Tesi sul tema "Variants génétiques humains"

L'apprentissage fédéré (FL) est une technique d'apprentissage automatique qui permet à plusieurs détenteurs de données d'entraîner un modèle de manière collaborative, sans partager les données brutes. Cette approche est particulièrement pertinente dans le domaine de la génétique, où les données sont souvent réparties entre plusieurs institutions, et où des contraintes réglementaires, telles que le Règlement Général sur la Protection des Données, limitent la centralisation des données. En plus d'améliorer la confidentialité et la sécurité des données, FL permet l'entraînement de modèles plus robustes en accédant à des ensembles de données plus vastes et plus diversifiés. FL a été proposé pour la première fois en 2016 comme approche pour entraîner des modèles d'apprentissage automatique sur une fédération d'appareils mobiles, coordonnée par un serveur central. Dans leur mise en œuvre, le serveur définissait un modèle global, et transmettait ses paramètres à un sous-ensemble de clients. Les clients optimisaient ensuite le modèle reçu, en effectuant une descente de gradient stochastique sur leurs données locales, puis renvoyaient les mises à jour locales au serveur. Le serveur créait un nouveau modèle global en agrégeant les mises à jour locales par moyenne pondérée. Ce processus était répété soit pendant un nombre prédéfini de tours, soit jusqu'à la convergence du modèle. FL a également été adapté aux environnements cross-silo, où les clients (généralement entre 2 et 50) sont des organisations telles que des hôpitaux et des instituts de recherche. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'efficacité de FL cross-silo pour l'évaluation clinique des variantes génétiques humains. À cet effet, nous avons utilisé la base de données publique ClinVar pour simuler des collaborations multi-institutionnelles réalistes dans l'évaluation des variantes nucléotidiques simples, codantes et non codantes, ainsi que des variations du nombre de copies. Concrètement, nous avons évalué la performance de plusieurs modèles d'apprentissage automatique supervisé, entraînés de manière fédérée entre plusieurs institutions, pour classifier les variantes génétiques comme pathogènes ou non pathogènes. Nous avons ensuite comparé ces performances à celles de modèles centralisés et celles de modèles locaux propres à chaque institution. Pour ce qui est de la comparaison avec les performances de modèles centralisés, les performances de FL étaient équivalentes ou supérieures. Pour ce qui est de la comparaison avec les performances de modèles locaux, les performances de FL étaient dans la grande majorité des cas supérieures. Ces résultats démontrent les avantages à utiliser l'apprentissage fédéré dans la collaboration entre les institutions. Dans nos expériences, nous avons évalué plusieurs stratégies d'agrégation de FL, notamment FedProx, FedAdagrad, FedAdam et FedYogi, qui font référence aux méthodes utilisées par le serveur pour combiner les mises à jour locales en un nouveau modèle global. Nos résultats ont montré que FedProx offrait généralement les meilleures performances. De plus, nous avons analysé la dégradation des performances du modèle de FL et de son modèle centralisé équivalent lorsqu'une institution décidait de ne pas participer à l'entraînement collaboratif. Nous avons constaté que, dans la plupart des cas, le modèle de FL se montrait plus résilient que les approches centralisées, démontrant sa capacité à se généraliser de manière adéquate à des ensembles de données non vus, même avec des ensembles d'entraînement plus réduits. À notre connaissance, cette thèse présente la première étude simulée de FL pour la classification de la pathogénicité des variantes génétiques. Avec nos conclusions, nous espérons encourager l'adoption de FL pour établir des collaborations multi-institutionnelles sécurisées dans l'interprétation des variantes humains
Federated learning (FL) is a machine learning (ML) technique that enables multiple data holders to collaboratively train a model, without raw data sharing. This approach is particularly relevant in the field of genomics, where data is often distributed across institutions, and regulatory constraints, such as General Data Protection Regulation (GDPR) and Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA), restrict data centralization. In addition to improving privacy and data security, FL allows the training of more robust ML models, by leveraging access to a larger and more diverse dataset. FL was first proposed by Google researchers in 2017 as an approach for training ML models on a federation of mobile devices coordinated by a central server. In this setup, the mobile devices contained data that was either sensitive or large in size with respect to the ML model. In their implementation, the server defined a global ML model and communicated the parameters to a subset of clients. The clients then optimized the received model by performing Stochastic Gradient Descent on local data, and sent back the local updates to the server. The server derived a new global model by aggregating the local updates through weighted averaging. This process was repeated for a predefined number of rounds or until the model converged. FL has also been adapted to cross-silo settings, where clients (typically 2-50) are organizations, such as hospitals and research institutions. The objective of this thesis is to study the effectiveness of cross-silo FL for the clinical assessment of human genetic variants. To that extent, we leveraged the public-available database ClinVar for simulating realistic multi-institutional collaborations in the assessment of coding Single Nucleotide Variants (SNVs), non-coding SNVs, and copy number variants (CNVs). Concretely, we evaluated the performance of a diverse set of supervised ML models, trained in a FL manner across multiple institutions, in classifying genetic variants into pathogenic or non-pathogenic, and compared it to the centralized and individual- institution (local) model counterparts. Our results showed that FL generally achieved competitive or superior performance than the centralized model, and systematically outperformed the local models, highlighting the advantages of collaboration. In the experiments we benchmarked several FL aggregation strategies, including FedProx, FedAdagrad, FedAdam, and FedYogi, which refer to the methods used by the server to combine local updates into a new global model. Our results showed that FedProx generally provided the best performance. Furthermore, we analyzed the performance degradation of both FL and its centralized model counterpart when one institution decided not to participate in the collaborative training. We found that FL was more resilient than centralized approaches in most cases, demonstrating that FL can generalize adequately to unseen datasets with smaller training sets. To the best of our knowledge, this thesis presents the first simulated FL study for the pathogenicity classification of genetic variants. With our findings, we expect to incentive the adoption of FL for establishing secure multi-institutional collaborations in human variant interpretation

Les études d’association sur génome entier ont permis d’identifier de nombreux facteurs de risque génétiques impliqués dans des maladies complexes. Il apparaît cependant que les variants fréquents n’expliquent qu’une faible partie de l’héritabilité des maladies. Une partie non négligeable serait due à la présence de variants rares avec des effets génétiques plus forts. Tester l’association de ces variants est problématique du fait de leur faible fréquence dans la population générale. De nombreuses méthodes statistiques ont été développées avec la stratégie commune d’agréger l’information pour un groupe de variants. Cette thèse a pour objectif de comparer les principales stratégies à l’aide de simulations de différents scénarios génétiques et de l’application à de vraies données de séquençage. Nous avons aussi développé un test, appelé DoEstRare, comparant les distributions des positions des variants rares entre les cas et les témoins, afin de détecter des regroupements de variants dans des régions locales. Enfin, il a été montré qu’une structure de population est un facteur de confusion pour l’interprétation des résultats d’analyse de variants rares. Avec le recrutement de témoins pour les analyses, avec des projets tels que French Exome et VACARME, il est alors nécessaire de comprendre l’impact d’une structure à fine échelle géographique (e.g. échelle de la France) pour les différentes stratégies statistiques. La seconde partie de cette thèse consiste à évaluer cet impact au moyen de simulations de données génétiques pour des structures géographiques locales
Genome-wide association studies have identified many common risk alleles for a wide variety of complex diseases. However these common variants explain a very small part of the heritability. A hypothesis is the presence of rare genetic variants with stronger effects. Testing the association of those rare variants is challenging due to their low frequency in populations. Many statistical methods have been developed with the strategy to aggregate the information for a group a rare variants. This thesis aims to compare the main strategies through simulating under various genetic scenarios and the application to real sequencing data. We also developed a statistical test, called DoEstRare, which can detect clustered disease-risk variants in local genetic regions, by comparing the position distributions between cases and controls. Moreover, it has been shown that population stratification represents a confounding factor in the analysis interpretations for rare variants. With the recruitment of controls, in the context of projects such as French Exome and VACARME, it is necessary to assess the impact of a very fine geographical structure (France) for different statistical strategies. The second part of this thesis consists in estimating this impact by simulating fine-scale population structures

La Polyarthrite Rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune inflammatoire complexe qui touche près de 0,3% de la population française. A ce jour, malgré l'identification d'un facteur génétique majeur (HLA-DRB1), et d'une centaine de facteurs de susceptibilité d'effet faible à modéré (majoritairement identifiés par des études d'associations pangénomiques - GWAS), on ne peut expliquer au plus que 50% de la composante génétique de la maladie. Les GWAS se focalisant sur les variants fréquents (fréquence de l'allèle mineure (MAF) ≥ 1%) et considérant l'effet de ces variants comme indépendants, nous avons cherché dans ces travaux à identifier de nouveaux facteurs génétiques de la PR via l'analyse de variants rares (variants d'un seul nucléotide (SNVs) ou petites insertions et délétions (InDels)) pour lesquels peu d'études sont référencées dans la littérature. Nous avons ensuite étudié les interactions gène/gène (GxG) dans des voies biologiques enrichies par les variants rares identifiés.Pour cela, nous avons travaillé sur deux jeux de données obtenus par séquençage d'exomes. Dans le premier échantillon (data1), nous avons cherché à évaluer la contribution des variants rares dans 1080 gènes candidats séquencés chez 240 cas et 240 témoins français. Dans le second échantillon (data2), notre objectif était d'identifier de nouveaux facteurs génétiques par l'analyse de variants rares chez 30 individus (dont 19 atteints) appartenant à 9 familles françaises à cas multiples de PR. Nous avons mis en place un workflow afin de réaliser toutes les étapes de traitement des séquences obtenues jusqu'à l'identification des variants (alignement des lectures sur la séquence de référence du génome humain GRCh37, nettoyage de l'alignement, identification des variants (SNV et Indels) et filtre qualité des variants identifiés).Avec data1, nous avons répliqué l'association entre la PR et le gène BTNL2 (p-value = 3,0E-6) et identifié trois nouveaux gènes à risque (p-value ≤ 4,0E-3), impliqués dans la différentiation et l'activation des cellules du système immunitaire, en combinant les multiples variants de fréquences faibles à modérées identifiés dans ces gènes (analyses d'association de type burden). Dans data2, nous avons effectué une étude d'association-liaison, par laquelle nous avons identifié 3 gènes - SUSD5, MNS1 et SMYD5 - présentant une agrégation de variants (rares et fréquents) associée à la PR (p-value < 0,04 après 10E6 permutations), et un gène nommé SUPT20H dont le signal d'association était porté par un seul variant rare à pénétrance complète dans une famille et sans phénocopie. Nous avons aussi mis en évidence, via une étude d'enrichissement, une agrégation de variants rares dans plusieurs voies biologiques dont l'adhésion focale. Dans cette voie, nous avons identifié 9 interactions candidates pour lesquelles plusieurs combinaisons génotypiques semblent conférer un risque supplémentaire de développer la PR (p-value ≤ 5,0E-5)
Rheumatoid arthritis (RA) is a complex inflammatory autoimmune disease affecting about 0.3% of French population. Today, despite the identification of a major genetic factor (HLA-DRB1), and more than one hundred susceptibility factors with low to moderate effect (mainly identified by Genome-Wide association studies - GWAS), we cannot explain more than 50% of RA genetic component. Knowing that GWAS only study frequent variants (minor allele frequency (MAF) ≥ 1%) and consider that all of them are independent, we tried to identify new RA genetic factors by focusing on rare variants (single nucleotide variants (SNVs) or small insertions and deletions (InDels)) for which, to date, only few studies has been conducted. In addition, we studied gene/gene interactions (GxG) in biological pathways enriched for rare susceptible variants.To this end, we worked on two datasets obtained by exome sequencing. With the first dataset (data1), we wanted to evaluate the contribution of rare variants to RA risk into 1080 candidate genes sequenced in 240 cases et 240 controls from French population. With the second dataset (data2), our aim was to identify new genetic factors by focusing on rare variants selected from 30 individuals (including 19 affected) belonging to 9 French multiplex families. We set up in the laboratory a workflow to process the produced sequences up to the identification of variants (read alignment on human reference genome GRCh37, alignment refinement, variant identification (SNV et Indels) and quality filters).In data1, we replicated the association between RA and BTNL2 gene (p-value = 3,0E-6) and identified 3 new RA risk genes (p-value ≤ 4,0E-3), involved in the differentiation and activation of immune system cells, by combining rare to low frequency variants (burden association analysis). In data2, with a linkage – association study, we identified 3 genes - SUSD5, MNS1 and SMYD5 – presenting an aggregation of rare and frequent variants associated with RA (p-value < 0.04 with 10E6 permutations), and another gene SUPT20H in which we identified one rare variant with complete penetrance in one of the family and without phenocopy. Finally, we identified, by enrichment analysis, several biological pathways presenting an aggregation of rare variants. In one of them (focal adhesion), we extracted 9 candidate GxG interactions for which multiple genotype combinations seem to increase RA risk (p-value ≤ 5,0E-5)

L'expression des gènes est le résultat de nombreuses interactions. De la régulation de la transcription par les promoters et les enhancers à de nombreuses formes de régulations post-transcriptionelles, chaque région régulatrice étant soumise à des pressions sélectives différentes. Dans ce contexte, l’étude de l’évolution des différentes régions régulatrices au sein des populations humaines, ainsi que l’évaluation de leurs contributions respectives à la variabilité de l’expression génique sont essentielles à la compréhension de la variabilité phénotypique humaine. Ce manuscrit se propose donc d’étudier la contribution de la variabilité génétique à la régulation de l’expression génique sous deux angles différents. Je me suis penché sur les conséquences de l'introgression néandertalienne sur la diversité au sein des régions régulatrices dans les populations eurasiennes. Pour cela, j’ai déterminé non seulement quelles sont les régions régulatrices dont la diversité provient de l'introgression néandertalienne de manière disproportionnée, mais j’ai également d'identifié si la source du probable évènement de sélection associé. Je me suis aussi intéressé plus précisément au fonctionnement d'un type de régulation particulier, la régulation par les miARN. En utilisant les résultats de séquençage des petits ARN dans les monocytes, immuno-stimulés ou non, de 100 individus d'ascendance européenne et 100 individus d'ascendance africaine, j'ai pu étudier à la fois la diversité de l'expression des miARN au sein de ces individus, mais également comment ceux-ci participent à la régulation de l'expression des gènes dans un contexte immunitaire
Gene expression is the result of numerous interactions, from transcription regulation by promoters and enhancers, to several forms of post-transcriptionnal regulation. But each regulatory region is under different selective constraint. In this context, the study of the evolution of regulatory regions in human populations and their relative contribution to the variability of gene expression are vital to the understanding of the human phenotypic diversity. This thesis studies the contribution of the genetic diversity to gene regulation following to different path of investigations. I investigated the consequences of the Neanderthal introgression on diversity of regulatory regions in Eurasians populations. I identified which are the regulatory regions that which diversity is unexpectedly influenced by Neanderthal introgressed mutations, and also identified the sources of the associated selection event. I also focused on the specific case of the regulation by miRNA. Using small RNA sequencing in monocytes, either resting or immune-stimulated, of 100 individual of European ancestry and 100 individuals of African ancestry. I studied the diversity of miRNA expression within this cohort, but also how miRNA participate to the regulation of genes in an immune context

Le syndrome de Joubert (JBTS) est une maladie neurodéveloppementale rare, caractérisée par un retard de développement, des troubles moteurs et un retard mental, avec une malformation du cerveau appelée "signe de la dent molaire" visible à l'IRM. Le cervelet est l'organe principalement affecté dans cette maladie autosomique récessive, qui est génétiquement et cliniquement hétérogène, impliquant plus de 40 gènes causaux, codant pour des protéines liées aux cils. Les cils, sont des organites sensoriels essentiels au développement et à l'homéostasie. Cependant, les mécanismes reliant le dysfonctionnement des cils aux défauts neurodéveloppementaux du JBTS restent largement inconnus.Le premier objectif de ma thèse était de modéliser le JBTS et d'étudier l'impact du dysfonctionnement des gènes ciliaires sur le développement cérébelleux humain en utilisant des organoïdes. J'ai utilisé trois lignées hiPSC portant des mutations dans le gène RPGRIP1L, codant pour une protéine cruciale pour la formation de cils fonctionnels. Une lignée était dérivée d'un patient JBTS sévère, tandis que les deux autres étaient des RPGRIP1L-KO générées par CRISPR-Cas9. En améliorant un protocole publié (Silva et al., 2020), j'ai généré des organoïdes cérébelleux contrôles isogéniques qui expriment les marqueurs des principaux types cellulaires du cervelet : les progéniteurs des granules et les cellules de Purkinje.Ce modèle a révélé des défauts sévères et précoces dans les organoïdes dérivés du patient JBTS et des cellules RPGRIP1L-KO. J'ai montré que RPGRIP1L est différentiellement requis pour la formation des cils dans les progéniteurs non polarisés, mais pas dans les progéniteurs apicaux polarisés. De plus, les organoïdes RPGRIP1L-KO et JBTS étaient plus grands avec une organisation différente ainsi qu'une expansion des progéniteurs apicaux précoces par rapport aux témoins WT. Des analyses transcriptomiques à différents stades de différenciation des organoïdes ont identifié la signalisation FGF comme la voie la plus perturbée, l'expression de nombreux ligands FGF et de leurs cibles étant fortement augmentée dans les organoïdes JBTS et RPGRIP1L-KO entre les jours 14 et 21. La transcription des facteurs SOX et HES, essentiels au maintien d'un état de progéniteur neuronal, était aussi accrue tandis que les gènes neurogéniques et les gènes de maturation neuronale étaient moins exprimés aux stades tardifs (jour 28-35). Les marqueurs de la spécification et de la différenciation des cellules de Purkinje étaient également réduits dans les conditions de perte de fonction de RPGRIP1L. Le rétablissement d'une signalisation FGF normale dans les organoïdes RPGRIP1L-KO, via un inhibiteur chimique, restaure la neurogenèse et la taille des organoïdes.Ce travail a donc mis en évidence, pour la première fois dans un modèle humain de JBTS, une hyperactivation précoce de la signalisation FGF conduisant à un retard de maturation neuronale, pouvant expliquer certaines caractéristiques neurologiques observées chez les patients.Le deuxième objectif de ma thèse était d'établir un modèle pour évaluer la pathogénicité des variants génétiques associés au JBTS. En utilisant une lignée de poisson zèbre mutante pour le gène rpgrip1l, présentant des phénotypes embryonnaires pénétrants, j'ai démontré que l'injection de l'ARN WT RPGRIP1L humain dans des œufs mutants conduit à la localisation correcte de la protéine humaine à la zone de transition ciliaire et au sauvetage des phénotypes embryonnaires, contrairement à l'injection d'ARN codant des variants pathogéniques. Ces résultats ont validé les tests de sauvetage chez le poisson zèbre en tant qu'outil pour déterminer la pathogénicité de nombreux variants humains classés comme "variants de signification inconnue" (VUS)
Joubert syndrome (JBTS) is a rare neurodevelopmental disease characterized by developmental delay, motor disability, and mental retardation, with patients exhibiting a distinctive mid-hindbrain malformation known as the "molar tooth sign" on brain MRI. The cerebellum is primarily affected in this autosomal recessive disorder, which is genetically and clinically diverse, involving over 40 causal genes encoding cilia-related proteins. Cilia are sensory organelles present on most cell types, essential for development and homeostasis, but the mechanisms linking cilia dysfunction to JBTS neurodevelopmental defects remain largely unknown.The first aim of my thesis was to model JBTS and investigate the impact of ciliary gene dysfunction on human cerebellar development using an organoid-based approach. I used three hiPSC lines with mutations in the JBTS causal gene RPGRIP1L, encoding a scaffold protein crucial for building functional cilia. One line was derived from a severe JBTS patient, while the other two were RPGRIP1L KOs generated via CRISPR-Cas9. By implementing a published protocol (Silva et al., 2020), I generated WT organoids that recapitulated the early cerebellar development, with a mid-hindbrain boundary signature at day 7, and a further maturation towards Granule Cell Progenitor and Purkinje Cell identities.This model revealed severe, early defects shared by JBTS patient and RPGRIP1L-KO organoids. I showed that RPGRIP1L is differentially required for cilia formation in neural organoids, with its loss causing significant ciliary defects in non-polarized progenitors, but not in polarized apical progenitors. RPGRIP1L KO and JBTS patient-derived organoids were larger and differently organized, with an expansion of early apical progenitors compared to WT controls. Bulk RNAseq analyses at various stages along the differentiation protocol identified FGF signaling as the most disrupted pathway, with many FGF ligands and downstream targets significantly upregulated in RPGRIP1L-KO and JBTS patient-derived organoids from day 14 to 21. Associated with prolonged and higher FGF signaling, neural progenitor markers (SOX and HES transcription factors) were upregulated, while neurogenic genes were strongly downregulated. Gene ontology analysis at later stages (day 21-35) corroborates these findings showing impaired neuronal differentiation, axon development and synapses formation in JBTS patient and RPGRIP1L KO organoids. Notably, markers of Purkinje Cell specification and differentiation were also downregulated in both RPGRIP1L-deficient conditions. Restoring normal FGF signaling in RPGRIP1L-KO organoids using drug treatment rescued neurogenesis and organoid size. One underlying cause of FGF hyperactivation might be the reduction by half of the GLI3 repressor amount in RPGRIP1L deficient organoids.This work highlighted, for the first time in a JBTS human model, early FGF signaling deregulation that may account for some neurological features observed in patients.The second aim of my thesis was to establish a model to assess gene variant pathogenicity and better understand genotype-phenotype correlations in JBTS. Using a zebrafish rpgrip1l mutant line with penetrant embryonic phenotypes, I demonstrated that after injecting human RPGRIP1L WT RNA into mutant eggs, the protein correctly localized at the zebrafish ciliary transition zone and rescued the mutant phenotype. Further, injecting RNA encoding various known JBTS variants showed a good correlation between variant pathogenicity and its ability to restore a normal phenotype in the zebrafish assays. These results validated zebrafish rescue assays as a valuable tool for determining the pathogenicity of numerous human variants currently classified as "variants of unknown significance" (VUS)

L'objectif de mon travail fut de valider et d'optimiser la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour l'identification et la classification d'un ensemble de bactéries pathogènes ou opportunistes chez l'homme, en enrichissant une base de données et en testant la robustesse de la méthode, afin d'obtenir une méthode rapide fixe et fiable d'acquisition de résultats. Les différents résultats obtenus ont permis la validation de la technique comme outil d'identification bactérienne fiable en routine. Elle permet désormais de caractériser les mélanges de deux bactéries voir même la différentiation d'espèces très proches comme les Shigella spp et E. coli. Nous avons montré que la technique sera encore améliorée par un outil supplémentaire de comparaison des souches pour une veille épidémiologique "en temps réel", sans investissement supplémentaire, en permettant plusieurs types d'économie. Elle apporte un gain réel dans la prise en charge du patient et le choix éclairé des antibiotiques testés pour l'antibiogramme. La technique peut aussi constituer un outil alternatif de sérotypage.

Le virus de l'immunodeficience humaine (hiv), agent etiologique du sida, est caracterise par une variabilite de sequence elevee. Bien que les lymphocytes t cd4#+ soient les principales cellules cibles du virus, les monocytes/macrophages sont egalement infectables et pourraient disseminer le virus dans l'organisme. Par ailleurs, des variants hiv-1 monocytotropes, n'induisant pas de syncytia in vitro (non-si), sont presents a tous les stades de l'infection, ce qui suggere un role dans la persistance virale. Nous avons compare la presence de hiv-1 dans les lymphocytes t, les monocytes et le plasma non cultives de 21 sujets infectes, en utilisant la technique d'amplification genique (pcr) avec quatre couples d'amorces differents. L'adn proviral a ete detecte dans 62% des echantillons monocytaires, principalement avec une seule paire d'amorces a l'inverse de ce qui a ete obtenu dans les lymphocytes t et les plasmas correspondants. Des experiences de semi-quantification ont revele le plus souvent une faible frequence de monocytes infectes. Une detection positive dans cette population cellulaire a ete correlee a un taux de cellules cd4#+<500/l chez le patients. Les variants hiv-1 vehicules par les lymphocytes t, les monocytes et le plasma, d'un sujet en stade sida, ont ete sequences dans la region v3 de l'enveloppe virale qui se trouve fortement impliquee dans la determination des proprietes biologiques du virus. Deux types de sequences ont ete identifiees dans les monocytes (43% des clones), mais non dans les lymphocytes t, et presentaient les determinants genetiques associes au phenotype si. L'emergence preferentielle de tels variants a ete observee apres culture in vitro du plasma, bien qu'en minorite dans ce compartiment sanguin in vivo. L'analyse biologique de l'isolat viral a confirme son monocytotropisme associe a un phenotype si, suggerant qu'aux stades tardifs de l'infection les monocytes circulants pourraient constituer un reservoir de variants hiv-1 aux proprietes cytopathiques

L'actine est une protéine qui s'assemble en réseaux dynamiques essentiels à de nombreux processus physiologiques. Des mutations ponctuelles dans les gènes codant pour l'actine cytoplasmique humaine causent des maladies rares appelées Actinopathies Non Musculaires (ANM). Les ANM provoquent un large éventail de symptômes allant de légers à graves. À ce jour, aucune corrélation définitive entre le génotype des ANM et le phénotype observé n'a été établie. De plus, les mécanismes fonctionnels de ces variants restent vagues. Pour combler cette lacune, nous avons utilisé Caenorhabditis elegans pour évaluer les conséquences de neuf variants d'actine identifiés chez l'Homme que nous avons reproduits dans un gène codant pour l'actine de C. elegans. Nous avons observé une diversité de perturbations variant-spécifiques à différentes échelles. La gravité des variants Humains correspond bien à celle des variants reproduits chez C. elegans, et laisse entrevoir leurs mécanismes physiopathologiques
Actin is a protein that self-assembles into dynamic networks essential for physiological processes. Punctual mutations in the human cytoplasmic actin coding genes ACTB and ACTG1 lead to disorders termed Non-Muscle Actinopathies (NMA). NMAs cause a broad spectrum of symptoms ranging from mild to severe. To date, a definitive genotype-to-phenotype correlation within the NMA field has yet to emerge, and the functional mechanisms underlying symptoms in patients remain elusive. To fill this gap, we used Caenorhabditis elegans. Using various techniques, we assessed the multiscale consequences of nine actin variants identified in NMA patients that we reproduced in a C. elegans’ actin coding gene. We observed a diversity of variant-specific perturbations at different scales. Overall, the severity of Human variants correlates well with that of C. elegans variants and hints at their pathophysiological mechanisms

La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, connaît actuellement une résurgence inquiétante, et l’OMS estime à plus de 10 millions le nombre de nouveaux cas cliniques en 2015 avec environ 1,8 millions de décès dus à la maladie. Environ un tiers de la population mondiale est exposée à M.tuberculosis, et après exposition, la plupart des individus sont infectés par la mycobactérie. La grande majorité (~90%) des individus infectés ne présentera jamais de symptomatologie clinique. Parmi les 10% qui développent la maladie, environ la moitié le fera dans les deux années suivant l’infection, ce qui est en général considéré comme une forme primaire de tuberculose. Les autres patients présenteront leur maladie à distance de l’infection primaire (parfois plusieurs dizaines d’années plus tard) ; il s’agit des formes pulmonaires classiques de l’adulte. Chez l’homme, le rôle de certains facteurs génétiques a été maintenant démontré dans le développement d’une tuberculose active, à la fois la tuberculose pulmonaire de l’adulte et les formes plus disséminées de l’enfant, et aussi dans le contrôle de l’infection tuberculeuse. Cependant, la plus grande part de ces facteurs génétiques reste à identifier. Le premier objectif de ma thèse était d'identifier les facteurs génétiques de l'hôte modulant les phénotypes immunologiques de production d'Interféron gamma in vitro (IGRA) après exposition à M. tuberculosis dans un échantillon de 590 individus ayant été en contact avec un cas avéré de tuberculose dans le Val de Marne, en région parisienne. Puis, dans un second temps, de voir si les facteurs trouvés pouvaient être répliquées dans un échantillon familial d'Afrique du Sud, zone de très forte endémie tuberculeuse. Pour cela, j'ai tout d'abord réalisé des analyses de liaison génétique à l'échelle du génome entier sur plusieurs phénotypes quantitatifs d'IGRA. Celles-ci ont permis de mettre en évidence 2 loci majeurs (p < 10-4) répliqués en Afrique du Sud et liés à la production d'interféron gamma induite pour l’un par le bacille du BCG, et pour l’autre, par la part spécifique de l'antigène ESAT6 de M. tuberculosis (absent de la plupart des mycobactéries environnementales et du BCG), indépendamment de la capacité intrinsèque de réponse aux mycobactéries. La seconde étape a consisté en la réalisation d'une étude d'association sur les régions de liaison ainsi identifiées. Un variant associé au phénotype spécifique de l’ESAT6 (p < 10-5) a ainsi été trouvé, variant contribuant de manière significative au pic de liaison précédemment découvert (p<0.001) et ayant été rapporté comme modulant l’expression du gène ZXDC. Le second objectif de la thèse concernait l’identification de variants génétiques rares sous-jacents à la déclaration d’une tuberculose pulmonaire chez les individus infectés par le bacille. A cette fin, j’ai comparé les exomes de 120 patients tuberculeux à ceux de 136 individus infectés par le bacille mais non malades, tous originaires du Maroc. Cette étude m’a permis d’identifier le gène BTNL2, en bordure de la région HLA, dans lequel près de 10% des patients comportaient un variant rare perte de fonction contrairement aux contrôles qui n’en présentaient aucun
Tuberculosis remains a major public health concern, with approximately 10.4 million new cases and 1.8 million deaths due to the disease in 2015 according to WHO. While an estimated one third of the world population is estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis, only about 10% of infected individuals go on to develop a clinical disease. Among them, half will declare the disease in the 2 years following infection, which is generally considered as primary tuberculosis. The other patients will develop the disease more distant in time of primary infection, sometimes several tens of years latter; these are classical pulmonary forms in adults. In humans, the role of genetic factors have been demonstrated in the development of active tuberculosis, in pulmonary forms as in disseminated forms in childhood, et also in the control of M.tuberculosis infection. Nevertheless, most of these genetic factors remain to identify. The first aim of my PhD was to identify genetic factors controlling in vitro interferon-gamma production phenotypes (IGRA) after exposure to M.tuberculosis in a sample of 590 subjects who were in contact with a proven tuberculous patient in Val-de-Marne, Paris suburbs, and in a second time, to try to replicate the findings in a south African familial sample where the tuberculosis is highly endemic. For this purpose, I first performed genome-wide genetic linkage analysis for several quantitative IGRA phenotypes. They led to identify 2 major loci (p<10-4) replicated in South-Africa and linked to the interferon-gamma production induced by live BCG for the first one, and for the second one, by the specific part of the ESAT6 antigen of M.tuberculosis (absent from most of environmental mycobacteria and from BCG), independently of intrinsic ability to respond to mycobacteria. The second step was an association study in the identified linkage regions. A variant associated to the specific ESAT6 phenotype was found (p<10-5), which was significantly contributing to the linkage peak (p<0.001) and previously reported as eQTL of ZXDC gene. The second objective of my PhD was the identification of rare genetic variants underlying the development of pulmonary tuberculosis in infected individuals. To this end, I compared exome data from 120 tuberculous patients and 136 infected individuals without any clinical symptoms. All of them were from Morocco. This study resulted in the lighting of BTNL2 gene, very closed to the HLA region, in which around 10% of patients had a rare loss of function variant whereas the controls didn’t have any

La FSH est une hormone qui joue un rôle central dans la fonction de reproduction. De ce fait, elle est utilisée en assistance médicale à la procréation (AMP) afin de recruter un pool de follicules et de l’amener jusqu'à l'ovulation. La FSH agit sur un récepteur spécifique (RFSH) qui active des voies de signalisation par l'intermédiaire des protéines G et des β-arrestines. L'étude in vitro d’un mutant et de variants du RFSH décrits chez l’homme nous a permis de mettre en évidence différents mécanismes conduisant à des biais de signalisation de ce récepteur. Ces altérations génétiques, en modifiant l'équilibre qui existe entre les différentes voies de signalisation activées par le RFSH, conduisent à des manifestations cliniques. En parallèle, nous avons mené une étude clinique sur le polymorphisme N680S du RFSH, qui nous a permis de confirmer et de prolonger les résultats de la littérature tout en corrélant les résultats obtenus in vitro à la signalisation des récepteurs N680 et S680. L’ensemble de nos résultats ouvre des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies en AMP
FSH is a hormone which is centrally involved in reproduction. For this reason, FSH is extensively used in in vitro fertilization (IVF) to recruit and lead a pool of follicle to ovulation. FSH acts on its cognate receptor (FSHR) which activates signaling pathways through the canonical G-protein pathways as well as through β-arrestin-dependent transduction mechanisms. In vitro studies of a mutant and of variants of the FSHR identified in patients allowed us to highlight different mechanisms leading to bias in the signaling pathways triggered by this receptor. These genetic alterations, by modifying the equilibrium that exists between the different signaling pathways activated by the FSHR, lead to clinical consequences. In parallel, we have carried out a clinical study centered on the N680S polymorphism of the FSHR. Our results confirm and extend previous studies from the literature while correlating the results we obtained in vitro with the functional consequences of the N680S polymorphism of the FSHR. Together, our results open new avenues for developing new strategies in IVF

Des variants du gène FLNC ont été impliqués dans le développement de cardiomyopathies (CM), toutefois les mécanismes de physiopathologie ne sont pas entièrement élucidés. Ce travail a comporté la caractérisation génétique d’une cohorte clinique puis le développement d’un modèle cellulaire et d’un modèle Drosophile pour confirmer la pathogénicité de variants faux sens et d’évaluer les conséquences fonctionnelles des mutants FLNC. L’étude de 1150 patients atteints de CM a permis d’établir la prévalence du gène FLNC entre 1 et 8 %. De plus, les variants tronquants ont été associés préférentiellement à des CM dilatées (CMD) avec un risque rythmique accru et les variants faux sens (régionalisés dans le ROD2 de la protéine) à des CM hypertrophiques (CMH). Chez la drosophile, la perte de fonction de l’orthologue du gène FLNC (ARN interférence) a montré une dilatation cardiaque et une diminution de la fraction d’éjection chez l’adulte, associées à une désorganisation des sarcomères et du réseau d’actine. Les 3 variants faux sens sélectionnés, identifiés dans des CMH, et introduits par CRISPR/Cas9 dans des Drosophiles n’ont pas montré d’effet fonctionnel ou histologique significatif. L’étude de lignées produisant une protéine tronquée a permis d’établir que le domaine C-terminal de la filamine n’était pas requis pour la fonction cardiaque chez la Drosophile. Un clone hiPSC édité par CRISPR/Cas9 portant une délétion homozygote du site d’épissage de l’exon 42 qui aboutit à un saut en phase de l’exon a été différencié en cardiomyocytes. Les cardiomyocytes amplifiés ont permis de former des pseudo-tissus cardiaques battant dont l’analyse a montré une modification du phénotype rythmique qui correspondrait à un phénotype de CMD. En conclusion, ce travail a permis de montrer l’importance du gène FLNC dans le développement des CM et de développer 2 nouveaux modèles pour étudier les mécanismes de pathogénicité et développer des thérapeutiques ciblées
Variants of FLNC gene have been implicated in the development of cardiomyopathies (CM), however the pathophysiological mechanisms are not fully understood. This work involved the genetic characterization of a clinical cohort and then the development of a cell model and a Drosophila model to confirm the pathogenicity of missense variants and to assess the functional consequences of FLNC mutants. The study of 1150 patients with CM found the prevalence of FLNC gene to be between 1 and 8%. In addition, the truncating variants were preferentially associated with dilated CMs (DCM) with an increased rhythmic risk, and the missense variants (regionalized in the ROD2 of the protein) with hypertrophic CMs (MHC). In Drosophila, loss of function of the ortholog of FLNC gene (RNA interference) showed cardiac dilation and a decrease of the fractionnal shortening in adults, associated with disorganization of the sarcomeres and the actin network. The 3 selected missense variants, identified in MHCs, and introduced by CRISPR / Cas9 in Drosophila did not show any significant functional or histological effect. Study of lines producting a truncated protein revealed that the C-terminal domain of filamine was not required for heart function in Drosophila. A CRISPR / Cas9 edited hiPSC clone carrying a homozygous deletion of the exon 42 splice site that results in exon phase skiping was differentiated into cardiomyocytes. The amplified cardiomyocytes formed beating cardiac pseudo-tissues, and their analysis showed a change in rhythmic phenotype corresponding to DCM patients pattern. In conclusion, this work made it possible to show the importance of the FLNC gene in the development of CM and to develop 2 new complementary models to study the mechanisms of pathogenicity and develop targeted therapies

Les variants minoritaires résistants (VMR) du VIH-1 aux antirétroviraux n'ont pas été étudiés en Thaïlande. Deux groupes de patients dont le génotypage conventionnel n'a pas montré de mutations associées à la résistance ont été inclus dans l'étude: 104 patients récemment infectés, naïfs de traitement antirétro viral et 22 patients en échec de traitement de première ligne par les inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse. Les résultats de pyroséquençage ont montré que la prévalence des variants minoritaires Y181C et M184V dans les 2 groupes est faible en Thaïlande. Le rôle des VMR N155H dans la sélection des profils de résistance au raltégravir (RAL) ont été évalué chez des patients multitraités en échec au RAL. Une PCR allèle spécifique (AS-PCR) a été utilisée pour détecter les mutants N155H. La sélection précoce de cette mutation à des niveaux variés n'influence pas la maintenance de cette mutation pendant l'échec en comparaison avec le passage au double mutant Q148H+Q140S, suggérant que ce mutant N155H n'aurait pas de rôle dans la détermination de profils de résistance. La barrière génétique pour l'évolution de la résistance aux inhibiteurs d'intégrase (INIs) a été comparée entre le sous-type B et CRF01-AE du VIH-1 par l'analyse des 66 mutations associées à la résistance aux INIs dans 144 séquences d'intégrase (109 VIH-1 sous-type CRF01-AE et 35 VIH-1 sous-type B) chez des patients naïfs aux INIs. La plupart des positions d'acides aminés étudiées montrent un haut niveau de conservation, ce qui indique la même barrière génétique entre les sous-types CRF01-AE et B
Minority HIV-1 drug resistance bas not been studied in Thailand. Two groups of patients, whose conventional genotyping results showed no drug resistance-associated mutations, were investigated: 104 homosexual men recently infected with HIV-1, naive to antiretroviral treatment and 22 first-line NNRTI-based failures. Pyrosequencing assay was developed to detect and quantify minority Y181C and M184V variants from the patients' plasma samples. 1/104 (0. 96%) and 3/101 (3%) samples were found harboring Y181C and M184V in the group of homosexual men. In patients with first-line treatment failure, one harbored minority Ml84V mutants (4. 5%). Thus, due to such a low prevalence, minority drug résistance test may not be cost-effective for implementing in Thailand. The mechanism of raltegravir (RAL)-resistant evolutions has not been completely elucidated. Because of the emergence of RAL résistance usually initiated with the N155H mutant, we assessed the role of minority N155H-mutated variants in circulating RNA and archived DNA in 5 heavily treated patients experiencing RAL failure and harboring 3 different résistance profiles. No minority N155H-mutated variant was found by allele specific PCR (AS-PCR) in both plasma and whole blood samples collected at baseline and after RAL withdrawal in ail 5 patients. During RAL failure, the mutation N155H was detected at different levels in 3 patients displaying the N155H pathway and gradually declined when the double mutant Q148H+G140S was selected in one patient. In two patients with the Q148H résistance pathway, no N155H variant was identified by AS-PCR in both viral RNA and DNA. The N155H mutants might not play a role in determining different résistance profiles. The genetic barrier, defined by the accumulative number of drug-associated mutations required for the virus to escape drug-selective pressure, is a crucial factor in the development of drug résistance. There are limited data on subtype CRJF01_AE, a predominant isolate in Southeast Asia. The genetic barrier for the evolution of integrase inhibitors (INIs) including RAL, elvitegravir (EVG), and dolutegravir (DTG) résistance was compared between HIV-1 subtypes B and CRF01_AE by analyzing of 66 substitutions associated with INI résistance at 41 amino acid positions in 144 nucleotide sequences (109 HIV-1 subtype CRF01_AE and 35 HIV-1 subtype B) of IN gene derived from INI-naïve patients. Most studied amino acid positions including ail corresponding to RAL and EVG primary mutations show a high degree of conservation, indicating the same genetic barrier between subtypes CRF01_AE and B. Nevertheless, different genetic barriers were observed in two mutations described to be associated with DTG résistance (L101I, A124T) and other five RAL and EVG secondary mutations (V72I, T125K, G140C/S, V201I), which could have an impact on the development of résistance to RAL, EVG, and DTG

L’avènement du séquençage haut débit permet actuellement d’étudier et d’analyser la part de lacomposante génétique des maladies complexes médiée par les variants rares. Cependant, leurinterprétation représente un défi majeur. En effet, le séquençage de milliers d’exomes et degénomes a révélé la complexité du polymorphisme humain et notamment la surreprésentation devariants rares. Et malgré le développement de logiciels d’analyse ainsi que de différentes bases dedonnées, la priorisation des variants rares reste difficile. Dans le cadre de cette thèse, nous avons focalisé nos analyses sur les variations génétiques rares impliquées dans la maladie d’Alzheimer (MA). D’un point de vue génétique, la MA répond dans une majorité des cas à un déterminisme multifactoriel mais une minorité des cas sont des formes précoces à transmission autosomique dominante. La caractérisation des gènes PSEN1, PSEN2 et APP responsables des formes mendéliennes de MA a permis de formuler l’hypothèse de la cascade amyloïde en plaçant le peptide amyloïde (Aβ) au centre du processus physiopathologique. Afin de détecter de nouveaux facteurs de risque génétique dans la survenue de la MA, nous avons réalisé une étude d’association à partir de données de séquençage d’exomes de 522 cas atteints de formes précoces de MA et 584 contrôles. Les premières analyses ont porté sur les variants mononucléotidiques ainsi que les courtes insertions/délétions et ont permis de mettre en évidence un enrichissement en variants rares prédits délétères dans le gène ABCA7 chez les individus malades. Notre attention s’est ensuite portée sur les variations du nombre de copies (CNVs). L’absence de récurrence à l’échelle d’un gène nous a amené à travailler sur une liste de gènes. En nous focalisant sur l’hypothèse amyloïdergique, nous avons construit une liste de 342 gènes impliqués dans le métabolisme et la toxicité du peptide Aβ. Grâce à cette stratégie, nous avons ainsi réussi à mettre en évidence un enrichissement de CNVs rares intersectant ce réseau centré sur le peptide Aβ. Le résultat majeur de cette étude de CNVs a été la mise en évidence d’une duplication du locus 17q21.31 chez 5 patients atteints d’une maladie neurodégénérative similaire à une maladie d’Alzheimer. Les patients porteurs présentent un diagnostic clinique de MA, des biomarqueurs et une imagerie métabolique en faveur d’une neurodégénérescence de type Alzheimer. En revanche, l’imagerie amyloïde et l’analyse neuropathologique n’ont pas révélé de pathologie amyloïde et sont donc en faveur d’une tauopathie pure. L’étude des CNVs a également révélé une délétion partielle du gène PSEN1, emportant les exons 9 et 10, pour laquelle nous avons pu réaliser des études fonctionnelles. Nous avons ainsi pu déterminer que la protéine mutante favorisait la production de peptides amyloïdes plus longs, ces derniers étant des médiateurs majeurs de la neurotoxicité d’Aβ
Next-generation sequencing allows studying and analyzing the genetic component part of complexdiseases mediated by rare variants. However, their interpretation represents a major challenge.Indeed, the sequencing of thousands of exomes and genomes revealed the human polymorphismcomplexity and in particular the overrepresentation of rare variants. Despite the development ofsoftwares and variant databases, the prioritization of rare variants remains arduous. My thesis subject was focused on the involvement of rare variants in Alzheimer's disease (AD). From a genetic point of view, AD is caused, in most cases, by a multifactorial determinism, but a minority of cases are autosomal dominant early-onset forms (ADEOAD). The characterization of mutations in the PSEN1, PSEN2 and APP genes as a cause of these Mendelian forms of AD led to the formulationof the amyloid cascade hypothesis, stating that the amyloid-β peptide (Aβ) is triggering the pathophysiological process. In order to detect new genetic risk factors involved in AD, we performed an association study using exome sequencing data from 522 cases with early-onset Alzheimer Disease and 584 controls. The first analyzes focused on single nucleotide variants and short insertions / deletions, and revealed an enrichment in cases of variants that are predicted to be deleterious in the ABCA7 genes. We then then focused on copy number variations (CNVs). The lack of recurrence at the gene-level incited us to work on a gene list. By focusing on the amyloidogenic hypothesis, we built a list of 342 genes involved in the metabolism and toxicity of the Aβ peptide. Thanks to this strategy, we found an enrichment of rare CNVs intersecting this Aβ network in cases.The main result of this CNV study was the identification of a duplication of the 17q21.31 locus in 5patients with a neurodegenerative disease similar to Alzheimer's disease. These patients have aclinical diagnosis of AD, as well as biomarkers and metabolic imaging consistent with an ADneurodegeneration. However, amyloid imaging and neuropathological analysis did not reveal anyamyloid pathology, and were therefore pointing to a pure tauopathy. This CNV study also revealed a partial deletion of the PSEN1 gene, overlapping exons 9 and 10, for which we performed functional studies. We demonstrated that the mutant protein enhanced the production of longer amyloid peptides, the latter being major mediators of Aβ neurotoxicity

La maladie alcoolique du foie (MAF) et l’hépatite C chronique (HCC) sont les causes les plus fréquentes de cirrhose, carcinome hépatocellulaire (CHC) et transplantation hépatique dans les pays industrialisés. La fibrose hépatique est le stigmate lésionnel de la progression de la maladie vers la cirrhose comme dans toutes les hépatopathies chroniques. Certains facteurs de risque cliniques environnementaux ont été identifiés. Toutefois, ils n’expliquent pas l’extrême variabilité individuelle de la progression de la fibrose. L’influence ethnique à développer une maladie plus sévère ainsi que les études de concordance des jumeaux mono- et di-zygotiques sur la prévalence de la cirrhose alcoolique ont suggéré l’existence de facteurs génétiques associés. Les nombreuses études de gènes candidats réalisées n’ont identifié que très peu de variants associés de manière reproductible. Pour l’HCC par exemple, le score de risque de cirrhose ou « CRS » a montré sa capacité à prédire une fibrose avancée dans diverses cohortes caucasiennes. Récemment, une étude d’association pangénomique (GWAS) dans la stéatohépatopathie non-alcoolique (NAFLD) a mis en évidence un singleton (single nucleotide polymorphism [SNP]) particulier (rs738409 C>G) dans le gène PNPLA3. Ce dernier s’est révélé être, dans diverses études, le SNP ayant l’impact le plus robuste et le plus reproductible dans cette maladie. Par ailleurs, ce même variant a également été significativement associé à la cirrhose alcoolique chez les hispaniques.

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont permis de montrer que :

1) Le CRS avait la capacité de prédire la progression de la fibrose chez des patients caucasiens ayant une HCC dans 2 cohortes européennes indépendantes.

2) Par ailleurs, dans la MAF, nous avons répliqué chez des patients caucasiens l’association entre le SNP rs738409 dans le gène PNPLA3 et la cirrhose. Nous avons également montré pour la première fois, que l’expression de PNPLA3 était significativement diminuée chez les patients avec une fibrose plus avancée. De plus, nous avons observé dans 2 cohortes européennes que rs738409 était également associé à la prévalence du CHC.

3) Enfin, nous avons également mis en évidence l’impact de ce même SNP sur la stéatose hépatique et la fibrose dans l’HCC sans toutefois qu’il influence la réponse à la thérapie antivirale dans 3 cohortes caucasiennes indépendantes.

Ainsi de manière remarquable, un même SNP (rs738409) apparait associé à des lésions hépatiques sévères dans les trois pathologies hépatiques chroniques les plus fréquentes (la MAF, l’HCC et la NAFLD). Ceci suggère des voies pathogéniques communes de la fibrogénèse hépatique. Par ailleurs, ces travaux soulignent indirectement que les GWAS ont la capacité d’ouvrir de nouvelles voies physiopathologiques et d’identifier de nouveaux variants, gènes ou région génétiques capables de constituer de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques dans l’HCC et la MAF.
Doctorat en Sciences médicales
info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'arn u3, implique dans le controle de la biogenese des ribosomes, est code chez la souris par une petite famille multigenique, constituee de quatre genes fonctionnels codant pour la forme majeure u3b et d'un gene unique codant pour une forme variante u3a. Les deux formes d'arn u3a et u3b divergent assez substantiellement en sequence (environ 15%), gardent une structure secondaire tres analogue, (mais avec quelques differences selectivement maintenues chez les deux rongeurs etudies, le rat et la souris). Les deux types de genes sont exprimes differentiellement selon les conditions de croissance cellulaire. Les quatre genes u3b sont regroupes dans l'adn chromosomique mais ne s'organisent pas en repetition reguliere. Les homologies de sequence entre les quatre unites geniques u3b se limitent a une region relativement peu etendue dont le domaine central (contenant la region transcrite) reste parfaitement identique. La comparaison des segments de sequence homologues flanquant le domaine de sequence identique suggerent que des series de conversions geniques ont joue un role majeur dans l'evolution concertee de la famille multigenique. Le restant des regions intergeniques ne montre pas d'autre similarite mais revele l'accumulation de sequences repetitives (b1, b2 et l1) et la presence de motifs connus pour servir d'activateurs inductibles qui pourraient permettre des modulations differentes de l'expression de chacun des genes en reponse a des conditions de croissance cellulaire variees

La myopathie myofibrillaire est une maladie neuromusculaire à évolution lente caractérisée par de graves troubles musculaires causés par des mutations dans le gène codant pour des protéines du cytosquelette. L'un des gènes affectés en relation avec le développement de la MFM est DES. Des mutations dans le gène de la desmine entraînent des myopathies des muscles squelettiques et cardiaques. Cependant, les évènements qu'elles entraînent et qui sont à l’origine des phénotypes pathologiques cardiaques restent mal connus. Mon objectif est de créer un modèle in vitro de MFM basé sur des cellules souches pluripotentes humaines afin d'étudier le rôle des mutations spécifiques dans la desmine sur le développement et la fonction des cellules cardiaques. Pour atteindre cet objectif, en collaboration avec les docteurs A. Behin, K. Wahbi et la société Phenocell, nous avons généré des iPSC à partir des cellules sanguines périphériques de patients souffrant d'une forme de cardiomyopathie induite par une mutation de la desmine. Les lignées iPSC générées contenant les mutations du gène codant la desmine ont permis d’étudier le rôle d’une mutation dans la spécification et la fonction des cardiomyocytes. La bioénergétique mitochondriale, la structure cellulaire et la fonction contractiles ont été évaluées au niveau cellulaire. En conclusion, il convient de noter que les mutations de la desmine conduisent à une désorganisation des structures des sarcomères dans les cardiomyocytes et à une perturbation de l'expression des protéines mitochondriales. Ce qui conduit à une altération des fonctions de la mitochondrie. Ces données permettent d’améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaire qui sous-tendent le développement de la MFM
Myofibrillar Myopathy is a slowly progressive neuromuscular disease characterized by severe muscular disorders caused by mutations in the gene encoded cytoskeletal proteins. One of the genes described in connection with the development of MFM is DES. Mutations in the desmin gene lead to skeletal and cardiac muscles myopathies. However, the cardiac pathological consequences caused by them remain poorly understood. My objective is to create an in vitro human stem cell model of MFM to specifically investigate the role of patient-specific mutations in desmin on cardiac lineage development and function. To achieve that objective, in collaboration with Drs. Behin and K. Wahbi and Phenocell, we generate patient-specific iPSC from peripheral blood cells of the patient suffering severel form of desmin-deficient cardiomyopathy. The generated iPSC lines carrying DES gene mutations enable a powerful examination of the role of desmin mutation on cardiomyocyte specification and function. Bioenergetic, structural, and contractile function will be assessed in a single cell. In conclusion, it should be noted that desmin mutations lead to a disorganization of sarcomere structures in cardiomyocytes and to a perturbation of mitochondrial protein expression. This leads to a distortion of functions in the mitochondria. These data facilitate the understanding of the molecular pathway underlying the development of desmin-related myopathy. And the system we have created could also allow us to better evaluate the correlation between the desmin genotype and phenotype in terms of effect on the heart

Les malformations du cortex cérébral (MDC) représentent une cause importante de handicap et d'épilepsie pharmaco-résistante. Le séquençage à haut débit a permis une amélioration considérable de l'identification des bases moléculaires des MDC non syndromiques. Toutefois, certaines formes, notamment les MDC complexes, demeurent inexpliquées. Mon projet de thèse a pour objectif de progresser dans la compréhension des MDC complexes en utilisant deux modèles : les microlissencéphalies (MLIS) et le syndrome d'Aicardi (AIC), une forme syndromique particulière associant des malformations de l'oeil et du cerveau uniquement rapporté chez les filles. L'étude par séquençage d'exome en trios de 16 familles MLIS m'a permis d'identifier et de caractériser un nouveau gène, WDR81, impliqué dans le cycle cellulaire. Par la même stratégie, j'ai pu identifier un variant homozygote pathogène dans TLE1, un partenaire majeur de FOXG1 dans la balance prolifération/différenciation de progéniteurs neuronaux, dans une famille consanguine de microcéphalie postnatale dont le phénotype est proche du syndrome FOXG1. En parallèle, mes travaux ont permis de préciser les spectres phénotypiques associés à RTTN, EPG5, COL4A1, COL4A2, TBR1, KIF5C, KIF2A et FOXG1. La deuxième partie de mon projet avait pour objet l'identification des bases moléculaires du syndrome d'Aicardi à partir d'une cohorte internationale de 19 patientes. Après avoir exclu un biais d'inactivation du chromosome X et la présence de microremaniements chromosomiques, j'ai réalisé un séquençage d'exome en trio. Aucun variant récurrent n'a été retrouvé dans les séquences codantes. Dans un second temps, j'ai testé une approche combinant les données du séquençage de génome et l'analyse du transcriptome (RNA-Seq) sur fibroblastes, me permettant d'identifier des transcrits dérégulés qui étaient impliqués dans le développement du cerveau et de l'oeil. J'ai comparé les résultats de cette analyse avec ceux de l'analyse du génome dans le but d'identifier des variants dans ces gènes candidats. En conclusion, mon travail de thèse a permis d'améliorer la connaissance des bases moléculaires des MDC complexes et d'ouvrir des perspectives de nouveaux mécanismes tels que ceux engageant les gènes WDR81 et EPG5, et le rôle des endosomes et de l'autophagie dans les MDC, et aussi TLE1 comme nouvelle cause de microcéphalies postnatales. Mes travaux ont également permis de générer une collection de données de séquençage haut débit (WES, WGS et RNA-Seq) qui seront mises en commun dans le cadre d'un consortium international afin de développer des nouvelles stratégies d'analyse en particulier pour les séquences non codantes. Cette approche permettra également d'ouvrir la voie vers la compréhension des mécanismes cellulaires impliqués dans la formation du cerveau et de l' œil
Malformations of cortical development (MCD) are a major cause of intellectual disability and drug-resistant epilepsy. Next Generation Sequencing (NGS) has considerably improved the identification of the molecular basis of non-syndromic MCD. However, certain forms, including complex MCD, remain unexplained. My PhD project aimed to improve the understanding of complex MCD using two disorders: Microlissencephaly (MLIS) and Aicardi Syndrome (AIC), the latter associating brain and eye malformations and only reported in girls. Trio Whole Exome Sequencing (WES) performed in 16 MLIS families allowed me to identify and functionally characterize a new MLIS gene, WDR81, in which mutations lead to cell cycle alteration. Moreover, using the same strategy, I was able to identify a pathogenic homozygous variant in TLE1 in a patient from consanguineous family with a postnatal microcephaly, suggestive of a FOXG1-like presentation. Interestingly, TLE1 is a major partner of FOXG1, a gene involved in maintaining the balance between progenitor proliferation and differentiation. In parallel, my work allowed me to redefine the phenotypic spectrum associated with RTTN, EPG5, COL4A1 and COL4A2, TBR1, KIF5C, KIF2A and FOXG1. The second part of my PhD program was aimed at identifying the genetic basis of AIC in an international cohort of 19 patients. After excluding a skewed X chromosome inactivation and the presence of chromosomal rearrangements, I performed WES in trios. The analysis of the data from WES did not allow me to identify any recurrent variants. I therefore tested a new approach combining Whole Genome Sequencing (WGS) and RNA-Sequencing (RNA-Seq) on fibroblast cells. I identified a number of deregulated transcripts implicated in brain and eye development. I compared the results of this analysis with the WGS analysis in order to find variants in these candidate genes. In conclusion, these studies have improved the knowledge of the molecular basis of complex MCD, such as TLE1 in postnatal microcephaly, and revealed the pathogenic mechanisms such as WDR81 in cell cycle progression and EPG5 in endosomes and autophagy. My work has also generated a collection of NGS data (WES, WGS and RNA-Seq) that will be shared in an international consortium to develop new analytical strategies, in particular for the non-coding DNA regions. This novel strategy provides opportunities to improve understanding of the cellular mechanisms involved in brain and eye development