Dissertationen zum Thema „Biochemical Recurrence“

Through a prospective clinical trial exploring PSMA PET/MRI, we aimed to address the current clinical need for more sensitive and specific imaging in biochemically recurrent prostate cancer. This imaging technology has the potential to detect micro-metastatic and low volume recurrent disease, potentially altering standard of care treatment options for patients. Additionally, as a proof of principle we aimed to apply novel organoid culture technology to develop patient derived cell models to allow drug testing and next generation sequencing as part of a precision medicine approach in early recurrent prostate cancer.

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Este estudo teve como objetivo analisar e comparar a sobrevida livre de recidiva bioquímica em cinco anos e fatores prognósticos em pacientes portadores de câncer de próstata submetidos à braquiterapia ou cirurgia radical. Foram analisados 129 pacientes com câncer de próstata, destes 64 foram submetidos à braquiterapia permanente com sementes de Iodo 125 e 75 pacientes foram tratados com prostatovesiculectomia radical, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2005, em um hospital da rede privada da cidade de Juiz de Fora-MG. As principais variáveis analisadas, coletadas dos prontuários dos pacientes, foram: idade, data de nascimento, PSA inicial, escore de Gleason à biópsia prostática e na peça cirúrgica para os pacientes operados, estadiamento clínico e patológico para os casos cirurgicos, volume da próstata ao pré-planejamento e no momento da braquiterapia, atividade das sementes de Iodo 125 e dosagens seriadas de PSA após o tratamento. Os pacientes foram classificados, segundo D’Amico, em grupos de risco: baixo, intermediário e alto. A recidiva bioquímica foi definida como níveis de PSA> 0,4ng/ml para os casos de prostatectomia radical e três elevações consecutivas de PSA para os pacientes implantados (ASTRO). Para estudo do efeito do tratamento na sobrevida livre de recidiva bioquímica foram geradas curvas de Kaplan-Meier, e teste de log-rank foi usado para determinar diferenças entre as curvas. A influência de múltiplas variáveis na sobrevida livre de recidiva bioquímica, como Gleason, estadiamento, iPSA, categoria de risco e idade foram estimados por regressão de Cox. No primeiro artigo, foi observada taxa de sobrevida livre de recidiva bioquímica superior (p=0,0056) para os pacientes submetidos à braquiterapia 79,70% (IC95%:66,87-87,99) quando comparado aos pacientes submetidos à cirurgia 44,30% (IC95%:23,28-63,47) sendo identificados como fatores prognósticos associados de forma independente à sobrevida livre de recidiva bioquímica a modalidade terapêutica (HR= 3,33 ;IC95% :1,41-7,88), os níveis séricos de iPSA (HR=2,54;IC95%:1,11-5,78) e a categoria de risco (HR=4,18 ;IC95%:1,89-9,23). No segundo artigo, que avaliou somente os pacientes submetidos à braquiterapia, foi verificada uma taxa de sobrevida livre de recidiva bioquimica em cinco anos, significativamente superior (p=0,0012) para os pacientes do grupo de baixo risco 91,6% (IC 95%:75,92-97,24), quando comparada com àquela dos pacientes do grupo de risco intermediário/alto 59,19% (IC 95%:36,00-76,40). A sobrevida livre de recidiva bioquimica também foi significativamente superior nos pacientes com iPSA ≤ 10ng/ml (p=0,0084) e com escore de Gleason ≤ 6 à biópsia prostática (p=0,0057). Na análise multivariada, o risco de falha bioquímica também se manteve maior nos pacientes que pertenciam ao grupo de risco moderado/alto e para pacientes com iPSA superior a 10ng/ml. Os dados de sobrevida livre de recidiva bioquimica em cinco anos, para os pacientes desta análise, tratados com braquiterapia, foram comparáveis aos da literatura.
This study aimed to analyze and compare the biochemical relapse-free survival at five years and prognostic factors in patients with prostate cancer undergoing radical surgery or brachytherapy. We analyzed 129 patients with prostate cancer, these 64 underwent brachtherapy with permanent seeds implantation and 75 patients were treated with radical prostatectomy, from January 2002 to December 2005 in a private hospital network in the city of Juiz de Fora-MG. The main variables analyzed were collected from medical records and were: age, date of birth, initial PSA, Gleason score of prostate biopsy and of surgical specimens, clinical and pathologic staging on surgical cases, the prostate volume pre-planning and at the time of brachytherapy, seed activity of lodine 125 and serial measurements of PSA after treatment. Patients were classified according to D’Amico, at risk groups; low, intermediate and high. The biochemical recurrence was defined as PSA levels>0.4 ng/ml for cases of radical prostatectomy and three consecutive elevations of PSA for patients implanted (ASTRO). For the study of the effect of the treatment on biochemical relapse-free survival Kaplan-Meier curves were generated, and log rank test was used to determine the differences among the curves. The influence of multiple variables in the biochemical relapse-free survival as age, initial PSA, Gleason score, staging and risk category was estimated by Cox regression. In the first article, was observed rate of biochemical relapse-free survival superior (p = 0.0056) for patients undergoing brachytherapy 79.70% (CI95% :66,87-87, 99) when compared with patients undergoing surgery 44.30% (CI95% :23,28-63, 47) and were identified as prognostic factors independently associated with survival free of biochemical recurrence modality therapy (HR = 3.33, CI95% :1,41-7 88), serum levels of IPSA (HR = 2.54, CI95% :1,11-5, 78) and risk category (HR = 4.18, CI95% :1,89-9, 23). In the second article, which evaluated only the patients who underwent brachytherapy, there was a rate of biochemical relapse-free survival at five years, significantly higher (p = 0.0012) for patients with low-risk group 91.6% (CI 95% :75,92-97, 24), when compared with that of patients in the intermediate/high risk group 59.19% (CI95% :36,00-76, 40).The biochemical relapse-free survival was also significantly higher in patients with IPSA ≤ 10ng/ml (p = 0.0084) and Gleason score ≤ 6 on prostate biopsy (p = 0.0057). In multivariate analysis, the risk of biochemical failure also remained higher in patients who belonged to the group of moderate / high risk and patients with IPSA more than 10ng/ml. Data from biochemical relapse-free survival at five years for the patients of this analysis were comparable to literature.

ABSTRACT Background In the US, the incidence and mortality rates of prostate cancer (PCa) are higher among African American men compared to European American men. Obesity is an important risk factor of PCa. Obesity is known to alter the gene expression profiles in prostate tumors. This study evaluates the impact of obesity and the expression of obesity-related genes on the progression of PCa in African American men. Methods The primary outcome of interest is biochemical recurrence (BCR) of PCa. There were 48 African American prostate cancer patients in the study. The tissue samples included 42 normal tissues, 40 Prostate Intraepithelial Neoplasia (PIN) and 45 tumor tissues (127 tissue samples in total). We assembled 99 obesity-related genes and determined the levels of their expression in the three types of tissue samples using Nanostring Technologies. An ANOVA test was used to compare the means for gene expression among normal, PIN and tumor tissue samples. Unconditional logistic regression models were used to calculate odds ratios (ORs) and their respective 95% confidence intervals (95% CIs) to determine the association between obesity and BCR as well as gene expression and BCR. Results were regarded as statistically significant if p-values were less than 0.05. A Kaplan Meier Curve was constructed to depict the survival time and time to event (BCR) among obese and non-obese African American prostate cancer patients. Patients were followed up from the date of first surgery to the date of biochemical recurrence or date of last follow-up. Statistical analysis was done with SAS 9.4 software. Results Forty-three obesity-related genes were statistically significantly associated with biochemical recurrence. There was no association between obesity and biochemical recurrence (BCR) in obese African American men compared to non-obese African American men (OR= 2.03, 95% CI = 0.22 - 18.77, p-value= 0.53). Twenty genes showed an upward trend in gene expression among normal, PIN and tumor tissue samples including ADIPOR1, AKRIC4, ALOX12, ALOX15, CRYBB2, EIF5A, ERG, GNPDA2, HNF1B, HSD3B1, KLK4, LEP, MC4R, MTCH2, PCSK1, PIK3CB, SLC2A2, STAT1, SULT1A1, YY1. The probability of survival (not having BCR) is lower in obese African American men compared to non-obese African American men as indicted in the Kaplan Meier curve. In other words, the probability of developing BCR is higher in obese African American men compared to non-obese African American men. Conclusion We did not find a significant association between obesity and biochemical recurrence. However, we elucidated some obesity-related genes that could explain PCa carcinogenesis. Further studies are needed to determine functional significance of these selected obesity-related genes and the role they play in encouraging PCa progression in African American men.

O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer
Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica (Sinais e Imagens Médicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021
O cancro da próstata é a segunda doença oncológica mais frequente nos homens, sendo frequentemente tratado com remoção cirúrgica total do órgão, denominada prostatectomia radical. Apesar dos avanços no diagnóstico e da evolução das terapias cirúrgicas, 20–35% dos candidatos a prostatectomia radical com intuito curativo sofrem de recidiva bioquímica, uma condição que representa o insucesso do tratamento inicial e também o primeiro sinal de progressão da doença. Em particular, dois terços dos casos de recidiva bioquímica ocorrem dentro de um período de dois anos. Ocorrendo cedo, este estado implica uma maior agressividade biológica da doença e um pior prognóstico, uma vez que pode dever-se `a presença de doença oculta, localmente avançada ou metastática. Apesar de o prognóstico devido ao desenvolvimento de recidiva bioquímica variar, em geral está associado a um risco acrescido de desenvolvimento de doença metastática e de mortalidade específica por cancro da próstata, representando assim uma importante preocupação clínica após terapia definitiva. Contudo, os modelos preditivos de recidiva bioquímica actuais não só falham na explicação da variabilidade dos resultados pós-cirúrgicos, como não têm habilidade para intervir cedo no processo de decisão de tratamento, uma vez que dependem de informação provinda da avaliação histopatológica da peça cirúrgica da prostatectomia ou da biópsia. Actualmente, o exame padrão para diagnóstico e para estadiamento do cancro da próstata é a ressonância magnética multiparamétrica, e as características provindas da avaliação dessas imagens têm mostrado potencial na caracterização do(s) tumor(es) e para predição de recidiva bioquímica. “Radiomics”, a recente metodologia aplicada à análise quantitativa de imagens médicas tem mostrado ter capacidade de quantificar objectivamente a heterogeneidade macroscópica de tecidos biológicos como tumores. Esta heterogeneidade detectada tem vindo a sugerir associação a heterogeneidade genómica que, por sua vez, tem demonstrado correlação com resistência a tratamento e propensão metastática. Porém, o potencial da análise radiómica das imagens de ressonância magnética (MRI) multiparamétrica da próstata para previsão de recidiva bioquímica pós-prostatectomia radical ainda não foi totalmente aprofundado. Esta dissertação propôs explorar o potencial da análise radiómica aplicada a imagens pré-cirúrgicas de ressonância magnética biparamétrica da próstata para previsão de recidiva bioquímica, no período de dois anos após prostatectomia radical. Este potencial foi avaliado através de modelos predictivos com base em dados radiómicos e parâmetros clínico-histopatológicos comummente adquiridos em três fases clínicas: pré-biópsia, pré- e pós-cirúrgica. 93 pacientes, de um total de 250, foram eleitos para este estudo retrospectivo, dos quais 20 verificaram recidiva bioquímica. 33 parâmetros clínico-histopatológicos foram recolhidos e 2715 variáveis radiómicas baseadas em intensidade, forma e textura, foram extraídas de todo o volume da próstata caracterizado em imagens originais e filtradas de ressonância magnética biparamétrica, nomeadamente, ponderadas em T2, ponderadas em Difusão, e mapas de coeficiente de difusão aparente (ADC). Embora os pacientes elegíveis tenham sido examinados na mesma instituição, as características do conjunto de imagens eram heterogéneas, sendo necessário aplicar vários passos de processamento para possibilitar uma comparação mais justa. Foi feita correção do campo tendencial (do inglês, “bias”) e segmentação manual das imagens T2, registo tanto para transposição das delineações do volume de interesse entre as várias modalidades imagiológicas como para correção de movimento, cálculo de mapas ADC, regularização do campo de visão, quantização personalizada em tons cinza e reamostragem. Tendo os dados recolhidos uma alta dimensionalidade (número de variáveis maior que o número de observações), foi escolhida a regressão logística com penalização L1 (LASSO) para resolver o problema de classificação. O uso da penalização aliada à regressão logística, um método simples e commumente usado em estudos de classificação, permite impedir o sobreajuste provável neste cenário de alta dimensionalidade. Além do popular LASSO, recorremos também ao algoritmo Priority-LASSO, um método recente para lidar com dados “ómicos” e desenvolvido com base no LASSO. O Priority-LASSO tem como princípio a definição da hierarquia ou prioridade das variáveis de estudo, através do agrupamento dessas mesmas variáveis em blocos sequenciais. Neste trabalho explorámos duas maneiras de agrupar as variáveis (Clínico-histopatológicas vs. Radiómicas e Clínico-histopatológicas vs. T2 vs. Difusão vs. ADC). Além disso, quisemos perceber qual o impacto da ordem destes mesmos blocos no desempenho do modelo. Para tal, testámos todas as permutações de blocos possíveis (2 e 24, respectivamente) em cada um dos casos. Assim, uma estrutura de aprendizagem automática, composta por métodos de classificação, validação-cruzada k-fold estratificada e repetida, e análises estatísticas, foi desenvolvida para identificar os melhores classificadores, dentro um conjunto de configura¸c˜oes testado para cada um dos três cenários clínicos simulados. Os algoritmos de regressão logística penalizada com LASSO e o Priority-LASSO efectuaram conjuntamente a seleção de características e o ajuste de modelos. Os modelos foram desenvolvidos de forma a optimizar o n´umero de casos positivos de recidiva bioquímica através da maximização das métricas área sob a curva (AUC) e medida-F (Fmax), derivadas da análise de curva característica de operação do receptor (ROC). Além da comparação das implementações Priority-LASSO com o caso em que não houve agrupamento de variáveis (isto é, LASSO), foram também comparados dois métodos de normalização de imagens com base no desempenho dos modelos (avaliado por Fmax). Um dos métodos tinha em conta o sinal de intensidade proveniente da próstata e de tecidos imediatamente circundantes, e outro apenas da próstata. Paralelamente, também o efeito do método de amostragem SMOTE, que permite equilibrar o número de casos positivos e negativos durante o processo de aprendizagem do algoritmo, foi avaliado no desempenho dos modelos. Com este método, gerámos casos sintéticos para a classe positiva (classe minoritária) para recidiva bioquímica, a partir dos casos já existentes. O modelo de regressão logística com Priority-LASSO com a sequência de blocos de variáveis Clínico-histopatológicas, T2, Difusão, ADC e com restrição de esparsidade de cada bloco com o parâmetro pmax = (1,7,0,1), foi seleccionada como a melhor configuração em cada um dos cenários clínicos testados, superando os modelos de regressão logística LASSO. Durante o desenvolvimento dos modelos, e em todos os cenários clínicos, os modelos com melhor desempenho obtiveram bons valor médios de Fmax (mínimo–máximo: 0.702–0.754 e 0.910–0.925 para classe positiva e negativa de recidiva bioquímica, respectivamente). Contudo, na validação final com um conjunto de dados independentes, os modelos obtiveram valores Fmax muito baixos para a classe positiva (0.297–0.400), revelando um sobreajuste, apesar do uso de métodos de penalização. Também se verificou grande instabilidade nos atributos seleccionados. Contudo, os modelos obtiveram razoáveis valores de medida-F (0.779–0.833) e de Precisão (0.821–0.873) para a classe de recidiva bioquímica negativa durante as fases de treino e de validação, pelo que estes modelos poderão ter valor a ser explorado. Os modelos pré-biópsia tiveram desempenho inferior no treino, mas sofreram menos de sobreajuste. Os classificadores pré-operatórios foram excessivamente optimistas, e os modelos pós-operatórios foram os melhores a detectar correctamente casos negativos de recidiva bioquímica. Outros resultados observados incluem a superioridade no desempenho dos modelos baseados em imagens que usaram o método de normalização realizado apenas com o volume da próstata, e o inesperado resultado de que o uso método de amostragem SMOTE não ter trazido melhoria na classificação de casos positivos de recorrência bioquímica, nem nos casos negativos, durante a validação dos modelos. Tendo em contas às variáveis seleccionadas e a sequência de prioridade dos melhores modelos Priority-LASSO, concluímos que os atributos radiómicos provindos da análise de textura de imagens MRI ponderadas em T2 poderão ter potencial para distinguir pacientes que não irão sofrer recidiva bioquímica inicial, conjuntamente com níveis iniciais de antigénio específico da próstata, num cenário pré-biópsia. A inclusão de parâmetros pré- ou pós-operatórios não adicionou valor substancial para a classificação de casos positivos de recidiva bioquímica em conjunto com variáveis radiómicos de MRI biparamétrica. Estudos com alto poder estatístico serão necessários para elucidar acerca do papel de atributos de radiómica baseados em imagens de bpMRI como predictores de recidiva bioquímica.
Primary prostate cancer is often treated with radical prostatectomy (RP). Yet, 20–35% of males undergoing RP with curative intent will experience biochemical recurrence (BCR). Of those, two-thirds happen within two years, implying a more aggressive disease and poorer prognosis. Current BCR risk stratification tools are bounded to biopsy- or to surgery-derived histopathological evaluation, having limited ability for early treatment decision-making. Magnetic resonance imaging (MRI) is acquired as part of the diagnostic procedure and imaging derived features have shown promise in tumour characterisation and BCR prediction. We investigated the value of imaging features extracted from preoperative biparametric MRI (bpMRI) combined with clinic-histopathological data to develop models to predict two-year post-prostatectomy BCR in three simulated clinical scenarios: pre-biopsy, pre- and postoperative. In a cohort of 20 BCR positive and 73 BCR negative RP-treated patients examined in the same institution, 33 clinico-histopathological variables were retrospectively collected, and 2715 radiomic features (based on intensity, shape and texture) were extracted from the whole-prostate volume imaged in original and filtered T2- and Diffusion-weighted MRI and ADC maps scans. A systematic machine-learning framework comprised of classification, stratified k-fold cross validation and statistical analyses was developed to identify the top performing BCR classifiers’ configurations within three clinical scenarios. LASSO and Priority-LASSO logistic regression algorithms were used for feature selection and model fitting, optimising the amount of correctly classified BCR positive cases through AUC and F-score maximisation (Fmax) derived from ROC curve analysis. We also investigated the impact of two image normalisation methods and SMOTE-based minority oversampling on model performance. Priority-LASSO logistic regression with four-block priority sequence Clinical, T2w, DWI, ADC, with block sparsity restriction pmax = (1,7,0,1) was selected as the best performing model configuration across all clinical scenarios, outperforming LASSO logistic regression models. During development and across the simulated clinical scenarios, top models achieved good median Fmax values (range: 0.702–0.754 and 0.910–0.925 for BCR positive and negative classes, respectively); yet, during validation with an independent set, the models obtained very low Fmax for the target BCR positive class (0.297–0.400), revealing model overfitting. We also observed instability in the selected features. However, models attained reasonably good F-score (0.779–0.833) and Precision (0.821–0.873) for BCR negative class during training and validation phases, making these models worth exploring. Pre-biopsy models had lower performances in training but suffered less from overfitting. Preoperative classifiers were overoptimistic, and postoperative models were the most successful in detecting BCR negative cases. T2w-MRI textured-based radiomic features may have potential to distinguish negative BCR patients together with baseline prostate-specific antigen (PSA) levels in a pre-biopsy scenario. The inclusion of pre- or postoperative variables did not substantially add value to BCR positive cases classification with bpMRI radiomic features. Highly powered studies with curated imaging data are needed to elucidate the role of bpMRI radiomic features as predictors of BCR.

Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Radiações em Diagnóstico e Terapia) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
O cancro de próstata é o segundo tipo de cancro com maior prevalência nos homens, em todo o mundo. A deteção inicial desta doença ocorre, geralmente, durante exames e consultas de rotina, quando níveis aumentados do antigénio prostático específico e/ou um exame retal anormal são descobertos. Contudo, apenas a avaliação histopatológica, inicialmente baseada em amostras extraídas através de uma biópsia, é capaz de fornecer um diagnóstico definitivo, permitindo não só orientar o tratamento do doente, assim como o processo de tomada de decisão associado. Após esta avaliação inicial, se o doente for diagnosticado com cancro da próstata localizado, ou seja, um tumor confinado à próstata, o tratamento mais adotado é a prostatectomia radical. Este último é o tratamento padrão utilizado quando se pretende uma terapia com curativa. A vantagem da técnica de prostatectomia radical é que, toda a próstata, onde o tumor se encontra confinado, é removida cirurgicamente, auxiliando na redução do risco de metástases. A posterior análise da peça prostática permite ao patologista avaliar diversas características tumorais, determinantes no prognóstico do doente. Para este fim, o microscópio tem sido a principal ferramenta utilizada, uma vez que proporciona imagens ao vivo com uma ótima resolução. No entanto, desde a introdução do primeiro sistema automatizado de digitalização de lâminas em imagens de alta resolução, o interesse da comunidade de anatomia patológica em explorar este tipo de métodos para diferentes aplicações tem crescido exponencialmente. O potencial desta nova área não é, todavia, a simples transferência de uma imagem da lâmina de vidro para um monitor, nem tão pouco a flexibilidade de distribuição e modificação da própria imagem digital, mas sim, a possibilidade de aprimorar a avaliação do patologista com informações e inteligência que não podem ser detetados pela análise humana. Por conseguinte, a implementação de algoritmos de aprendizagem automática capazes de executar tarefas como deteção, classificação e segmentação de imagens digitais histopatológicas é, finalmente, possível. Estes métodos de análise automatizada permitem explorar todo o panorama morfológico do tumor e dos seus elementos mais invasivos presentes, capturando, por exemplo, a orientação nuclear, a textura, a forma e a arquitetura. A complexidade e densidade inerente a este tipo de imagens, oferecem uma abundância de informação, ideal para estimular e promover o desenvolvimento de algoritmos baseados em deep learning. No que diz respeito ao cancro da próstata, os algoritmos desenvolvidos visam apoiar as avaliações efetuados pelos patologistas, nomeadamente, estadiamento e classificação, sendo, portanto, focados no sistema de classificação utilizada para a próstata - o Gleason score. Contudo, problemáticas alternativas podem também beneficiar da aplicação destas t´técnicas, nomeadamente métodos capazes de distinguir imagens que apenas contêm tecido benigno de imagens em que tumor esteja presente. Por outro lado, modelos capazes de prever a recidiva bioquímica de cancro da próstata permitiriam aos médicos modificar estratégias de tratamento e pós-tratamento, a fim de equilibrar benefícios e efeitos adversos de um terapia específica. A previsão de recidiva permite, também, que os pacientes escolham com responsabilidade os diferentes tratamentos e estratégias que lhes são propostos pelos médicos, possibilitando, em última análise, uma maior sua satisfação após o tratamento. Desta forma, com o objetivo de explorar os referidos problemas, a presente dissertação apresenta procedimentos de recolha, processamento e anotação de dados, que permitiram a criação de uma base digital de dados histológicos anotados da próstata. Com base nestes dados dois modelos distintos de deep learning, especificamente Convolutional Neural Networks foram desenvolvidos. O modelo I propõe a identificação de cancro da próstata e diferenciação entre tumor e tecido benigno. O modelo II pretende prever a condição de recidiva bioquímica do cancro de próstata, para um período de tempo posterior `a cirurgia em dois anos. Relativamente ao desenvolvimento da base de dados, 200 casos de cancro da próstata, tratados através de prostatectomia radical, foram selecionados. As lâminas correspondentes à lesão índice, ou seja, à lesão principal, foram identificadas e, apenas estas foram incluídas na amostra final. A adoção desta abordagem deveu-se ao facto de que cada peça origina entre 15-45 lâminas, sendo que a maioria não contém tumor. Por outro lado, dado o período de tempo para a realização de todo este projeto, seria inviável a utilização de todas as lâminas. Assim, as lâminas selecionadas foram digitalizadas e processadas. Uma t´técnica de normalização de contraste foi aplicada, de forma a uniformizar as cores das diferentes imagens digitais, evitando uma elevada variabilidade de contraste e cor que advém da utilização de diferentes protocolos de cor, bem como da própria digitalização da lâmina. As imagens histológicas digitalizadas e normalizadas foram posteriormente divididas em imagens mais pequenas, isto é, subimagens, uma vez que desta forma existe uma otimização da extração de características por parte dos algoritmos. Estas subimagens foram individualmente visualizadas e anotadas, originando um total de cerca de 160,000 subimagens, correspondentes aos 200 casos diferentes selecionados. Para o desenvolvimento do modelo de classificação do cancro de próstata, a arquitetura Inception v3 foi implementada e treinada utilizando as subimagens da base de dados. Este modelo foi capaz de identificar três classes distintas: negativa (tecido benigno), positiva (tecido maligno) e neoplasia intraepitelial da próstata, esta última, embora com menor precisão dada a quantidade reduzida de exemplos pertencentes a esta classe. Um valor de 93 % de precisão foi obtido, o que corresponde a valores equiparados ao estado da arte para este tipo de técnicas. Este valor, contudo, demonstra ainda potencial para otimização e melhoria, uma vez que as diferentes classes dos dados utilizados seguiam uma distribuição não equilibrada. A inclusão de mais casos clínicos e a aplicação de técnicas de aumento de dados, podem ser facilmente realizadas, o que culminará num modelo com ainda melhor precisão de classificação. Relativamente ao modelo referente à previsão de recidiva bioquímica, a mesma arquitetura foi utilizada, mas neste caso, treinada apenas com base nas subimagens positivas, isto ´e, as subimagens contendo tecido maligno da próstata. Os resultados obtidos revelaram que este modelo não tem a capacidade de extrair informação relevante correlacionada com o objetivo do estudo, e portanto, não consegue distinguir com sucesso casos não recorrentes de casos recorrentes, produzindo apenas uma precisão de 60 %. Contudo, apesar do referido modelo falhar na execução do objetivo estipulado, é fundamental notar que a tarefa de predição de recidiva bioquímica é de complexidade elevada, não sendo possível aos patologistas, através da observação das imagens histológicas, retirar nenhuma conclusão que diretamente se correlacione com esta condição. Diferentes abordagens, como por exemplo, o aumento da quantidade de dados utilizados, a introdução no modelo de características clínicas relevantes no prognóstico da doença poderão apresentar melhorias substanciais, no que diz respeito à capacidade preditiva deste modelo. Concluindo, a capacidade de algoritmos de deep learning para extrair informação relevante de imagens digitais da histopatologia da próstata foi demonstrada através do presente estudo. O desenvolvimento e o criação de uma base de dados anotados, fornece a base fundamental para o desenvolvimento de modelos adicionais, onde diversas questões podem ser exploradas. O desenvolvimento de uma interface que permita implementar o modelo de deteção de cancro da próstata desenvolvido é também uma possibilidade, uma vez que fornece eficiência e consistência, beneficiando a prática da patologia clinica.
Prostate cancer is the second most prevalent cancer in men, worldwide. Histopathological assessment plays an indispensable role in understanding the disease mechanisms, providing definitive diagnosis to guide patient treatment and management decisions. The microscope has been the primary tool to this end, producing images at increased resolution. However, with the development of the first automated high resolution whole-slide imaging system, which allows the digitisation of glass slides, interest in using this system for different applications in pathology practice has steadily grown, giving rise to the digital pathology field. The promise of digital pathology is not, however, the simple transfer of an image from a glass slide to a monitor, not even the flexibility of distribution and modification of the image, but instead the potential to enhance the pathologist’s assessment with information and artificial intelligence that cannot be perceived by human examination. With the advent of digital pathology and the recent expert-level accuracy achieved by machine learning based algorithms in medical image detection, classification and segmentation, new possibilities to develop automated image analysis methods arise. As far as prostate cancer is concerned, these models have been aimed at supporting pathologist’s image descriptions such as staging and grading, being hence, focused on the Gleason grading system. In order to explore alternative problems, the present dissertation presents data collection, processing and annotation procedures, that allowed the creation of an annotated digital histology database of prostate resection cases. These data was used to develop deep learning models not only to classify prostate cancer, but also to predict prostate cancer biochemical recurrence. Inception v3 architecture was implemented and trained from scratch for the proposed assignments. The prostate cancer classification model yielded an accuracy of 93%, being able to identify three distinct classes: negative (benign tissue), positive (malignant tissue) and high-grade prostate intraepithelium neoplasia, the latter, although, with lower precision, given to unbalanced class distributions. The prostate cancer biochemical prediction model was not able to successfully distinguish between non-recurrent and recurrent cases, yielding an accuracy of 60%. This value was accomplished, nevertheless, due to the fact that the model was classifying all entries as negative, and therefore, the value of accuracy corresponds to the percentage of negative cases present in the dataset. Although not all models here developed achieved good results, the capacity of deep learning algorithms to harvest relevant features from prostate histopathology digital images has been demonstrated. The development and establishment of an annotated database provides the fundamental basis to further develop additional models, and mainly to improve the biochemical recurrence prediction model by applying more sophisticated methods, given the complexity of this problem.

Aberrant promoter methylation is known to silence tumor-suppressor genes in prostate cancer. Using a quantitative real-time PCR assay(MethyLight), I determined promoter methylation levels of APC, RASSF1A, CYP26A1 and TBX15 in 219 radical prostatectomies diagnosed between 1998-2001, examined their correlation with clinicopathological follow-up data including Gleason Pattern(GP), Gleason Score(GS) and pathological stage, and explored their potential in predicting biochemical recurrence(BR) using univariate and multivariate analyses. I demonstrated that methylation status of all four genes could accurately differentiate normal from cancerous tissues. Quantitative methylation levels of APC and TBX15 correlated strongly with GP, GS, and pathological stage. Both APC and TBX15 methylation levels could significantly predict BR in univariate analysis(p-value=0.028 and 0.003, respectively). The methylation profiles of APC and TBX15 combined could discriminate patients into high, intermediate, and low risk groups of BR(p-value=0.005). My project demonstrated that quantitative increase in promoter methylation levels of APC and TBX15 were associated with PCa progression.

Biomarker validation remains one of the most important constraints to development of new clinical diagnostic assays. To address this challenge, an immuno-mass spectrometric assay known as SISCAPA has been developed for quantitation of protein biomarkers in human blood. The SISCAPA assay overcomes the sensitivity barrier facing most mass spectrometric approaches by utilizing high affinity antibodies for enrichment of specific surrogate peptide analytes from complex mixtures such as trypsin-digested human plasma. However, several technological barriers remain before the SISCAPA technology gains widespread use for biomarker validation. Improvements are required in areas such as selection of high affinity anti-peptide antibodies, peptide detection sensitivity and increasing sample throughput to allow biomarker validation on large sample sets. The work presented in this dissertation describes the development of new methods for antibody selection and for high-throughput application of SISCAPA technology to biomarker measurement in human plasma. Specifically, two technological developments are described: 1) an assay called MiSCREEN was developed, which allows high-throughput screening of anti-peptide antibodies, enabling selection of high affinity reagents for de novo SISCAPA assays and 2) a liquid chromatography (LC)-free SISCAPA assay was developed that enables quantitation of surrogate peptides using both MALDI-TOF and RapidFire/MS platforms. Taken together, these technological advances provide a meaningful solution to the biomarker validation dilemma and allow a unified system for biomarker qualification, verification, validation and development of clinical assays for diagnosis and monitoring of a variety of diseases. To demonstrate the utility of the unified SISCAPA system for biomarker measurement, an assay was developed for protein C inhibitor (PCI) as a marker for prediction of biochemical recurrence in prostate cancer patients. The PCI-specific analyte was shown to predict biochemical recurrence of prostate cancer after radiation/hormone treatment. Early stage detection of recurrence was achieved, when compared to the ‘gold standard’ marker for prostate cancer, prostate specific antigen (PSA). Two-dimensional gel electrophoresis studies on PCI, revealed unique protein spots in a serum sample from a biochemically recurrent patient. Studying such alterations at the protein level may enable understanding of the molecular mechanisms by which PCI is involved in prostate cancer progression.
Graduate

Trabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina
Introdução: Os exames imagiológicos apresentam uma baixa sensibilidade para deteção da localização de recidivas bioquímicas do carcinoma da próstata, quando os doentes apresentam antigénio específico da próstata (PSA) inferior a 1 ng/mL. Por outro lado, sabemos que quanto mais cedo for tratado o doente com recidiva bioquímica, melhor é seu o prognóstico.Objetivo: Pretende-se compreender os avanços dos últimos dois anos acerca da taxa de deteção de doença dos exames de imagem no contexto de recidiva bioquímica do carcinoma da próstata com PSA inferior a 1 ng/mL.Métodos: Realizada pesquisa na base de dados PUBMED, com seleção dos artigos que abordavam a temática em estudo. Foram avaliadas as taxas de deteção de doença para diferentes valores de PSA e diferentes exames constantes dessas publicações, assim como variáveis de caraterização demográfica e terapêutica.Resultados: Foram identificadas 19 publicações, que envolveram maioritariamente técnicas de tomografia por emissão de positrões associada a tomografia computorizada (PET/CT) ou ressonância magnética (PET/MRI). A PET/CT com 18F-PSMA e 68Ga-PSMA, assim como a PET/MRI com 68Ga-PSMA foram as técnicas com melhores taxas de deteção de doença nos doentes com recidiva bioquímica com PSA inferior a 1 ng/mL, demonstrando capacidade para guiar a terapêutica de resgate nestes doentes. Também o radiotraçador 64CuCl2 mostrou potencial papel na deteção de recidiva local. A utilização de tomografia computorizada isoladamente e de cintigrafia óssea apresentaram piores resultados para deteção de lesões. Na análise dos estudos incluídos foi ainda possível verificar que é possível a existência de metastização à distância com PSA inferior a 1 ng/mL.Discussão/Conclusão: A PET/CT com 18F-PSMA, a PET/CT com 68Ga-PSMA e a PET/MRI com 68Ga-PSMA apresentam-se como a que melhores taxas de deteção obtiveram para doentes com recidiva bioquímica e PSA inferior a 1 ng/mL, apesar de carecerem de maior validação em estudos prospetivos e comparativos. A validação destas técnicas poderá permitir a sua utilização futura em contexto clínico.
Introduction: In patients with biochemical recurrence (BCR) of prostatic cancer and prostate-specific-antigen (PSA) values lower than 1ng/mL imaging has a low sensibility for detection of suspicious lesions. On the other hand, its known that the prognosis of these patients is better when the treatment starts earlier.Aim: Assess the breakthroughs of the last two years on imaging that allow better detection rates in patients with BCR and PSA values lower than 1ng/mL.Methods: Through a search on PUBMED database, several articles were selected by its relevance for the topic. We evaluated the detection rates of disease for different PSA values and different techniques, as well as variables for demographic characterization and treatment.Results: 19 studies were identified. The majority of imaging techniques were based on positron emission tomography associated with computed tomography (PET/CT) or magnetic resonance (PET/MRI). 18F-PSMA and 68Ga-PSMA PET/CT, as well as 68Ga-PSMA PET/MRI, were the techniques with better detection rates for disease in BCR patients with PSA levels lower than 1ng/mL, showing their ability to guide salvage therapy in these patients. Also, the radiotracer 64CuCl2 showed great potential in detecting local recurrence. The use of CT and bone scan alone presented the worse results for lesion detection. In this analysis we verified that the presence of distant metastasis was possible for patients with BCR and PSA values lower than 1ng/mL.Discussion/Conclusions: 18F-PSMA and 68Ga-PSMA PET/CT, as well as 68Ga-PSMA PET/MRI, were the procedures with better detection rate in BCR patients with PSA levels lower than 1ng/mL, although there is a lack of validation in prospective and comparative studies. Validation of this techniques is therefore needed and may allow their future inclusion in clinical practice.

Trabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina
Introduction: Radical prostatectomy (RP) is one of the first line treatment options in clinically localized prostate cancer. However, biochemical (BC) recurrence after surgery occurs in about one third of patients. In these cases, radiotherapy (RT) is one of the options with higher potential for cure in the setting of multimodal treatment. The pathological study provides important information about the risk of disease progression and cancer-specific mortality. RT can either be used as an adjuvant therapy (when there are poor prognostic factors in the pathological study of the surgical specimen) either as a salvage therapy (when there is a diagnosis of BC recurrence). The purpose of this study was to evaluate the efficiency of RT after RP in prostate cancer. A retrospective study was conducted, with a follow-up period of approximately 10 years, observing patients who underwent adjuvant or salvage RT after RP for localized prostate cancer.Materials and methods: A retrospective collection data was performed, consulting the clinical records of the patients who underwent adjuvant or salvage RT in 2007 and 2008 at the Radiotherapy Department of the Coimbra Hospital and University Centre, describing patients’ demographic characteristics, the type of surgery, the pathological study results and the follow-up throughout the time. Statistical analysis was performed using the IBM SPSS Statistics® program, version 21, for descriptive inferential analysis. Kaplan-Meier estimates were performed to determine survival curves.Results: 26 patients were included, with a mean age of 61,9±1,08 years, a median of PSA-initial level of 7,6 ng/mL and the interquartile range of 5,63. After RP, a detectable PSA value was obtained in 53,8% with a median of the PSA values of 0,355 ng/mL (interquartile range 0,883). There were 42,3% surgical specimens classified as pT3a and 19,2% as pT3b, without metastatic ganglion invasion in 80,8%. BC recurrence after RP occurred in 58,3% of the cases, with the necessity of the administration of salvage RT. BC recurrence after RT occurred in 55% of the cases submitted to salvage RT and in 50% of those submitted to adjuvant RT. The overall survival rate and the cancer-specific survival at 10 years was of 96,2% and 100%, respectively.Discussion: Most of the patients were middle-aged men with localized prostate cancer at a pT3N0 stage, according to the TNM grading system. Most of the patients submitted to salvage RT presented negative surgical margins. In the group that performed adjuvant RT, positive surgical margins were observed in 66,7%, thus, integrating criteria for adjuvant RT. There was no significant statistically difference between the two groups in terms of incidence of BC recurrence after RT. The overall survival at 10 years was elevated and the result of the cancer-specific survival rate was 100%.Conclusion: Considering the comorbidities related to RT, a thorough assessment should be made in order to select patients who will benefit from the administration of adjuvant RT after RP, without presenting any signs of recurrence of the disease. When characteristics of aggressive illness are identified, RP followed by adjuvant RT is recommended. In all other cases, early RT administration, at the first signs of BC recurrence, it was proven to be equally effective and prevents the adverse effects related to RT in a significant proportion of patients who will not experience BC recurrence in the future.
Introdução: A prostatectomia radical (PR) é uma das opções terapêuticas de primeira linha em doentes com carcinoma da próstata (CaP) clinicamente localizado. Contudo, verifica-se recidiva bioquímica (recidiva BQ) em cerca de um terço dos doentes. Nestes casos, a radioterapia (RT) é uma das opções com maior potencial curativo como complemento ao tratamento cirúrgico. O estudo anatomopatológico da peça operatória dá informação útil acerca do risco de progressão da doença e morte relacionada com doença. A RT pode ser utilizada a título adjuvante (quando existem fatores de mau prognóstico no estudo anatomopatológico da peça cirúrgica) ou a título de resgate (quando existe um diagnóstico de recidiva BQ). O objetivo deste trabalho foi a avaliação da eficácia da RT após PR no CaP. Foi realizado um estudo retrospetivo relativo a um período de aproximadamente 10 anos, onde foram observados doentes submetidos a RT adjuvante ou de resgate após realização de PR com intuito curativo por CaP localizado. Materiais e métodos: Foi realizada uma colheita de dados retrospetiva dos registos clínicos dos doentes que realizaram RT adjuvante ou de resgate nos anos de 2007 e 2008 no serviço de Radioterapia do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, com caracterização demográfica do doente, do tipo de cirurgia, do estudo anatomopatológico da peça operatória e do seguimento do doente. A análise estatística foi feita recurso ao programa IBM SPSS Statistics®, versão 21, com cálculo de estatística descritiva e inferencial. Foram feitas estimativas de Kaplan-Meier para determinar curvas de sobrevivência.Resultados: Foram incluídos 26 doentes, com idade média de 61,9±1,08 anos, com mediana do valor do PSA inicial de 7,6 ng/mL e amplitude interquartil (AIQ) 5,63. Foram classificadas como pT3a 42,3% das peças e como pT3b 19,2%, não existindo invasão ganglionar em 80,8%. A recidiva BQ após PR ocorreu em 58,3% dos casos, com necessidade de administração de RT de resgate. Ocorreu recidiva BQ após RT em 55% dos casos submetidos a RT de resgate e em 50% dos submetidos a RT adjuvante, não se verificando diferença estatisticamente significativa entre as opções terapêuticas. A taxa de sobrevivência global (OS) e de sobrevivência específica de doença a 10 anos foi de 96,2% e 100%, respetivamente.Discussão: A maioria dos doentes eram homens de meia idade, com carcinoma da próstata localizado, em estádio pT3N0, segundo o sistema TNM. Entre os doentes submetidos a RT de resgate, verificou-se que a maioria não tinha invasão de margens cirúrgicas. No grupo que realizou RT adjuvante, 66,7% apresentavam invasão de margens cirúrgicas, sendo esta uma indicação para realizar RT adjuvante. Não se provou uma diferença estatisticamente significativa entre a RT adjuvante e a RT de resgate na ocorrência de recidiva BQ. A OS a 10 anos foi elevada e a taxa de sobrevivência específica de doença a 10 anos foi de 100%.Conclusão: Considerando as comorbilidades associadas ao tratamento com RT deve ser feita uma avaliação rigorosa para selecionar os doentes que beneficiarão da administração de RT após PR sem sinais de recorrência da doença. Perante características de doença agressiva a RT adjuvante à cirurgia está recomendada. Nos restantes casos, a administração de RT precocemente, aos primeiros sinais de recidiva BQ, é igualmente eficaz e evita o risco dos efeitos adversos a curto e a longo prazo associados à RT numa proporção de doentes significativa que não sofrerá recidiva BQ a longo prazo.