Tesi sul tema "Inibidores de histona desacetilases"

O estado da cromatina influencia diretamente nos processos de expressão gênica desencadeada durante a formação de memórias. Nesse sentido sendo de grande interesse seu estudo na área biomédica. Modificações epigenéticas como a metilação do DNA e modificações pós-traducionais em histonas são reguladores cruciais do estado da cromatina e ds transcrição gênica. Uma das modificações pós-traducionais mais bem estudada é a acetilação de histonas. Quando as histonas estão acetiladas a cromatina encontra-se num estado relaxado permitindo a expressão gênica. A reação é catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e é um processo reversível catalisado por histona desacetilases (HDACs). A utilização de fármacos inibidores de histona desacetilases (HDACis) tem ajudado na elucidação dos mecanismos gênicos envolvidos na formação do aprendizado e da memória. Nosso trabalho se baseia na hipótese de que a atividade de HDACs é crucial para modulação das respostas de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória e que a acetilação de histonas é um passo essencial neste processo. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que a infusão intra-hipocampal de tricostatina A (TSA) ou butirato sódico (NaB) imediatamente após o treino resulta na melhora da memória de longa duração (LTM). TSA demonstrou ainda possuir duas ondas de efeitos melhoradores da LTM, uma imediatamente e outra 3h após o treino que coincidem com as ondas de ativação de vias de sinalização intracelular e de síntese de proteínas importantes para a formação da LTM. Adicionalmente, a inativação farmacológica da amigdala basolateral (BLA) antes do treino bloqueou os efeitos melhoradores do TSA administrado no hipocampo, evidenciando que a integridade da BLA é importante para este processo. Neste trabalho demonstramos também que a administração intraperitoneal de NaB imediatamente após o treino em animais velhos sem prejuízo cognitivo resulta em melhora significativa da memória. O tratamento com NaB não afetou a LTM de animais jovens saudáveis. Por fim, nossos dados demonstram que a administração de um fármaco antagonista de receptores TrkB, ANA-12, no hipocampo de animais jovens após o treino ou teste resulta no prejuízo da memória. No entanto a administração de NaB antes do treino preveniu os efeitos prejudiciais de ANA-12. Em conjunto estes resultados demonstram que a modulação epigenética através da atividade de HDACs é importante para a formação da LTM. Nossos dados fortalecem ainda a visão de que eventos epigenéticos possuem papel critico no aprendizado e memória interagindo com vias de sinalização intracelulares desencadeadas por estes processos.
The chromatin state directly impacts gene expression triggered by memory formation. Therefore, this process is of great interest to the biomedical area. Critical regulators of chromatin state and gene transcription are the epigenetic modifications such as DNA methylation and posttranslational modifications of histone proteins. One of the most studied postranslational modification of histones is histone acetylation. When histones are acetylated, chromatin is in a relaxed conformation allowing gene expression. Lysine acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and is reversed by the action of histone deacetylases (HDACs). The use of histone deacetylase inhibitors (HDACis) is helping to elucidate genetic mechanisms of learning and memory. Our work is based on the hypothesis that HDACs activity is crucial for inhibitory avoidance (IA) learning responses modulation and the idea that histone acetylation is an essential step. The data presented in this work demonstrate that infusion of Trichostatin A (TSA) or Sodium Butyrate (NaB) intrahipocampally produced memory enhancement. Moreover, TSA showed two waves of memory enhancing effects when given immediately or 3 h after training coinciding with the observed waves of protein synthesis and PKA activation for memory formation. Our study also demonstrates that the enhancement of IA memory consolidation depends on the integrity of basolateral amygdala (BLA) since its functional inactivation by muscimol (MUS) completely blocked the enhancing effect of TSA infused in the rat hippocampus. Here, we also demonstrate that intraperitoneal administration of NaB immediately after training led to memory enhancement in aged rats with no cognitive deficit. Surprisingly, NaB had no effect in younger rats with normal memory retention. Finally, data presented here also demonstrate that TrkB activity in the hippocampus is crucial for long-term memory (LTM) since administration of a TrkB receptor antagonist, ANA-12, in the dorsal hippocampus immediately after training or retrieval led to memory retention impairment. Moreover, infusion of NaB before training prevented this impairing effect of TrkB antagonism. Taken together, these results show that epigenetic modulation by HDACs activity is required for memory formation. Our data also supports the idea of HDACs playing critical roles in learning and memory interacting with intracellular signaling pathways triggered by these processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.
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Os genes de histonas desacetilases (HDAC) são altamente conservados entre diferentes espécies e dirigem importantes processos epigenéticos na manutenção da estrutura e funcionamento do genoma. Entretanto, o papel das HDAC na regulação dos traços de virulência de patógenos permanece pobremente explorado. O fungo patogênico em humanos Cryptococcus neoformans passa por mudanças fenotípicas que promovem persistência e sobrevida dentro do hospedeiro ou em nichos ecológicos. Tais mudanças estão associadas à regulação diferencial da expressão gênica. Neste contexto, inicialmente foi avaliado o efeito de dois inibidores químicos de histona desacetilases (HDACi), o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), sobre as células de C. neoformans. Os resultados demonstraram que ambos inibidores foram capazes de afetar os principais traços de virulência de C. neoformans. Em seguida, foram identificados e deletados 8 genes de HDAC de Classe I e Classe II em C. neoformans. A maioria dos processos previamente associados à virulência em C. neoformans foi afetada pelo tratamento com HDACi eou pela deleção de genes: a capacidade de crescimento a 37 – 39 ºC, a formação da cápsula polissacarídica, a produção de melanina, as atividades de fosfolipase e de proteases, a formação de hifas de acasalamento e a integridade da parede celular. Os mutantes de HDAC também mostraram defeitos na sobrevivência intracelular quando co-cultivados com macrófagos murinos, assim como virulência comprometida nos modelos de infecção de Galleria mellonella e camundongos. A histona desacetilase Clr3 foi apontada como um importante regulador da virulência em C. neoformans. A linhagem de C. neoformans clr3mutante mostrou-se hipovirulenta em ambos os modelos de criptococose animal. Outrossim, a análise de RNA-seq indicou que a proteína Clr3 regula a expressão de vários genes importantes para a adaptação e sobrevivência de C. neoformans ao ambiente hospedeiro. Os resultados indicam que a remodelação da cromatina, por meio das conservadas HDAC, é um importante mecanismo envolvido na virulência de C. neoformans. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, directing one of the most important epigenetic processes regulating gene expression – chromatin remodeling. However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes to promote persistence and survival inside the host or in specific ecological niches. Very likely, these changes are associated with epigenetic regulation. In this context, we initially evaluated the effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA). The results showed that both were able to impair the expression of the main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence trait expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. In the other hand, for some genes we also have observed an opposite regulation. Most processes previously related to virulence in C. neoformans were affected here, such as thermotolerance (growth at 37-39 oC); capsule, melanin and protease formation; and cell wall integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed for the clr3HDAC mutant strain. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence in vivo. Also, we tested the virulence in Galleria mellonella and mice. Overall our results support that the Clr3 histone deacetylase is a newly identified regulator of fungal virulence. The corresponding mutant was hypovirulent in both animal models of cryptococcosis. Furthermore transcriptional profiling shows that the Clr3 protein regulates the expression of many genes that are important for the adaptation of C. neoformans for survival inside the host. Our work displays that chromatin remodeling by the conserved histone deacetylases is an important mechanism behind the virulence of C. neoformans.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.

Os glioblastomas multiforme (GBM), são tumores cerebrais, que por sua malignidade, aliada ao seu rápido crescimento e frequente recorrência, exigem uma maior investigação da comunidade científica. Novas terapias devem afetar as células-tronco tumorais (CSC), as quais são responsáveis pela resistência e progressão tumoral. Neste trabalho fizemos o uso da Tricostatina A (TSA), um inibidor de histonas deacetilase, para se obter a modulação epigenética, e portanto, manipulação da expressão gênica, da linhagem celular U87-MG de GBM, utilizada aqui como um modelo para a pesquisa com CSC. Observamos a redução da proliferação e sobrevivência das tumoresferas de U87, as quais são formadas por CSC, seguida de alterações morfológicas nas células tratadas. A diferenciação das U87 foi confirmada pelo aumento dos níveis de marcadores neuronais e gliais, tais como NeuN e GFAP. Além disso, mostramos evidências de senescência celular após o tratamento com TSA. Nenhum efeito sobre a migração celular foi encontrado após a modulação epigenética. Portanto, os nossos resultados mostram a influência da TSA na diferenciação, proliferação e sobrevivência de CSC de glioma e também na indução da senescência celular, demonstrando o potencial da TSA na terapia dos tumores cerebrais.
Glioblastoma multiforme (GBM), because of its fast growth and recurrence, require further investigation by the scientific community in order to find promising new therapies for these tumors, specially affecting their Cancer stem cells (CSC), which drive many tumorigenic processes. In this work we have made use of the HDAC inhibitor Trichostatin A to achieve the epigenetic modulation of the U87-MG GBM cell line, as a model for CSC research. We have observed reduction of the U87 tumorspheres, which are enriched for CSC, proliferation and survival followed by morphological changes both in the treated tumorspheres and in single cells. Enhanced on the U87 differentiation was confirmed by increased levels of neuronal and glial markers such as NeuN and GFAP. Furthermore we showed evidences of cellular senescence after the TSA treatment. No effect on cell migration was found after TSA treatment. Therefore, these results demonstrate a plethora effects on differentiation, proliferation, survival of glioma cells and induction of cellular senescence by TSA, making TSA a promising agent for glioma therapy.

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória.
Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração.
Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença altamente letal e agressiva. Alteração no perfil de acetilação das histonas envolvendo desacetilases de histonas (HDAC), assim como modificações da expressão de miRNAs podem levar ao desenvolvimento tumoral. Neste estudo, foi avaliada a expressão das HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 em ADP e amostras de tecido pancreático não tumoral (TN) usando análises experimentais e de banco de dados. Os níveis de expressão foram correlacionados com características clínico-patológicas dos pacientes e foi realizada uma investigação in silico de miRNAs reguladores de efeito das HDACs. Os níveis de expressão das HDACs foram avaliadas por qRT-PCR a partir de 25 amostras de ADP e 23 amostras de TN e a análise da expressão diferencial (ED) e correlação entre HDACs e miRNAs em ADP foi realizada utilizando perfis de expressão de seis microarranjos do Gene Expression Omnibus. Potenciais relações miRNA-HDACs foram coletadas em bases de dados de interação de miRNAs. Um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Encontramos expressão reduzida em ADP comparado com TN para todas as HDACs analisadas, com P<0,05 para HDAC1, 2 e 3. Entretanto, os fold-changes foram muito baixos e provavelmente sem relevância biológica, e a expressão da HDAC2 e HDAC7 foi correlacionada com a idade ao diagnóstico. Nenhuma outra correlação entre a expressão das HDACs e características clínico-patológicas foi identificada. Análises de ED sugeriram significativa superexpressão das HDAC1, 2 e 7 e subexpressão da HDAC3, contudo todas apresentaram fold-changes pequenos. As análises dos bancos de dados identificaram 728 miRNAs como reguladores das HDACs. Interseções entre os conjuntos de miRNAs (GSE41369 e GSE43796) e aqueles recuperados da análise de expressão diferencial indicaram cinco miRNAs que influenciam a HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR -4269 e miR-3616-3p) e três que influenciam a HDAC2 (miR-4307, miR-944 e miR-195). A expressão das HDACs provavelmente não é um biomarcador de prognóstico robusto para o ADP, uma vez que a expressão diferencial entre os grupos é sutil. Ainda, este e estudos anteriores indicam nenhuma ou pouca associação entre a expressão HDACs e características clínico-patológicas relacionadas com o prognóstico. Finalmente, miRNAs provavelmente não estão exercendo um papel central na regulação da HDACs no ADP.
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal and aggressive disease. The disruption of histone acetylation through histones deacetylases (HDACs) and expression regulation by miRNAs can lead to tumor development. In this study we assessed HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC7 expression in PDAC and non-tumoral tissue (NT) samples using experimental and databases analysis, correlated their expression levels with clinical and pathological features in patients and performed in silico investigation of HDACs regulation by miRNAs. Expression levels of HDACs were measured by qRT-PCR from 25 PDAC and 23 NT. An analysis of differential expression (DE) and correlation of HDACs and miRNAs in PDAC was performed using six Gene Expression Omnibus microarray datasets. Potential miRNA-HDACs relationships were collected from miRNA interaction databases. A P<0.05 was considered statistically significant. We found reduced expression in PDAC compared with NT for HDAC1, HDAC2 and HDAC3, with P<0.05. Expression levels of HDAC7 did not significantly differ between groups. However, fold-changes were very small and probably not biologically relevant. Only HDAC2 and HDAC7 were associated with age at diagnosis and no other associations between HDAC expression and clinical features were identified. DE analysis suggested significant up-regulation of HDAC1, HDAC2 and HDAC7, and down-regulation of HDAC3, albeit all of them associated with small fold changes. Databases analysis identified 728 miRNAs that could be HDACs regulators. Intersections among the set of miRNAs found in differential expression analysis of GSE41369 and GSE43796 and those retrieved from target prediction identified five miRNAs targeting HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR-4269 and miR-3616-3p) and three targeting HDAC2 (miR-4307, miR-944 and miR-195). HDACs expression is likely not a robust prognostic biomarker in PDAC since differential expression between groups is subtle. Also, this and previous studies indicate no or only very few associations between HDACs expression and clinicopathological features related to prognosis. Finally, miRNAs are probably not exerting a central role in HDAC regulation in PDAC.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos.
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Neuropeptídeos são importantes moléculas sinalizadoras cerebrais que desempenham função na regulação de memórias motivadas emocionalmente, influenciando sua aquisição, consolidação, expressão e extinção. O peptídeo liberador de gastrina se liga seletivamente a seu receptor de membrana, o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR), que atua como regulador molecular de funções cerebrais, como formação da memória, respostas emocionais e plasticidade sináptica. Evidências apontam para uma possível interação funcional entre GRPR e o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina envolvida em processos comuns ao GRPR. A acetilação de histonas, tipo de modificação da cromatina indiretamente regulada pela inibição de histonas desacetilases (HDACs) e que resulta em aumento na transcrição gênica, também está associada à formação da memória no hipocampo. Com base nisso, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma possível interação entre o bloqueio de GRPR e a regulação da cromatina pela inibição de HDACs na consolidação e na extinção da memória aversiva, bem como nos níveis hipocampais de BDNF e de acetilação da histona H3. Ratos Wistar machos receberam infusões bilaterais no hipocampo dorsal de salina ou do inibidor de HDACs butirato de sódio (NaB; 100 mM) e de salina ou do antagonista de GRPR RC-3095 (1μg/0,5μl), respectivamente, antes e imediatamente após o treino na tarefa de esquiva inibitória. Em um segundo experimento, as infusões das mesmas drogas foram realizadas antes e imediatamente após o teste de retenção que serviu como treino de extinção. Os efeitos prejudiciais sobre a consolidação e sobre a extinção da memória aversiva induzidos pelo RC-3095 foram prevenidos pela infusão de NaB. Além disso, observou-se aumento no BDNF hipocampal após infusões de NaB seguidas de RC-3095, embora nenhuma alteração tenha sido observada nos níveis de H3 acetilada após esses tratamentos. Esses resultados indicam que os efeitos prejudiciais induzidos pelo bloqueio de GRPR na formação e na extinção da memória aversiva podem ser prevenidos pela inibição de HDACs, e que este efeito protetor pode ser relacionado a níveis hipocampais aumentados de BDNF. Em conclusão, uma disfunção na via de sinalização por GRP/GRPR pode ser compensada por mecanismos epigenéticos para possibilitar processos relacionados à memória no hipocampo.
Neuropeptides are important brain signaling molecules that play a role in the regulation of emotionally-motivated memories, influencing their acquisition, consolidation, expression and extinction. Gastrin-releasing peptide selectively binds to its membrane receptor, the gastrin-releasing peptide receptor (GRPR), which acts as a molecular regulator of brain functions, including memory formation, emotional responses and synaptic plasticity. Findings suggest a possible functional interaction between GRPR and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a neurotrophin involved in common processes to GRPR. Histone acetylation, a type of chromatin modification indirectly regulated by the inhibition of histone deacetylases (HDACs) that results in an increase in gene transcription, has been also associated to memory formation in the hippocampus. Based on this, the objective of the present study was to evaluate a possible interaction between GRPR blockade and chromatin regulation by the inhibition of HDACs in the consolidation and extinction of aversive memory, as well as on hippocampal BDNF and acetylated histone H3 levels. Male Wistar rats received bilateral infusions into the dorsal hippocampus of saline or the HDAC inhibitor sodium butyrate (NaB; 100 mM) and saline or the GRPR antagonist RC-3095 (1μg/0.5-μl), respectively, before and immediately after the training in inhibitory avoidance. In a second experiment, the infusions of the same drugs were given before and immediately after a retention test trial that served as extinction training. RC-3095-induced impairing effects on consolidation and extinction of aversive memory were prevented by the infusion of NaB. In addition, it was observed an increase in hipoccampal BDNF after infusions of NaB followed by RC-3095, whereas no effect was observed in H3 acetylated levels after these treatments. The results suggest that impairing effects induced by GRPR blockade on formation and extinction of aversive memory can be prevented by HDAC inhibition, and that this protective effect could be related to increased hippocampal BDNF levels. In conclusion, a dysfunction in GRP/GRPR signaling pathway can be compensated by epigenetic mechanisms to allow processes related to memory in hippocampus.

Els neuroblastomes es caracteritzen per l’heterogeneïtat de les cèl•lules que els composen i la seva capacitat de transdiferenciar entre els diferents fenotips cel•lulars. La freqüència de mutacions en el gen de p53 és molt baixa en el moment de la diagnosi, manifestant-se, normalment, només després del tractament inicial. Aquestes característiques són les causes principals del fracàs dels tractaments actuals contra aquesta neoplàsia. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat assajar noves estratègies terapèutiques que poguessin resultar efectives contra tots els tipus cel•lulars, per tal d’evitar l’aparició de recidives. Amb aquesta finalitat, hem decidit utilitzar dues drogues amb eficàcia clínica demostrada. D’una banda, s’ha escollit el SAHA, un inhibidor inespecífic de les HDACs que ha demostrat la seva eficàcia independentment del context de p53; i per l’altra, s’ha seleccionat l’inhibidor de la transcripció actinomicina D, que ha demostrat ser més eficaç contra les cèl•lules que expressen p53. A més, s’ha utilitzat la nutlina-3 com a control per verificar la repercussió de p53 en l’efecte de l’actinomicina D. Aquest treball demostra com aquests fàrmacs disminueixen la viabilitat de totes les línies cel•lulars de neuroblastoma analitzades. El mecanisme i la sensibilitat al tractament observats depenen, tant de la droga utilitzada, com de la línia cel•lular examinada. Així doncs, els resultats obtinguts demostren el potencial d’aquests compostos i de la seva combinació com a estratègia terapèutica per al neuroblastoma.
Neuroblastomas are characterized by the heterogeneity of their cell population and for their ability to transdifferentiate among the different cell phenotypes that are present in the tumor. The frequency of p53 mutations is sparingly low at the time of diagnosis, manifesting only after the initial treatment. These features are the main cause of failure of current treatments for this malignancy. The aim of this thesis was to test new therapeutic strategies that may be effective against all cell types present in the tumor, in order to avoid relapse. To this end, we decided to use two drugs with proven clinical efficacy. On one hand, the nonspecific HDAC inhibitor SAHA, which exerts its effect in a p53-independent manner, was chosen; on the other hand, the transcription inhibitor actinomycin D, which is more efficacious against cells expressing p53, was selected. In addition, we used nutlin-3 as a control to verify the impact of p53 on the effect of the actinomycin D. This work demonstrates how these drugs decrease the viability of all neuroblastoma cell lines analyzed. The mechanism and sensitivity to treatment depend on both drugs used and the cell line examined. Thus, the results suggest the potential of these compounds and their combination as a therapeutic strategy for neuroblastoma.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia
Coorientador: Flavia Lombardi Lopes
Coorientador: Daniel Robert Arnold
Banca: Flávio Vieira Meirelles
Banca: Luiz Sérgio de Almeida Camargo
Banca: Gisele Zoccal Mingoti
Banca: Naiara Zoccal Saraiva
Resumo: Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T18:46:30Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_cs_dr_jabo.pdf: 1211579 bytes, checksum: 2f19bde4e0f7fbfd3f2aae7f084ceea1 (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento...
Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2015.
Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-09T19:54:19Z No. of bitstreams: 1 2015_FellipeJoséGomesQueiroz_Parcial.pdf: 4549466 bytes, checksum: 8b3b2eefb20a4c4e5d0cfd09507eacd5 (MD5)
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As principais doenças inflamatórias intestinais – doença de Crohn e colite ulcerativa – apresentam caráter inflamatório idiopático agudo ou crônico que envolve a cascata de sinalização NF-kB por meio dos receptores Toll-like e TNF-α. No âmbito das modificações pós-translacionais, as acetilações reversíveis de resíduos de lisina nas subunidades p50 e p65 de NF-kB – promovidas por histonas acetiltransferases (HAT) – modulam as respostas inflamatórias dependentes desta via. Neste contexto, inibidores de HATs e.g. p300 e GCN5, regulam as funções do NF-kB induzidas por TNF e IL-1β e compreendem estratégia terapêutica para o tratamento da UC. Descrevemos neste trabalho o planejamento, a síntese e a avaliação biológica de novos inibidores de histona acetiltransferases – p300 e GCN5 – obtidos a partir do ácido isoanacárdico. A estratégia sintética permitiu à obtenção de 25 derivados: 2 intermediários aldeídos, 3 ácidos carboxílicos, 5 amidas e 15 ésteres, em rendimentos que variaram de 78-98%. A avaliação biológica dos compostos-alvo frente às enzimas p300 e GCN5 evidenciaram a capacidade dos derivados LDT380 (28), LDT383 (35) e LDT407 (32) – que contém a subunidade carboxila – atuarem como inibidores de ambas acetiltransferases com IC50 variando de 11 μM a 51 μM para a enzima p300; e de 25 μM a 61 μM para a enzima GCN5. A confirmação da atividade inibitória dos compostos ativos por métodos ortogonais, os estudos de docking com p300 e GCN5, a avaliação sobre a translocação de NF-kB, bem como a avaliação em modelos experimentais in vivo compreendem as perspectivas desse trabalho. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
The major inflammatory bowel diseases - Crohn's disease and ulcerative colitis - show acute or chronic idiopathic inflammatory profiles that involve the NF-kB signaling cascade through Toll-like and TNF-α receptors. In the context of posttranslational modifications, reversible acetylation of lysine residues on p50 and p65 subunits of NF-kB - promoted by histone acetyltransferases (HAT) - modulate inflammatory responses dependent on this pathway. In this context, HATs inhibitors e.g. GCN5 and p300 regulate NF-kB functions induced by TNF and IL-1β and comprise therapeutic strategy for the treatment of UC. Herein we describe the design, synthesis and biological evaluation of new inhibitors of histone acetyl transferases - p300 and GCN5 - obtained from isoanacardic acid. The synthetic strategy allowed for obtaining 25 derivatives: 2 aldehyde intermediates, 3 carboxylic acids, 5 amides and 15 esters in yields ranging from 78-98%. Biological evaluation of target-compounds against the GCN5 and p300 enzymes revealed the ability of compounds LDT380 (28) LDT383 (35) and LDT407 (32) - containing the carboxyl subunit - to act as inhibitors of both acetyltransferases with IC50 ranging from 11 μM to 51 μM for p300; and from 25 μM and 61 μM for GCN5. The work’s perspectives include the confirmation of the inhibitory activity of the active compounds by orthogonal methods, docking studies with p300 and GCN5, studies on the translocation of NF-kB, ans posteriorly in vivo evaluation in experimental models of colitis.

Orientador: Jean Leandro dos Santos
Banca: Chung, Man Chin
Banca: Simone Kashima Haddad
Resumo: A reativação da expressão gênica de gama-globina e consequente produção de hemoglobina fetal (HbF) por mecanismos epigenéticos é uma valiosa intervenção terapêutica na anemia falciforme. Estudos recentes mostram que a inibição da enzima Histona Deacetilase (HDAC), principalmente HDAC-1 e HDAC-2, mostrou ser uma estratégia promissora em promover o aumento da expressão gênica de gama-globina e a produção de HbF sem causar alteração no ciclo e proliferação celular. Neste trabalho foram planejadas por modelagem molecular novos compostos inibidores de HDAC 1 e 2. Os estudos de ancoragem molecular revelaram a forma como estes compostos interagem com a HDAC-2, sendo a subunidade N-(2-aminofenil)benzamida responsável por interagir com o átomo de zinco presente no sítio ativo. Durante o processo de otimização das estruturas, os valores de docking score passaram de -9,8 para - 12,3, indicando melhores interações com o receptor. Onze compostos inéditos foram sintetizados e caracterizados por métodos analíticos. Os estudos enzimáticos mostraram atividade inibitória dos novos compostos variaram de 83 à 96% para HDAC-1, 83 à 94% para HDAC-2 e 82 à-89% para HDAC-3. O composto (22) (4-(4-aminofenetil)-N-(2-aminofenil)benzamida) foi um dos mais ativos apresentando, na concentração de 10 μM, atividade inibitória contra as HDACs 1 e 2 com valores superiores a 90%. Estes resultados mostram que os compostos planejados neste trabalho são potenciais inibidores de HDAC, sendo a molécula (22) a mais ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Reactivation of gamma-globin gene expression and fetal hemoglobin (HbF) production through epigenetic mechanisms are valuable strategy to sickle cell anemia treatment. Early studies have demonstrated that histone deacetylase inhibition, especially HDAC-1 and HDAC-2, is a promising strategy to increase gamma-globin gene expression and HbF production without alteration in cell cycle or cell proliferation. At this work it was designed, by molecular modeling, new compounds HDAc 1 and 2 inhibitors. The molecular modeling studies has demonstrated how these compounds interacts with HDAC-2, being the subunit N-(2-aminophenyl)benzamide responsible for interact with the zinc atom of active site. During the optimization process, the docking score values hava changed from -9,8 to -12,3, which indicates better interactions with the receptor. It was synthesized and characterized eleven new compounds. Enzimatic assays have demonstrated that the enzymatic inhibition of the compounds varied from 83 to 96% against HDAC 1, 83-94% against HDAC 2 and 82-89% of HDAC 3. Compound (22) (4-(4-aminophenetyl)-N-(2-aminophenyl) benzamide was one of the most promisor among all compounds. At 10uM it was able to inhibit HDAC 1 and 2 more than 90%. These data has demonstrated that the design compounds in this work are potencial inhibitors of HDAC, being...(Complete abstract click electronic access below)
Mestre

O envelhecimento da população mundial aumentou o interesse na busca pelos mecanismos fisiológicos e bioquímicos envolvidos no processo do envelhecimento saudável e por estratégias preventivas e terapêuticas de doenças relacionadas à idade. O envelhecimento cerebral alterou a atividade global de histona desacetilases (HDAC), enzima envolvida nos níveis de acetilação de histonas, marca epigenética relacionada com a expressão gênica. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que o protocolo de exercício físico diário em esteira reduziu a atividade global da HDAC no córtex frontal imediatamente e 1 hora após a última sessão de treino. Assim, é de interesse elucidar as isoformas de HDAC envolvidas no processo de envelhecimento e no efeito do exercício físico. O exercício físico voluntário aumenta os níveis do Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo (BDNF) por mecanismos epigenéticos, no entanto, o impacto do exercício forçado parece ser contraditório. Nossos objetivos foram avaliar os efeitos do envelhecimento e do exercício de corrida sobre os níveis de HDAC2 e de BDNF em córtex pré-frontal de ratos Wistar. Para isso, utilizamos ratos Wistar machos com 3 e 20 meses de idade. Os animais do grupo exercitado foram submetidos ao protocolo diário de exercício físico moderado em esteira por 14 dias. No 13° dia, os animais foram submetidos à tarefa da esquiva inibitória (treino) e, no 14° dia, 30 minutos após a última sessão de exercício físico, foi realizado o teste do paradigma da esquiva inibitória. Após 30 minutos do teste na esquiva inibitória (uma hora após a última sessão de exercício), os córtices foram obtidos para os ensaios bioquímicos. Os níveis da HDAC2 foram maiores em córtices de animais envelhecidos. Ainda, foi observada uma correlação negativa entre o conteúdo da HDAC2 e o desempenho no teste de memória aversiva (esquiva inibitória). O exercício físico em esteira não alterou os níveis de HDAC2 em nenhuma das idades testadas. O envelhecimento e o exercício físico em esteira não alteraram os níveis de BDNF. Nossos dados sugerem que os altos níveis de HDAC2 estão envolvidos com o pior desempenho de animais envelhecidos na memória aversiva e que esta isoenzima não está relacionada aos efeitos epigenéticos do exercício físico em córtex pré-frontal.
Increasing attention has been paid to study the physiological and biochemical mechanisms of healthy aging process as well to seek therapeutic and protective strategies for age-related neurodegenerative diseases, since the aging population is growing. Epigenetic marks related to gene expression has been involved in aging brain process; increases in global histone desacetylase (HDAC) activity, enzyme involved with histone acetylation levels, has been found in aged brain areas. Our research group demonstrated that daily treadmill exercise protocol reduced global HDAC activity in frontal cortex immediately and 1hr after the last training session. The role of HDAC isoforms in aging process and exercise effects still needs to be elucidated. Taken that a specific HDAC isoform, HDAC2, has been involved with formation of hippocampus-dependent memory, the involvement of HDAC2 in aging process and exercise effects must be considered. Besides, it was described that voluntary exercise increases the levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) through epigenetic mechanisms; while the forced exercise effects on BDNF levels seem be contradictory. Our aim was to evaluate the aging and exercise effects on HDAC2 and BDNF levels in prefrontal cortices of Wistar rats. Young adult and age male Wistar rats were submitted to a daily moderate treadmill exercise protocol (20 min/day during 14 days). The rats were assigned to sedentary and exercise groups. Single-trial step-down inhibitory avoidance (IA) conditioning was employed as an aversive memory paradigm. In the training trial (IA), rats were placed on a platform and immediately after stepping down on the grid received a footshock prior to removal from the apparatus. The test trial took place 24 hours after the training trial. Prefrontal cortices were obtained thirty minutes after inhibitory avoidance test, what was 1 hour after the last training session of exercise. HDAC2 levels were increased in cortices of aged rats. Moreover, a negative correlation was observed between HDAC2 content and aversive memory performance evaluated by inhibitory avoidance. Treadmill exercise did not alter the HDAC2 levels in any evaluated age. Aging process and treadmill exercise were unable to alter BDNF levels. Our results suggest that the age-related memory impairment may be associated with the increased HDAC2 levels.

Com o aumento da expectativa de vida, estima-se um aumento na incidência de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA). Vários processos fisiopatológicos interligados estão envolvidos tanto no processo do envelhecimento, quanto na etiologia das desordens neurodegenerativas, como por exemplo, o estresse oxidativo e a neuroinflamação. Têm sido descrito que mecanismos epigenéticos podem estar relacionados com o processo de envelhecimento, ocasionando modificações na expressão gênica em diferentes regiões do cérebro, como por exemplo, a acetilação de histonas que é responsável em parte, pela transcrição gênica, sendo esse processo controlado por duas enzimas, a histona acetiltransferase (HAT) e a histona desacetilase (HDAC). A HAT é responsável por ocasionar um relaxamento da cromatina e com isso uma maior acessibilidade para o processo de transcrição gênica enquanto que a HDAC causa uma maior compactação da cromatina, resultando uma supressão na transcrição gênica. Considerando o papel da acetilação de histonas no processo de envelhecimento, em especial em doenças neurodegenerativas, tem sido sugerido o uso de estratégias que aumentem a acetilação com finalidade neuroprotetora como, por exemplo, o uso de inibidores de HDAC. Diversos estudos demonstram que os inibidores da HDAC são capazes de melhorar as funções cognitivas e a formação de memória. Nesse contexto, a curcumina, um composto polifenólico encontrado no açafrão (Curcuma longa) tem demonstrado ser capaz de atuar sobre os mecanismos epigenéticos, sendo sugerido como um potente inibidor da HDAC. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar o tratamento agudo com extrato etanólico de Curcuma longa sobre a atividade da enzima histona desacetilase em estruturas cerebrais, hipocampo e córtex frontal, de ratos Wistar. Ratos Wistar machos adultos (3 e 20 meses de idade) foram aleatoriamente distribuídos nos seguintes grupos: salina, veículo (DMSO), extrato etanólico de Curcuma longa 10mg/Kg e 50mg/Kg. A atividade da histona desacetilase (HDAC) foi mensurada após 2 e 18 horas da administração, utilizando kit de ELISA específico. A ANOVA de três vias indicou um efeito do tempo (F(1,71)=4.238,p=0.044) após a administração do extrato etanólico de Curcuma longa e um efeito da idade em hipocampos (F(1,71) =10.430, p=0.002), ou seja, animais com 20 meses apresentaram atividade maior da HDAC quando comparados com os animais de 3 meses de idade. Em córtex frontal, a ANOVA de três vias indicou um efeito da idade (F(1,75)=4.438,p=0.039) e uma interação entre idade e tempo (F(1,75)=1.765,p=0.001). Em ambas as estruturas analisadas, não houve efeito da administração com extrato de Curcuma longa. Nossos resultados demonstram que a atividade da histona desacetilase foi aumentada em ambas as estruturas testadas de ratos com 20 meses de idade, sugerindo que no processo de envelhecimento cerebral ocorra uma redução na acetilação de histonas, o que pode reduzir a transcrição gênica. Além disso, a atividade da HDAC parece ser influenciada pelo ritmo circadiano, uma vez que houve um efeito do tempo nos níveis da atividade da HDAC em ambas as estruturas analisadas. A atividade da HDAC foi maior no tempo de 18 horas (correspondendo ao período da manhã) quando comparado ao tempo de 2 horas, que corresponde ao turno da tarde, este dado pode estar relacionado à cronobiologia, onde a organização circadiana permite que o organismo mantenha a homeostase em resposta a variações diárias decorrentes do ambiente externo e do próprio organismo. Cabe descrever que os ratos Wistar são notívagos, onde o período da manhã é o início do período de sono; assim poderíamos sugerir uma redução da acetilação e consequentemente uma redução na expressão gênica nesse período.
With the increase of life expectancy, an increase in the incidence of neurodegenerative diseases, for example, the Alzheimer‟s disease (AD),is estimated. Several interconnected pathophysiological processes are involved both in the aging process and neurodegenerative diseases, oxidative stress and neuroinflammation. It has been described that epigenetic alterations may be related to the aging process, causing changes in gene expression in different regions of the brain, such as, histone acetylation (HAT), and histones deacetylases (HDAT). The HAT is responsible for causing a relaxation of chromatin and, thus, a better accessibility to the process of gene transcription, while HDAC causes further compactation of chromatin, resulting in gene transcription suppression. Considering the role of histone acetylation in the aging process, especially in neurodegenerative diseases, it has been suggested the use of strategies to increase the acetylation with neuroprotective purposes, such as, for example, the use of HDAC inhibitors. Several studies have shown that HDAC inhibitors are capable of improving the cognitive functions and memory formation. In this context, curcumin, a polyphenolic compound found in turmeric (Curcuma longa) has been shown to be capable of acting on epigenetic mechanisms, being suggested as potent inhibitor of HDAC. The aim of this work was to investigate the effect of acute treatment with ethanol extract of Curcuma longa on the activity of histone deacetylases enzymes in brain structures, hippocampus and frontal cortex of Wistar rats. Male Wistar rats (3 and 20 months old) were randomly distributed into four groups: saline, vehicle (DMSO), Curcuma longa ethanol extract (10mg/kg and 50mg/Kg.) The histone deacetylase (HDAC) activity was measured 2 and 18 hours after administration, using specific ELISA kit. The three-way ANOVA showed a time effect (F(1,71)=4.238,p=0.044) after the administration of Curcuma longa ethanol extract and an age effect in hippocampus (F(1,71)=10.430,p=0.002), that is, 20-months Wistar rats presented a higher HDAC activity when compared to 3-months Wistar rats. In frontal cortex, the three-way ANOVA showed an age effect (F(1,75)=4.438,p=0.039) and an interaction between age and time (F(1,75)=1.765,p=0.001). In both structures, there was no effect of Curcuma longa extract administration. Our results show that the activity of histone deacetylase was increased in both structures of 20-months Wistar rats, suggesting that in the brain aging process it occurs a reduction in histone acetylation, which can reduce gene transcription. Furthermore, as there was a time effect on the levels of HDAC activity in both analyzed structures, the HDAC activity may be influenced by the circadian rhythm. The HDAC activity was higher in 18 – hour period (corresponding to the morning period) as compared to 2 - hour period (corresponding to the afternoon period). This finding may be related to chronobiology, in which the circadian organization allows the body to maintain homeostasis in response to daily changes arising from the external environment and the body itself. It is important to highlight that Wistar rats are nocturnal creatures, having the morning as the beginning of the sleep period. So, they can present a reduction in acetylation and a consequent reduction in gene expression during this period.

Introdução: A formação da memória envolve mudanças na expressão de genes neuronais. Remodelações epigenéticas da cromatina e modificações pós-traducionais reversíveis no DNA ou nas proteínas histonas representam mecanismos centrais na regulação da expressão gênica durante o desenvolvimento do cérebro e a aprendizagem inicial ou recuperação da memória. Desequilíbrios nos níveis de acetilação de histonas estão associados à uma ampla variedade de desordens cerebrais. Histonas deacetilases (HDACs) desempenham um papel fundamental na homeostase da acetilação de histonas e na regulação de atividades celulares fundamentais como a transcrição, tornando-as um foco de estudo. Evidências mostram que a administração de inibidores de histonas deacetilases (HDACis) restauram a memória associada à regulação da expressão gênica e melhora a memória em ratos. Estudos em modelos animais têm mostrado que a formação da memória envolve uma série de alterações bioquímicas em várias áreas do sistema nervoso central, entre as quais se destacam o hipocampo e a amígdala basolateral (BLA). Neste contexto, fármacos experimentais, como a tricostatina A (TSA), que atuam sobre mecanismos epigenéticos, têm sido recentemente propostos como potenciais terapias para o tratamento de disfunção cognitiva e memória associados a doenças neurológicas e psiquiátricas. Objetivo: Neste trabalho objetivamos compreender e elucidar o papel da acetilação de histonas em processos envolvidos na modulação da memória utilizando o fármaco TSA e se baseia na hipótese de que a atividade de HDACs é essencial para a modulação das respostas de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória (IA). Métodos: Ratos Wistar foram canulados bilateralmente na amígdala. Os efeitos das micro-infusões intra-amigdalares de TSA foram observados na consolidação e na extinção da memória após o treino na tarefa de esquiva inibitória e nos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) na BLA e no hipocampo referentes à consolidação da memória. Resultados: Os resultados demonstraram que a infusão intra-amigdalar de TSA 1.5 h, 3 h e 6 h após o treino na tarefa de esquiva inibitória resulta na melhora da memória de longa duração (LTM). TSA acelerou a extinção da memória quando infundido imediatamente pós-teste. Além disso, aumentou os níveis de BDNF no hipocampo. Conclusão: Estes resultados indicam que eventos epigenéticos possuem um papel importante no aprendizado e na memória através da atividade de HDACs.
Introduction: Memory formation involves changes in the expression of neuronal genes. Epigenetic remodeling of chromatin and reversible post-translational modifications in the DNA or in the histone proteins represent central mechanisms in the regulation of gene expression during brain development and early learning or memory retrieval. Imbalances in the levels of histone acetylation are associated with a wide variety of brain disorders. Histone deacetylases (HDACs) play a key role in homeostasis of histone acetylation and regulation of fundamental cellular activities, such as transcription, making them a focus of study. Evidences shows that the administration of histone deacetylases inhibitors (HDACis) restore the memory associated with the regulation of gene expression and improves memory in rats. Studies in animal models have shown that memory formation involves a series of biochemical changes in several areas of the central nervous system, which the hippocampus and basolateral amygdala (BLA) are the most highlighted. In this context, experimental drugs, such as trichostatin A (TSA), that act on epigenetic mechanisms, have recently been proposed as potential therapies for the treatment of memory and cognitive dysfunction associated with psychiatric and neurological disorders. Objective: In this work we aimed to understand and elucidate the role of histone acetylation in processes involved in memory modulation using the drug TSA and is based on the hypothesis that HDACs activity is essential for the modulation of learning answers in the inhibitory avoidance (IA) task. Methods: Wistar rats were cannulated bilaterally in the amygdala. The effects of TSA micro-infusions into the BLA were observed in the consolidation and extinction of memory after training in the inhibitory avoidance task and the levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the BLA and hippocampus related to memory consolidation. Results: The results demonstrated that the TSA infusion into BLA 1.5 h , 3 h and 6 h posttraining in the inhibitory avoidance task results in improved long-term memory (LTM). TSA accelerated the extinction of memory when infused immediately post-test. In addition, increased levels of BDNF in the hippocampus. Conclusion: These results indicate that epigenetic events play an important role in learning and memory by HDAC activity.

O glioblastoma (GBM) é considerado um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central (SNC). Mesmo com o uso de protocolos modernos de tratamento o prognóstico se mantém bastante reservado, sendo que crianças com GBM apresentam uma sobrevida média de 12 a 15 meses. Mecanismos epigenéticos podem interferir no processo de carcinogênese, sendo que a acetilação do DNA pode modular a expressão de genes que atuam no controle do ciclo celular, contribuindo assim para o desenvolvimento e progressão de neoplasias. Estudos clínicos demonstram que inibidores de histonas deacetilases (HDACs), em monoterapia ou combinados a outros agentes antineoplásicos, são clinicamente ativos e bem tolerados no tratamento de uma ampla variedade de tumores. Estes inibidores podem sensibilizar a resposta celular à irradiação ionizante, possibilitando uma redução nas doses-padrão utilizadas, minimizando os efeitos colaterais a curto e longo prazo. A radiação ionizante induz dano no DNA e é geralmente aceito que quebras da dupla-fita (DSBs) é o tipo de lesão mais severa relacionada à sobrevivência celular e preservação da integridade genômica. No presente estudo, avaliamos o potencial efeito radiosensibilizante do PCI-24781, um novo e potente pan-inibidor de HDAC nas linhagens celulares de GBM pediátrico SF188 e KNS42. Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose das linhagens SF188 e KNS42 com ou sem tratamento com PCI-24781. Também foram comparadas as taxas de clonogenicidade das linhagens SF188 e KNS42 que foram irradiadas com ou sem tratamento prévio com PCI-24781. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos do PCI-24781 na expressão de algumas das principais proteínas responsáveis pelo reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. Para os ensaios de proliferação celular foram utilizados os tempo de 24, 48, 72 e 96h, para apoptose, 48h e para capacidade clonogênica sem irradiação o tempo de 48h, em diferentes doses de PCI-24781 (0,25 - 16 M). O inibidor bloqueou significativamente a proliferação celular (p<0,05), induziu morte por apoptose (p<0,05) e reduziu a capacidade na formação de colônias (p<0,001) em ambas as linhagens. No ensaio para avaliação da radiosensibilidade, foram utilizadas as doses do IC30 11 de cada linhagem do ensaio clonogênico seguida de diferentes doses de irradiação. Ambas as linhagens apresentaram uma significativa (p<0,001) diminuição na formação de colônias em todas as doses de irradiação. A linhagem mais resistente à droga, SF188 foi escolhida para estudo do reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. As expressões da proteína Rad51, importante na via de reparo por recombinação homóloga (HR), e das proteínas DNA-PKcs, Ku70 e Ku86, importantes na via de reparo por união terminal não-homóloga (NHEJ) apresentaram uma maior diminuição quando a linhagem irradiada foi previamente tratada com PCI-24781 em comparação à radioterapia exclusiva. Estes achados demonstram que o inibidor de histona PCI-24781 apresenta um importante papel como agente radiosensibilizante, comprometendo o reparo das quebras de dupla-fita em células de GBM pediátrico tratadas com radioterapia.
Glioblastoma (GBM) is considered one of the most aggressive tumors to affect the central nervous system (CNS). Even employing modern treatment protocols the prognosis remains very poor, with children affected by GBM presenting a median survival rate of 12 to 15 months. Epigenetic mechanisms may interfere with the process of tumorigenesis, and DNA acetylation can modulate the expression of genes that contribute in cell cycle control and participate to the development and progression of cancer. Clinical studies demonstrate that histone deacetylase inhibitors (HDACs), alone or in combination with other antineoplastic agents, are clinically active and well tolerated in the treatment of a wide variety of tumors. These inhibitors may sensitize the cellular response to ionizing radiation, enabling the reduction in standard doses of radiation, ultimately minimizing both short and long-term side effects. Ionizing radiation induces DNA damage and it is generally accepted that the double-stranded breaks (DSBs) is the most severe type of injury related to cell survival and preservation of genomic integrity. In the present study, we evaluated the potential radiosensitizer effect of PCI-24781, a novel potent pan-HDAC inhibitor in the pediatric GBM cell lines SF188 and KNS42. We compared the cell proliferation rates, apoptosis of clonogenicity of KNS42 and SF188, with or without treatment with PCI-24781. Moreover, clonogenicity rates were compared between cell lines that were irradiated with or without prior treatment with PCI-24781 Additionally, we evaluated the effects of PCI-24781 in the expression of some of the major proteins responsible for the repair of double-stranded breaks caused by the irradiation. For the cell proliferation assays, the times of 24, 48, 72 and 96 hours were used, for apoptosis, the time of 48h and clonogenic capacity without irradiation, the time of 48h, and different doses of PCI-24781 (0,25 - 16 M). The inhibitor significantly blocked cell proliferation (p<0,05), inducing cell death by apoptosis (p<0,05) and reducing the colony forming ability (p<0,001) of both lineages. In the assays to evaluate the radiosensitivity , the IC30 doses of the clonogenic assays were used for each cell-line after different doses of irradiation. Both lineages showed a significant decrease (p<0,001) in colony formation at all doses of irradiation. The most resistant cell-line to the drug, SF188, was 13 chosen to study the double-strand breaks repair caused by irradiation. The Rad51 protein levels, critical for homologous recombination (HR), and the DNA-PKcs proteins Ku70 and Ku86, important for DNA repair through non-homologous end joining (NHEJ) showed significant decrease in expression when cell-line was treated with PCI-24781 prior to radiotherapy. These data demonstrates that the histone deacetylase inhibitor PCI-24781 plays an important role as a radiosensitizer agent, compromising the repair of double-strand breaks in pediatric GBM cells following irradiation.

El glioblastoma multiforme es uno de los tumores humanos más agresivos y de peor pronóstico. Actualmente se están probando nuevos fármacos en la lucha contra este tipo de cáncer, entre los cuales se encuentran los inhibidores de las desacetilasas de histonas (HDACi). Este trabajo se ha centrado en caracterizar los efectos de dos HDACi, el ácido valproico (VPA) y el ácido suberanilohidroxámico (SAHA) sobre las células de glioma. Nuestros resultados demuestran que los HDACi causan la muerte de las células de glioma y afectan a la progresión del ciclo celular, debido a la disminución de las quinasas que regulan el punto de control G2 (Wee1 y Chk1), provocando así la entrada de las células en mitosis sin haber reparado el daño al DNA. En consecuencia, estos fármacos provocan la muerte de las células de glioma por apoptosis inducida por catástrofe mitótica.
El glioblastoma multiforme és un dels tumors humans més agressius i de pitjor pronòstic. Actualment s'estan provant nous fàrmacs en la lluita contra aquest tipus de càncer, entre els quals es troben els inhibidors de les desacetilases d'histones (HDACi). Aquest treball s'ha centrat en caracteritzar els efectes de dos HDACi, l'àcid valproic (VPA) i l'àcid suberanilohidroxámico (SAHA) sobre les cèl•lules de glioma. Els nostres resultats demostren que els HDACi causen la mort de les cèl•lules de glioma i afecten la progressió del cicle cel•lular, a causa de la disminució de les quinases que regulen el punt de control G2 (Wee1 i Chk1), provocant així l'entrada de les cèl•lules en mitosi sense haver reparat el dany al DNA. En conseqüència, aquests fàrmacs provoquen la mort de les cèl•lules de glioma per apoptosi induïda per catàstrofe mitòtica.
Glioblastoma multiforme is one of the most aggressive human tumors and has a poor prognosis. Currently, new drugs are being tested against glioblastoma such as histone deacetylase inhibitors (HDACi). This work has focused on characterizing the effects of two HDACi, valproic acid (VPA) and suberanilohydroxamic acid (SAHA) on glioma cells. Our results demonstrate that the HDACi kill glioma cells and affect cell cycle progression due to a decrease in the expression of two G2 chekcpoint kinases (Wee1 and Chk1), causing the entry of cells into mitosis with damaged DNA. Consequently, these drugs cause glioma cells death by apoptosis induced by mitotic catastrophe.

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas
Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico.
Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

O objetivo do presente estudo foi analisar o efeito do treinamento aeróbico periodizado realizado em ambientes aquático ou terrestre sobre parâmetros de estado oxidativo, inflamatórios e epigenéticos em sangue periférico de sujeitos adultos com diabetes mellitus tipo 2 (DMT2). Pacientes com DMT2 sedentários (55-64 anos de idade) randomizados foram alocados em dois grupos, um grupo realizou treinamento aeróbico aquático e outro grupo realizou treinamento aeróbico terrestre. Os programas de treinamento aeróbico intervalado foram realizados três vezes por semana com duração de 45 minutos cada sessão por 12 semanas, que consistiu em caminhada e/ou corrida em piscina funda realizada pelos indivíduos do grupo de exercícios aquáticos ou caminhada e/ou corrida em pista atlética realizada pelos indivíduos do grupo de treinamento terrestre. Os treinamentos em ambos os meios apresentaram uma periodização similar; as intensidades foram determinadas a partir do segundo limiar ventilatório (LV2) de cada indivíduo. O protocolo consistiu de quatro mesociclos com três semanas cada um, durante três meses. O sangue periférico foi coletado antes e imediatamente depois da primeira e da última sessão de exercício, assim foram avaliados os efeitos agudo da primeira sessão, agudo em indivíduos treinados, além do treinamento crônico. Foram avaliados parâmetros de estado oxidativo, por meio do conteúdo de espécies reativas, do dano aos lipídeos através do nível de 8-isoprostanos e formação de substâncias fluorescentes, assim como danos às proteínas a partir do conteúdo dos resíduos de triptofano e tirosina. Além disso, a capacidade antioxidante total (TRAP) foi avaliada, assim como a atividade de enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPX). Ainda, foram avaliados parâmetros inflamatórios através dos níveis das interleucinas 6 (IL6), interleucina 1β (IL1β e interleucina 10 (IL10). Foi avaliada a atividade global da enzima histona desacetilase (HDAC). Houve uma diminuição do conteúdo das espécies reativas e do nível de isoprostanos após a primeira sessão de exercício, assim como após a última sessão de exercício, indicando um efeito agudo do exercício mesmo nos indivíduos treinados. Em relação à atividade das enzimas antioxidantes, ocorreu uma redução da atividade da GPX após as 12 semanas de treinamento e as atividades da SOD e da CAT diminuíram após a primeira sessão de exercício e após as 12 semanas de treinamento, sem nenhum efeito sobre o conteúdo das espécies reativas. Não houve diferença significativa entre os grupos água ou terra. Após 12 semanas de treinamento em ambos os ambientes, foi observado um aumento da IL-10, uma citocina anti-inflamatória. A atividade global da enzima HDAC aumentou agudamente após a primeira e última sessão de exercício, e ocorreu uma diminuição após as 12 semanas de treinamento tanto no grupo água como no grupo terra. Em relação aos outros parâmetros avaliados, não foram observadas diferenças significativas. A partir dos resultados obtidos, podemos sugerir que o treinamento periodizado, que respeita as características individuais, tanto em meio aquático como em terrestre, é capaz de alterar parâmetros de estado oxidativo, epigenéticos e inflamatórios em sangue periférico de pacientes com DMT2.
The aim of this study was to analyze the effects of aerobic training periodization performed in aquatic or dry land environment on oxidative stress, inflammatory and epigenetic parameters in blood of subjects with type 2 diabetes mellitus (T2DM). Sedentary patients (55-64 years) diagnosed with T2DM with no regular physical activity were allocated in a water group or a dry land group through a blinded randomization. The exercise programs consisted in aerobic interval training sessions three times a week during 12 weeks involving deep-water walking or running in swimming pool with a life vest (water group) or walking or running on a track (land group). The intensities were determined by individual second ventilatory threshold, obtained through maximal effort test, performed in their specific training environment. Our protocol consists of a periodised training with four mesocycles of three weeks each during 3 months. The effects of first and last sessions, as well as, of 12 weeks training (without any effect of acute exercise) were investigated. Firstly, we evaluated several oxidative state parameters, specifically the reactive species content, the lipid peroxidation through the 8-isoprostane levels and the fluorescent substances formation, the protein damage by the content of tryptophan and tyrosine residues. Moreover, the total antioxidant capacity (TRAP) was evaluated, as well as the antioxidant enzyme activities, namely glutathione peroxidase (GPX), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). There were decreases in the reactive species and isoprostane levels after the first and the last exercise session, indicating an acute effect of exercise even in trained subjects. The exercise reduced antioxidant enzyme activities without any effect on TRAP values. Interestingly, there were no significant differences between land group and water groups. Yet, it was studied the effect of our exercise protocol on blood global HDAC activity and cytokines, interleukin 6 (IL6), interleukin 1β (IL1β) and interleukin 10 (IL10), levels in type 2 diabetes patients. After 12 weeks of training in both environments, we observed an increase in IL-10, an anti-inflammatory cytokine. Interestingly, the HDAC enzyme global activity increased acutely after first and last exercise session and there was a decrease after 12 weeks of training in both water and land groups. The results suggest that the periodization exercise performed in water and dry land environments is able to improve oxidative status, inflammatory and epigenetic parameters in subjects with type 2 diabetes.

Pacientes submetidos por longos períodos à diálise peritoneal (DP) podem evoluir com fibrose e redução da capacidade de ultrafiltração da membrana peritoneal (MP). Essas alterações da MP são desencadeadas pela exposição prolongada às soluções de diálise peritoneal, peritonites de repetição e irritantes químicos que induzem inflamação, neoangiogênese e fibrose da MP. A ativação da via Transforming Growth Factor (TGF-beta)/Smad é um fundamental mecanismo mediador da fibrogênese peritoneal. Sendo assim, drogas que inibam a via TGF-beta/Smad são de especial interesse no tratamento da FP. O ácido valpróico (VPA) é um inibidor das histona desacetilases (iHDAC), enzimas que regulam a conformação da cromatina e a expressão gênica, com atividade anti-inflamatória e antifibrótica. O presente estudo tem como objetivo principal avaliar o efeito do VPA em um modelo experimental de fibrose peritoneal em ratos. Vinte e quatro ratos Wistar machos (peso inicial de 280 - 320g) foram dividos em 3 grupos experimentais: CONTROLE (n=8), animais normais que receberam injeções de salina intraperitoneal (IP); FP (n=8), animais que recereberam injeções IP de gluconato de clorexidina (GC) diariamente por 15 dias para indução de fibrose peritoneal; FP+VPA (n=8), animais com FP e tratados com VPA. O ácido valpróico (300mg/kg) foi administrado por gavage diariamente por 15 dias, simultaneamente à indução de fibrose peritoneal. Ao fim dos experimentos, amostras do tecido peritoneal foram coletadas para realização de histologia, imunho-histoquímica (IH), imunofluorescência (IF) e biologia molecular. A análise da MP dos animais do grupo FP revelou um espessamento significativo da camada submesotelial devido ao acúmulo de matriz extracelular e infiltrado inflamatório. O tratamento com VPA foi capaz de prevenir significativamente o espessamento da MP, mantendo a espessura do peritôneo do grupo FP+VPA similar a do grupo CONTROLE. Com relação à função peritoneal, a administração de VPA evitou a queda da ultrafiltração e aumento do transporte peritoneal de glicose induzidos pelo GC. Além disso, o VPA impediu o aumento da expressão de miofibroblastos e de fatores associados à fibrose (TGF-beta, FSP-1 e fibronectina) induzidos pelo GC. Interessantemente, o VPA reduziu de maneira significativa a expressão da Smad3, mediador intracelular crítico da sinalização TGF-beta/Smad, em relação ao grupo FP. Por outro lado, os animais tratados com VPA apresentaram um aumento da expressão peritoneal de fatores antifibróticos como a BMP-7 e Smad7, proteínas que contrarregulam as ações do TGF-beta. Além de atenuar a fibrose peritoneal, o VPA apresentou efeitos anti-inflamatório e antiangiogênico, demonstrado pela menor expressão de citocinas pró-inflamatórias, fatores quimiotáticos para macrófagos (MCP-1) e VEGF no grupo FP+VPA quando comparado ao grupo FP. Em resumo, o VPA foi capaz de bloquear o espessamento por fibrose da MP e preservar a sua função, além de proteger o peritônio contra a neoangiogênese e inflamação. Além disso, o VPA induziu um aumento da expressão de fatores antifibróticos na MP. Os resultados apresentados neste trabalho chamam a atenção para mecanismos envolvidos nas modificações da MP induzidas pela DP ainda pouco explorados e que podem constiuir potenciais alvos na prevenção do desenvolvimento da fibrose peritoneal associada à DP
Long term peritoneal dialysis (PF) can induce peritoneal fibrosis and loss of ultrafiltration capacity of peritoneal membrane (PM). These peritoneal changes are due to prolonged exposure to peritoneal dialysis solutions, chemical irritants and acute peritonitis episodes that induce inflammation, neoangiogenesis and PM fibrosis. The Transforming Growth Factor (TGF-?) is the main mediator involved in the development of peritoneal fibrosis. Thus, drugs that inhibit the TGF-?/Smad pathway or inflammation are of particular interest in the treatment of PF. Valproic acid (VPA) is an histone deacetylase (HDAC) inhibitor. HDACs are enzymes that regulate chromatin conformation and gene expression. Recent studies have described HDACi as promising drugs in the treatment of inflammatory and fibrotic diseases. The main aim of this study was to evaluate the effect of VPA in an experimental model of peritoneal fibrosis in rats. Twenty four Wistar rats (initial weight of 280-320g) were divided into three experimental groups: CONTROL (n = 8), normal animals that received only saline ip; FP (n = 8), peritoneal fibrosis was induced by daily Gluconate Clorhexedine (GC) intraperitoneal (IP) injections for 15 days; FP+VPA (n = 8), animals with peritoneal fibrosis and treated with VPA. Daily valproic acid (300mg/kg) doses were administered by gavage simultaneously with the induction of peritoneal fibrosis in the FP+VPA group. At the end of experiments, the animals were submitted to euthanasia and samples of peritoneal tissue were collected for histology, immunocytochemistry, immunofluorescence, and molecular biology. Also, a functional peritoneal test was performed. The FP group showed a significant thickening of PM due to the accumulation of extracellular matrix and inflammatory cellular infiltration. VPA treatment was able to significantly prevent PM thickening, maintaining the peritoneal thickness of the VPA group similar to that of the CONTROL group. The VPA administration also preserved peritoneal function in the FP+VPA group, avoiding the reduction of ultrafiltration and increasing of peritoneal glucose transport induced by GC. According to the histological changes mentioned above, the VPA hampered the upregulation of the pro-fibrotic genes (TGF-beta, FSP-1, and fibronectin) and increase in the myofibroblasts expression induced by GC injections. Interestingly, the peritoneal expression of phosphorylated Smad3 detected by immunohistochemistry and Smad3 mRNA was significantly higher in the FP group. However, this effect was attenuated by VPA treatment. On the other hand, VPA was able to induce an increase in the expression of the antifibrotic factors, such as BMP-7 and Smad7, in the peritoneal membrane. Besides its antifibrotic activity, VPA also showed anti-inflammatory and anti-angiogenic effects. Animals of the FP+VPA group showed a significant reduction of the PM expression of pro-inflmmatory cytokines, macrophage chemoattractants and, VEGF expression when compared with FP group. In conclusion, we have shown that VPA inhibits the progression of peritoneal fibrosis in a CG-induced peritoneal fibrosis model in rats. VPA inhibited different and important mechanisms involved in peritoneal membrane modifications induced by PD, as activation of TGF-beta/Smad pathway, inflammation, and angiogenesis. Notably, VPA induced the expression of antifibrotic factors. Our results are very interesting and shed lights on a new perspective for the treatment of peritoneal fibrosis. However, this is an exploratory study and future studies are needed before to translate this experimental finding into clinical application

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013
As desacetilases das histonas (HDACs) têm um papel importante na homeostasia dos níveis de acetilação das histonas e algumas proteínas não-histonas, regulando assim processos celulares fundamentais como a transcrição. Este mecanismo epigenético, tal como outras modificações pós-tradução das histonas e a metilação do DNA, têm demonstrado ser importantes nos processos de aprendizagem e memória. De facto, existem cada vez mais evidências de que alterações na estrutura da cromatina estão envolvidas na etiologia de doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas. Desse modo, os inibidores das HDACs (HDACi) têm exibido propriedades neuroprotectoras e neuroregenerativas em vários modelos de doenças como Alzheimer, Parkinson, Huntington, entre outras. De facto, as HDACs parecem ser um bom alvo terapêutico em doenças associadas a defeitos cognitivos, tendo já sido demonstrado que os HDACi conseguem reverter muitos destes defeitos através da indução da expressão de genes implicados nos processos de aprendizagem e memória, entre outros. O grande desafio continua a ser no entanto o desenvolvimento de um potente e eficaz inibidor das HDACs com excelente permeabilidade da barreira hemato-encefálica, com menos citotoxicidade e menos efeitos adversos.
Histone deacetylases (HDACs) play an important role in homeostasis of acetylation levels of histones and other non-histone proteins, and thus regulating fundamental cellular activities such as transcription. These epigenetic mechanisms, as other posttranslational modifications of histones and DNA methylation, have shown to be important in learning and memory processes. In fact, there is accumulating evidence that altered chromatin plasticity is involved in the pathophysiology of neurodegenerative and neuropsychiatric diseases. Therefore, HDAC inhibitors (HDACi) exhibit neuroprotective and neuroregenerative properties in animal models of various brain diseases, like Alzheimer’s, Parkinson’s, Huntington’s, and many others. In fact, HDACs seem to be a good therapeutic target in diseases associated with cognitive deficits, and it has been demonstrated that HDACi can reverse much of these deficits through the induction of gene expression related to learning and memory processes, and others. However, the great challenge is still the development of a potent and efficient HDAC inhibitor with an excellent permeability of the hematoencephalic barrier, with less citotoxicity and less side effects.

ABSTRACT: Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological malignancy, despite advances in treatment. The most common histological type, high grade serous carcinoma (HGSC) is usually diagnosed at an advanced stage, and although this type of tumors frequently responds to surgery and platinum-based chemotherapy, they usually recur. Ovarian clear cell carcinoma (CCC) is an unusual histological type, which is known to be intrinsically chemoresistant and is associated with poor prognosis in advanced stages. Hence, the discovery of new therapeutic strategies urges and the fact that histone deacetylases (HDACs) expression is increased in ovarian cancer points out HDAC inhibitors (HDACIs) as an attractive approach. Our hypothesis is that HDACIs are useful drugs to treat ovarian cancer. So, the main goal was to disclose the molecular mechanisms underlying the action of HDACIs in ovarian cancer. We investigated the expression profile of HDAC, class I (HDAC1, 2, 3) and class II (HDAC4, 6 and phosphoHDAC4/5/7) in ovarian cancer. HDACs protein expression was analyzed by immunohistochemistry on tissue microarrays (TMA) from 64 patients with ovarian cancer (49 cases of HGSC and 15 cases of CCC). Our results showed that HGSC expressed HDAC1, 2, 3, 4, 6 and phosphoHDAC4/5/7 whereas CCC expressed HDAC1, 2 and 6. HDAC2, 3, 4 and pHDAC4/5/7 were associated with HGSC type. Kaplan-Meier curves showed that HDACs expression was not associated with survival. We also evaluated the association of HDACs expression profile with the cell cycle markers and we found that HDAC1 expression was statistically associated with p21 expression in HGSC. In order to understand the effects of HDACIs we used cancer cell lines (OVCAR3 and ES2) exposed to HDACIs, butyric acid and vorinostat, 5-aza-2´-deoxycytidine (DNA methylation inhibitor) and carboplatin and paclitaxel (standard chemotherapy) alone and combined. Analysis of cell death, proliferation and migration in cancer cell lines was performed. Our results showed, that both HDACIs induced cell death, mainly through apoptosis in the two cell lines. This result was further confirmed in ES2 cell line exposed to vorinostat, by the study of immunofluorescence of cleaved caspase 3 and the ratio of BAX/BCL-2 proteins, which increased after vorinostat exposure. Cell migration was decreased by vorinostat in both cancer cell lines. Our results also indicated that the association of different drugs were able to potentiate the effect of standard chemotherapy, mainly in ES2 cell line (CCC), supporting that EOC treatment can benefit from combined chemical and epigenetic therapy. Considering that CCC is a unique clinical, histopathological and molecular entity within ovarian cancer and having HNF1β as a pivotal pro-survival gene we evaluate the role of HNF1β in cell cycle arrest and apoptosis in CCC upon vorinostat exposure. Our results showed that vorinostat induced increased levels of HNF1β and at the same time cell cycle arrest and apoptosis in ES2 cells. This effect on HNF1β is associated with increased acetylation load of HNF1β. This study confirms that epigenetic modulation affects not only the conformation of chromatin and gene expression, but also it may alter the function and the turnover of proteins other than histones. Also, epigenetic modulation of signaling pathways have been reported in HGSC and CCC, including the overexpression of Notch pathway elements and we investigated the modulation of the Notch pathway by vorinostat in ovarian cancer. Using immunofluorescence and quantitative polymerase chain reaction, our results revealed that vorinostat activated the Notch pathway in CCC and HGSC cell lines, through different Notch ligands. The activation of Notch pathway by vorinostat, in CCC and HGSC cell lines, culminated in the increased expression of the same downstream transcription factors, hairy enhancer of split (Hes1) 1 and 5, and Hes-related proteins 1 and 2. Therefore, vorinostat modulates the expression of several downstream targets of the Notch pathway and independent Notch receptors and ligands that are expressed in HGSC and CCC. This upregulation of the Notch pathway may explain why vorinostat therapy fails in ovarian carcinoma treatment, as shown in certain clinical trials. We also established a cell line from ascitic fluid from a patient with HGSC, who had been previously treated with neoadjuvant chemotherapy. The cell spontaneous immortalization was obtained on 2D cell culture and expansion was performed on 2D and 3D cell cultures. Characterization studies confirmed that IPO-SOC43 cell line is of EOC origin and maintains morphological and molecular features of the primary tumor. The success of the cell line growth in a 3D systems, allows it to be used in more complex assays than those performed in 2D models. IPO-SOC43 is available for public research and we hope it can contribute to enrich the in vitro models addressing EOC heterogeneity, being useful to investigate EOC and to develop new therapeutic modalities. In conclusion, the results in vitro proved that there is benefits of combined therapy, using drugs with action of epigenetic modulation and conventional therapy. This thesis also pave the path for future studies on the role of HDACs cancer cells pathophysiology, serving as markers for the design of personalized and specific therapeutic strategies.
RESUMO: O carcinoma do ovário é a neoplasia ginecológica mais letal. Vários fatores são identificados como responsáveis pela baixa eficácia no tratamento do carcinoma do ovário. Assim, é postulado que a elevada taxa de mortalidade se deve principalmente, a dificuldades no diagnóstico da doença numa fase inicial e à resistência à terapêutica convencional. Deste modo, a investigação de novas estratégias terapêuticas é essencial e urgente. A expressão aumentada das desacetilases de histonas (HDAC) identificada em carcinomas do ovário pode indicar que os inibidores de HDACs (HDACIs) possam ser uma alternativa terapêutica. Os HDACIs são uma classe de agentes anti-neoplásicos, que bloqueiam a desacetilação de histonas e outras proteínas, causando paragem do ciclo celular, diferenciação e/ou apoptose das células neoplásicas. Vários HDACIs estão a ser testados em ensaios clínicos, quer como agentes únicos quer em terapias combinadas, apresentando alguns resultados positivos no combate a vários tumores sólidos e hematológicos. Os mecanismos moleculares do efeito anti-tumoral dos HDACIs não estão completamente esclarecidos, nem a avaliação da sensibilidade e/ou resistência das células a fármacos com influência na regulação epigenética. O cancro do ovário é um conjunto vasto de neoplasias distintas sendo os carcinomas o grupo mais prevalente. Atualmente, não é possível, de modo fiável prever o curso clínico da doença nem a resposta individual à quimioterapia. No entanto, a identificação morfológica do tipo de carcinoma do ovário tem valor prognóstico independente em análise multivariada, pelo que a avaliação de potenciais biomarcadores que possam constituir alvos terapêuticos deverá ser efetuada de modo independente, pois previsivelmente cada tipo histológico deverá ter uma resposta específica ao tratamento. Por estas razões, a hipótese geral desta tese é que os HDACIs são fármacos úteis no tratamento do cancro do ovário, sendo o objetivo a avaliação de mecanismos subjacentes à ação destes fármacos em carcinomas de ovário de modo a permitir uma terapêutica mais eficaz. Neste projeto foram estudados apenas dois tipos histológicos de carcinoma do ovário: seroso de alto grau (HGSC), que é o mais frequente e o carcinoma de células claras (CCC) que apesar de pouco frequente é atualmente resistente à terapia convencional. Assim, um dos primeiros objetivos desta tese foi caracterizar o perfil de expressão das HDACs em carcinomas do ovário e validar a relevância de testar HDACIs como agentes de regulação epigenética, no tratamento do carcinoma do ovário. Os resultados em doentes com cancro do ovário mostram que o perfil de expressão das HDACs se associa ao tipo histológico. No HGSC verifica-se uma associação das HDACs 2, 3, 4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas, enquanto que no carcinoma de células claras (CCC), as HDAC1, 2 e 6 apresentam níveis elevados de expressão e verifica-se uma diminuição da expressão da HDAC3, HDAC4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas. A expressão das HDACs 2, 3, 4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas estão associadas ao tipo histológico sendo mais expressas no HGSC. A expressão da HDAC3 está ainda associada a parâmetros clínicos, nomeadamente ao estádio mais avançado e à metastização; bem como a HDAC4c e a HDAC4/5/7 fosforiladas. Considerando que as HDACs estão sobre-expressas nestes tipos histológicos de carcinomas do ovário, seguidamente, pretendemos avaliar o efeito epigenético dos HDACIs em modelos in vitro de carcinoma de ovário e compreender as alterações decorrentes da exposição aos HDACIs, bem como perceber o efeito destes na dinâmica molecular e viabilidade celular. Para tal, usamos duas linhas celulares, de dois tipos histológicos já avaliados, uma linha de HGSC - OVCAR3 e uma linha celular de CCC - ES2. Os resultados indicam que os HDACI induzem a morte celular em ambas as linhas celulares, principalmente através da apoptose, avaliada por citometria de fluxo. Este resultado foi evidenciado na linha celular ES2 exposta ao vorinostat, pelo estudo da imunofluorescência da caspase 3 clivada e da avaliação da razão das proteínas BAX/BCL-2, que aumentou após a exposição ao vorinostat. Os resultados também indicam que a associação de diferentes tipos de fármacos potencia o efeito da quimioterapia convencional e os HDACIs, em particular o vorinostat, tendo um efeito cumulativo na morte celular, principalmente na linha celular ES2 (CCC). A migração celular também é afetada pelo vorinostat em ambas as linhas celulares de carcinoma de ovário. Os resultados mostram também que o vorinostat induz aumento do HNF1β e ao mesmo tempo paragem do ciclo celular e apoptose nas células ES2. O aumento da expressão do HNF1β é acompanhado pelo aumento dos seus níveis da acetilação. Este estudo confirma que a modulação epigenética afeta a conformação da cromatina e da expressão genética, mas também pode alterar a função e o turnover de outras proteínas além das histonas. Pela primeira vez é observado que a proteína HNF1β pode ser acetilada, contudo serão necessários mais estudos para validar o papel da acetilação na função e degradação da proteína HNF1β. Nesta tese foi avaliado também a modulação de outras vias de sinalização importantes no carcinoma do ovário, como por exemplo a via Notch através da exposição a HDACIs, nomeadamente vorinostat e ácido butírico. E os nossos resultados mostram que o vorinostat ativa a via Notch nas linhas celulares de CCC e HGSC, através de diferentes ligandos da via Notch. No CCC, a ativação da via Notch parece ocorrer através dos ligandos Delta (Dll) 1, 2 e 3, enquanto nos HGSC, os ligandos Dll1, Jagged 1 e 2 são os mais expressos. A ativação da via Notch pelo vorinostat, em ambas linhas celulares, culminou na expressão aumentada dos mesmos genes alvo da via Notch, Hes1 e 5 e Hey 1 e 2. Assim, o vorinostat modula a expressão de vários fatores de transcrição da via Notch, independentemente do painel de receptores e dos ligandos expressos nas linhas de HGSC e CCC. Esta redundância da via Notch pode explicar porque a terapêutica isolada com vorinostat falha no tratamento do carcinoma do ovário, como observado em vários ensaios clínicos. Por fim, no decorrer dos trabalhos apresentados, e considerando a importância das linhas celulares na compreensão da biologia do cancro e nos mecanismos de sensibilidade e resistência das células aos fármacos, foi estabelecida uma linha celular, IPO-SOC43 a partir de líquido ascítico de uma doente com HGSC que havia sido previamente tratada com quimioterapia neoadjuvante.Foram efetuados estudos de caracterização desta linha que demonstram que a linha celular IPO-SOC43 é de origem epitelial e que mantém características morfológicas e moleculares do tumor primário. As células mantêm-se em cultura em monocamada (2D) e em agregados em 3D, com taxas de proliferação e viabilidade dentro do esperado para uma linha neoplásica maligna. O sucesso da viabilidade em culturas 3D permite o seu uso em ensaios mais complexos, nomeadamente, na análise da contribuição dos vários componentes do microambiente tumoral na progressão da doença e resposta à terapêutica. A linha celular IPO-SOC43 está disponível para ser utilizada experimentalmente e esperamos que possa contribuir para enriquecer os modelos in vitro que abordam a heterogeneidade dos EOC e desenvolver novas modalidades terapêuticas. Em suma, os resultados contribuem para a implementação racional de novas e diferentes abordagens terapêuticas. Os resultados mostram que in vitro há benefício de terapêutica combinada, utilizando fármacos com ação de modelação epigenética e terapia convencional. Esta tese também abre caminho para estudos futuros mais detalhados sobre a função das HDACs na dinâmica celular e não só na regulação epigenética, bem como também na análise de mecanismos subjacentes à ação de proteínas codificadas por genes relevantes em cada tipo histológico de carcinoma do ovário. Espera-se assim, que a compreensão dos mecanismos subjacentes à ação dos fármacos envolvidos na regulação epigenética possa fornecer orientações para estratégias terapêuticas mais específicas e personalizadas.