Letteratura scientifica selezionata sul tema "Inibidores de histona desacetilases"

A unidade básica da cromatina é o nucleossomo que consiste em, aproximadamente, 146 pares de bases do DNA enroladas ao redor de um octâmero central de proteínas conhecidas como histonas. Essas proteínas básicas, inicialmente, foram consideradas como componentes meramente estruturais, mas agora são reconhecidas pelo importante papel que desempenham na manutenção do equilíbrio dinâmico da cromatina. As caudas aminoterminais das histonas estão sujeitas a uma variedade de modificações pós-traducionais, como metilação, acetilação, fosforilação, entre outras, que regulam suas funções. Algumas modificações estão associadas a genes ativos, enquanto outras a genes silenciosos. Uma das modificações mais estudadas atualmente é a acetilação, que depende da atividade de duas famílias de enzimas, histonas acetiltransferases (HAT) e histonas desacetilases (HDAC). As mutações ou translocações cromossomais, envolvendo genes HAT e HDAC, resultam no desenvolvimento de malignidades hematológicas, como leucemia promielocítica aguda, linfoma e outras. Inibidores das histonas desacetilases (iHDAC) têm emergido como uma nova classe de agentes anticâncer. Estes iHDAC têm demonstrado atividades contra diversos tipos de câncer e notáveis efeitos na proliferação da célula tumoral, na morte celular programada, na diferenciação e angiogênese in vitro e in vivo.

O estado da cromatina influencia diretamente nos processos de expressão gênica desencadeada durante a formação de memórias. Nesse sentido sendo de grande interesse seu estudo na área biomédica. Modificações epigenéticas como a metilação do DNA e modificações pós-traducionais em histonas são reguladores cruciais do estado da cromatina e ds transcrição gênica. Uma das modificações pós-traducionais mais bem estudada é a acetilação de histonas. Quando as histonas estão acetiladas a cromatina encontra-se num estado relaxado permitindo a expressão gênica. A reação é catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e é um processo reversível catalisado por histona desacetilases (HDACs). A utilização de fármacos inibidores de histona desacetilases (HDACis) tem ajudado na elucidação dos mecanismos gênicos envolvidos na formação do aprendizado e da memória. Nosso trabalho se baseia na hipótese de que a atividade de HDACs é crucial para modulação das respostas de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória e que a acetilação de histonas é um passo essencial neste processo. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que a infusão intra-hipocampal de tricostatina A (TSA) ou butirato sódico (NaB) imediatamente após o treino resulta na melhora da memória de longa duração (LTM). TSA demonstrou ainda possuir duas ondas de efeitos melhoradores da LTM, uma imediatamente e outra 3h após o treino que coincidem com as ondas de ativação de vias de sinalização intracelular e de síntese de proteínas importantes para a formação da LTM. Adicionalmente, a inativação farmacológica da amigdala basolateral (BLA) antes do treino bloqueou os efeitos melhoradores do TSA administrado no hipocampo, evidenciando que a integridade da BLA é importante para este processo. Neste trabalho demonstramos também que a administração intraperitoneal de NaB imediatamente após o treino em animais velhos sem prejuízo cognitivo resulta em melhora significativa da memória. O tratamento com NaB não afetou a LTM de animais jovens saudáveis. Por fim, nossos dados demonstram que a administração de um fármaco antagonista de receptores TrkB, ANA-12, no hipocampo de animais jovens após o treino ou teste resulta no prejuízo da memória. No entanto a administração de NaB antes do treino preveniu os efeitos prejudiciais de ANA-12. Em conjunto estes resultados demonstram que a modulação epigenética através da atividade de HDACs é importante para a formação da LTM. Nossos dados fortalecem ainda a visão de que eventos epigenéticos possuem papel critico no aprendizado e memória interagindo com vias de sinalização intracelulares desencadeadas por estes processos.
The chromatin state directly impacts gene expression triggered by memory formation. Therefore, this process is of great interest to the biomedical area. Critical regulators of chromatin state and gene transcription are the epigenetic modifications such as DNA methylation and posttranslational modifications of histone proteins. One of the most studied postranslational modification of histones is histone acetylation. When histones are acetylated, chromatin is in a relaxed conformation allowing gene expression. Lysine acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and is reversed by the action of histone deacetylases (HDACs). The use of histone deacetylase inhibitors (HDACis) is helping to elucidate genetic mechanisms of learning and memory. Our work is based on the hypothesis that HDACs activity is crucial for inhibitory avoidance (IA) learning responses modulation and the idea that histone acetylation is an essential step. The data presented in this work demonstrate that infusion of Trichostatin A (TSA) or Sodium Butyrate (NaB) intrahipocampally produced memory enhancement. Moreover, TSA showed two waves of memory enhancing effects when given immediately or 3 h after training coinciding with the observed waves of protein synthesis and PKA activation for memory formation. Our study also demonstrates that the enhancement of IA memory consolidation depends on the integrity of basolateral amygdala (BLA) since its functional inactivation by muscimol (MUS) completely blocked the enhancing effect of TSA infused in the rat hippocampus. Here, we also demonstrate that intraperitoneal administration of NaB immediately after training led to memory enhancement in aged rats with no cognitive deficit. Surprisingly, NaB had no effect in younger rats with normal memory retention. Finally, data presented here also demonstrate that TrkB activity in the hippocampus is crucial for long-term memory (LTM) since administration of a TrkB receptor antagonist, ANA-12, in the dorsal hippocampus immediately after training or retrieval led to memory retention impairment. Moreover, infusion of NaB before training prevented this impairing effect of TrkB antagonism. Taken together, these results show that epigenetic modulation by HDACs activity is required for memory formation. Our data also supports the idea of HDACs playing critical roles in learning and memory interacting with intracellular signaling pathways triggered by these processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.
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Os genes de histonas desacetilases (HDAC) são altamente conservados entre diferentes espécies e dirigem importantes processos epigenéticos na manutenção da estrutura e funcionamento do genoma. Entretanto, o papel das HDAC na regulação dos traços de virulência de patógenos permanece pobremente explorado. O fungo patogênico em humanos Cryptococcus neoformans passa por mudanças fenotípicas que promovem persistência e sobrevida dentro do hospedeiro ou em nichos ecológicos. Tais mudanças estão associadas à regulação diferencial da expressão gênica. Neste contexto, inicialmente foi avaliado o efeito de dois inibidores químicos de histona desacetilases (HDACi), o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), sobre as células de C. neoformans. Os resultados demonstraram que ambos inibidores foram capazes de afetar os principais traços de virulência de C. neoformans. Em seguida, foram identificados e deletados 8 genes de HDAC de Classe I e Classe II em C. neoformans. A maioria dos processos previamente associados à virulência em C. neoformans foi afetada pelo tratamento com HDACi eou pela deleção de genes: a capacidade de crescimento a 37 – 39 ºC, a formação da cápsula polissacarídica, a produção de melanina, as atividades de fosfolipase e de proteases, a formação de hifas de acasalamento e a integridade da parede celular. Os mutantes de HDAC também mostraram defeitos na sobrevivência intracelular quando co-cultivados com macrófagos murinos, assim como virulência comprometida nos modelos de infecção de Galleria mellonella e camundongos. A histona desacetilase Clr3 foi apontada como um importante regulador da virulência em C. neoformans. A linhagem de C. neoformans clr3mutante mostrou-se hipovirulenta em ambos os modelos de criptococose animal. Outrossim, a análise de RNA-seq indicou que a proteína Clr3 regula a expressão de vários genes importantes para a adaptação e sobrevivência de C. neoformans ao ambiente hospedeiro. Os resultados indicam que a remodelação da cromatina, por meio das conservadas HDAC, é um importante mecanismo envolvido na virulência de C. neoformans. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, directing one of the most important epigenetic processes regulating gene expression – chromatin remodeling. However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes to promote persistence and survival inside the host or in specific ecological niches. Very likely, these changes are associated with epigenetic regulation. In this context, we initially evaluated the effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA). The results showed that both were able to impair the expression of the main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence trait expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. In the other hand, for some genes we also have observed an opposite regulation. Most processes previously related to virulence in C. neoformans were affected here, such as thermotolerance (growth at 37-39 oC); capsule, melanin and protease formation; and cell wall integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed for the clr3HDAC mutant strain. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence in vivo. Also, we tested the virulence in Galleria mellonella and mice. Overall our results support that the Clr3 histone deacetylase is a newly identified regulator of fungal virulence. The corresponding mutant was hypovirulent in both animal models of cryptococcosis. Furthermore transcriptional profiling shows that the Clr3 protein regulates the expression of many genes that are important for the adaptation of C. neoformans for survival inside the host. Our work displays that chromatin remodeling by the conserved histone deacetylases is an important mechanism behind the virulence of C. neoformans.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.

Os glioblastomas multiforme (GBM), são tumores cerebrais, que por sua malignidade, aliada ao seu rápido crescimento e frequente recorrência, exigem uma maior investigação da comunidade científica. Novas terapias devem afetar as células-tronco tumorais (CSC), as quais são responsáveis pela resistência e progressão tumoral. Neste trabalho fizemos o uso da Tricostatina A (TSA), um inibidor de histonas deacetilase, para se obter a modulação epigenética, e portanto, manipulação da expressão gênica, da linhagem celular U87-MG de GBM, utilizada aqui como um modelo para a pesquisa com CSC. Observamos a redução da proliferação e sobrevivência das tumoresferas de U87, as quais são formadas por CSC, seguida de alterações morfológicas nas células tratadas. A diferenciação das U87 foi confirmada pelo aumento dos níveis de marcadores neuronais e gliais, tais como NeuN e GFAP. Além disso, mostramos evidências de senescência celular após o tratamento com TSA. Nenhum efeito sobre a migração celular foi encontrado após a modulação epigenética. Portanto, os nossos resultados mostram a influência da TSA na diferenciação, proliferação e sobrevivência de CSC de glioma e também na indução da senescência celular, demonstrando o potencial da TSA na terapia dos tumores cerebrais.
Glioblastoma multiforme (GBM), because of its fast growth and recurrence, require further investigation by the scientific community in order to find promising new therapies for these tumors, specially affecting their Cancer stem cells (CSC), which drive many tumorigenic processes. In this work we have made use of the HDAC inhibitor Trichostatin A to achieve the epigenetic modulation of the U87-MG GBM cell line, as a model for CSC research. We have observed reduction of the U87 tumorspheres, which are enriched for CSC, proliferation and survival followed by morphological changes both in the treated tumorspheres and in single cells. Enhanced on the U87 differentiation was confirmed by increased levels of neuronal and glial markers such as NeuN and GFAP. Furthermore we showed evidences of cellular senescence after the TSA treatment. No effect on cell migration was found after TSA treatment. Therefore, these results demonstrate a plethora effects on differentiation, proliferation, survival of glioma cells and induction of cellular senescence by TSA, making TSA a promising agent for glioma therapy.

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória.
Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração.
Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença altamente letal e agressiva. Alteração no perfil de acetilação das histonas envolvendo desacetilases de histonas (HDAC), assim como modificações da expressão de miRNAs podem levar ao desenvolvimento tumoral. Neste estudo, foi avaliada a expressão das HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 em ADP e amostras de tecido pancreático não tumoral (TN) usando análises experimentais e de banco de dados. Os níveis de expressão foram correlacionados com características clínico-patológicas dos pacientes e foi realizada uma investigação in silico de miRNAs reguladores de efeito das HDACs. Os níveis de expressão das HDACs foram avaliadas por qRT-PCR a partir de 25 amostras de ADP e 23 amostras de TN e a análise da expressão diferencial (ED) e correlação entre HDACs e miRNAs em ADP foi realizada utilizando perfis de expressão de seis microarranjos do Gene Expression Omnibus. Potenciais relações miRNA-HDACs foram coletadas em bases de dados de interação de miRNAs. Um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Encontramos expressão reduzida em ADP comparado com TN para todas as HDACs analisadas, com P<0,05 para HDAC1, 2 e 3. Entretanto, os fold-changes foram muito baixos e provavelmente sem relevância biológica, e a expressão da HDAC2 e HDAC7 foi correlacionada com a idade ao diagnóstico. Nenhuma outra correlação entre a expressão das HDACs e características clínico-patológicas foi identificada. Análises de ED sugeriram significativa superexpressão das HDAC1, 2 e 7 e subexpressão da HDAC3, contudo todas apresentaram fold-changes pequenos. As análises dos bancos de dados identificaram 728 miRNAs como reguladores das HDACs. Interseções entre os conjuntos de miRNAs (GSE41369 e GSE43796) e aqueles recuperados da análise de expressão diferencial indicaram cinco miRNAs que influenciam a HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR -4269 e miR-3616-3p) e três que influenciam a HDAC2 (miR-4307, miR-944 e miR-195). A expressão das HDACs provavelmente não é um biomarcador de prognóstico robusto para o ADP, uma vez que a expressão diferencial entre os grupos é sutil. Ainda, este e estudos anteriores indicam nenhuma ou pouca associação entre a expressão HDACs e características clínico-patológicas relacionadas com o prognóstico. Finalmente, miRNAs provavelmente não estão exercendo um papel central na regulação da HDACs no ADP.
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal and aggressive disease. The disruption of histone acetylation through histones deacetylases (HDACs) and expression regulation by miRNAs can lead to tumor development. In this study we assessed HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC7 expression in PDAC and non-tumoral tissue (NT) samples using experimental and databases analysis, correlated their expression levels with clinical and pathological features in patients and performed in silico investigation of HDACs regulation by miRNAs. Expression levels of HDACs were measured by qRT-PCR from 25 PDAC and 23 NT. An analysis of differential expression (DE) and correlation of HDACs and miRNAs in PDAC was performed using six Gene Expression Omnibus microarray datasets. Potential miRNA-HDACs relationships were collected from miRNA interaction databases. A P<0.05 was considered statistically significant. We found reduced expression in PDAC compared with NT for HDAC1, HDAC2 and HDAC3, with P<0.05. Expression levels of HDAC7 did not significantly differ between groups. However, fold-changes were very small and probably not biologically relevant. Only HDAC2 and HDAC7 were associated with age at diagnosis and no other associations between HDAC expression and clinical features were identified. DE analysis suggested significant up-regulation of HDAC1, HDAC2 and HDAC7, and down-regulation of HDAC3, albeit all of them associated with small fold changes. Databases analysis identified 728 miRNAs that could be HDACs regulators. Intersections among the set of miRNAs found in differential expression analysis of GSE41369 and GSE43796 and those retrieved from target prediction identified five miRNAs targeting HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR-4269 and miR-3616-3p) and three targeting HDAC2 (miR-4307, miR-944 and miR-195). HDACs expression is likely not a robust prognostic biomarker in PDAC since differential expression between groups is subtle. Also, this and previous studies indicate no or only very few associations between HDACs expression and clinicopathological features related to prognosis. Finally, miRNAs are probably not exerting a central role in HDAC regulation in PDAC.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos.
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Neuropeptídeos são importantes moléculas sinalizadoras cerebrais que desempenham função na regulação de memórias motivadas emocionalmente, influenciando sua aquisição, consolidação, expressão e extinção. O peptídeo liberador de gastrina se liga seletivamente a seu receptor de membrana, o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR), que atua como regulador molecular de funções cerebrais, como formação da memória, respostas emocionais e plasticidade sináptica. Evidências apontam para uma possível interação funcional entre GRPR e o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina envolvida em processos comuns ao GRPR. A acetilação de histonas, tipo de modificação da cromatina indiretamente regulada pela inibição de histonas desacetilases (HDACs) e que resulta em aumento na transcrição gênica, também está associada à formação da memória no hipocampo. Com base nisso, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma possível interação entre o bloqueio de GRPR e a regulação da cromatina pela inibição de HDACs na consolidação e na extinção da memória aversiva, bem como nos níveis hipocampais de BDNF e de acetilação da histona H3. Ratos Wistar machos receberam infusões bilaterais no hipocampo dorsal de salina ou do inibidor de HDACs butirato de sódio (NaB; 100 mM) e de salina ou do antagonista de GRPR RC-3095 (1μg/0,5μl), respectivamente, antes e imediatamente após o treino na tarefa de esquiva inibitória. Em um segundo experimento, as infusões das mesmas drogas foram realizadas antes e imediatamente após o teste de retenção que serviu como treino de extinção. Os efeitos prejudiciais sobre a consolidação e sobre a extinção da memória aversiva induzidos pelo RC-3095 foram prevenidos pela infusão de NaB. Além disso, observou-se aumento no BDNF hipocampal após infusões de NaB seguidas de RC-3095, embora nenhuma alteração tenha sido observada nos níveis de H3 acetilada após esses tratamentos. Esses resultados indicam que os efeitos prejudiciais induzidos pelo bloqueio de GRPR na formação e na extinção da memória aversiva podem ser prevenidos pela inibição de HDACs, e que este efeito protetor pode ser relacionado a níveis hipocampais aumentados de BDNF. Em conclusão, uma disfunção na via de sinalização por GRP/GRPR pode ser compensada por mecanismos epigenéticos para possibilitar processos relacionados à memória no hipocampo.
Neuropeptides are important brain signaling molecules that play a role in the regulation of emotionally-motivated memories, influencing their acquisition, consolidation, expression and extinction. Gastrin-releasing peptide selectively binds to its membrane receptor, the gastrin-releasing peptide receptor (GRPR), which acts as a molecular regulator of brain functions, including memory formation, emotional responses and synaptic plasticity. Findings suggest a possible functional interaction between GRPR and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a neurotrophin involved in common processes to GRPR. Histone acetylation, a type of chromatin modification indirectly regulated by the inhibition of histone deacetylases (HDACs) that results in an increase in gene transcription, has been also associated to memory formation in the hippocampus. Based on this, the objective of the present study was to evaluate a possible interaction between GRPR blockade and chromatin regulation by the inhibition of HDACs in the consolidation and extinction of aversive memory, as well as on hippocampal BDNF and acetylated histone H3 levels. Male Wistar rats received bilateral infusions into the dorsal hippocampus of saline or the HDAC inhibitor sodium butyrate (NaB; 100 mM) and saline or the GRPR antagonist RC-3095 (1μg/0.5-μl), respectively, before and immediately after the training in inhibitory avoidance. In a second experiment, the infusions of the same drugs were given before and immediately after a retention test trial that served as extinction training. RC-3095-induced impairing effects on consolidation and extinction of aversive memory were prevented by the infusion of NaB. In addition, it was observed an increase in hipoccampal BDNF after infusions of NaB followed by RC-3095, whereas no effect was observed in H3 acetylated levels after these treatments. The results suggest that impairing effects induced by GRPR blockade on formation and extinction of aversive memory can be prevented by HDAC inhibition, and that this protective effect could be related to increased hippocampal BDNF levels. In conclusion, a dysfunction in GRP/GRPR signaling pathway can be compensated by epigenetic mechanisms to allow processes related to memory in hippocampus.

Els neuroblastomes es caracteritzen per l’heterogeneïtat de les cèl•lules que els composen i la seva capacitat de transdiferenciar entre els diferents fenotips cel•lulars. La freqüència de mutacions en el gen de p53 és molt baixa en el moment de la diagnosi, manifestant-se, normalment, només després del tractament inicial. Aquestes característiques són les causes principals del fracàs dels tractaments actuals contra aquesta neoplàsia. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat assajar noves estratègies terapèutiques que poguessin resultar efectives contra tots els tipus cel•lulars, per tal d’evitar l’aparició de recidives. Amb aquesta finalitat, hem decidit utilitzar dues drogues amb eficàcia clínica demostrada. D’una banda, s’ha escollit el SAHA, un inhibidor inespecífic de les HDACs que ha demostrat la seva eficàcia independentment del context de p53; i per l’altra, s’ha seleccionat l’inhibidor de la transcripció actinomicina D, que ha demostrat ser més eficaç contra les cèl•lules que expressen p53. A més, s’ha utilitzat la nutlina-3 com a control per verificar la repercussió de p53 en l’efecte de l’actinomicina D. Aquest treball demostra com aquests fàrmacs disminueixen la viabilitat de totes les línies cel•lulars de neuroblastoma analitzades. El mecanisme i la sensibilitat al tractament observats depenen, tant de la droga utilitzada, com de la línia cel•lular examinada. Així doncs, els resultats obtinguts demostren el potencial d’aquests compostos i de la seva combinació com a estratègia terapèutica per al neuroblastoma.
Neuroblastomas are characterized by the heterogeneity of their cell population and for their ability to transdifferentiate among the different cell phenotypes that are present in the tumor. The frequency of p53 mutations is sparingly low at the time of diagnosis, manifesting only after the initial treatment. These features are the main cause of failure of current treatments for this malignancy. The aim of this thesis was to test new therapeutic strategies that may be effective against all cell types present in the tumor, in order to avoid relapse. To this end, we decided to use two drugs with proven clinical efficacy. On one hand, the nonspecific HDAC inhibitor SAHA, which exerts its effect in a p53-independent manner, was chosen; on the other hand, the transcription inhibitor actinomycin D, which is more efficacious against cells expressing p53, was selected. In addition, we used nutlin-3 as a control to verify the impact of p53 on the effect of the actinomycin D. This work demonstrates how these drugs decrease the viability of all neuroblastoma cell lines analyzed. The mechanism and sensitivity to treatment depend on both drugs used and the cell line examined. Thus, the results suggest the potential of these compounds and their combination as a therapeutic strategy for neuroblastoma.