Dissertationen zum Thema „Microbiologie laitière“

La litière de fumier recyclé (LFR) (séparation du fumier et fraction solide remise sous les animaux) est de plus en plus utilisée dans l’industrie laitière au Québec. Pourtant, les risques reliés à son utilisation sur la santé humaine sont méconnus. La présente étude tente donc d’identifier la meilleure méthode de compostage de la LFR quant à la qualité de l’air dans les fermes laitières. Quatre méthodes de compostage du solide ont été testées : SW) statique; TW) retourné quotidiennement; DC24) statique après 24 h dans un composteur rotatif; et DC72) statique après 72 h dans un composteur rotatif. Des échantillons d’air ont été prélevés aux jours 0, 5, 10 à l’aide d’un échantillonneur liquide et d’un autre sur filtre. Les poussières ont été mesurées par compteur optique de particules. Les microorganismes ont été analysés par culture (bactéries et moisissures mésophiles, moisissures thermotolérantes) ou par qPCR pour les bactéries totales et Penicillium/Aspergillus, ainsi que plusieurs agents pathogènes et un gène de résistance aux carbapénèmes. Au jour 0, les poussières et les moisissures mésophiles sont inférieures pour SW, TW et DC24. Les bactéries totales sont plus faibles pour SW et TW et Penicilium/Aspergillus pour DC24. Au jour 5, les poussières sont inférieures pour DC24 et DC72, alors que les moisissures mésophiles, bactéries totales et Penicillium/Aspergillus sont en plus faibles concentrations pour SW et TW. Au jour 10, les poussières et Penicillium/Aspergillus sont plus faibles pour SW et TW, les bactéries totales pour DC72 et les résultats ne diffèrent pas pour les moisissures mésophiles. Pour les trois journées d’échantillonnage, SW a des concentrations inférieures à DC72 en bactéries mésophiles. Aucun des résultats de moisissures thermotolérantes ni d’endotoxines ne diffère et aucun des agents pathogènes ni le gène de résistance n’a été détecté par qPCR. Les traitements SW et TW semblent représenter les meilleurs choix quant à la qualité de l’air.
Recycled manure solids (RMS) (solid-liquid separation f fresh manure where the solid fraction is used as bedding) gain rising interest in Quebec’s dairy industry. However, RMS use’s associated risks on human and animal health are unknown. This study tried to identify the best composting method regarding to air quality in dairy barns. Four composting methods were tested: SW) static, TW) daily turned, DC24) static after 24 h in a drum composter and DC72) static after 72 h in a drum composter. Air sampling were done with a liquid sampler and a filter sampler at days 0, 5 and 10. Dust concentrations were measured by an optical particle counter. Microorganisms were analysed by culture (mesophilic bacteria and fungi, thermotolerant fungi) or by qPCR for total bacteria (16s rDNA) and Penicillium/Aspergillus (ITS1), as well for several pathogenic agents and a carbapeneme resistance gene (KPC). At day 0 and 5, SW, TW and DC24 lead to the lowest concentrations for dust and mesophilic fungi. Total bacteria were lower for SW and TW, while Penicillium/Aspergillus were lower for DC24. At day 5, DC24 and DC72 lead to the lowest concentrations for dust, while SW and TW lead to lower concentrations for mesophilic fungi, total bacteria and Penicillium/Aspergillus. At day 10, dust and Penicillium/Aspergillus were lower for SW and TW, while total bacteria were lower for DC72 and no mesophilic fungi did not differ. For the three sampling days, SW lead to lower concentration of mesophilic bacteria than DC72. No thermotolerant fungi or endotoxins results differ and no pathogenic agent or the carbapenem resistance gene were detected by qPCR. Thus, SW and TW seem to be the methods to privilege regarding air quality in dairy barns.

Une base de données regroupant l'ensemble des peptides antimicrobiens provenant de protéines laitières et décrits dans la littérature a été réalisée, révélant le fait que peu de peptides antimicrobiens ont été identifiés à partir d'un mélange de protéines du lactosérum ou de produits laitiers. D'autre part, un hydrolysat d'isolat de protéines sériques a été fractionné par chromatographie liquide haute performance afin de séparer spécifiquement des fractions contenant des peptides antimicrobiens. Cinq fractions antimicrobiennes ont été obtenues et les peptides responsables de l'activité ont été identifiés. En parallèle, cinq extraits peptidiques hydrosolubles ont été isolés de fromages canadiens. Deux de ces extraits ont révélé une activité antimicrobienne et confirme la présence de peptides antimicrobiens dans les produits laitiers. Les protéines laitières ont ainsi démontré leur capacité à générer des peptides antimicrobiens après hydrolyse.

Résumé : Le fer est essentiel à la croissance et à la survie de nombreux micro-organismes dans l'environnement, car il sert de cofacteur dans diverses voies métaboliques, notamment la respiration et le cycle TCA. Le fromage est toutefois caractérisé par une très faible teneur en fer, encore limitée par la présence de diverses protéines liant les métaux. Cette limitation a un impact significatif sur la croissance et l'activité de plusieurs micro-organismes impliqués dans l'affinage du fromage, des recherches antérieures ayant identifié le fer comme un facteur limitant la croissance de micro-organismes clés de l'affinage du fromage. Cette étude a cherché à déterminer si l'ajout de fer dans le fromage pouvait moduler la structure et les fonctions de la communauté microbienne. Une communauté microbienne synthétique composée de neuf souches représentatives des fromages affinés en surface a été cultivée dans des matrices fromagères produites à la fois en laboratoire et à l'échelle pilote. Différentes sources et concentrations de fer ont été testées à l'échelle du laboratoire pour évaluer leurs effets sur la composition de la communauté microbienne et le métabolome à la fin de l'affinage. À l'échelle pilote, des fromages à croûte lavée et additionnés de concentrations croissantes de chlorure de fer ont été affinés puis analysés pour la croissance microbienne, le volatilome, la métabolomique, les caractéristiques biochimiques et physico-chimiques tout au long du cycle d'affinage. Nos résultats ont montré que l'ajout de fer modifiait la composition de la communauté microbienne en augmentant de manière dose-dépendante la croissance des bactéries d'affinage du fromage, en particulier des Actinomycetota, telles que Brevibacterium aurantiacum. La stimulation de B. aurantiacum est corrélée à un développement plus rapide et plus intense de la couleur rouge-orange caractéristique de la croûte des fromages à croûte lavée. L'ajout de fer a également influencé le volatilome et les profils d'acides aminés libres du fromage, bien que les effets aient été moins prononcés à l'échelle pilote. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'ajout de fer pourrait servir d'outil pour favoriser de manière sélective la croissance de bactéries spécifiques à l'affinage des fromages, ce qui pourrait accélérer l'affinage et améliorer la saveur et l'aspect des fromages
Iron is essential for the growth and survival of many microorganisms in the environment, serving as a co-factor in various metabolic pathways, including respiration and the TCA cycle. Cheese, however, is characterized by very low iron content, further restricted by the presence of various metal-binding proteins. This limitation significantly impacts the growth and activity of several microorganisms involved in cheese ripening, with previous research identifying iron as a growth-limiting factor for key cheese-ripening microorganisms. This work explored whether iron addition in cheese could modulate the microbial community's structure and functions. A synthetic microbial community of nine strains representative of surface-ripened cheeses was grown in cheese matrices produced at both laboratory and pilot scales. Different iron sources and concentrations were tested at the lab scale to assess their effects on microbial community composition and metabolome at the end of ripening. At the pilot scale, smear-ripened cheeses supplemented with increasing concentrations of iron chloride were analyzed for microbial growth, volatilome, metabolomics, bio-chemical, and physico-chemical features throughout the ripening cycle. Our results showed that iron addition altered the microbial community composition by dose-dependently increasing the growth of cheese-ripening bacteria, particularly Actinomycetota, such as Brevibacterium aurantiacum. The stimulation of B. aurantiacum correlated with more rapid and intense development of the characteristic orange-red color of the rind of smear-ripened cheeses. Iron addition also influenced cheese's volatilome and free amino acids profiles, though effects were less pronounced at the pilot scale. Overall, these findings suggest that iron addition could serve as a tool to selectively promote the growth of specific cheese-ripening bacteria, potentially accelerating ripening and improving cheese flavor and appearance

Les acides linoléiques conjugués (ALC) ont suscité beaucoup d’intérêt à cause de leurs effets bénéfiques sur la santé. Une des hypothèses pouvant expliquer le lien entre la consommation d’ALC et les effets bénéfiques revendiqués est l’existence d’interactions étroites entre les ALC et le microiote colique chez l’humain. Dans cette optique, ce projet de doctorat vise à étudier à l’aide de différents modèles in vitro novateurs, la bioaccessibilité des ALC et d’autres acides gras (AG) d’origine laitière lors du transit gastrointestinal. Il vise également à évaluer le potentiel prébiotique de ces AG et leur impact sur l’équilibre de l’écosystème digestif. Des laits enrichis naturellement en 18:2 cis-9, trans-11 (18:2 c9 t11) ou par émulsification de deux isomères d‘ALC d’origine synthétique sous formes de triglycérides ou d’acides gras libres ont été préparés et utilisés. Les laits ont été standardisés à 1 et à 3,25 % de matière grasse (MG). Un simulateur in vitro de la partie distale du tube digestif a été utlisé pour l’étude de la bioaccessibilité des AG au niveau digestif alors qu’un système de fermentation en continu avec microbiote colique immobilisé a été utilisé pour l’étude de l’effet des différents AG sur l’équilibre du microbiote colique. Les résultats obtenus ont révélé que la bioaccessibilité des AG est très variable et qu’elle dépend de la longueur de la chaîne, de la présence de doubles liaisons et du pourcentage de MG. L'absorption était plus efficace en présence de 1 % de MG. D’autre part, l’étude des effets des ALC d’origine laitière sur la survie et la croissance de différentes souches probiotiques après digestion gastrointestinale a montré que les bifidobactéries n’ont pas été affectées par aucun des traitements alors qu’une stimulation de la croissance des lactobacilles a été observée avec les AG synthétiques à 1 % de MG. Le digestat provenant du lait contenant 3.25 % de MG semble conduire à un mélange d'acide gras résiduel ayant un effet légèrement bactéricide ou bactériostatique pour les lactobacilles. Finalement, l’étude de l’impact des ALC et des AG du lait sur l’équilibre de l’écosystème colique n’a pas révélé de changement significatif de cet équilibre. Certains groupes bactériens ont été stimulés comme les bifidobactéries. Au niveau métabolique, nous avons noté une production de l’acide oléique, de l’acide trans-vaccénique, de l’acide stéarique, de 18:2 cis-9, trans-11 et de 18:2 trans-10, cis-12 qui est concomitante avec une consommation de l’acide linoléique (AL).
Conjugated linoleic acid (CLA) have attracted a lot of interest because of their beneficial effects on health. One hypothesis that could explain the link between the consumption of CLA and the claimed beneficial effects relies to the close interactions between CLA and the human colonic microiota. This study aims to investigate the bioaccessibility of CLA and other fatty acids (FA) of dairy origin during gastrointestinal transit by using different in vitro innovative models. It also aims to evaluate the prebiotic potential of these FA and their impact on the balance of the digestive ecosystem. Fortified milks naturally enriched with cis-9, trans-11 18: 2 (c9 t11 18:2) or by emulsifying two synthetic CLA isomers in the forms of triglycerides or free fatty acid were prepared and used. The milk samples were standardized to 1 and 3.25% fat. An in vitro model reproducing the distal part of the digestive tract has been used for the bioaccessibility study of FA in the digestive tract while a continuous colonic fermentation model with immobilized colonic microbiota was used to study the effect different FA on the balance of the colonic microbiota. Our results showed that the bioaccessibility of FA is highly variable and depends on the length of the FA, the presence of double bonds and the percentage of fat. In general, the absorption was more effective in the presence of 1% fat. Furthermore, the effects of milk CLA after gastrointestinal digestion on the survival and growth of different probiotic strains has shown that Bifidobacteria were not affected by any of the treatments, while a stimulation of growth of Lactobacilli was observed with synthetic FA at 1% MG. Digested milk containing 3.25% fat seems to lead to a mixture of residual fatty acid exhibiting a bactericidal or bacteriostatic effect on Lactobacilli. Finally, the study of the impact of CLA and milk FA did not inducu any significant changes in the microbiota equilibrium. However, some bacterial groups such as bifidobacteria were stimulated. Regarding metabolic activity, we noted a production of oleic acid, vaccenic acid, stearic acid, cis 9, trans-11 18: 2 and trans-10, cis -12 18: 2 which was concomitant with a consumption of linoleic acid.

Chez les ruminants, l’Acidose Ruminale SubAiguë (ARSA) est une maladie d’origine nutritionnelle qui fait suite à une perturbation des fermentations microbiennes et à une acidité anormale du compartiment ruminal. L’installation chronique de ce dysfonctionnement digestif peut avoir une incidence néfaste sur l’efficacité de production et la santé des animaux. À l’échelle de l’individu ou du troupeau, elle aura pour conséquences des retombées économiques négatives pour l’éleveur. Un des problèmes majeurs de cette maladie est qu’elle ne se manifeste pas par des signes cliniques spécifiques. A l’heure actuelle, seul le pH ruminal permet d’objectiver la maladie même si aucun indicateur de pH ne fait l’unanimité, notamment du fait des variabilités importantes liées à la technique de mesure du pH d’une part et à la susceptibilité des animaux d’autre part. Dans ce contexte, cette thèse a eu pour objectif d’améliorer le diagnostic individuel de l’ARSA chez la vache laitière en développant une approche multiparamétrique applicable sur le terrain. Nous proposons de nouveaux indicateurs issus de cinétiques de pH mesuré de façon non-invasive avec des bolus intra-ruminaux. Ces nouveaux indicateurs relatifs, calculés quotidiennement sur les cinétiques normalisées sur 0 (NpH), sont le temps passé sous NpH <-0,3, l’écart type et l’amplitude. Ils permettent de pallier les fortes sources de variabilité et présentent l’intérêt d’être transposables entre études et sont plus précis pour caractériser l’ARSA. Parallèlement, nous avons développé des modèles multiparamétriques composés de plusieurs paramètres mesurés simultanément dans différents compartiments biologiques (lait, fèces, salive, sang, urine) ou sur l’animal (comportement). Leur capacité de prédiction de l’ARSA a ensuite été évaluée en élevage. Certains modèles incluant des paramètres périphériques au rumen et simples à mesurer sur le terrain présentent une bonne sensibilité (concentration en urée dans le lait, en bicarbonate dans le sang, pH salivaire), et d’autres ont une bonne spécificité (nombre de buvées de l’animal, pH fécal, concentration en urée dans le lait). Néanmoins, aucun modèle ne renferme un couple sensibilité et spécificité satisfaisant. A l’issue de ce travail nous proposons une stratégie diagnostique fondée sur 4 étapes : 1) l’analyse du contexte de diagnostic de l’ARSA, 2) l’évaluation des facteurs de risques, 3) l’évaluation des modèles multiparamétriques et 4) le calcul d’indicateurs NpH ruminaux des individus à risque
In ruminants, subacute ruminal acidosis (SARA) is a nutritional disease that induces an abnormal acidity of the rumen compartment as well as disturbance in microbial fermentation. When the disease becomes chronic, it can lead to negative effects on production efficiency and animal health at the individual or the herd scales, with negative economic consequences for the farmer. One of the major problems of SARA is that there are no obvious clinical signs. Presently, the only benchmark to define SARA is rumen pH. However, no pH indicator is unanimous due to the important variability related both to the measurement technique itself and to the animal susceptibility. In this context, this thesis aimed to improve the individual diagnosis of SARA in dairy cows by developing a multiparametric approach that could be used on field. We propose new indicators of pH kinetics measured noninvasively with intra-ruminal boluses. These new relative indicators, calculated daily (kinetic normalised on 0, NpH), consist of the time spent under NpH < - 0.3, the NpH standard deviation and the NpH range. These indicators make it possible to overcome the strong sources of variability and have the advantage of being transposable while being more accurate to characterize SARA. At the same time, we have developed multiparametric models including a number of parameters measured simultaneously in various biological compartments (milk, faeces, saliva, blood, urine) or on animal behaviour. The models ability to predict SARA has been evaluated on field. Some models including rumen peripheral parameters (concentration of urea in milk, of bicarbonate in blood, salivary pH) have a proficient sensitivity while others have a proficient specificity (number of drinking acts, faecal pH, and urea concentration in milk). However, no model developed is both sensitive and specific enough. The diagnostic strategy we propose is based on 4 steps: 1) analysis of the SARA diagnostic context, 2) assessment of risk factors, 3) evaluation of multiparametric models and (4) determination of ruminal NpH indicators for individuals presenting a high risk of SARA

Le méthane, puissant gaz à effet de serre (GES), est produit dans le rumen des bovins par la fermentation microbienne anaérobie des aliments. Cette production est également responsable d’une perte d’énergie pour l’animal représentant 6 % à 8 % de l’apport alimentaire. Pour ces raisons, plusieurs travaux de recherches sont entrepris pour réduire ces émissions, en jouant sur la composition des aliments ou sur l’utilisation d’additifs alimentaires. Actuellement, la mesure des émissions de méthane se fait par différentes techniques, qui présentent des inconvénients, notamment le coût ou encore la difficulté d’application à grande échelle sur le terrain. De ce fait, de nombreuses recherches sont menées pour trouver des méthodes alternatives ou « proxy » pour la mesure indirecte du méthane. Mon travail de thèse a pour objectif de rechercher des marqueurs associés à la production de méthane chez la vache laitière, par une approche métabolomique multiplateforme. Ces marqueurs, une fois validés, pourront être dosés par des méthodes simples de laboratoire et appliqués à grande échelle pour évaluer les émissions de méthane. Étant donné le caractère exploratoire de l’approche et pour maximiser nos chances de réussite, nous avons combiné l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la méthanogènèse et l’analyse des profils métaboliques de quatre matrices (le lait, le plasma, le contenu ruminal et les urines) avec différentes plateformes analytiques complémentaires : la résonnance magnétique nucléaire et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Les échantillons biologiques proviennent d’une expérimentation animale utilisant 25 vaches Holstein primipares, et séparées en deux groupes suivant la présence ou non de l’additif anti-méthane dans la ration. Nous avons mesuré une diminution des émissions de méthane de 22,7% chez les animaux ayant reçu l’additif. Les analyses statistiques multivariées ont montré des profils métaboliques différents entre les 2 groupes d’animaux dans le plasma (27 métabolites discriminants) et le lait (16 métabolites discriminants). Les travaux sur les urines et le contenu ruminal sont en cours. L’analyse des réseaux métaboliques a mis en évidence plusieurs voies métaboliques impactées par la réduction des émissions de méthane impliquées dans le métabolisme énergétique ou encore dans celui des acides-aminés
Ruminants produce significant amount of enteric methane, which is a major contributor of greenhouse gas emissions from agricultural origin. This production also results in a loss of 6 to 8% of the energy present in the diet. The reduction of enteric methane emissions from ruminants is an active area of research that requires the use of expensive, constraining measurement methods such as respiratory chambers or the use of a tracer gas that are difficult to use outside experimental farms. Therefore, there is a need of alternative, non-invasive measurement methods that can be used on large number of animals. In this work, we used an open metabolomic approach for identifying potential metabolic biomarkers associated with the production of methane in dairy cows. These discriminant metabolites, once validated, may be used for monitoring methane emissions under field conditions. To maximize the chance of finding such biomarkers, we used a multiplatform metabolomics approach (nuclear magnetic resonance and mass spectrometry) to better cover the metabolome and analyzed four biological matrices, namely milk, plasma, ruminal fluid and urine. We carried out a study involving 25 primiparous Holstein dairy cows that were divided into two groups fed a diet with or without a specific anti-methanogenic compound. We measured 22.7% reduction of methane emissions in the Treated group compared to the Control group. We identified 27 discriminant metabolites in plasma and 16 discriminant metabolites in milk. Metabolic network analysis highlighted pathways involved in energy and amino acids metabolism suggesting a general effect on the host animal induced by a reduction in methanogenesis

La mammite est la pathologie la plus fréquente chez la vache laitière, affectant toute la filière laitière du producteur jusqu'au transformateur. L'objectif de ce travail est l'étude de l'incidence des facteurs endogènes (cellules somatiques, système plasmine-plasminogène) et des facteurs exogènes (bactéries) sur la caséinolyse. Ceci a été rendu possible grâce à des modèles expérimentaux de mammite in vivo à E. Coli ou à LPS, et au modèle in vitro d'inoculation d'E. Coli dans du lait cru. La protéolyse dans le modèle in vivo à E. Coli a permis d'établir une séquentialité de protéolyse où les cellules somatiques et les bactéries interviendraient entre 3 et 216 h PI, et une phase entre 15 et 33 h PI où la plasmine serait prédominante. Plusieurs fractions peptidiques appartenant à la fraction protéose peptones, sont présentes pendant la phase aigue de l'inflammation, dont deux peptides d'origine cellulaire. Dans ce modèle le rôle bactérien dans les mécanismes de la protéolyse est difficilement appréhendable. L'étude in vitro de la protéolyse d'origine bactérienne avec le modèle E. Coli/lait a montré une interaction entre les bactéries, les protéases bactériennes et le système plasmine-plasminogène. Le second modèle in vitro protéases d'E. Coli/caséines a quant à lui permis d'établir un ordre préférentiel de dégradation des caséines. Le modèle in vivo à LPS a montré que l'activité de la gélatinase dans la fraction constituée de cellules matures est plus importante que dans la fraction constituée de cellules immatures
Mastitis is a frequently occurring pathological condition that is widely reported in dairy cow, affecting the whole field. The aim of this work is to investigate the endogenous proteolysis that includes mostly proteases of leukocytes and plasmin-plasminogen system in comparison with exogenous bacterial incidence on proteolysis of casein. The result of this study was possible owing to the feasibility of in vivo experimental mastitis using E. Coli or endotoxin from E. Coli and in vitro inoculation of E. Coli strain in raw milk. Proteolysis in E. Coli in vivo model enabled proteolysis sequentiality to be achieved. Both somatic cell count and bacteria were involved. Between 3 and 216 h PI; from 15 to 33 h PI the plasmin role was preponderant. During inflammation, many peptide fractions including two of cellular origin were present in the proteose-peptones fraction. The role of E. Coli in milk proteolysis, however remains to be elucidated. In vitro study of bacterial proteolysis with E. Coli / milk model demonstrated an interaction between bacteria, bacterial proteases and the plasmin-plasminogen system. The second model involving E. Coli proteases/casein highlighted a preferential order of caseinolysis. Furthermore, LPS experimental mastitis showed that the gelatinase activity associated with mature blood PMN is more notable than in the immature blood PMN

Afin de garantir la sécurité sanitaire, mais aussi de préserver la biodiversité des écosystèmes microbiens de fermentation et d’affinage, différentes stratégies sont aujourd’hui investiguées. Il s’agit autant de décrire les espèces en présence et d’évaluer leur dynamique, que de prévoir leur croissance ou décroissance selon les conditions de fabrication ou de conservation des aliment. Cette étude a pour objectif de définir une méthode de quantification culture indépendante, complémentaire à la microbiologie classique. Elle se base sur une extraction d’ADN et la réalisation d’une gamme étalon permettant de quantifier les microorganismes culture indépendant présents. Le bilan de cette étude met en évidence des quantifications moléculaires proches des données microbiologiques. Une fois cette quantification mise en place, le second point de l’étude vise à mettre en place une technique « culture-indépendante » ayant pour but d’évaluer l’activité réelle des flores au sein des produits laitiers ces expérimentations permettent d’appréhender l’intérêt de la technique pour des études plus poussées des comportements microbiens
In order to guarantee the public health, but also to preserve the biodiversity of the microbial ecosystems of fermentation and refining, various strategies are today creating. It is a question as much of describing the involved species and of evaluating their dynamics, to envisage their growth or decrease according to the conditions of manufacture or conservation of food. This study aims to define a method of quantification culture independent, complementary to traditional microbiology. It is based on a DNA extraction and the realization of a range standard making it possible to quantify the micro-organisms culture independent present. The assessment of this study highlights molecular quantifications close to the microbiological data. Once this quantification installation, the second point of the study aims at setting up an “independent culture” technique having for goal to evaluate the real activity of the flora within the dairy products: these experiments make it possible to apprehend the interest of the technique for more pushed studies of the microbial behaviors

Les industries alimentaires sont soumises à des contrôles stricts en termes de sécurité microbiologique, suite à l’implication de produits contaminés par des agents pathogènes dans des toxi-infections alimentaires. Actuellement, les mesures de gestion appliquées en usine ne permettent plus la détection, ni l’élimination de contaminations sporadiques de l’environnement d’une usine, pouvant être à l’origine d’une contamination des produits en cours de fabrication, et par conséquent de toxi-infections alimentaires. Comment peut-on alors estimer que les mesures de gestion entreprises sur-protègent ou sous-protègent la santé du consommateur ? Les progrès de l’appréciation quantitative des risques permettent d’envisager l’utilisation de cette démarche en matière de sécurité microbiologique des aliments. La validation de cette approche en tant qu’outil de maîtrise des dangers microbiologiques fait l’objet de cette thèse, à travers l’exemple de Listeria monocytogenes dans les fromages à pâte molle au lait pasteurisé. Basé sur les résultats d’une analyse statistique rétrospective de données d’auto-contrôles pour Listeria provenant de trois industries laitières et sur une synthèse bibliographique de tous les éléments aujourd’hui intégrable dans une appréciation quantitative des risques microbiologiques, nous proposons un modèle complet, permettant d’estimer le risque de listériose lié à la consommation de fromages à pâte molle au lait pasteurisé, en tenant compte de l’ensemble du procédé de fabrication et des sources potentielles de contamination. De la pasteurisation à la consommation, il simule l’amplification d’une primo-contamination de l’environnement de l’usine par Listeria monocytogenes, dans le temps, l’espace et entre les produits, en tenant compte de l’impact des mesures de gestion. L’analyse de sensibilité du modèle permet l’identification des leviers majeurs de maîtrise et l’optimisation des mesures préventives et correctives. Ce modèle, généralisable à d'autres espèces et d’autres procédés, illustre concrètement l’intérêt de l’appréciation quantitative du risque en matière de sécurité alimentaire.

L'objectif de ce travail est de caractériser l'effet des levures vivantes Sc47 sur le métabolisme ruminal et l'utilisation digestive de la ration en lien avec le statut oxydo-réducteur du rumen chez des vaches laitières recevant des rations qui diffèrent dans leur composition. En effet, le milieu ruminal est très anaérobie et réducteur : les micro-organismes qui s'y développent sont à l'origine de ces conditions physico-chimiques particulières caractérisées par des valeurs de potentiel rédox (Eh) ou indice de Clark (rH) basses : respectivement dans cette étude entre –213 et –147 mV et entre 6.04 et 7.48 unités rH. L'impact de trois constituants du régime des vaches laitières d'une part sur le statut réducteur du milieu ruminal et d'autre part sur son métabolisme et/ou l'utilisation digestive de la ration a été testé en interaction avec l'addition de levures vivantes : un fourrage sec chez la vache tarie, deux concentrés azotés différant par le niveau de solubilité ruminal des protéines qu'il contient et enfin la nature de l'amidon, rapidement ou lentement dégradable dans le rumen chez la vache en lactation. Il apparaît nettement que le régime alimentaire ainsi que le niveau d'ingestion des animaux influencent directement le statut réducteur du rumen : un niveau réducteur bas étant favorable à l'activité d'une flore cellulolytique alors que des niveaux plus élevés s'avèrent être un indicateur de l'apparition de troubles métaboliques du rumen. En effet, le pouvoir réducteur ruminal est corrélé avec l'activité fermentaire qui s'y développe ainsi qu'à la structure des communautés bactériennes en présence. D'après nos résultats, l'effet de la levure vivante sur les conditions réductrices du rumen semble fortement conditionné par le niveau du statut réducteur induit par le régime alimentaire : les conditions réductrices ruminales peuvent être renforcées dans la mesure où le Eh initial se trouve, dans notre étude, entre –174 et –152 mV. Ce renforcement serait favorable à l'activité de la flore fibrolytique si celle-ci n'est pas dominante, ce groupe fonctionnel participant alors également au maintien des conditons réductrices. En outre, la levure vivante aurait un impact direct sur les bactéries protéolytiques favorisant la quantité de protéines "by pass" si bien que la valeur azotée de la ration peut être améliorée en particulier en termes de PDIA
The objective of this work is to characterize the effect of live yeast Sc47 on ruminal metabolism and ration digestibility in relation to ruminal redox status of dairy cows fed diets that differed in their composition. Indeed, the rumen environment is very anaerobic and very reducing : the inhabiting micro-organisms are the main sources of particular physic-chemical conditions characterized by low values of redox potential (Eh) or Clark’s exponent (rH): in this study, values were between –213 and –147 mV and between 6.04 and 7.48 units for Eh and rH, respectively. The impact of three constituting ingredients of the diet of dairy cows was investigated. On the one hand, the reducing status of rumen was observed and on the other hand, the metabolism and/or digestibility of the diet with or without addition of live yeast was explored. The tested constituents were: hay for dry dairy cows, two concentrates differing in nitrogen levels of ruminal solubility, and two energetic concentrates differing in rate of ruminal degradation of starch – quickly or slowly degradable in the rumen of lactating dairy cows. It clearly appeared that the diet and the level of dry matter intakes of animals directly influenced the reducing ruminal status: low levels being favorable to the activity of cellulolytic microflora whereas higher levels appeared to be indicators of metabolic disorders occuring in the rumen. Indeed, the reducing power was correlated to rumen fermentative activity and the structure of bacterial communities involved. According to our results, the effect of live yeast on rumen reducing conditions appeared strongly influenced by the level of the intrinsic reducing status induced by diet: reducing conditions in the rumen could be strengthened to the extent that the original values ranged between –174 and –152 mV. This reinforced ruminal conditions would uphold the activity of fibrolytic microflora if it is not dominant, this functional group then participating to the maintenance of reducing conditions. In addition, live yeast has a direct impact on proteolytic bacteria promoting by-pass proteins so that the protein value of the ration may be improved especially in terms of PDIA

Les souches de Lactococcus lactis subsp. Lactis biovar. Diacetylactis sont des bactéries largement utilisées en industrie laitière. Elles sont à l’origine de l'arôme dans de nombreux fromages, lorsqu'elles métabolisent le citrate. La citrate lyase, qui joue un rôle clef dans ce métabolisme, a été purifiée. Des anticorps polyclonaux et 12 anticorps monoclonaux dirigés contre cette enzyme ont été produits. Ces anticorps sont spécifiques des biovars diacetylactis au sein des Lactocoques. Par immunochimie, il est possible d'analyser la croissance de ces biovars aussi bien en culture pure qu'en culture mixte. Le dosage de cette enzyme peut être réalise avec les anticorps polyclonaux en ELISA indirect. L'immunocapture de l'antigène par les anticorps monoclonaux rend le dosage plus spécifique et permet de suivre la croissance de la souche DRC2 durant sa phase exponentielle. Au cours de cultures mixtes avec Lactococcus Lactis subsp. Cremoris AM2, une interaction négative sur la croissance de la souche DRC2 (ammensalisme) a pu être mise en évidence. Les immuno-empreintes effectuées sur des sonicats bactériens ont démontré qu'il est possible de détecter et d'étudier l'évolution phylogénique des sous-unités de la citrate lyase chez les bactéries lactiques : Leuconostoc Lactis, Leuconostoc mesenteroides et chez certaines espèces de Lactobacillus : la sous-unité alpha exprime une plus grande stabilité au sein des bactéries lactiques que la sous-unité beta. Ces résultats encourageants démontrent que cette approche devrait être élargie à d'autres souches d'intérêt industriel.

L'acidose ruminale est l'une des préoccupations majeures des exploitations laitières actuelles. Les levures vivantes (LV) ont été largement étudiées et utilisées chez les vaches laitières pour stabiliser la fermentation ruminale. Récemment, la mesure du potentiel redox ruminal (Eh, en mV) a été considérée comme un outil intéressant pour indiquer le trouble de la fermentation ruminale. L'effet positif de LV sur Eh ruminal a été rapporté, mais il reste variable selon les conditions expérimentales. Les objectifs de ce travail étaient de fournir une meilleure compréhension du mode d'action de LV et de définir la condition optimale de l'utilisation de LV chez les vaches laitières. La première partie de ce travail a consisté en une analyse quantitative des résultats de 22 expériences avec des vaches laitières canulées. La deuxième partie de ce travail a consisté à vérifier certains des résultats de l'analyse quantitative par une expérience chez des vaches en lactation. En utilisant l'analyse quantitative de données existantes provenant d'expériences antérieures, nous avons clarifié la relation entre le Eh ruminal et d'autres paramètres ruminaux principaux tels que le pH et le profil VFA, et suggéré que les variations de Eh pourraient être liées au transfert d'électrons dans les réactions dans le rumen. En outre, la réponse du Eh après la supplémentation en LV était également liée à celle du profil AGV ruminal, suggérant que l'effet de LV sur le profil VFA était atteint par l'augmentation du pouvoir réducteur, reflétant un meilleur transfert d'électrons dans le rumen. L'analyse a en outre démontré que la régulation du Eh ruminal par LV serait particulièrement efficace lorsque le risque de troubles digestifs est élevé. Puisque l'influence des caractéristiques de la ration sur le Eh ruminal a été quantifiée, l'effet de LV dans un régime donné pourrait être estimé indirectement. En outre, l'analyse quantitative a également révélé que la réponse de Eh suite à la supplémentation en LV était associée à la quantité de sucres solubles ingérée. L'expérience in vivo chez des vaches en début de lactation a confirmé un effet plus important de LV sur Eh ruminal avec une ration riche en sucres solubles, et a démontré que la supplémentation en LV avait un impact sur la richesse des bactéries, et que les métabolites ont également été influencés par la supplémentation en LV, probablement associée à la diminution du Eh ruminal
Ruminal acidosis is one of the major concerns of current dairy farms. Live yeasts (LY) have been extensively studied and used in dairy cows for stabilization of rumen fermentation. Recently, measurement of ruminal redox potential (Eh, in mV) has been considered as an interesting tool to indicate ruminal fermentation disorder. The positive effect of LY on ruminal Eh has been reported, but it remains variable according to the experimental conditions. The aims of this work was to provide better understanding of mode of actions of LY, and to define the optimal condition of LY utilization in dairy cows. The first part of this work consisted to quantitative analysis of existing results from 22 experiments with cannulated dairy cattle. The second part of this work consisted to verify some of the results from quantitative analysis by an in vivo experiment in lactating cows. By using quantitative analysis of existing data from previously conducted experiments, we clarified the relationship between ruminal redox and other main ruminal parameters such as pH and VFA profile, and suggested that Eh variations might be related to the transfer of electrons in the reactions producing VFAs in the rumen. Moreover, response of ruminal Eh following live yeast supplementation was also related to that of ruminal VFA profile, which suggested that the effect of LY on VFA profile was achieved via the increase of reducing power, possibly reflected improved electron transfer and use in the rumen. The analysis further demonstrated that the regulation of ruminal Eh by LY would be particularly effective when risk of digestive disorder is high. Since the influence of dietary characteristics on ruminal Eh was quantified, the effect of LY in a given diet could be indirectly estimated. In addition, quantitative analysis also associated the response of ruminal Eh following LY supplementation to the intake of soluble sugars. The in vivo experiment in early-lactating cows confirmed greater effect of LY on ruminal Eh in diet rich in soluble sugars, and further demonstrated that i) LY supplementation tended to impact the richness of ruminal bacteria, and ii) some unidentified metabolites were also influenced by LY supplementation, probably associated to the decrease of ruminal Eh

L'objectif général de cette thèse était d'isoler et d'identifier de nouvelles souches de levures ayant une activité antagoniste contre des pathogènes alimentaires tel que Listeria sp. à partir des produits laitiers du terroir québécois. L'utilisation potentielle de ces souches comme agent naturel pour la biopréservation des aliments a également été explorée. Au total, 95 levures isolées de lait et de fromage du terroir québécois ont été criblés pour leur activité inhibitrice notamment contre Listeria monocytoenes. Parmi celles-ci, quatre levures, à savoir Candida tropicalis LMA-693, Debaryomyces hansenii LMA-916, Pichia fermentans LMA-256 et Wickerhamomyces anomalus LMA-827 ont montré une activité inhibitrice liée à la production de substances extracellulaires hydrophobes facilement extraites à partir du surnageant de culture. Les extraits concentrés réalisés à partir de surnageant de ces souches ont montré une forte inhibition contre Listeria ivanovii HPB28 avec des réductions de compte microbiens de 97, 92, 84 et 78 % pour les souches LMA-693, LMA-916, LMA-256 et LMA-827, respectivement. Des essais visant à purifier et à caractériser des peptides antilisteria produits par W. anomalus LMA-827 ont été effectués à partir des surnageants de culture. Deux pics HPLC ayant démontré une inhibition significative de L. ivanovii HPB28 ont été alors identifiés et purifiés. Dans la deuxième partie de la thèse, l'effet protecteur contre L. monocytogenes LMA-1045 des souches D. hansenii LMA-916 et de W. anomalus LMA-827 a été évaluée dans un caillé modèle de type Camembert, en co-culture et en utilisant les extraits acétone concentrés provenant de ces souches. Les analyses microbiologiques des différents caillés modèles ont révélé une inhibition significative de L. monocytoenges LMA-1045 par les extraits acétone à partir du premier jour de maturation jusqu'au cinquième. Les observations en microscopie électronique ont révélé une forte proportion de cellules en processus de lyse ainsi que la formation de pores. Finalement, la survie de D. hansenii LMA-916 aux gastro-intestinales a été étudiée grâce à un simulateur dynamique in vitro du tube digestif (TIM-1). Cette souche a montré une tolérance au stress digestif et un taux de survie (nombre de UFC de l'extrant / nombre de UFC de l'intrant du TIM-1 multiplié par 100) de 2,08 % en comparant avec 1,85 % de Saccharomyces boulardii.
The overall objective of this thesis was to isolate and identify new yeast strains from Quebec dairy products with antagonistic activity against food-borne pathogens such as Listeria sp. It also aims to evaluate the potential of these strains to be used as a natural food biopreservation. A total of 95 isolates of yeasts isolated from milk and cheese of Quebec were screened. Four yeasts, in particular, namely Candida tropicalis LMA-693, Debaryomyces hansenii LMA-916, Pichia fermentans LMA-256, and Wickerhamomyces anomalus LMA-827 selected for their inhibitory activity against Listeria monocytogenes. The inhibitory activity of these strains appears to be related to the production of an extracellular hydrophobic substances extracted from the culture supernatant. The evaluation of the inhibitory activity of these strains showed a strong inhibition against L. ivanovii HPB28 with microbial reduction of 97, 92, 84 and 78 %, respectively. Attempts to purify and characterize peptides produced by W. anomalus were conducted from the culture supernatant. Two protein HPLC peaks have demonstrated significant inhibition of L. ivanovii HPB28 were then identified and purified. In the second part of the thesis, the protective effect of D. hansenii LMA-916 and W. anomalus LMA-827 was analyzed as well as their acetone extracts concentrated against L. monocytogenes LMA-1045 in Camembert cheese model curd. Microbiological analyzes of different curds models showed significant inhibition of L. monocytogenes LMA-1045 in Camembert curd models containing the acetone extracts from the first day of ripening up to the fifth and ninth days. The electron microscopy observations revealed an extensive cell lysis, with the formation of pores. Finally, the survival of D. hansenii LMA-916 in a Camembert curd model under the gastrointestinal stress was studied using dynamic simulator in vitro gastrointestinal tract (TIM-1). The behavior of this strain showed a digestive stress tolerance and survival rate (number of CFU in the effluent from the TIM-1 / number of CFU input to the TIM-1 multiplied by 100) 2.08 % comparing with 1.85 % for Saccharomyces boulardii.

Les bactéries sont des microorganismes unicellulaires participant à de nombreux processus biologiques. Les espèces impliquées dans la fermentation lactique et la croissance des plantes suscitent un intérêt particulier en agro-industrie. L’identification de souches bactériennes est essentielle pour concevoir des ferments lactiques pour les produits laitiers et des biofertilisants pour les sols. Les techniques actuelles d’identification des bactéries sont destructives, et nécessitent donc de préparer des échantillons dédiés aux analyses. L’objectif de ce travail est de développer une méthode de criblage par spectroscopie UV-Vis-NIR de bactéries inoculées sur boîtes de Pétri, afin d’en évaluer le potentiel en tant qu’alternative simple, rapide et non destructive aux outils de diagnostic conventionnels. Un protocole de mesure a tout d’abord été établi sur un nombre restreint de souches bactériennes pour un spectromètre NIR et un spectromètre UV-Vis-NIR. 142 souches de bactéries lactiques et 76 souches de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes ont ensuite été inoculées sur milieu gélosé puis analysées avec les deux instruments au cours de plusieurs expérimentations. Un biais associé à ces séries d’inoculations et de mesures était présent sur les spectres bruts. Une réduction de ce biais a été possible en corrigeant les acquisitions par rapport aux spectres de boîtes de gélose pure réalisées à chaque expérimentation. Une analyse exploratoire des données spectrales a mis en évidence des différences entre les genres et les espèces des bactéries. Elles ont majoritairement été attribuées aux polysaccharides contenus dans les parois cellulaires, constituants la capsule bactérienne ou sécrétés dans l’environnement extracellulaire. Des modèles de classification ont été développés avec les données spectrales par PLS-DA et réseaux de neurones artificiels. Leurs performances ont été comparées en prédiction sur 84 souches de bactéries lactiques isolées de laits crus et 19 souches de rhizobactéries supplémentaires. Les taux de classification correct des meilleurs modèles obtenus sont respectivement de 70% et 63% pour le genre et l’espèce des bactéries lactiques, et de 66% pour le genre des rhizobactéries. Des pistes d’amélioration ont été proposées pour améliorer les performances et étendre les applications de la méthode
Bacteria are unicellular microorganisms involved in many biological processes. Species involved in lactic fermentation and plant growth generates a particular interest in agro-industry. The identification of bacterial strains is essential for the creation of lactic ferments for dairy products and biofertilizers for soils. Current techniques for the identification of bacteria are destructive, and therefore require dedicated sample preparation for analyses. The purpose of this work is to develop a UV-Vis-NIR spectroscopy screening method for bacteria inoculated on Petri dishes, in order to evaluate its potential as a simple, rapid and non-destructive alternative to conventional diagnostic tools. A measurement protocol was first elaborated on a limited number of bacterial strains for a NIR spectrometer and a UV-Vis-NIR spectrometer. 142 strains of lactic acid bacteria and 76 strains of plant growth-promoting rhizobacteria were then grown on agar plates and analyzed with both instruments during several experiments. Bias related to these series of inoculations and measurements was present in the raw spectra. A reduction of this bias was possible by correcting the acquisitions from pure agar plate spectra acquired during each experiment. An exploratory analysis of the spectral data revealed differences between genera and species of bacteria. They were mainly attributed to polysaccharides contained in the cell walls, forming the bacterial capsule or produced in the extracellular environment. Classification models have been developed with the spectral data using PLS-DA and artificial neural networks. Their performances were compared in prediction on 84 strains of lactic acid bacteria isolated from raw milk and 19 additional strains of rhizobacteria. The correct classification rates of the best models obtained were 70% and 63% for the genus and species of lactic acid bacteria and 66% for the genus of rhizobacteria, respectively. Suggestions have been made to improve the performance of the method and extend its applications

Brevibacterium aurantiacum est une actinobactérie qui confère des propriétés organoleptiques clés aux fromages à croûte lavée lors de l’affinage. Malgré son importance industrielle, il n’existe aucun outil génétique disponible pour la modification génétique de cette espèce et seulement deux génomes complets sont disponibles à l’heure actuelle. L’acquisition de connaissances fondamentales sur le répertoire des gènes de cette espèce et sur leurs fonctions est primordiale pour comprendre son rôle dans l’affinage des fromages à croûte lavée. Lors de ce projet de maîtrise, 12 plasmides et quatre vecteurs synthétiques ont été utilisés pour transformer six souches laitières de B. aurantiacum et une souche de B. linens dans le but d’adapter l’outil génétique CRISPR-Cas9 pour ces actinobactéries. Différents protocoles de préparation de cellules électrocompétentes et de transformation par électroporation ont été testés, mais il a été impossible de transformer les souches bactériennes à l’étude. Les actinobactéries du genre Brevibacterium sont donc récalcitrantes à la transformation génétique Dans un second temps, nous avons séquencé six génomes additionnels de Brevibacterium et nous avons effectué des analyses génomiques comparatives avec les génomes publics. Nos analyses phylogénétiques ont révélé que les souches laitières précédemment considérées comme membres de l’espèce B. linens appartiennent en fait à l’espèce B. aurantiacum, mettant en évidence l’importance de cette espèce dans la production fromagère. Les génomes de B. aurantiacum sont composés de 2612 gènes de coeur et possèdent un pangénome ouvert atteignant jusqu’à 6259 gènes. Les génomes étudiés sont riches en éléments d’ADN mobiles et des transferts horizontaux de gènes (HGT) entre diverses actinobactéries d’affinage des fromages ont été observés chez tous les génomes de B. aurantiacum. Nos analyses génomiques comparatives apportent de nouvelles informations sur l’évolution et l’adaptation de B. aurantiacum à l’écosystème des fromages.
Brevibacterium aurantiacum is an orange-pigmented actinobacterium that confers key organoleptic properties to washed-rind cheeses during surface ripening. To date, only two complete and assembled genomes of B. aurantiacum are available and there is currently no genetic tool available to study this industrially relevant species. The acquisition of fundamental knowledge on the gene repertoire of this species and their functions is essential to understand its evolution and its role in cheese ripening In this study, 12 plasmids and 4 synthetic vectors were used to transform 6 B. aurantiacum dairy strains and one B. linens strain in the aim of adapting CRISPR-Cas9 tool for these bacterial species. Different electrocompetent cell preparation and electroporation methods were tested to transform various Brevibacterium strains, but no transformants were recovered with all the experiments. Therefore, it seems that Brevibacterium strains are recalcitrant to genetic transformation We sequenced six additional genomes of Brevibacterium and performed phylogenetic and pan-genome analyses. Our phylogenetic analysis revealed that cheese isolates, previously identified as B. linens, belong to the B. aurantiacum species, making this species a key player in cheese production. B. aurantiacum genomes are composed of 2612 core genes with an open pan-genome reaching now 6259 genes. Horizontal gene transfers (HGT) between cheese actinobacteria were observed in all B. aurantiacum genomes. HGT regions involved in iron acquisition were found in five B. aurantiacum genomes, which suggests cooperative evolution between smear-ripened cheese actinobacteria. Our comparative genomic analysis provides novel insights into the evolution and the adaptation of B. aurantiacum to the cheese ecosystem.

Ce travail de thèse a permis la mise au point d'un procédé d'encapsulation de bactéries probiotiques dans des matrices ne contenant que des ingrédients laitiers. L'étude à l'échelle laboratoire puis, le dimensionnement du procédé à l'échelle pilote ont permis la production de microparticules stables dans des milieux aqueux et résistantes à des conditions simulant l'estomac. La nature des protéines présentes mais également leurs proportions ont influencé la localisation des bactéries dans les microparticules : à la surface pour une matrice uniquement composée de caséine et à l'intérieur pour une matrice composée à la fois de caséines et de protéines solubles. L'interprétation de ces résultats par une étude à l'échelle moléculaire des interactions qui s'établissent entre les bactéries probiotiques et les protéines laitières a été possible grâce à l'utilisation de la microscopie à force atomique. Les protéines solubles interagissent de façon spécifique avec les bactéries alors que les caséines interagissent de façon non spécifique. De même, la présence de pili à la surface de la bactérie est favorable à la l'établissement d'interactions fortes entre LGG et les protéines solubles. Ce travail a donc permis d'expliquer des résultats obtenus à l'échelle macroscopique (taux d'encapsulation et de survie dans des conditions gastriques) grâce à des observations microscopiques et une étude à l'échelle nanoscopique des interactions entre les différents composants. Cette approche multi-échelle a élucidé certains mécanismes régissant l'encapsulation de bactéries probiotiques dans des matrices laitières
In this work thesis, an encapsulation process for probiotic bacteria using only milk proteins is developed. The laboratory scale followed by a pilot and an industrial scale development of the process allow the production of stable and resistant microparticles both in aqueous and gastric media. The nature and quantities of proteins added is found to influence the bacterial location in the microparticles. The bacteria are located mostly at the surface when only caseins are present. Oppositely, well encapsulated bacteria are observed when addition of whey proteins are performed. A molecular study of interactions established between milk proteins and bacteria is possible with the use of atomic force microscopy. Whey proteins are found to specifically interact with bacteria whereas the caseins establish non-specific links. In addition, the presence of piliated bacteria is found favorable to establish strong and long interactions between proteins and bacteria. This work permits the interpretation of results obtained at a macroscale (encapsulation rate and bacterial survival in stomach conditions) thanks to microscopic observations and nanoscopic interactions study. This multiscale approach permits the elucidation of mechanisms driving the probiotic encapsulation in milk matrices

Staphylococcus aureus et ses entérotoxines constituent un risque pour l’industrie alimentaire ainsi que pour les consommateurs. Environ la moitié des souches de S. aureus peuvent libérer des toxines menant à des symptômes de nausées, de diarrhées et de vomissements chez la personne ayant ingéré un produit contaminé. Une des solutions envisagées pour éliminer S. aureus et éviter la production d’entérotoxines, est l’utilisation d’un cocktail de phages. Au cours de ce projet de doctorat, trois objectifs ont été développés afin de poursuivre une stratégie de sélection d’un cocktail de phages anti-S. aureus. Tout d’abord, deux phages isolés du milieu laitier, adaptés à celui-ci et respectant des critères de sélection, ont été caractérisés. Ensuite, afin d’éviter un transfert de facteurs de virulence, des myophages anti-S. aureus ont été produits sur une souche de Staphylococcus xylosus, une espèce non-pathogène utilisée en transformation alimentaire et ont été caractérisés afin de confirmer leur identité lorsqu’amplifiés sur les deux espèces. D’un autre côté, l’efficacité contre une panoplie de souches de S. aureus isolées de sources distinctes, l’absence de gènes de virulence dans les génomes phagiques et la résistance à différentes conditions environnementales ont permis de sélectionner des phages différents. Ceux-ci ont fait l’objet de deux cocktails de phages efficaces menant à une réduction significative de la concentration de S. aureus dans des fromages de type Cheddar produits en laboratoire. De plus, ces phages n’ont pas déclenché une surproduction d’entérotoxines staphylococciques C, confirmant la sécurité de leur utilisation dans le milieu laitier. Enfin, la conservation des phages sous forme encapsulée et congelée dans des microbilles de gel d’alginate/calcium semble une approche à approfondir. Les phages staphylococciques virulents analysés dans cette thèse constituent d’excellents agents de biocontrôle étant non nocifs et infectant spécifiquement une espèce bactérienne donnée. Ayant confirmé l’efficacité de deux cocktails de phages, l’utilisation du produit phagique permettra de diminuer le risque d’apparition de souches bactériennes résistantes aux phages. De plus, entreprendre une mise à jour constante du cocktail phagique permettra de réduire la contamination causée par S. aureus, préservant ainsi l’innocuité et la qualité des aliments.
Staphylococcus aureus and its enterotoxins pose a risk to the food industry and for consumers. Approximately half of the S. aureus strains can release toxins leading to symptoms of nausea, diarrhea and vomiting to the person who ingests a contaminated product. One emerging solution to eliminating and preventing S. aureus enterotoxin production is the use of a phage cocktail. Through this doctoral project, three objectives were developed to pursue a strategy for selecting an anti-S. aureus phage cocktail based on well-defined criteria. First, a methodology was developed leading to the isolation and characterization of two phages from raw milk. Then, in order to avoid a transfer of virulence factors, anti-staphylococcal myophages were produced on a strain of Staphylococcus xylosus, a non-pathogenic species used in food processing. Their genomic identity when propagated separately on the two species was confirmed. Moreover, the host range of these phages was tested against a panel of S. aureus strains isolated from different sources. Their genome was analyzed to confirm the lack of virulence genes. In addition, their resistance to different environmental conditions was used to select different phages for application purposes. These data helped design two efficient phage cocktails leading to a significant drop of S. aureus concentration in small-scale laboratory-based Cheddar cheeses. In addition, they did not trigger the overproduction of staphylococcal enterotoxin C confirming the safety of their use in the dairy environment. Finally, in the aim of commercializing the product, conservation methods were investigated and the encapsulation and freeze of phages in micro-beads consisting of alginate/calcium gel particles appear promising. Staphylococcal virulent phages seem to be excellent biocontrol agents, being harmless and infecting specifically a given bacterial species. Having confirmed the efficacy of two phage cocktails, the use of the phage product could help decreasing the risk of emergence of phage resistant bacteria. Furthermore, undertaking a constant update of the phage cocktail could also help reducing contamination caused by S. aureus and thereby preserving safety and food quality.

Un isolat proteique de lactoserum (ipl) a ete soumis a un traitement thermomecanique d'extrusion en milieu fortement hydrate (77% d'eau). Un produit de type pate a tartiner de texture ferme et lisse est obtenu uniquement dans une zone de ph restreinte (3,5-3,9) a 20% (p/p) de proteines, pour une temperature de fourreau d'extrusion (tf) de 90c et une vitesse de rotation des vis (n) de 100-200 tpm. Ce produit est compose de particules proteiques microcoagulees (diametre moyen: 8-11 m, pour tf: 90c et n:100 tpm) mais contient encore une proportion importante de proteines solubles (indice de solubilite de l'azote: 45%). Lorsque le ph augmente (ph 4,0 a 6,8), l'ipl extrude perd sa texture lisse, sa fermete et sa cohesion; son indice de solubilite de l'azote diminue (25%, ph 6,8). L'addition de caseinate de calcium a l'ipl (melange ipl-caseinate de calcium: 50/50, p prot. /p prot. , 20% de proteines, p/p), et eventuellement de xanthane, permet d'obtenir, par traitement d'extrusion a ph neutre (6,7), un produit de texture lisse et tartinable (tf: 85-90c; n: 100 tpm). Le melange ipl-caseinate de calcium microcoagule (tf: 85c) en presence de 0,5% (p/p produit final) de xanthane est alors constitue de microparticules de proteines de lactoserum coagulees (diametre moyen: 5-7 m), enrobees de caseinate de calcium reste essentiellement soluble (indice de solubilite de l'azote du melange: 78%). Le meme ipl sous forme pulverulente (4-5% d'eau) inocule par streptococcus thermophilus (510#5 u. F. C. /g) a ete soumis a un traitement thermique d'extrusion sur une longueur de fourreau de 500 ou 1000 mm (tf: 80-204c; n: 50 tpm). Une reduction du nombre de streptococcus thermophilus viables a 1/10#4#,#2 (longueur de fourreau: 500 mm, tf: 143c) et de 1/10#4#,#9 (longueur de fourreau: 1000 mm, tf: 133c) a ete obtenue sans modification de la solubilite des constituants proteiques de l'ipl (evaluee par chromatographie de permeation de gel et d'interactions hydrophobes) et de ses proprietes gelifiantes

Une étude expérimentale sur le traitement thermique des fluides alimentaires fortement encrassants par des cellules ohmiques de géométrie rectangulaire a été réalisée. Cette étude a mis en évidence tout d'abord le lien étroit qui peut exister entre la structure de l'écoulement dans la cellule et la répartition du dépôt sur la surface des électrodes. Les mesures des profils de vitesse et de température dans une cellule non-encrassée ont montré que selon le comportement hydrodynamique (profil de vitesse et comportement rhéologique du fluide) le gradient de température entre la paroi et le cœur du fluide peut être plus ou moins important. Ensuite, des essais de chauffage de fluides modèles encrassants dans une cellule ohmique ont été réalisés. Ces essais ont montré l'existence de trois phases distinctes : (i) une première phase au cours de laquelle l'encrassement généré n'est pas décelable au travers les paramètres physiques mesurés (pression différentielle, température et puissance électrique consommée), (ii) une phase linéaire pendant laquelle les couches de dépôt s'échauffent continuellement par effet Joule jusqu'à atteindre la température d'ébullition à la pression de travail et (iii) une troisième phase qui correspond à une dégradation thermique du dépôt et potentiellement l'arrachement de ce dernier. Enfin, en se basant sur les résultats obtenus, un modèle mathématique a été développé afin de prédire l'épaisseur du dépôt à partir de l'évolution des paramètres électriques du système en fonction du temps de fonctionnement. La comparaison entre un Echangeur de Chaleur à Plaques et les cellules ohmiques a montré que lors du chauffage ohmique les cinétiques d'encrassement sont plus lentes que celles obtenues par les technologies classiques
An experimental study on the heat treatment of fouling food fluid by flat ohmic cells was carried out. This study highlighted first of all the close link existing between the flow structure and the deposit distribution on to electrode surfaces. Measurements of velocity and temperature profiles in a non-fouled ohmic cell showed that according to the hydrodynamic behavior (velocity profile and rheologic behavior of the fluid) the variation in the temperature gradient between the wall and the bulk could be more or less significant. Then, a specific study of the heat treatment of a fouling model fluid in an ohmic cell was carried out. This study showed the existence of three distinct phases: (i) a first phase in which no evolution of the process parameters could be observed, (ii) a linear phase, where the deposit layers build up on the electrode surfaces was heated continuously by the Joule effect until reaching the boiling point and (iii) a third phase which corresponded to an overheating of the deposit layers with potential removal phenomenon. Lastly, based on the results obtained, a mathematical model was developed in order to predict the thickness of the deposit from the evolution of the electric parameters versus the operating time. The comparison between a Plate Heat Exchanger and the ohmic apparatus in terms of deposit thickness clearly showed different kineticks evolutions, apparently in favour of the ohmic technology

L'industrie laitière est un secteur majeur de l'agro-alimentaire, représentant 20% du total des industries agroalimentaires le fromage, premier produit de transformation du lait, occupe une place prépondérante, notamment en France et au Québec. La demande croissante des consommateurs pour des produits naturels et sains, associée à la nécessité de prolonger la durée de conservation des fromages, pousse les professionnels du secteur à adopter des pratiques de « Clean Label » et à développer des techniques de biopréservation, pour préserver la qualité des produits tout en répondant aux préoccupations sanitaires et de naturalité. Les écosystèmes fromagers abritent une grande diversité microbienne, qui participe à leur typicité, et représentent une opportunité de découvrir des candidats potentiels pour la biopréservation. L'isolement de souches possédant une activité antimicrobienne dans le fromage devient de plus en plus intéressant, notamment pour l'inhibition des microorganismes d'altération et/ou pathogènes. Dans ce projet, deux fromages artisanaux français et deux fromages québécois ont été sélectionnés. La caractérisation globale du microbiote des fromages français a été réalisée en utilisant des méthodes moléculaires, afin de visualiser leur typicité et leur diversité microbiologique. Grâce à un isolement systématique des microorganismes de ces fromages, un total de 794 isolats de bactéries, levures et moisissures ont pu être caractérisés pour leurs activités antimicrobiennes sur gélose double couche. L'activité antifongique a été testée contre 3 levures et 4 moisissures indésirables. L'activité antibactérienne a été expérimentée contre 9 bactéries pathogènes ou d'altération. Les 36 isolats fromagers ayant démontré une capacité d'inhibition vis-à-vis des différents contaminants ont été identifiés par séquençage de l'ARNr 16S (bactéries) ou des ITS (levures). Parmi elles, les levures Metschnikowia pulcherrima LMA-2038, du Carré du Vinage, et Trichosporon asahii LMA-810, de la Rose Blanche, ont montré des activités à la fois antifongiques (contre Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa, Cladosporium cladosporioides et Penicillium commune) et antibactériennes (contre Listeria innocua et Clostridium tyrobutyricum). Leur potentiel comme agent de biopréservation a été testé dans des fromages modèles. Leur ajout a significativement diminué la croissance des deux levures contaminantes Y. lipolytica et R. mucilaginosa. Des tests de caractérisation des potentiels composés de biopréservation ont été réalisés afin de mieux comprendre la nature des molécules impliquées dans ces activités antagonistes. Ces travaux confirment que les fromages sont des réservoirs potentiels de souches antimicrobiennes qui pourraient servir comme agent de biopréservation et participer au développement d'outil pour répondre au « Clean Label »
The dairy industry is a major sector of the agri-food industry, representing 20% of the total agri-food industries. Cheese, as the primary product of milk transformation, holds a significant position, particularly in France and Quebec. Increasing consumer demand for natural and healthy products, coupled with the need to extend the shelf life of cheeses, is driving industry professionals to adopt “Clean Label” practices and develop biopreservation techniques to preserve product quality while addressing health and naturalness concerns. Cheese ecosystems host a diverse microbial population that contributes to their typicity and offer an opportunity to discover potential candidates for biopreservation. The isolation of strains with antimicrobial activity from cheese has become increasingly interesting, especially for inhibiting spoilage and/or pathogenic microorganisms. In this project, two artisanal French cheeses and two Quebec cheeses were selected. The overall characterization of the microbiota in French cheeses was conducted using molecular methods to visualize their uniqueness and microbial diversity. Through systematic isolation of microorganisms from these cheeses, a total of 794 isolates comprising bacteria, yeasts, and molds were characterized for their antimicrobial activities on double-layer agar. Antifungal activity was tested against 3 undesirable yeasts and 4 molds, while antibacterial activity was experimented against 9 pathogenic or spoilage bacteria. Among these, 36 cheese isolates demonstrating inhibition capacity against various contaminants were identified through sequencing of 16S rRNA (bacteria) or ITS (yeasts). Among them, yeasts Metschnikowia pulcherrima LMA-2038 from “Carré du Vinage” and Trichosporon asahii LMA-810 from “Rose Blanche” exhibited both antifungal activity (against Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa, Cladosporium cladosporioides, and Penicillium commune) and antibacterial activity (against Listeria innocua and Clostridium tyrobutyricum).Their potential as biopreservation agents was tested in model cheeses, significantly reducing the growth of the two contaminating yeasts, Y lipolytica and R. mucilaginosa. Characterization tests of potential biopreservation compounds were conducted to better understand the nature of the molecules involved in these antagonistic activities. These findings confirm that cheeses are potential reservoirs of antimicrobial strains that could serve as biopreservation agents and contribute to the development of tools to meet "Clean Label" requirements

C’est l’étude de quelques caractères phénotypiques et du génotype de souches de Staphylococcus aureus isolées de cas de mammites chez des brebis laitières dans la région Provence Alpes Côte d’Azur (PACA). Le génotypage (PFGE, MLST, RAPD-PCR, RFLP) a montré que ces souches de S. Aureus étaient génétiquement proches. Les souches étudiées ont exprimé une forte capacité relative d’adhérence et de formation de slime, malgré l’absence du gène bap (codant la biofilm-associated protein) mais avec la présence des gènes icaA-D chez la majorité des souches. Quarante six souches ont été testées vis à vis de 10 antibiotiques et ont montré une faible résistance en relation avec l’absence de plasmides. La production d’entérotoxines A-D in vitro à partir de 15 souches a souligné que la relative homogénéité génétique des souches cachait une variabilité phénotypique. Cent treize isolats provenant des trois espèces laitières ont étés comparés en utilisant la technique des puces à ADN avec le marqueur Cy5 (187 gènes de virulence). Les résultats ont mis en évidence certaines signatures génétiques en relation avec la clonalité des souches régionales ainsi que des gènes spécifiques aux souches « ovins-caprins » versus « bovins ». L’adaptation au portage nasal ne semble pas le fait de particularités génétiques propres. La partie II a permis par la comparaison de deux souches, l’une responsable de mammite subclinique et l’autre de mammite gangreneuse, de montrer que sur un fond de souches « endémiques » (étudiées dans la partie I) certaines souches avaient, avec un potentiel génétique différent, le pouvoir de provoquer des pathologies mammaires plus sévères
This study characterized phenotypic and genotypic traits of Staphylococcus aureus isolates recovered from dairy sheep farm in Provence-Alpes-Côte d’Azur (PACA). The typing by PFGE, MLST, RAPD-PCR, RFLP shown that the strains were genetically related. Among forty six strains tested for adherence and slime production, 39% and 26% were positive respectively despite the absence of bap gene (coding the biofilm-associated protein) but with the presence of the intercellular adhesion locus (icaA-D). The strains were mainly susceptible to ten antibiotics (absence of plasmids). The in vitro production of enterotoxins A-D in fifteen isolates illustrated the phenotypic variability for this parameter in these genetically related strains. A genomic comparative study was carried out on 113 S. Aureus isolates recovered from sheep, goats, cows, from nostrils recovered from regional sheep and from other dairy sheep farms in France. For this purpose, a single-dye DNA microarray had been developed for simultaneous characterization of 187 genes implicated in S. Aureus virulence. The screening of the 113 isolates allowed us to identify a few genes or alleles which were specifically associated with the regional dairy sheep in correlation to their genetic clonality. Some genes had been found to be specific to small ruminants versus cows. The nasal carriage isolates had identical genetic specificity in comparison with mastitis isolates. The S. Aureus strains compared in the part two shown that gangrenous mastitis had genetic particularities (presence of genes of virulence) in comparison with the strains responsible of subclinical mastitis

Le premier objectif de cette thèse est d'étudier la composante fongique du microbiote des ruminants, en particulier celui des vaches laitières. Pour cela, le mycobiote intestinal de vaches laitières a été ciblé selon deux régimes alimentaires saisonniers différents, un régime hivernal et un régime estival, permettant de mettre en évidence l'impact de l'alimentation et de la saison sur le mycobiote intestinal. L'analyse de la beta-diversité a montré un mycobiote différent selon le type d'alimentation. En effet, les vaches ont reçu une alimentation estivale en pâturage et une alimentation hivernale qui est composée de foins, d'ensilage de maïs et d'herbe et de concentré de production. Les indices d'alpha-diversité (Simpson inverse, Chao1, uniformité de Simpson) démontrent une plus grande richesse, une diversité et une uniformité du mycobiote avec l'alimentation estivale, et une chute de ces mêmes paramètres lors de l'alimentation hivernale. Dans notre analyse, nous avons remarqué que le genre Geotrichum est présent chez tous les ruminants de cette étude en hiver et compose la majorité du mycobiote (abondance relative moyenne de 65%). Une seconde étude a permis de mettre en évidence un mycobiote composé d'une unité taxonomique opérationnelle (OTU) appartenant à la famille des Dipodascaceae, présente dans tous les compartiments du tractus gastrointestinal (rumen, colon, rectum). L'OTU n'a pas pu être identifiée plus profondément, mais il est à noter que le genre Geotrichum appartient à la famille Dipodascaceae. L'analyse de la beta-diversité de ces mêmes échantillons a été réalisée, après extraction de l'ADN avec 3 kits (MN, ZQ et ZM) et l'analyse des profils mycobiotiques a pu mettre en évidence des différences entre le profil obtenu en utilisant l'ADN extrait avec un kit commercial recommandé pour les analyses des microbiotes (ZM), et les profils obtenus avec les deux autres kits (MN et ZQ). Le deuxième objectif de cette thèse porte sur la recherche de levures non-Saccharomyces comme souches probiotiques pour les ruminants. Le criblage d'une collection de 431 levures non-Saccharomyces pour leurs propriétés inhibitrices contre des bactéries à Gram-positif et à Gram négatif a permis de montrer que 71 souches ont au moins une activité inhibitrice contre une de ces cibles. Toutefois, pour la suite de cette thèse, 6 levures non- Saccharomyces ont été sélectionnées : ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 et ICVY064, en raison de leur spectre d'activité in vitro contre des pathogènes du ruminant, en conditions aérobie et anaérobie à 30°C et 39°C. A noter que deux souches ICVY060 et LAN55 ont montré le plus large spectre d'activité contre toutes les bactéries cibles. Enfin, ces 6 souches se sont avérées être non cytotoxiques, non hémolytiques, sensibles aux principaux antifongiques utilisés en clinique et survivent relativement mieux in vitro que le probiotique Saccharomyces cerevisiae CNCM-I-1077 dans des conditions mimant l'abomasum. D'autres tests tels que les propriétés de surface, ou encore leur impact sur l'expression des gènes codant les protéines de jonctions cellulaires intestinales ont été réalisés
The first objective of this thesis was to study the fungal component of ruminant microbiota, particularly in dairy cows. To this end, we targeted the intestinal mycobiota of dairy cows differently fed and considering also the impact of the seasonality. Therefore, the analysis of beta-diversity showed a different mycobiota, depending on the type of feed received. The cows were fed with a summer pasture diet and a winter diet constituted of hay, corn and grass silage and production concentrate. The alpha diversity indices (Simpson inverse, Chao1, Simpson uniformity) unveiled a greater richness, diversity and uniformity of mycobiota with summer feeding, and a noticeable decrease in these parameters with winter feeding. In our analysis, we found that Geotrichum genus was present in all ruminants in this study in winter, leading to the highest relative abundance 65%. A second study revealed a mycobiota composed of an operational taxonomic unit (OTU) belonging to the Dipodascaceae family and present in all compartments of the gastrointestinal tract (rumen, colon, rectum). The OTU could not be further identified, but it should be noted that the Geotrichum genus belongs to the Dipodascaceae family. Analysis of the beta-diversity of these same samples was carried out after DNA extraction using 3 different kits, and analysis of the mycobiotic profiles revealed differences between the profile obtained using DNA extracted with a commercial kit recommended for microbiota analysis (ZM), and the profiles obtained with the other two kits (MN and ZQ). The second objective was to screen and characterize a collection of non-Saccharomyces yeasts for their probiotic trends and design a potential application in the animal production, particularly in ruminants. Following a screening of a collection of 431 non-Saccharomyces yeasts for their inhibitory activity against Gram-positive target bacteria and Gram-negative bacteria, 71 strains showed inhibitory activity against at least one of the target bacteria. Nonetheless, we considered 6 non-Saccharomyces yeasts (ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 and ICVY064) due to their spectrum of activity in vitro against ruminant pathogens, under both aerobic and anaerobic conditions and prevailing temperatures of 30°C and 39°C. Two strains, ICVY060 and LAN55, showed the broadest spectrum of activity by inhibiting all targeted bacteria. Of note, these strains were characterized for their resistance to conditions mimicking those prevailing in the animal abomasum and intestine compartments, with better survival rate in the in vitro abomasum conditions. Finally, all these strains resulted to be safe as non-cytotoxic, non-hemolytic activity was registered and were also sensitive to the main antifungal agents of clinical use. Further analyses, such as their surface properties or their impact on membrane integrity by studying the expression of genes encoding cell junction proteins were established

Le procédé de thermisation du lait est très utilisé dans la fabrication des fromages mais les risques associés à cette pratique en terme de danger bactérien «L. Monocytogenes» étaient jusqu'à ce jour peu connus faute de données disponibles sur le comportement de ce pathogène dans le lait thermisé comparé à celles obtenues sur le lait cru. L'objectif de ce travail de thèse était d'évaluer l'incidence des barèmes de thermisation sur la cinétique de croissance de L. Monocytogenes et de mettre en évidence de possibles interactions entre la flore microbienne des laits crus et ce pathogène. La description des espèces microbiennes présente au cours de la croissance de L. Monocytogenes dans les laits crus et les laits thermisés, a été réalisée par une nouvelle approche moléculaire que nous avons développée. Cette approche est basée sur l'analyse directe de l'ADN microbien, extrait des échantillons de lait, puis l'amplification par PCR et la séparation électrophorétique, en conditions, dénaturantes, de fragments d'ADNr discriminants entre espèces. Pour l'identification rapide des espèces, nous avons constitué des bases de données regroupant les empreintes électrophorétiques des différentes espèces microbiennes rencontrées dans les produits laitiers. Ainsi, par comparaison des profils microbiens des laits aux bases de données, nous pouvons identifier rapidement (2 à 3 jours) et de façon précise, les espèces microbiennes présentes dans les échantillons de lait. Les résultats de ce travail de recherche montrent que les pratiques de thermisation du lait systématisées en technologie fromagère présentent des risques. Ils sont liés soit à l'emploi de barèmes de thermisation insuffisants soit, dans le cas d'une éventuelle recontamination après traitement, au caractère propice à la croissance de L. Monocytogenes des laits thermisés. La population en bactéries lactiques résiduelle, après thermisation semble être un facteur déterminant de l'inhibition de L. Monocytogenes
Milk thermization is often used in cheese making but risks associated to this practice on "L. Monocytogenes" bacterial danger were to date little known as data comparing the behaviour of this pathogen in raw milk and thermized milk were not available. The objective of this work was to evaluate the effect of the thermization sca1es on the growth kinetics of L. Monocytogenes and to show up the interactions between the microbial species of raw milks and this pathogen. The description of the microbial species in raw milks and thermized milks was performed by a new molecular approach we have deve1oped. This approach is based on the direct analysis of microbial DNA extracted from milk samples, PCR amplification and e1ectrophoretics separations in denaturing conditions of ribosomal DNAr fragments that discriminate microbial species. For rapid species identifications, exhaustive reference databases were created inc1uding electrophoresis fingerprints of microbial species met in dairy products. By comparing milks microbial profiles to the reference database we were able to rapidly (2-3 days) identify the microbial species in milk samples. Results of this work shows that industrial dairy practices that consist to heat milk be1ow the pasteurization treatment in order to reduce contaminations by L. Monocytognes present a risk. According to the applied treatment (time x temperature) and the level of contamination by L. Monocytogenes, thermization can be insufficient to destroy all Listeria. We have also shown that thermized milk is more favourable to L. Monocytogenes recontamination than raw milk. The residual population of lactic bacteria after thermization seems to be a determinant factor in the inhibition of L. Monocytogenes

Au cours des dernières décennies, les produits laitiers riches en matières grasses ont été associés à une prise de poids et à des syndromes métaboliques générant une évaluation négative de la part des consommateurs. Cependant, des études scientifiques révèlent la présence de protéines laitières et leurs hydrolysats en peptides comme ingrédients alimentaires fonctionnels, favorables à la santé. Compte tenu des propriétés ambivalentes des produits laitiers riches en protéines hydrolysées et en gras dans l’alimentation humaine, des études scientifiques ont démontré que la composition du microbiote intestinal peut être est modulée par la présence et la disponibilité de nutriments et autres aliments fonctionnels et avoir un impact sur l’état physiologique de l’hôte. Ce projet de recherche visait à évaluer les effets de régimes alimentaires enrichi en produits laitiers riches en gras et en protéines lactiques sur la structure du microbiote intestinal associée à des paramètres cliniques de la lipidémie. Dans le cadre ces travaux des porcs ont été utilisés comme modèle animal pour caractériser l’impact des traitements alimentaires sur le microbiote de l’iléon, du côlon et des fèces en utilisant une approche métataxonomique avec un séquençage à haut débit Illumina MiSeq. Dans la première partie de ce projet, des porcs ont été nourris avec un régime alimentaire riche en gras animal (20%) et en fructose (HFF) ou un régime côntrole (LF) de base faible en gras (3%) pour établir un modèle porcin permettant l’étude du microbiote intestinal associé au développement de syndrome métabolique en lien avec l’obésité. Des échantillons de digesta provenant de l’iléon, du côlon et de matières fécales ont été prélevés à 12 semaines de traitement. Les ADN ont été extraits en utilisant une technique d’isolement et de purification d’ADN de haute qualité préalablement standardisée et rigoureusement établie et ensuite séquencés et une analyse bioinformatique des séquences a été générée à partir du logiciel QIIME v.1.9.1. Les profils des compositions des microbiotes intestinaux des groupes HFF et LF ont été caractérisés et groupés en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) pour estimer les dissimilitudes de diversité alpha et bêta de manière statistique par la méthode discriminante LEfSe (score LDA significatif> 2,0). Selon les résultats statistiques de diversité du microbiote intestinal, le groupe HFF a montré une composition de dysbioses. Les genres Fusobacteria, Desulfovibrio et l’Anaerovibrio ont augmenté de façon significative (p <0,05) dans le groupe de porcs nourris au HFF. Fusobacteria est un puissant pathogène porteur de lipopolysaccharides (LPS), tandis que Desulfovibrio est un réducteur de sulfates et l’Anaerovibrio un genre de bactéries d’activité lipolytique. Ces profils métataxonomiques du microbiote ont aussi été liés III à l’augmentation des paramètres de lipidémie dans le sang périphérique. Ensuite, la composition bactérienne a aussi été déterminée par un qPCR spécifique afin de cibler des bactéries associées aux syndromes métaboliques. Ces résultats constituent une base de référence importante pour caractériser un régime obésogène associé à la dysbiose microbienne intestinale chez le porc. Dans la deuxième partie de ce projet, afin de valider les effets du régime riche en gras du lard sans fructose (HF), un deuxième essai a été réalisé. Dans cet essai, les résultats obtenus ont montré des profils de diversités alpha, bêta, qPCR et des distances significatives entre le traitement HF et le traitement témoin faible en gras. Cependant, les réponses de la lipidémie et le taux de LPS n’ont pas montré différence significative entre les traitements. Ces résultats montrent aussi que le régime alimentaire riche en gras animal peut modifier significativement les structures écologiques du microbiote sans entraîner nécessairement de changement physiologique chez l’hôte. Finalement, la troisième partie du projet visait à caractériser la composition du microbiote intestinal de porcs en croissance alimentés avec un régime de base sans protéines laitières et contenant 18 % de gras animal, un deuxième régime avec 8% de gras laitier (beurre) et à troisième régime enrichi en fromage cheddar. Ce dernier régime riche en peptides laitiers est hautement hydrolysé. L’analyse discriminante du LDA-LEfse et les mesures de la diversité alpha et bêta ont démontré un effet neutre sur le microbiote intestinal soumis au régime du cheddar. Cependant, des différences significatives sur les mesures de diversité ont été observées avec le traitement au beurre. L’augmentation de l’abondance relative des Enterobactériceae, Mogibacteriacea, Bifidobacterium pseudolongum, Paraprevotella, Phasolarctobacterium, Turicibacter, Clostridiaceae Akkermansia sp., Bacteroides sp., Lactobacillus reuteri et Ruminococcus a été constatée de façon significative dans le microbiote associé au traitement enrichi en beurre. De plus, l’augmentation significative d’Akkermansia et de Ruminococcus gnavus, suggère une modification du microbiote associé au traitement enrichi en beurre. Ces deux clades sont étroitement liés à la dégradation de la mucine, un indicateur de la santé de l’intégrité intestinale. Dans ce chapitre, le niveau taxonomique au moyen des oligotypes du genre d’Akkermansia chez le modèle porcin a été identifié pour décrire l’oligodiversité correspondante à ce taxon d’importance. Les résultats des oligotypes ont révélé neuf séquences d’oligotypes d’Akkermansia, dans les échantillons du côlon et des selles du groupe de porcs nourris avec le régime contenant du beurre. C’est la première fois qu’une telle profondeur d’analyse métataxonomique hautement discriminante a été réalisée chez IV un modèle porcin. Selon les résultats obtenus, le modèle porcin permet de caractériser le microbiote intestinal dans chaque section intestinale de façon discriminante, et cela, en raison de régimes alimentaires. Finalement, les régimes contenant du beurre comme source de gras laitier ou du fromage cheddar ont des effets convergents sur la relation hôte-microbiote et qui peuvent être observés distinctement à travers des structures microbiennes dans les sections intestinales.
In recent decades, dairy products have been associated with weight gain due to their high fat milk content, generating a negative consumer assessment. However, scientific studies revealed beneficial effects of dairy products such as cheese due to the presence of functional peptides produced from hydrolysis, as favorable ingredients for health. Nevertheless, several cheeses as cheddar contain a high concentration of dairy fat. Given the interest to know how the dairy products could affect the clinical physiology of host, studies about the gut microbiota structures has been proposed. However, controversial results from these studies have been obtained. This thesis aimed to evaluate the effects of butter and proteins hydrolysate from cheese on the structure of the gut microbiota associated with clinical parameters of lipidemia. The goal of this project was to characterize microbiota variations in the intestinal sections of the ileum, colon and fecal sample using a metataxonomic approach with Illumina MiSeq high-throughput sequencing. In the first part of this project, a porcine model was established to provide a model for the study of gut microbiota associated with obesity from fecal samples including ileum and colon. In the first part of this study, the approach of isolation and purification of high-quality DNA has been standardized and established. Subsequently, a bioinformatics pipeline was generated using QIIME v.1.9.1 open source software. Later, a trial was defined in pigs fed with lard-fructose (HFF). At 12 weeks of treatment, a dysbiosis process was associated with diet-induced changes estimated by a LEfse discriminant method (significant LDA score> 2.0), as well as alpha and beta diversity. The genus Fusobacteria, a potent pathogen carrying LPS, associated with sulfate-reducing bacteria such as Desulfovibrio and Anaerovibrio a genus of bacteria with lipolytic activity, showed a significant increase (p-value <0,05) of this model fed to HFF in pigs. These metataxonomic profiles of the pig gut microbiota have also been linked to an increase in lipidemia parameters in the peripheral blood. This microbiota composition was also profiled to metabolic syndromes by qPCR. These results constitute an important reference base for the characterization of an obesogenic diet associated with gut microbial dysbiosis. In order to validate the effects of the high-fat free-fructose (HF) diet, a second test was performed. In this trial, the results obtained showed an asymptomatic dysbiosis. Indeed, alpha and beta diversity profiles, in addition to qPCR profiling, showed significant distances between HF treatment and low-fat treatment control. However, the measure of lipidemia (cholesterol and triglycerides) and the level of LPS were irrelevant between treatments. These results showed that the high-fat diet can significantly alter the VI ecological structures of the microbiota without necessarily causing physiological changes in the host. Finally, the third part of the project, consisting in the characterization of the impact of diets with butter or cheddar cheese composed of highly hydrolyzed peptides, on the gut microbiota of pig model. The ileum, the colon, and the feces were sampled at 10 weeks. Measurements of the Bray-Curtis dissimilarity and Weighted-UniFrac phylogenetic distances, and the LDA-LEfse discriminatory analysis of the beta and alpha diversities demonstrated a neutral effect on the gut microbiota subjected to the cheddar diet, while significant dissimilarities were observed with the butter treatment. The abundance of Enterobacteriaceae, Mogibacteriaceae, Bifidobacterium pseudolongum, Paraprevotella, Phasolarctobacterium, Turicibacter, Clostridiaceae Akkermansia sp., Bacteroides sp., Lactobacillus reuteri, and Ruminococcus characterized the gut microbiota of the treatment with butter. The significant increase of Akkermansia and Ruminococcus gnavus in (two clades closely related to the degradation of mucin, which is a health indicator of intestinal integrity), suggest an alteration of the gut microbiota due to butter treatment, which could be proposed as biomarkers to comply with the control diet with lard-HF. We highlighted the identification of the taxonomic level by oligotypes of the genus Akkermansia in the pig model. This identification revealed nine signed-oligotypes from the Akkermansia taxon, in the colon and fecal samples of pigs fed butter. This was the first time that a highly discriminating depth of metataxonomic analysis was performed in the pig model. The pig as a model that allows the characterization of the gut microbiota affected by a dietary treatment. Finally, diets enriched with cheddar cheese and butter have convergent effects on the host-microbiota relationship and can be observed distinctly through microbial structures in the intestinal sections.

L’usage des produits microbiens administrés directement (aussi appelés probiotiques) gagne de l’intérêt comme alternative à l’utilisation des antibiotiques comme promoteurs de croissance dans les élevages. Cependant, très peu d’informations existent quant à l’influence des probiotiques sur la modulation du microbiote gastrointestinal et la réponse immunitaire innée chez le veau laitier. Les objectifs de cette thèse visaient à (1) Étudier l’effet de Lactobacillus acidophilus BT 1386 ou de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1- 1079 sur les constituants sanguins, biochimiques / chimiques du sang. (2) Déterminer les mécanismes potentiels d’une réponse immunitaire renforcée de Lactobacillus acidophilus BT 1386 et de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079. (3) Déterminer comment Lactobacillus acidophilus BT 1386 ou Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079 modulent la composition de la communauté microbienne GIT de veau par séquençage de nouvelle génération de la région V3-V4 du gène ARNr 16S. (4) Comparer l'efficacité de ces deux DFM avec la tetracycline-néomycine, un promoteur de croissance antibiotique. Quatre traitements ont été distribués aléatoirement à 48 veaux âgés de 2 à 7 jours (n=12). TÉMOIN : lactoremplaceur (LR) suivi d’une moulée de démarrage (MD); SCB) TÉMOIN + Saccharomyces cereviseae var. boulardii CNCM I-1079 [7,5 × 108 unités formatrices de colonie (CFU)/L de LR + 3 × 109 CFU/kg de MD]; LA) TÉMOIN + Lactobacillus acidophilus BT 1386 (2,5 × 108 CFU/L de LR + 1 × 109 CFU/kg de MD); ATB) TÉMOIN + traitement antibiotique composé de chlortétracycline (528 mg/L de LR + 55 mg/kg de MD) et de néomycine (357 mg/L de LR). Les animaux ont été élevés selon les procédures d’élevage conventionnelles pendant les 96 jours de la période expérimentale. Des échantillons de sang ont été prélevés de la veine jugulaire à différents moments pendant les périodes de pré-sevrage (jours 1 à 42), de sevrage (jours 43 à 53) et de post-sevrage (jours 54 à 96). Aux jours 33 et 96 dans chacun des groupes, 4 veaux ont été euthanasiés afin de prélever des échantillons de tissus et de digesta. Des SCB viables ont été retrouvées tout au long du tractus gastrointestinal, ainsi que dans les fèces des veaux en périodes pré- et post-sevrage. Autour du sevrage, les fèces du groupe SCB contenaient une population de lactobacilli plus importante que celles du groupe TÉMOIN. Au cours de la période pré-sevrage, la distribution des lactobacilli évoluait graduellement à travers les sections du tube digestif (colon > contenu iléal > rumen > muqueuse iléale). À l’exception du rumen, tous les autres compartiments présentaient une population de lactobacilli réduite en post- vs. en pré-sevrage. Comparativement aux groupes TÉMOIN et LA, la profondeur et la largeur des cryptes du colon des groupes SCB et ATB étaient réduites. Toujours comparativement aux groupes TÉMOIN et LA, le nombre de cellules caliciformes contenant des mucines neutres tendait à augmenter pour les groupes SCB et ATB, alors que le nombre de mucines acides augmentaient. Globalement, les traitements n’ont pas affecté les performances des animaux. Pendant le sevrage, une amélioration de la stimulation oxydative et de la phagocytose, ainsi qu’une augmentation des concentrations des protéines de la phase aiguë, ont été observées chez les groupes SCB et LA. L’ajout de probiotiques à la diète du veau a eu moins d’impact sur la diversité bactérienne mais a tout de même modifié significativement l’abondance des différentes populations microbiennes, et ce plus particulièrement dans l’iléon. L’ajout de SCB ou de LA a réduit l’abondance de certains genres bactériens pathogènes, tels que Streptococcus et Tyzzerella_4, alors que cela a augmenté l’abondance de bactéries potentiellement bénéfiques pour l’hôte tel que celles appartenant au genre Fibrobacter. Par ailleurs, d’autres bactéries bénéfiques tel que Rumminococcaceae UCG 005 et Olsenella étaient aussi plus abondantes, mais seulement pour le traitement SCB. Les bactéries pathogènes Peptoclostridium et Ruminococcus_2 étaient respectivement moins abondantes lorsque les traitements SCB et LA étaient ajoutés à la ration. Les analyses de prédiction fonctionnelle ont montré qu’en plus des effets observés sur les voies métaboliques locales impliquées dans le cycle cellulaire, la sécrétion biliaire et les voies de signalisation de l’AMPc et du proteasome, l’ajout des deux formes de probiotiques a également affecté d’importantes voies impliquées au sein d’autres tissus comme la synthèse des hormones thyroïdiennes ou le fonctionnement des synapses dopaminergiques. Cette étude suggère que les probiotiques, et plus particulièrement SCB, devraient être davantage considérés comme modulateur de la santé gastro-intestinale du veau laitier. Aussi, la supplémentation en SCB, en améliorant la réponse immunitaire innée, permettrait de stimuler le système immunitaire du veau avant l’infection, le préparant ainsi à mieux affronter les périodes plus sensibles comme celle du sevrage. Le SCB et le LA ont modifié la composition en bactéries du GIT. Dans l’ensemble, cette étude a montré une démonstration remarquable de l’importance du DFM sur le microbiote de la TI. Cependant, il faut mieux comprendre les molécules et les mécanismes qui déterminent le rôle du microbiote, puis exploiter ces connaissances pour améliorer la santé et augmenter la production animale
L’usage des produits microbiens administrés directement (aussi appelés probiotiques) gagne de l’intérêt comme alternative à l’utilisation des antibiotiques comme promoteurs de croissance dans les élevages. Cependant, très peu d’informations existent quant à l’influence des probiotiques sur la modulation du microbiote gastrointestinal et la réponse immunitaire innée chez le veau laitier. Les objectifs de cette thèse visaient à (1) Étudier l’effet de Lactobacillus acidophilus BT 1386 ou de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1- 1079 sur les constituants sanguins, biochimiques / chimiques du sang. (2) Déterminer les mécanismes potentiels d’une réponse immunitaire renforcée de Lactobacillus acidophilus BT 1386 et de Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079. (3) Déterminer comment Lactobacillus acidophilus BT 1386 ou Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079 modulent la composition de la communauté microbienne GIT de veau par séquençage de nouvelle génération de la région V3-V4 du gène ARNr 16S. (4) Comparer l'efficacité de ces deux DFM avec la tetracycline-néomycine, un promoteur de croissance antibiotique. Quatre traitements ont été distribués aléatoirement à 48 veaux âgés de 2 à 7 jours (n=12). TÉMOIN : lactoremplaceur (LR) suivi d’une moulée de démarrage (MD); SCB) TÉMOIN + Saccharomyces cereviseae var. boulardii CNCM I-1079 [7,5 × 108 unités formatrices de colonie (CFU)/L de LR + 3 × 109 CFU/kg de MD]; LA) TÉMOIN + Lactobacillus acidophilus BT 1386 (2,5 × 108 CFU/L de LR + 1 × 109 CFU/kg de MD); ATB) TÉMOIN + traitement antibiotique composé de chlortétracycline (528 mg/L de LR + 55 mg/kg de MD) et de néomycine (357 mg/L de LR). Les animaux ont été élevés selon les procédures d’élevage conventionnelles pendant les 96 jours de la période expérimentale. Des échantillons de sang ont été prélevés de la veine jugulaire à différents moments pendant les périodes de pré-sevrage (jours 1 à 42), de sevrage (jours 43 à 53) et de post-sevrage (jours 54 à 96). Aux jours 33 et 96 dans chacun des groupes, 4 veaux ont été euthanasiés afin de prélever des échantillons de tissus et de digesta. Des SCB viables ont été retrouvées tout au long du tractus gastrointestinal, ainsi que dans les fèces des veaux en périodes pré- et post-sevrage. Autour du sevrage, les fèces du groupe SCB contenaient une population de lactobacilli plus importante que celles du groupe TÉMOIN. Au cours de la période pré-sevrage, la distribution des lactobacilli évoluait graduellement à travers les sections du tube digestif (colon > contenu iléal > rumen > muqueuse iléale). À l’exception du rumen, tous les autres compartiments présentaient une population de lactobacilli réduite en post- vs. en pré-sevrage. Comparativement aux groupes TÉMOIN et LA, la profondeur et la largeur des cryptes du colon des groupes SCB et ATB étaient réduites. Toujours comparativement aux groupes TÉMOIN et LA, le nombre de cellules caliciformes contenant des mucines neutres tendait à augmenter pour les groupes SCB et ATB, alors que le nombre de mucines acides augmentaient. Globalement, les traitements n’ont pas affecté les performances des animaux. Pendant le sevrage, une amélioration de la stimulation oxydative et de la phagocytose, ainsi qu’une augmentation des concentrations des protéines de la phase aiguë, ont été observées chez les groupes SCB et LA. L’ajout de probiotiques à la diète du veau a eu moins d’impact sur la diversité bactérienne mais a tout de même modifié significativement l’abondance des différentes populations microbiennes, et ce plus particulièrement dans l’iléon. L’ajout de SCB ou de LA a réduit l’abondance de certains genres bactériens pathogènes, tels que Streptococcus et Tyzzerella_4, alors que cela a augmenté l’abondance de bactéries potentiellement bénéfiques pour l’hôte tel que celles appartenant au genre Fibrobacter. Par ailleurs, d’autres bactéries bénéfiques tel que Rumminococcaceae UCG 005 et Olsenella étaient aussi plus abondantes, mais seulement pour le traitement SCB. Les bactéries pathogènes Peptoclostridium et Ruminococcus_2 étaient respectivement moins abondantes lorsque les traitements SCB et LA étaient ajoutés à la ration. Les analyses de prédiction fonctionnelle ont montré qu’en plus des effets observés sur les voies métaboliques locales impliquées dans le cycle cellulaire, la sécrétion biliaire et les voies de signalisation de l’AMPc et du proteasome, l’ajout des deux formes de probiotiques a également affecté d’importantes voies impliquées au sein d’autres tissus comme la synthèse des hormones thyroïdiennes ou le fonctionnement des synapses dopaminergiques. Cette étude suggère que les probiotiques, et plus particulièrement SCB, devraient être davantage considérés comme modulateur de la santé gastro-intestinale du veau laitier. Aussi, la supplémentation en SCB, en améliorant la réponse immunitaire innée, permettrait de stimuler le système immunitaire du veau avant l’infection, le préparant ainsi à mieux affronter les périodes plus sensibles comme celle du sevrage. Le SCB et le LA ont modifié la composition en bactéries du GIT. Dans l’ensemble, cette étude a montré une démonstration remarquable de l’importance du DFM sur le microbiote de la TI. Cependant, il faut mieux comprendre les molécules et les mécanismes qui déterminent le rôle du microbiote, puis exploiter ces connaissances pour améliorer la santé et augmenter la production animale.
There is interest in the use of direct-fed microbials (DFM) as substitutes for antibiotic growth promoters in farm animal production. However, little information exists on the effects of Lactobacillus acidophilus BT 1386 (LA) and Saccharomyces cereviseae boulardii CNCM I-1079 (SCB) on the modulation of the gastrointestinal tract (GIT) microbiota and innate immune responses in dairy calves. Therefore, the objectives of this thesis were to (1) investigate the effect of Lactobacillus acidophilus BT 1386 or Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079 on blood cellular and biochemical/chemical constituents; (2) determine the potential mechanisms of enhanced immune response by Lactobacillus acidophilus BT 1386 and Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079; (3) determine how Lactobacillus acidophilus BT 1386 or Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM 1-1079 modulate calf GIT microbial community composition by next-generation sequencing of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene and (4) compare the efficacy of these two DFM with tetracycline-neomycin, an antibiotic growth promoter. Forty eight calves (2 to 7 days old) were randomly allocated to four treatments: 1) Control (CTRL) fed milk replacer (MR) and starter feed (SF); 2) CTRL supplemented with Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCMI-1079 (SCB; 7.5 × 108 (CFU)/L MR + 3 × 109 CFU/kg SF); 3) CTRL supplemented with Lactobacillus acidophilus BT1386 (LA; 2.5 × 108 CFU/L MR + 1 × 109 CFU/kg SF); and 4) CTRL supplemented with antibiotics (ATB) chlortetracycline and neomycin (528 and 357 mg/L MR, respectively), and chlortetracycline (55 mg/kg SF). Animals were raised for 96 days following standard management procedures. Growth parameters (body weight and feed intake) of calves were recorded weekly. Four calves per treatment were euthanized on day 33 (pre-weaning) and an additional four calves per treatment on day 96 (post-weaning) to sample rumen and ileum tissues for real time quantitative polymerase chain reaction and colon for histomorphology. The ileum, colon and rumen were also analyzed for viability. Furthermore, samples of digesta (colon, ileum and rumen) and mucosa (colon and ileum) for bacterial characterization by sequencing the V3-V4 region of 16S rRNA gene. Weekly feces samples were collected for viability analysis. Blood samples were also collected for isolation of neutrophils and peripheral blood mononuclear cells for oxidative burst and phagocytosis analyses by flow cytometry. Serum measurements of acute phase proteins were done by ELISA. Viable SCB were recovered throughout the GIT and in the feces pre- and post-weaning. The feces of SCB-treated calves showed a greater lactobacilli population compared with CTRL (P < 0.01) around weaning. In the pre-weaning period, the distribution of lactobacilli population differed along the digestive tract (colon > ileum content > rumen > ileum mucosa; P < 0.001). The lactobacilli population were significantly reduced in all compartments (P = 0.02) post-weaning compared to pre-weaning, except in the rumen. Crypts depth and width of the colon decreased (P < 0.01) whereas number of goblet cells containing neutral mucins tended to increase (P = 0.058) while acidic mucins increased (P < 0.05) in SCB- and ATB-treated calves compared with CTRL and v LA-treated calves. Overall, growth performances were not affected by treatment. There was improvement of both oxidative burst and phagocytosis by SCB and LA during weaning in calves. Similarly, the concentrations of acute phase proteins (C-reactive proteins and serum amyloid A proteins) were increased by SCB and LA during weaning. The DFM had less impact on the bacteria diversity but had significant impact on the abundance of the bacteria community with most changes associated to treatments occurring in the ileum. SCB and LA reduced some pathogenic bacteria genera such as Streptococcus, Tyzzerella_4 and increased some potential beneficial bacteria such as fibrobacter. Meanwhile, Rumminococcaceae UCG 005 and Olsenella, also beneficial, were increased only by SCB treatment. The potential pathogenic bacterium, Peptoclostridium, was reduced by SCB only while LA reduced Ruminococcus_2. The functional prediction analyses indicated that besides affecting local pathways such as cell cycle, bile secretion, proteasome or cAMP signaling pathway, both DFM might also affect important pathways in other tissues such as thyroid hormone synthesis or Dopaminergic synapse in the brain. Our results suggest that SCB is a modulator of gastrointestinal health and could prime the immune system prior to infection leading to an enhanced innate immune response in calves especially during periods of stress (e.g., weaning). Consequently, SCB might have the potential to strengthen calf immune system in the critical periods of disease susceptibility. Both SCB and LA changed the bacteria composition of the GIT. Overall, this study showed a remarkable demonstration of the importance of DFM on the GIT microbiota. However, what is needed is a complete and better understanding of the molecules and mechanisms driving the roles played by the microbiota and then to exploit this knowledge to improve health and increase animal production.

La texture des produits résultant de la fermentation lactique est obtenue par la présence d'exopolysaccharides excrétés par les bactéries lactiques utilisées. Ils conditionnent l'onctuosité du produit. La région du chromosome, impliquée dans la synthèse de ces exopolysaccharides chez Streptococcus thermophilus est nommée locus eps et est très variable. S. Thermophilus est une bactérie lactique utilisée en coculture avec d'autres bactéries lactiques telles Lactococcus lactis (fabrication des fromages) ou Lactobacillus delbruckeii subsp. Bulgaricus (fabrication des yaourts). Le locus eps constitue un modèle de l'implication des transferts horizontaux intra- et interspécifiques dans la genèse du polymorphisme de l'espèce. L'étude des loci eps des trois souches de S. Thermophilus CNRZ368, NST2280 et IP6757, a permis de révéler une grande variabilité de ce locus due aux transferts horizontaux. La souche CNRZ368 présente un locus de 32,5 kb dont une région de 13,6 kb pourrait provenir de L. Lactis. De plus, les loci eps de deux souches phylogénétiquement très proches, IP6757 et NST2280, sont très différents. La comparaison des séquences de 27 kb du locus eps d'IP6757 et de 19,2 kb de celui de NST2280 révèle deux régions de grande homologie séparées par une région souche-spécifique. Ces résultats, associés à la comparaison des loci eps d'autres souches phylogénétiquement proches d'IP6757 et NST2280, indiquent que le locus eps d'un ancêtre de la souche IP6757 aurait évolué rapidement par acquisition, à partir d'une autre souche de la flore lactique, et remplacement d'une partie de son locus
The texture of dairy products resulting from lactic fermentation is obtained by the presence of exopolysaccharides excreted by the used lactic acid bacteria. These exopolysaccharides are required for the smoothness of the product. The chromosome region involved in the synthesis of exopolysaccharides synthesis in Streptococcus thermophilus is called eps locus. This region is very variable. S. Thermophilus is a lactic acid bacterium used in coculture with other lactic acid bacteria such as Lactococcus lactis (used in cheese production) or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (used in yoghurt production). The eps locus represents a model of the implication of intra- and interspecific horizontal transfer in the origin of S. Thermophilus polymorphism. Study of the eps loci of 3 S. Thermophilus strains, CNRZ368, NST2280 and IP6757, allowed to reveal a large variability of this locus caused by horizontal transfers. S. Thermophilus CNRZ368 contains a 32. 5 kb eps locus including a 13. 6 kb region which could originate from L. Lactis. Moreover, the eps loci of 2 very related strains, IP6757 and NST2280, are very different. The comparison of the sequences of 27 kb and 19. 2 kb eps loci of IP6757 and NST2280 S. Thermophilus strains respectively shows two regions with high homology separated by a specific-strain region. These results, associated with the comparison of the eps loci of other phylogenetically related strains of IP6757 and NST2280, indicate that the eps locus of an IP6757 ancestor should have quickly evolved by acquisition, from an other bacterium of the lactic flora, and replacement of a part of its locus

Les quantités importantes d’aliments consommés et la proportion élevée de concentrés devant être incorporée aux rations pour soutenir les besoins des vaches hautes-productrices induisent bien souvent des perturbations de l’équilibre ruminal. Ces changements se répercutent sur la biohydrogénation ruminale des acides gras insaturés de la ration, qui entraînent à leur tour une inhibition de la synthèse des matières grasses par le tissu mammaire. Plusieurs stratégies nutritionnelles ont été mises de l’avant pour mieux tirer profit des rations riches en concentrés. Récemment, des études ont montré la capacité du carbonate de potassium (K2CO3) à prévenir la chute de matière grasse associée à des régimes à forte teneur en concentrés. Toutefois, on comprend encore mal l’origine de ces effets. Les travaux de cette thèse visaient donc, dans un premier temps, à départager si les effets observés en ajoutant du K2CO3 aux rations des vaches laitières étaient dus à une augmentation de la différence alimentaire cation anion (DACA), de la teneur en ions K+ ou encore du pouvoir tampon de la ration. Un autre objectif de cette thèse était de déterminer les effets d’un ajout de K2CO3 sur la synthèse de matières grasses du lait lorsque des sources d’acides gras polyinsaturés (AGPI) sont introduites dans l’alimentation de la vache laitière. Enfin, les travaux cherchaient à déterminer l’effet d’un ajout de K2CO3 à la ration sur les populations microbiennes du rumen, particulièrement celles reconnues pour être impliquées dans le métabolisme lipidique. Pour répondre à ces questions, une première expérience a été mise en place, où 35 vaches Holstein en début de lactation ont été distribuées selon un plan en blocs complets aléatoires. La période expérimentale était de 28 jours et précédée d’une collecte de 5 jours (covariable). Les cinq rations expérimentales étaient constituées en vue de départager les effets du K2CO3 (témoin vs K2CO3), de la capacité tampon (K2CO3 vs KHCO3), de la DACA (K2CO3 vs KCl) et du type de cations (K2CO3 vs Na2CO3). Dans cette expérience, et contrairement aux études antérieures, l’ajout de K2CO3 aux rations riches en concentrés n’a pas permis d’augmenter la production de lait ou la matière grasse des vaches en début de lactation. De plus, les résultats suggèrent qu’une augmentation du K alimentaire via l’ajout de K2CO3 pourrait induire un déséquilibre ionique cellulaire qui pourrait affecter le transport des nutriments dans les cellules épithéliales mammaires et ainsi affecter la synthèse du lait. Une seconde expérience a ensuite été menée, où 28 vaches Holstein en début de lactation ont été distribuées selon un plan en blocs complets aléatoires. La période expérimentale était également de 28 jours et précédée d’une collecte de 5 jours (covariable). Les quatre rations expérimentales étaient offertes selon un arrangement factoriel 2 × 2, soit 0 ou 1,5 % K2CO3 et 0 ou 2 % d’huile de soya, comme source d’acides gras polyinsaturés. Les résultats ont montré que l’ajout de K2CO3 peut entraîner une augmentation de la sécrétion des matières grasses laitières chez des animaux recevant de grandes quantités de concentrés. Cette augmentation dépend toutefois de la teneur en lipides de la ration. Cette étude a également permis de mettre en lumière une relation positive entre la production laitière et la teneur en chlore du lait. Lors de cette seconde expérience, des échantillons de contenu ruminal ont également été prélevés chez 24 vaches (n = 6) afin d’étudier l’impact d’un supplément de K2CO3 sur l’environnement et les populations microbiennes du rumen des vaches en début de lactation recevant des rations riches en concentrés avec ou sans huile de soya. Ces travaux ont permis de comprendre que le K2CO3 et l’huile de soya ont des effets distincts sur les populations microbiennes. L’ajout de K2CO3 a stimulé la croissance de Butyrivibrio hungatei, bactérie productrice de 18:1 trans-11. L’ajout d’huile de soya a, quant à elle, réduit la présence de Butyrivibrio/Pseudobutyrivibrio, un groupe de bactéries productrices de 18:1 trans-11, de Fibrobacter succinogenes, une bactérie fibrolytique, de Butyrivibrio proteoclasticus, une bactérie productrice de 18:0, et de Streptococcus bovis, une bactérie amylolytique Les travaux regroupés dans cette thèse apportent un éclairage nouveau sur le rôle de la supplémentation minérale sur les performances de production des vaches laitières
Negative energy balance typically appears in early-lactation dairy cows as a consequence of a reduction of dry matter intake, as well as of an increase in energy demand for milk production. To compensate this energy deficit, cows are fed with high-concentrate diets. However, highly fermentable carbohydrates introduced in diets can result in a decreased milk fat synthesis. Previous studies reported that addition of potassium carbonate (K2CO3) to high-concentrate diets helps to maintain milk fat, although the mechanism is yet to be established. Consequently, the objective of the current thesis was, firstly, to investigate the effects of dietary cation-anion difference (DCAD), cation source, and buffering ability of the mineral supplement on rumen biohydrogenation of fatty acids (FA) and production performance of dairy cows fed a high-concentrate diet. Secondly, this thesis aimed at evaluating the effect of K2CO3 on production performance, biohydrogenation of fatty acids, and mineral composition of milk in early-lactation dairy cows fed a high-concentrate diet with or without soybean oil (SBO), as a source of polyunsaturated fatty acid. A third objective of this thesis was to evaluate the effect of K2CO3 supplementation, in diets containing soybean oil (SBO) on rumen microbial population associated with lipid metabolism. Consequently, a first experiment was set up, where 35 early-lactation Holstein cows were used in a randomized complete block design with 33-d periods, including a 5-d pretreatment collection period used as a covariate. Five different dietary treatments were used to assess the effects of K2CO3 (control vs. K2CO3), buffering ability (K2CO3 vs. KHCO3), DCAD (K2CO3 vs. KCl), and cation type (K2CO3 vs. Na2CO3). In this experiment, and as opposed to previous studies, supplementing high-concentrate diets with K2CO3 did not increase milk or milk fat yield in early-lactation cows. Also, results suggested that increasing dietary K through the addition of K2CO3 could lead to a disequilibrium in cellular ion composition that can impair nutrient transport into and out of the mammary epithelial cells, and consequently affect milk synthesis. A second experiment was conducted where 28 ruminally fistulated Holstein cows were used in a randomized complete block design. The experiment lasted 33 d, including a 5-d pre-treatment collection period used as a covariate. Experimental treatments were arranged as a 2 × 2 factorial with 0 or 1.5% K2CO3 and with 0 or 2% SBO. Results of this experiment revealed that potential effect of K2CO3 on milk fat synthesis is dependent on the levels of dietary polyunsaturated FA. Moreover, a positive relation was established between milk Cl concentration and milk yield, suggesting that the equilibrium of this ion is linked to the efficiency of lactogenesis Finally, rumen samples were collected from the rumen of 24 cows enrolled in the second experiment (n = 6) to assess treatment effects on rumen microbial population associated with lipid metabolism. Feeding K2CO3 and SBO had distinct effects on rumen bacteria. Dietary K2CO3 stimulated the growth of Butyrivibrio hungatei, a bacterium recognized to produce trans-11-18:1 during biohydrogenation. Conversely, feeding SBO reduced the growth of Butyrivibrio/Pseudobutyrivibrio bacterium group, known to produce trans-11-18:1, of Fibrobacter succinogenes, a fibrolytic bacterium, of Butyrivibrio proteoclasticus, a bacterium involved in 18:0 production, and of Streptococcus bovis, an amylolytic bacterium. Overall, the experiments conducted and reported in this thesis provide new insights on the impact of mineral supplementation on milk performance in dairy cows.

Le méthane (CH4) est un puissant gaz à effet de serre produit lors de la fermentation microbienne anaérobie des aliments dans le rumen. L’un des enjeux majeurs pour le secteur de l’élevage est de trouver des stratégies (alimentaires, génétique) pour réduire les émissions de CH4 tout en maintenant les performances animales. Les techniques de mesure de ces émissions sont coûteuses et difficilement utilisables à grande échelle sur le terrain, d’où la nécessité de trouver des alternatives de mesure ou biomarqueurs pour prédire ces émissions. Les acides gras (AG) du lait ont déjà été identifiés comme indicateurs intéressants de la méthanogenèse chez la vache laitière, mais il convient d’améliorer la précision des équations de prédiction du CH4 existantes ainsi que d'élargir leur domaine d'application à tous types de rations. L'objectif de mon travail de thèse a été de confirmer la pertinence des AG du lait comme indicateurs périphériques de la méthanogénèse chez la vache laitière avec diverses conditions nutritionnelles. Deux bases de données regroupant des données individuelles (issues d’une collaboration scientifique internationale) et moyennes (issues de la littérature) de CH4, de composition en AG du lait et d’autres performances et caractéristiques de l’animal, ainsi que des données de composition chimique des rations, ont été créées. Parallèlement, l’acquisition in vivo de données en conditions expérimentales contrôlées pour des rations mal connues ont permis d’incrémenter la base de données individuelles. Des équations de prédiction des émissions de CH4 [en g/jour, g/kg de matière sèche ingérée (MSI), et g/kg de lait] ont été développées à partir de certains AG du lait, utilisés seuls ou combinés à d’autres variables d’ingestion et de performances laitières, représentant alors des modèles complexes. Des relations entre les émissions de CH4 et la teneur de différents AG du lait (C10:0, iso C17:0 + trans-9 C16:1, iso C16:0, cis-11 C18:1, cis-15 C18:1, cis-9,cis-12 C18:2, et trans-11,cis-15 C18 :2) ont été mises en évidence, confirmant des voies métaboliques communes dans le rumen entre méthanogenèse et métabolisme lipidique. Les équations sont également liées aux types de régimes à partir desquels elles ont été développées. Les équations simples (AG du lait uniquement) sont moins précises que les complexes (erreurs résiduelles de prédiction, respectivement, de 58.6 g/jour, 2.8 g/kg MSI et 3.7 g/kg lait vs. 42.8 g/jour, 2.5 g/kg MSI et 3.3 g/kg lait). Une différence minimum de 16% de CH4 entre stratégies de réduction pourra être mise en évidence par la meilleure équation de prédiction développée. Des équations basées sur des AG bien déterminés par les méthodes infrarouges devront être testées pour évaluer, en routine et à grande échelle, de nouvelles stratégies de réduction des émissions de CH4 entérique chez la vache laitière
Methane (CH4) is a potent greenhouse gas coming from the anaerobic microbial fermentation of the diet in the rumen. One of the main current challenge for the dairy sector is to find CH4 mitigation strategies (diets or genetics) without altering animal performance. Enteric methane measurement methods are costly and very difficult to apply on a large scale on field. Thus, there is a need to develop alternative measurement methods, such as equations based on proxies to predict CH4 emissions. Milk fatty acids (FA) have been identified as potential predictors of the methanogenesis in dairy cattle, but the prediction ability of extant published CH4 equations must be improved, and their domain of applicability must be enlarged to a wide range of diets. The objective of this PhD thesis was to confirm the potential of milk FA as proxies to predict enteric CH4 emissions in dairy cows fed a wide range of diets. Two databases (based on individual and mean data, respectively) were built thanks to an international collaboration, and gathered data on CH4, milk FA composition, dairy performances, diet and animal characteristics. Two in vivo experiments were conducted with the aim to study the effect of dietary strategies poorly documented, on methanogenesis and milk FA. The data from these experiments were included in the created database. Firstly, simple CH4 prediction equations were developed [g/d, g/kg of DMI (DMI), and g/kg of milk] based only on milk FA, and secondly other variables related to cow intake or characteristics, and dairy performance were added and constituted complex equations. Relationships between CH4 and several milk FA (C10:0, iso C17:0 + trans-9 C16:1, iso C16:0, cis-11 C18:1, cis-15 C18:1, cis-9,cis-12 C18:2, and trans-11,cis-15 C18 :2) were found, confirming common rumen metabolic pathways between methanogenesis and lipid metabolism. Equations were also closely related to the diets included in the database used for their development. Simple equations were less accurate than complex ones (prediction error of 58.6 g/d, 2.8 g/kg DMI and 3.7 g/kg milk vs 42.8 g/d, 2.5 g/kg DMI and 3.3 g/kg milk, respectively). A minimum difference of 16% in CH4 emissions between mitigating strategies can be evidenced with the best prediction equation developed in this PhD. Methane prediction equations based on milk FA well determined by infrared spectrometry methods need to be developed in order to be used on a routine basis and on a large scale. These prediction equations would allow studying the effect of novel mitigation strategies of enteric CH4 emissions in dairy cows

Le méthane (CH4) est un puissant gaz à effet de serre produit lors de la fermentation microbienne anaérobie des aliments dans le rumen. L’un des enjeux majeurs pour le secteur de l’élevage est de trouver des stratégies (alimentaires, génétique) pour réduire les émissions de CH4 tout en maintenant les performances animales. Les techniques de mesure de ces émissions sont coûteuses et difficilement utilisables à grande échelle sur le terrain, d’où la nécessité de trouver des alternatives de mesure ou biomarqueurs pour prédire ces émissions. Les acides gras (AG) du lait ont déjà été identifiés comme indicateurs intéressants de la méthanogenèse chez la vache laitière, mais il convient d’améliorer la précision des équations de prédiction du CH4 existantes ainsi que d'élargir leur domaine d'application à tous types de rations. L'objectif de mon travail de thèse a été de confirmer la pertinence des AG du lait comme indicateurs périphériques de la méthanogénèse chez la vache laitière avec diverses conditions nutritionnelles. Deux bases de données regroupant des données individuelles (issues d’une collaboration scientifique internationale) et moyennes (issues de la littérature) de CH4, de composition en AG du lait et d’autres performances et caractéristiques de l’animal, ainsi que des données de composition chimique des rations, ont été créées. Parallèlement, l’acquisition in vivo de données en conditions expérimentales contrôlées pour des rations mal connues ont permis d’incrémenter la base de données individuelles. Des équations de prédiction des émissions de CH4 [en g/jour, g/kg de matière sèche ingérée (MSI), et g/kg de lait] ont été développées à partir de certains AG du lait, utilisés seuls ou combinés à d’autres variables d’ingestion et de performances laitières, représentant alors des modèles complexes. Des relations entre les émissions de CH4 et la teneur de différents AG du lait (C10:0, iso C17:0 + trans-9 C16:1, iso C16:0, cis-11 C18:1, cis-15 C18:1, cis-9,cis-12 C18:2, et trans-11,cis-15 C18 :2) ont été mises en évidence, confirmant des voies métaboliques communes dans le rumen entre méthanogenèse et métabolisme lipidique. Les équations sont également liées aux types de régimes à partir desquels elles ont été développées. Les équations simples (AG du lait uniquement) sont moins précises que les complexes (erreurs résiduelles de prédiction, respectivement, de 58.6 g/jour, 2.8 g/kg MSI et 3.7 g/kg lait vs. 42.8 g/jour, 2.5 g/kg MSI et 3.3 g/kg lait). Une différence minimum de 16% de CH4 entre stratégies de réduction pourra être mise en évidence par la meilleure équation de prédiction développée. Des équations basées sur des AG bien déterminés par les méthodes infrarouges devront être testées pour évaluer, en routine et à grande échelle, de nouvelles stratégies de réduction des émissions de CH4 entérique chez la vache laitière
Methane (CH4) is a potent greenhouse gas coming from the anaerobic microbial fermentation of the diet in the rumen. One of the main current challenge for the dairy sector is to find CH4 mitigation strategies (diets or genetics) without altering animal performance. Enteric methane measurement methods are costly and very difficult to apply on a large scale on field. Thus, there is a need to develop alternative measurement methods, such as equations based on proxies to predict CH4 emissions. Milk fatty acids (FA) have been identified as potential predictors of the methanogenesis in dairy cattle, but the prediction ability of extant published CH4 equations must be improved, and their domain of applicability must be enlarged to a wide range of diets. The objective of this PhD thesis was to confirm the potential of milk FA as proxies to predict enteric CH4 emissions in dairy cows fed a wide range of diets. Two databases (based on individual and mean data, respectively) were built thanks to an international collaboration, and gathered data on CH4, milk FA composition, dairy performances, diet and animal characteristics. Two in vivo experiments were conducted with the aim to study the effect of dietary strategies poorly documented, on methanogenesis and milk FA. The data from these experiments were included in the created database. Firstly, simple CH4 prediction equations were developed [g/d, g/kg of DMI (DMI), and g/kg of milk] based only on milk FA, and secondly other variables related to cow intake or characteristics, and dairy performance were added and constituted complex equations. Relationships between CH4 and several milk FA (C10:0, iso C17:0 + trans-9 C16:1, iso C16:0, cis-11 C18:1, cis-15 C18:1, cis-9,cis-12 C18:2, and trans-11,cis-15 C18 :2) were found, confirming common rumen metabolic pathways between methanogenesis and lipid metabolism. Equations were also closely related to the diets included in the database used for their development. Simple equations were less accurate than complex ones (prediction error of 58.6 g/d, 2.8 g/kg DMI and 3.7 g/kg milk vs 42.8 g/d, 2.5 g/kg DMI and 3.3 g/kg milk, respectively). A minimum difference of 16% in CH4 emissions between mitigating strategies can be evidenced with the best prediction equation developed in this PhD. Methane prediction equations based on milk FA well determined by infrared spectrometry methods need to be developed in order to be used on a routine basis and on a large scale. These prediction equations would allow studying the effect of novel mitigation strategies of enteric CH4 emissions in dairy cows

La litière de fumier recyclé (LFR) est utilisée dans les fermes canadiennes comme alternative à la litière conventionnelle de paille. Elle est obtenue par l’extraction de la fraction solide du fumier des vaches, parfois suivie par une maturation. Toutefois, les caractéristiques microbiologiques de cette litière sont peu documentées. Ainsi, cette étude a permis la description du microbiote et des caractéristiques microbiologiques de la LFR comparativement à la paille, avant et après leur utilisation, et d’évaluer l’impact de différentes méthodes de production de la LFR sur ces écosystèmes. Les résultats des analyses du microbiote ont démontré que la richesse et la diversité du microbiote de la LFR avant utilisation étaient différentes de celles de la paille. Les litières de fumier recyclé avant et après utilisation possédaient une diversité microbienne moindre comparativement à celles mesurées pour la paille avant et après utilisation. Aussi, les différentes méthodes de production de la LFR n’influençaient pas la richesse du microbiote, mais influencent sa composition. La méthode de production utilisant la séparation suivie d’une maturation en amas possédait une charge bactérienne moindre que celle utilisant la séparation suivit d’une maturation en boîte. Finalement, la LFR contenait plus de Listeria monocytogenes et de Salmonella spp que la litière de paille. Cela permet de conclure que la LFR, actuellement produite dans les fermes de l'Est du Canada, constitue un risque microbiologique plus élevé que la litière de paille.
Recycled manure solid bedding (RMS) is used on Canadian farms as an alternative to conventional straw bedding. RMS is obtained by extracting the solid fraction of dairy cow manure, sometimes followed by maturation. However, the microbiological characteristics of this bedding are poorly documented. This study allowed the description of the microbiota and microbiological characteristics of RMS compared to straw and assessed the impact of the RMS production methods on its microbiota. The results of the microbiota analyses demonstrated that the richness and diversity of the microbiota in unused RMS were different from unused straw. Unused RMS and used RMS possessed more similar microbial diversity compared to the microbial diversity between unused and used straw. Moreover, the different RMS production methods did not influence the richness of the microbiota but influence its composition. The RMS production method using separation followed by heap maturation had a lower bacterial load than production method using separation followed by box maturation. Finally, RMS contained more Listeria monocytogenes and Salmonella spp than straw bedding. This leads to the conclusion that RMS bedding currently produced on farms in Eastern Canada, clearly constitute a greater microbiological risk as compared to straw bedding.