trans-(1R,2R)-chxn)2]3[Fe(CN)6]2·4.5H2O (7), [Cu(cis-chxn)]3[Fe(CN)6]2·6H2O (8), [Cu(trans-(1S,2S)-chxn)]3[Fe(CN)6]2·nH2O (9) and [Cu(trans-(1R,2R)-chxn)]3[Fe(CN)6]2·nH2O (10).Products (1)-(4) and (8)-(10) exhibit long rage ferromagnetic order. A magnetic study of compounds (1), (2) and (3) performed both on polycrystalline samples and oriented single crystals has shown that magnetic anisotropy plays an important role in domain dynamics.Stoichiometric control of the coordination sphere of copper in CuIIFeIII systems has enabled the preparation of compounds with long range magnetic order. (8) is the first structurally characterized CuIIFeIII ferromagnet to date.Finally, compounds (3), (4), (9) and (10) are chiral magnets. Chirality has been confirmed by X Rays and circular dichroism.The second chapter of this Thesis deals with the design of contrast agents for magnetic resonance imaginery (MRI). It shows the synthesis and characterization of four DOTA-like and TETA-like gadolinium complexes substituted with nitronyl and imino nitroxide free radicals ((8), (9), (12) and (13)).These complexes and their precursors have been characterized by IR, NMR, electronic absorption and ESI-MS. Magnetic measurements and EPR have been also performed, pointing to a quasi paramagnetic behaviour.A preliminary relaxometric study of Gd3+ complexes indicates that products (8) and (9) could be suitable MRI contrast agents. Their relaxivities are higher than those of currently used contrast agents such as [Gd-DOTA(H2O)]- (Dotarem®), [Gd-DTPA(H2O)]2- (Magnevist®) or [Gd-DTPA-BMA (H2O)] (Omniscan®). Moreover, their relaxivities are highly pH-dependent. This feature might prove to be useful for differentiating between healthy and damaged parts of a tissue.

Submitted by Fabiana Gonçalves Pinto (benf@ndc.uff.br) on 2016-10-24T17:42:22Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Soares Pessanha.pdf: 2199380 bytes, checksum: bb078e15b653af8e5dfd1387ea2db7e4 (MD5)
Made available in DSpace on 2016-10-24T17:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Soares Pessanha.pdf: 2199380 bytes, checksum: bb078e15b653af8e5dfd1387ea2db7e4 (MD5) Previous issue date: 2015
Mestrado Acadêmico em Ciências do Cuidado em Saúde
Introdução: Para a correta reparação das feridas, as diversas fases do processo de cicatrização devem ocorrer na sequencia correta, numa intensidade ideal. Vários fatores afetam a cicatrização das feridas ao interferir em uma ou mais fases deste processo, tal como, a presença de infecção. Objetivo geral: Analisar as cepas de Pseudomonas aeruginosa encontradas nas feridas crônicas tratadas com gel de carboximetilcelulose a 2% ou com placa de poliuretano. Método: Pesquisa observacional descritiva, com abordagem quantitativa, realizada através da coleta de material biológico de feridas crônicas de pacientes atendidos em serviços ambulatoriais, empregando swabs. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF) com número de parecer 815.353. As cepas de P. aeruginosa foram identificadas por MALDI-TOF MS, submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, identificação de genes de virulência através de PCR e tipagem molecular através de PFGE. Resultados: Das 43 feridas a partir das quais foram coletados swabs, em 31 (72,09%) obteve-se isolamento de P. aeruginosa (foram identificadas 48 cepas). Estas feridas têm 3,6 vezes mais chances de desenvolverem infecção quando comparadas àquelas a partir das quais esse microrganismo não foi isolado. As cepas isoladas dos pacientes em uso de gel de carboximetilcelulose a 2% apresentaram maiores taxas de resistência a gentamicina e ciprofloxacino (ambos com 7,89%). Já as cepas isoladas dos pacientes tratados com placa de poliuretano, destacaram-se pela resistência a ciprofloxacino (90%). Foram identificadas três cepas multirresistentes de duas feridas tratadas com placa de poliuretano impregnada com prata. Foram positivas para presença do gene exoS 26 cepas (54,16%), e 13 (27,08%), para o gene exoU. Observou-se mesmo perfil de PFGE entre as cepas coletadas em diferentes momentos de onze pacientes, enquanto que em seis pacientes as cepas coletadas em diferentes momentos foram distintas. Não houve semelhança de padrões de fragmentação de DNA entre cepas derivadas de pacientes diferentes. Conclusão: A maioria das feridas não apresentava sinais clínicos de infecção. Foram identificadas 48 cepas de P. aeruginosa. O isolamento deste microrganismo é fator de risco para desenvolvimento de infecção. As cepas de P. aeruginosa têm baixos índices de resistência antimicrobiana, com apenas três cepas multiresistentes. Os desbridamentos realizados nas feridas crônicas não têm sido efetivos para descolonização de P. aeruginosa, já que um mesmo clone bacteriano foi identificado na ferida em diferentes momentos, na maioria dos casos
Introduction: For proper wound healing, various stages of the healing process must occur in a correct sequence and an ideal intensity. Several factors affect the wounf healing on one or more phases of this process, such as the presence of infection. General objective: To analyze Pseudomonas aeruginosa strains found in chronic wounds treated with 2% carboxymethylcellulose gel or polyurethane plate. Method: Descriptive observational research with a quantitative approach, carried out through the collection of biological material of chronic wounds of patients attended in outpatient services, using swabs. The study was approved by the Research Ethics Committee (Academic Hospital Antonio Pedro - UFF) with number 815.353. P. aeruginosa strains were identified by MALDI-TOF MS, subjected to antimicrobial susceptibility testing, identification of virulence genes by PCR and molecular typing by PFGE. Results: Of the 43 wounds from which swabs were collected, at 31 (72.09%) was obtained isolation of P. aeruginosa (48 strains have been identified). These wounds are 3.6 times more likely to develop infection when compared to those from which this microorganism was not identified. The strains isolated from patients using 2% carboxymethyl cellulose gel showed more resistance rates to gentamicin and ciprofloxacin (both 7.89%). Already the strains isolated from patients treated with polyurethane plate, highlighted by the resistance to ciprofloxacin (90%). Three multiresistant strains were identified from two wounds treated with polyurethane plate impregnated with silver. 26 strains (54.16%) were positive for the presence of exoS gene and 13 (27.08%), for the exoU gene. It was observed even PFGE profile among strains collected at different times of eleven patients, while in six patients, strains collected at different times were different. There was no resemblance DNA fragmentation patterns among strains derived from different patients. Conclusion: Most of the wounds showed no clinical signs of infection. 48 strains of P. aeruginosa have been identified. The isolation of this microorganism is a risk factor for development of infection in chronic wounds. Strains of P. aeruginosa demonstrated low antimicrobial resistance rates and only three multi-resistant strains were identified. The debridement performed in chronic wounds is not effective for removing colonization by P. aeruginosa, because same bacterials clones was identified in the wound swabs collected in same patients at different times in most cases

Memoria para optar al título de Químico
Los llamados contaminantes emergentes, están presentes en un variado rango de productos de la vida cotidiana, como los productos farmacéuticos que son liberados de manera indiscriminada a las plantas de tratamiento de aguas, donde al no ser removidos en su totalidad tienden a permanecer en la fase acuosa, y por lo tanto, son frecuentemente detectados en aguas superficiales. La preocupación recae en que sus productos de degradación pueden ser incluso más tóxicos que los contaminantes iniciales. Entre los productos farmacéuticos, las drogas antiinflamatorias no esteroidales (non-steroidal anti-inflammatory drugs) (NSAIDs), han sido detectadas frecuentemente en el medio ambiente y no poseen una legislación que las regule. Es por esto que se desarrolló un método analítico para determinar la concentración de estos fármacos más comúnmente usados en muestras acuosas, mediante la técnica de microextracción por sorción en disco rotatorio (rotating disk sorptive extraction) (RDSE). El dispositivo de extracción es de teflón y presenta una cavidad en el cual se le inmoviliza un polímero de impresión molecular (MIP) como sorbente selectivo para la extracción de los analitos, con la posterior cuantificación mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-MS), con previo proceso de derivatización de los extractos provenientes de RDSE. Las condiciones de extracción optimizadas para los antinflamatorios no esteroidales, ácido mefenámico y diclofenaco fueron las siguientes: volumen de muestra de 50 mL, 25 mg de fase MIP, agitación a 3000 rpm, tiempo de extracción de 60 minutos, pH 2 y un proceso de desorción con 10 mL de metanol por 5 minutos. Se demostró que para los fármacos en estudio la fase sorbente de MIP extrae en promedio 3 veces más que la fase con el mismo polímero no impreso (NIP), dejando de manifiesto el efecto de las cavidades de la molécula impresa. La metodología propuesta se validó en una matriz de agua potable. El método alcanzó límites de detección entre 0,060 - 0,223 μgL-1 de AINEs con recuperaciones entre 99-100% ± 5-6%. La aplicación en muestras de aguas residuales obtenidas de una planta de tratamiento de Santiago entregó concentraciones para estos fármacos entre 1,8 - 4,3 μgL-1 en el afluente y de 1,3 – 2,8 en el efluente
The so called emerging contaminants are present in a wide range of daily life products such as drugs that are haphazardly released into water treatment plants where, as they are not completely removed, they tend to remain in the aqueous phase and consequently are found in surface waters. The concern lies in that they can transform into products that are more toxic and more dangerous than the original contaminants. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are a type of drugs that have been frequently detected in the environment and are not regulated by law. For this reason, an analytical method was developed to determine the concentration of the most commonly used NSAIDs in aqueous samples, using the rotating-disk sorptive microextraction technique (RDSE). The extraction device, made of Teflon, contains a cavity in which it can immobilize a molecularly imprinted polymer (MIP) as a selective sorbent for extracting analytes, which are subsequently quantified using the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method once the extracts from RDSE were subject to a derivatization process. The optimal condition for extraction of the mefenamic acid and diclofenac NSAIDs were the following: sample volume of 50 mL, 25 mg of MIP, 3000 rpm agitation, extraction time 60 min, pH2 and desorption with 10 mL of methanol during 5 minutes. For the drugs under study, it was shown that the sorbent phase of MIP recovered on average three times more than the same phase with no imprinted polymer (NIP), evidencing the effect of the cavities of the imprinted molecule. The proposed methodology was validated using a potable water matrix The method achieved NSAIDs detection limits between 0.060 to 0.223 ugL-1 with recoveries between 99-100% ± 5-6%. The application (of this method) to waste water samples obtained from a water treatment plant in Santiago showed NSAIDs concentrations of 1.8 to 4.3 μgL-1 in the influent stream and 1.3 to 2.8 μgL-1 in the effluent stream

Os poluentes orgânicos emergentes vêm se tornando fonte crescente de preocupação ambiental. Entre as classes mais comumente encontradas em amostras de águas estão os antibióticos, com destaque para as tetraciclinas. A ocorrência destes analitos em níveis muito baixos torna necessária a utilização de técnicas de extração seletivas e sensíveis capazes de pré-concentrar tais analitos na presença de concomitantes mais abundantes. Nesse sentido, acredita-se que os polímeros de impressão molecular (MIP) se enquadram perfeitamente para tal aplicação principalmente devido a características como seletividade e sensibilidade. Adicionalmente, o emprego de 2-hidroxietil metacrilato (HEMA) e o glicerol dimetacrilato (GDMA) durante a síntese aumenta a quantidade de hidroxilas superficiais, que por sua vez tornam o material mais compatível com sistemas aquosos, uma vez que há predomínio de interações de hidrogênio entre a água e as hidroxilas superficiais, minimizando a perturbação desse solvente na ligação analito-MIP. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver um disco de MIP com revestimento superficial hidrofílico para extração de tetraciclinas de amostras de águas seguida de análise por HPLC-UV. O MIP foi sintetizado utilizando-se oxitetraciclina como molécula-modelo, ácido metacrílico como monômero funcional, etileno glicol dimetacrilato como agente de ligação cruzada, 2,2’-azo-bis-iso-butironitrila como iniciador radicalar e HEMA e GDMA como comonômeros hidrofílicos. O material (1 g) foi então comprimido na forma de um disco de 40 mm de d.i. por 2 mm de espessura e empregado em procedimentos de extração em fase sólida em disco. A metodologia mostrou-se promissora para a extração seletiva de tetraciclinas com linearidade, precisão e exatidão adequadas e, com limites de quantificação da ordem de 5 µg L-1.
Emerging organic pollutants have caused great environmental concern. Among the most common pharmaceuticals, antibiotics are in focus, especially tetracyclines. The occurrence of these analytes at low levels makes necessary the use of selective and sensitive extraction techniques to enrich those compounds even in the presence of other concomitant interferents. In this way, it is thought that molecularly imprinted polymers (MIPs) fit perfectly to this application mainly due to their characteristics of selectivity and sensitivity. In addition, the use of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and glycerol dimethacrylate (GDMA) during the synthesis increases the number of surface hydroxyl groups, which in turns makes the polymer more compatible with aqueous systems, since they enhance the hydrogen bonds between the water and surface hydroxyl groups, minimizing the interference of this solvent in the complex analyte-polymer. Thus, the objective of this project was to develop a MIP disk for the extraction of tetracyclines from water samples followed by the HPLC-UV analysis. The MIP was synthesized using oxytetracycline as template, methacrylic acid as functional monomer, ethylene glycol dimethacrylate as the cross-linker agent, 2,2’-azo-bis-iso-butyronitrile as radical initiator and HEMA and GDMA as hydrophilic monomers. The polymer was then compressed in a disk form of 40 mm of internal diameter and 2 mm of thickness and this system was used in solid-phase extraction procedures. The developed method showed great results for selective extraction of tetracyclines with good linearity, precision and accuracy showing limits of quantification of 5 µg L-1.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Classically it was assumed that the compounds with therapeutic effect exert their action interacting with a single receptor. Nowadays it is widely recognized that the pharmacological effect of most drugs is more complex and involves a set of receptors, some associated to their positive effects and some others to the side effects and toxicity. Antipsychotic drugs are an example of effective compounds characterized by a complex pharmacological profile binding to several receptors (mainly G protein-coupled-receptors, GPCR). In this work we will present a detailed study of known antipsychotic drugs and the receptors potentially involved in their binding profile, in order to understand the molecular mechanisms of the antipsychotic pharmacologic effects.

The study started with obtaining homology models for all the receptors putatively involved in the antipsychotic drugs receptorome, suitable for building consistent drug-receptor complexes. These complexes were structurally analyzed and compared using multivariate statistical methods, which in turn allowed the identification of the relationship between the pharmacological properties of the antipsychotic drugs and the structural differences in the receptor targets. The results can be exploited for the design of safer and more effective antipsychotic drugs with an optimum binding profile.
Tradicionalmente se asumía que los fármacos terapéuticamente efectivos actuaban interaccionando con un único receptor. Actualmente está ampliamente reconocido que el efecto farmacológico de la mayoría de los fármacos es más complejo y abarca a un conjunto de receptores, algunos asociados a los efectos terapéuticos y otros a los secundarios y toxicidad. Los fármacos antipsicóticos son un ejemplo de compuestos eficaces que se caracterizan por unirse a varios receptores simultáneamente (principalmente a receptores unidos a proteína G, GPCR). El trabajo de la presente tesis se ha centrado en el estudio de los mecanismos moleculares que determinan el perfil de afinidad de unión por múltiples receptores de los fármacos antipsicóticos.

En primer lugar se construyeron modelos de homología para todos los receptores potencialmente implicados en la actividad farmacológica de dichos fármacos, usando una metodología adecuada para construir complejos fármaco-receptor consistentes. La estructura de estos complejos fue analizada y se llevó a cabo una comparación mediante métodos estadísticos multivariantes, que permitió la identificación de asociaciones entre la actividad farmacológica de los fármacos antipsicóticos y diferencias estructurales de los receptores diana. Los resultados obtenidos tienen interés para ser explotados en el diseño de fármacos antipsicóticos con un perfil farmacológico óptimo, más seguros y eficaces.

A rubelose é uma doença que atinge galhos e ramos, e é causada pelo fungo Erythricium salmonicolor, o qual infecta várias espécies vegetais, tais como citros, seringueira, e macieira. Esta doença vem chamando a atenção dos citricultores devido à redução de até 10% da produção de citros, a qual é preocupante para o Brasil, o maior produtor de laranja do mundo. Entretanto, a diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Desta maneira, este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de isolados do fungo E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas deste fungo e iii) selecionar bactérias endofíticas com potencial para o controle deste fungo fitopatogênico. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos (A, B, C, D, E, F), os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre as hifas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. No teste de antagonismo, 8 isolados bacterianos inibiram E. salmonicolor. Entretanto, foi observada diferença na interação entre as bactérias e diferentes isolados de E. salmonicolor, visto que bactérias diferentes inibiram os dois genótipos do fungo, revelando a variabilidade genética entre estas linhagens que pertencem a diferentes haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual de E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, responsável pelos processos de recombinações sexuais e parassexuais, que geram variabilidade genética em fungos filamentosos.
The fungus Erythricium salmonicolor is the causal agent of pink disease, which infects branches of many host plants, such as citrus, rubber, and apple. This disease may be a serious problem in Brazil, since it can reduce the citrus production up to 10%. Brazil is the major world citrus producer, therefore this problem is alarming. The genetic diversity of E. salmonicolor from Brazilian plants has not been evaluated, so the aims of this study were i) to evaluate the genetic diversity by RAPD of E. salmonicolor isolates from São Paulo and Minas Gerais; ii) to evaluate the vegetative compatibility and hyphal fusion of this fungus; and iii) to select endophytic bacteria able to inhibit the E. salmonicolor growth. RAPD analysis showed at least 6 distinct haplotypes (A, B, C, D, E, F), which did not have correlation with the isolation site and host plant. Also, vegetative compatibility tests showed that 84% of crosses resulted in hyphal fusion, but this compatibility was not related to the RAPD haplotypes. Eight endophytic bacteria were selected against E. salmonicolor, which could be used for biological control of this pathogen. However it was observed different types of interaction among endophytic bacteria and E. salmonicolor strains, since these bacteria inihibited differentially two fungi isolates. It reveals the genetic variability between these fungi isolates that belongs to different haplotypes These results show the importance of future studies concerning the sexual phase of E. salmonicolor, since the genetic variability seems to be high and this hyphal fusion, which precede the formation of heterokaryon (sexual and parassexual reproduction), could be responsible for the variability in this filamentous fungus.