Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Síndrome de Angelman“

Objetivo: Fornecer uma revisão atualizada em língua portuguesa sobre a síndrome de Angelman, com ênfase nos mecanismos genéticos e moleculares dessa patologia, uma causa de deficiência mental severa que em alguns casos pode apresentar recorrência familiar. Método: Foi feita uma revisão bibliográfica utilizando a base de dados do PubMed, tendo como critérios de busca o termo "Angelman syndrome" isoladamente e combinado com "UBE3A", "clinical", "genetics" e "molecular" no título dos artigos. Dentre esses, foram selecionados artigos de revisão e artigos originais sobre a fisiopatologia da síndrome, com ênfase nos últimos dez anos. Resultados: Utilizando-se "Angelman syndrome" na busca, apareceram cerca de 1.100 artigos, incluindo 240 de revisão. Nos últimos dez anos são mais de 600 artigos, aproximadamente 120 de revisão, 50% dos quais publicados nos últimos cinco anos. Na base de dados SciELO, são apenas nove artigos sobre a síndrome, dos quais três em português e nenhum artigo atual de revisão. Conclusão: Após ter sido uma das principais causas que atraíram atenção ao estudo e ao entendimento dos mecanismos do imprinting genômico, a síndrome de Angelman está agora se revelando como uma patologia das sinapses. Apesar de o entendimento da fisiopatologia molecular da síndrome de Angelman ainda estar longe de ser compreendida, seu estudo está fornecendo uma visão extraordinária sobre os mecanismos que regem a plasticidade sináptica, novamente atraindo a atenção de pesquisadores que trabalham na fronteira do conhecimento.

Os autores descrevem um caso típico de síndrome de Angelman. A paciente apresenta atraso de desenvolvimento neuropsicomotor, deficiência mental, macrostomia, dentes espaçados, convulsões, ausência de fala, andar com a base alargada e instável, crises de risos. Os estudos citogenéticos e moleculares revelaram deleção do segmento 15q11ql3 de origem materna, confirmando o diagnóstico clínico de síndrome de Angelman.

É nos primeiros anos de vida das crianças que se constituem sua organização cerebral, construindo dessa forma as sinapses que nada mais são que a comunicação entre neurônios, local o qual são conduzidos os estímulos, e são encarregados por preservar memórias e estabelecer rotinas. Esses impulsos nervosos transformam em eletricidade no cérebro, as emoções e experiências do dia a dia. Muito se tem pesquisado sobre diversas síndromes na primeira infância, entre elas Síndrome de Down, Síndrome do X Frágil, Síndrome de Angelman, Síndrome de Willians - Baeuren, Síndrome de Prader - Willi e a surdez. É imprescindível que as crianças com suspeita de alguma síndrome façam exames médicos e sejam acompanhadas pelos devidos profissionais da área da saúde, pois, algum distúrbio ou disfunção às vezes pode ser originado de diferentes causas. Alguns problemas como visão, audição, sintomas neurológicos etc., por diversas vezes são vistos como neuroses, ou problemas psicológicos. A família deve observar o desenvolvimento da criança.

El Síndrome de Angelman (SA) es una enfermedad rara caracterizada por discapacidad intelectual grave, retraso en el desarrollo, ausencia de habla o habla mínima, microcefalia, ansiedad, disfunciones motoras, marcha atáxica y deficiencias en las relaciones sociales. Sus características hacen que estas personas necesiten de intervención de varios especialistas clínicos y educativos a lo largo de su vida. El objetivo de este estudio fue conocer el nivel de calidad de vida que describían las familias de esta población. La muestra estuvo compuesta por 7 familias con hijos con Síndrome de Angelman de entre 4 y 16 años que fueron evaluadas a través de la Escala Kidslife. Los datos encontrados indician que el grado de dependencia limita ciertas características de la vida de la persona con Síndrome de Angelman y que esto repercute directamente en el nivel de calidad de vida que describen las familias en todos los niveles. Estos resultados nos llevan a analizar las implicaciones sociales y emocionales que pueden tener para las familias y para su entorno.

A Síndrome de Angelman (SA) caracteriza-se por uma anomalia no espaço entre a banda 11 e 13 do braço “q” do cromossoma 15. Essa anomalia genética determina severo atraso no desenvolvimento global com comprometimento mental e funcional. O quadro motor dos portadores da SA tem características da ataxia como hipotonia pré-natal e posteriormente movimentos trêmulos, com marcha atáxica em cerca de 90% dos pacientes. Esse relato de caso refere-se ao paciente MKL, 10 anos de idade, sexo masculino. A criança com atraso no desenvolvimento rudimentar, apresentou crises convulsivas mioclônicas aos 22 meses, controladas aos 6 anos. Aos 8 anos o paciente foi encaminhado ao setor de fisioterapia Na avaliação motora o paciente demonstrou apenas o controle cervical. Após 16 meses de estimulação motora rudimentar associada á estimulação vestibular, tátil, visual e proprioceptiva, adquiriu a mobilidade rotacional para as passagens transposturais; sedestação; a posição de quatro apoios e ortostática independentes; a marcha com apoio e a capacidade de comunicação.

El síndrome de Angelman (SA) y el de Prader Wili (SPW) son trastornos del neurodesarrollo cuya principal etiología molecular es la deleción de la región 15q11.2-q13. Esta deleción está promovida por la Recombinación Homóloga No Alélica (NAHR) y mediada por secuencias altamente repetitivas de bajo número de copias (LCRs) que la flanquean. La orientación de estas LCRs predispone al reordenamiento final que se obtendrá por NAHR. Las LCRs en orientación directa generan deleciones y duplicaciones mientras las que presentan orientación invertida originan inversiones. Estas inversiones pueden facilitar una recombinación inadecuada entre las LCRs que flanquean la región 15q11.2-q13 dando lugar a la deleción en la descendencia. En este trabajo se presenta un nuevo análisis de la frecuencia de la inversión 15q11.2-q13 en 23 controles de población general, 21 progenitores de pacientes con SA y 32 con descendencia por SPW. Se han analizado un total de 9540 cromosomas informativos mediante FISH de sondas de BACs, encontrando la inversión en el 4,61% de los cromosomas estudiados en la población control. También se ha analizado la frecuencia de la inversión en progenitores de pacientes con SA y SPW observando un incremento significativo de inversiones en las madres de hijos con SA por deleción y en los padres de SPW por deleción frente a la población control (p=8x10-7 y p=0.007, respectivamente). Nuestros resultados indican que la inversión 15q11.2-q13 es un polimorfismo presente en población general. Así mismo, el incremento de la frecuencia de la inversión en madres de SA y padres de SPW con deleción sugiere que la inversión podría ser una estructura que promueve el mal alineamiento de los LCRs y facilita la generación de deleciones en 15q11.2-q13. El SA es diagnosticado molecularmente en el 90% de los pacientes, sin embargo, en el 10% restante, aún presentando unas características clínicas bien definidas, su etiología molecular es todavía una incógnita (SA-like). Se han analizado 20 pacientes SA-like mediante a-CGH previo cribado de variaciones en número de copias (CNVs) en regiones sindrómicas y subteloméricas. Las regiones variables en número de copia con una frecuencia poblacional inferior al 5% o que no se encuentran estudiadas según la Database of Genomic Variants se han seleccionado para ser confirmadas mediante Multiplex Ligation-depenent Probe Amplificatio (MLPA). Se han evaluado las CNVs en 20 pacientes SA-like y sus progenitores y se ha ampliado el estudio para cribar pacientes con discapacidad intelectual (n=296), trastornos del espectro autista (n=164) y controles de población general española (n=453). Se ha identificado una deleción de novo (1q44), dos duplicaciones heredadas de la madre (Xp11.23 y Xq28) y 20 regiones heredadas con CNVs en los pacientes SA-like pero que no se observan en la población control. En tres pacientes la concomitancia de una deleción y un SNP puede estar originando una discapacidad intelectual de herencia recesiva, sugiriendo que el gen MYH13 y los ARNs no codificantes largos podrían estar involucrados en el fenotipo SA-like. En lo referente a los pacientes con discapacidad intelectual y trastornos del espectro autista se han identificado alteraciones de gran tamaño implicadas en la etiología: del(1)(p36), del(1)(q44), dup(10)(q21.1), dup(X)(q11.23q28) y dup(X)(q28) en tres casos. También se han detectado 29 regiones con CNVs heredadas que no son variables en población general, 12 de las cuales son compartidas con los pacientes SA-like. Nuestros resultados respaldan la idea de que regiones con CNVs pueden ser, probablemente, responsables de un alto porcentaje de trastornos del neurodesarrollo. Las CNVs identificadas en pacientes, pero no detectadas en población control, aún siendo heredadas, podrían estar asociadas a algunas características clínicas de la enfermedad desenmascarando, en genes específicos, mutaciones de carácter recesivo relacionados con los fenotipos.
Angelman syndrome (AS) and Prader Willi syndrome (PWS) are neurodevelomental disorders in which main molecular etiology is the 15q11.2-q13 deletion. This deletion is leaded by Non Allelic Homologous Recombination (NAHR) mediated by flanking high repetitive sequences named Low Copy Repeats (LCRs). The orientation of these LCRs leads the final product of NAHR. LCRs in direct orientation are solved in deletions or duplications while LCRs in inverted orientation lead inversions. These inversions could facilitate abnormal recombination between flanking LCRs and could mediate interstitial deletion of chromosome 15q11.2-q13 in the offspring. Herein we report a new analysis of the frequency of inversion 15q11.2-q13 in 23 controls from general population, 21 AS parents and 32 PWS parents. Molecular cytogenetic analysis was performed using FISH with BACs probes by examining a total of 9540 informative chromosomes. First, the 15q11.2-q13 inversion was detected on average in 4.61% of chromosomes of Spanish control population. Then we analyzed the frequency of the 15q11.2-q13 inversion in parents of AS and PWS and a significant increase in AS mothers and PWS fathers with offspring affected by deletion was observed in front of control group (p= 8x10-7and p=0,007, respectively). Our results indicate that 15q11.2-q13 inversion is a polymorphism presents in general population. Moreover, the high inversion frequency observed in AS mothers and PWS fathers of offspring affected by deletion suggest that the inversion could be a structure that promotes misalignment between the LCRs and facilitates the occurrence of 15q11.2-q13 deletions. AS has a recognizable molecular cause in about 90% of cases, nevertheless in 10% with well-defined clinical features the molecular etiology is still unknown (AS-like). We have analysed 20 AS-like patients by a-CGH after screening the patients for syndromic and subtelomeric copy number alterations (CNVs). Regions that contained rare CNVs or not reported in the Database of Genomic Variants were selected for validation using custom Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) assays. We assessed the CNV status in the 20 AS-like cases and in their parents, and also expanded the study to larger sets of samples of individuals suffering idiopathic intellectual disability (n=296), autism spectrum disorders (n=164) as well as to a control cohort of normal individuals (n=453). We have identified one de novo deletion (1q44), two maternally inherited duplications (Xp11.23 and Xq28) and 20 inherited altered regions present in AS-like cases that have not been present in control population. In three patients a concomitance of a deletion and SNPs is leading a possible recessive intellectual disability disease suggesting that MYH13 and long non-coding RNAs could be involved in AS-like. Concerning intellectual disability and autism spectrum disorders big alterations: del(1)(p36), del(1)(q44), dup(10)(q21.1), dup(X)(q11.23q28) and dup(X)(q28) in three patients, have been associated with the etiology. We also have identified 29 inherited genomic variants that were not present in the general population, 12 out of them shared with AS-like patients. Our results support the point of view that a considerable proportion of genomic regions showing variability in copy number could be responsible for neurodevelopment disorders. The inherited CNVs identified in cases, but not detected in controls, suggesting that even if they are inherited, they could be responsible for some of the clinical features perhaps unmasking, in specific genes, recessive mutations involved in the phenotypes.

Síndrome de Angelman (AS - MIM 105830) é causada pela ausência de função do gene UBE3A que codifica uma proteína ubiquitina - ligase (E6-AP). Esse gene é expresso bialelicamente em vários tecidos exceto no cérebro, onde a expressão é preferencialmente materna. O RNA anti-senso de UBE3A é considerado o regulador dessa expressão diferencial entre os alelos, e faz parte de um transcrito grande que só o alelo paterno é expresso devido ao imprinting genômico; no cérebro, esse transcrito se entende até a região anti-senso de UBE3A, mas nos demais tecidos o transcrito é menor e não engloba a região anti-senso. Este trabalho visa obter um modelo para estudo da AS. Células-tronco da polpa do dente (SHEDs) de pacientes com deleção do segmento 15q11-q13 ou mutação no gene UBE3A foram caracterizadas e submetidas à diferenciação neuronal. A diferenciação foi analisada através do estudo de RNA e proteínas para marcadores neuronais e, também, por testes funcionais. As SHEDs são células-tronco mesenquimais e constituem uma população heterogênea. Essas células ou algumas dessas células já expressam algumas proteínas neuronais ou de células excitáveis como nestina, β-tubulina III, MAP2 e proteína de canais dependentes de voltagem de sódio e potássio. Um ponto interessante é que as SHEDs apresentam baixa expressão do UBE3A anti-senso e a expressão do UBE3A nas células de pacientes é menor que 50% da expressão encontrada nas células de controles, que pode indicar a ocorrência de expressão preferencial materna desse gene em outros tipos celulares além de neurônios maduros. Quando induzidas à diferenciação neurogênica, a maioria das linhagens controles apresentou aumento da expressão de MAP2 e, principalmente, β-tubulina III; e a maioria das linhagens de pacientes com AS não apresentou aumento notável na expressão dessas proteínas, exceto uma linhagem de paciente que aumentou a expressão de β-tubulina III. As células induzidas à diferenciação apresentaram aumento estatisticamente significativo da condutância de sódio através de canais de sódio dependentes de voltagem. Com a análise de expressão de UBE3A e do UBE3A anti-senso é possível afirmar que a expressão deles não alterou com a diferenciação neuronal. Assim, é possível concluir que as células-tronco da polpa do dente, com o protocolo de diferenciação neurogênica, progrediram na via de diferenciação, mas a maioria das células não atingiu o estágio de maturação necessário para que ocorresse o imprinting do UBE3A ou a via de diferenciação não ia em direção a neurônios que apresentam imprinting do UBE3A.
Angelman syndrome (AS - MIN 105830) is caused by the loss of function of the maternal UBE3A gene, which encodes an ubiquitin protein ligase (E6-AP). UBE3A displays biallelic expression in most of tissues, but maternal predominant expression is observed in the brain. A RNA antisense that is paternally expressed in some regions in the brain is considered to be responsible for this tissue-specific imprinting; UBE3A antisense is part of a large transcript that starts at SNURF-SNRPN gene and is paternally expressed, and in the brain this transcript includes UBE3A antisense region however in other tissues this region is not included. The aim of the present study is to develop a new model for studying AS. Dental pulp stem cells (SHEDs) were characterized and differentiated by an already described protocol. SHEDs intrinsically express some neuronal proteins as nestin, β-tubulin III, MAP2 and voltage-gated sodium channels and potassium channels. Interestingly, SHEDs also present a low expression of UBE3A antisense, and UBE3A expression in cells from patients with AS is lower than 50% of the cells from normal control, so it is possible that preferential maternal expression of this gene might occur in some cells beyond mature neurons. After the neuronal differentiation, most control lineages and one lineage of AS patients had an increase of MAP2 and β-tubulin III expression. Two control lineages and most lineages from AS patients did not have a notable increase of expression of these proteins. Neuronal differentiated cells displayed an increase in conductance through voltage-gated sodium channels. Analysis of UBE3A and UBE3A antisense expression in SHEDs and cells induced to differentiate into neurons indicated no changes in their expression. Thus, after neuronal differentiation induction, dental pulp stem cells progressed through neuronal differentiation pathway. However, most cells did not reach the stage which UBE3A imprinting occurs or the neuronal differentiation is resulting in a cell that do not present UBE3A imprinting.

La síndrome d’Angelman (SA) és un trastorn neurogenètic caracteritzat per discapacitat intel·lectual greu amb absència de parla, característiques craniofacials dismòrfiques distintives, problemes neurològics com l’atàxia i/o tremolor en les extremitats i epilèpsia amb un patró específic d’electroencefalograma (EEG). El fenotip conductual es caracteritza per una aparença feliç, hiperactivitat, dèficit d’atenció i problemes de la son. La seva prevalença és d’aproximadament 1/15.000 naixements. La causa de la SA és la pèrdua d’expressió en neurones de la proteïna ubiquitina lligasa E6-AP codificada per l’al·lel matern del gen UBE3A, que es troba en la regió cromosòmica 15q11-q13. En el 10% dels individus que presenten el fenotip característic de la SA es desconeix la causa a nivell molecular i es classifiquen com a SA-like. En alguns casos, aquests pacients presenten síndromes amb fenotips que es solapen amb la SA, produïts per variants en gens amb funcions similars o solapants amb UBE3A o canvis en número de còpies (CNVs). Es creu que hi ha nous gens responsables de la SA que encara no han estat identificats. En els últims anys, l’anàlisi de l’exoma gràcies a la utilització de les noves tècniques de seqüenciació massiva (NGS) ha permès de forma exitosa identificar nous gens causants de malalties amb una herència mendeliana. L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat la identificació de nous gens responsables del fenotip SA-like a través de la seqüenciació de l’exoma complet (WES). En una cohort de 17 pacients amb fenotip SA i en els que s’ha descartat les causes genètiques de la SA, l’aplicació de WES en trios pacient-progenitors ha permès la identificació de 11 variants de novo i una variant lligada al cromosoma X patogèniques/probablement patogèniques en 11 gens implicats en trastorns del neurodesenvolupament (KIF1A, VAMP2, SYNGAP1, SATB2, ASXL3, KCNQ3, TBL1XR1, SMARCE1, SPTAN1, SLC6A1 i LAS1L). La taxa diagnòstica de la nostra cohort ha estat del 70,5% (12/17). A més, s’han identificat dues variants deletèries de novo en dos nous gens candidats (HSF2 i CHMP7) a la SA-like, que no han estat associades prèviament a malaltia. Els gens identificats en la nostra cohort no interaccionen directament amb el gen UBE3A, però si intervenen en les mateixes vies moleculars (sinapsi, remodelació de la cromatina i regulació de la transcripció). Els resultats mostren que existeix una gran heterogeneïtat genètica en els pacients SA-like, només dos dels pacients presenten variants en el mateix gen (TBL1XR1). En tots els casos, les característiques clíniques associades als gens identificats es solapen amb les de la SA. En la nostra cohort, el 50% de les variants identificades són missense, essent difícil de predir l’impacte d’aquest tipus de variants sobre la funció de la proteïna. Malgrat que els programes de predicció in silico poden ajudar a classificar aquestes variants, es necessiten portar a terme estudis funcionals que demostrin la seva patogenicitat. En aquest projecte, s’ha realitzat l’anàlisi funcional de la variant missense p.Arg169Thr en el gen KIF1A, demostrant que afecta a l’activitat ATPasa del domini motor probablement per un defecte en la unió dels microtúbuls, afectant de manera indirecta a la motilitat de la proteïna i al transport de vesícules. En conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi mostren que el 70,5% dels pacients SA-like presenten variants en altres gens que no són UBE3A. A més, s’ha demostrat que el WES és una eina útil pel diagnòstic de pacients amb un fenotip SA-like. Es proposa que el WES s’inclogui en l’algoritme diagnòstic de la SA, fet que permetrà augmentar la taxa de diagnòstic, permetent un millor seguiment dels pacients, realitzar un correcte assessorament genètic a la família i identificar noves dianes terapèutiques.
El síndrome de Angelman (SA) es un trastorno neurogenético caracterizado por discapacidad intelectual grave con ausencia de lenguaje, características craneofaciales dismórficas distintivas, problemas neurológicos como la ataxia y/o el temblor en las extremidades y epilepsia con un patrón específico en electroencefalograma (EEG). El fenotipo conductual se caracteriza por una apariencia feliz, hiperactividad, déficit de atención y problemas del sueño. La prevalencia es de aproximadamente 1/15.000 nacimientos. La causa del SA es la perdida de expresión en neuronas de la proteína ubiquitina ligasa E6-AP codificada por el alelo materno del gen UBE3A, que se encuentra en la región cromosómica 15q11-q13. En el 10% de los individuos que presentan el fenotipo característico del SA se desconoce la causa a nivel molecular y se clasifican como SA-like. En algunos casos, estos pacientes presentan síndromes cuyos fenotipos se solapan con el SA, producidos por variantes en genes que desempeñan funciones similares o solapantes con las de UBE3A o bien por cambios en número de copias (CNVs). Se cree que hay nuevos genes responsables del SA que todavía no han sido identificados. En los últimos años, el análisis del exoma gracias a la utilización de las nuevas técnicas de secuenciación masiva (NGS), ha permitido de forma exitosa identificar nuevos genes causantes de enfermedades con una herencia mendeliana. El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido identificar nuevos genes responsables del fenotipo SA-like a través de la secuenciación del exoma completo (WES). En una cohorte de 17 pacientes con fenotipo SA y en los que se han descartado las causas genéticas de la SA, la aplicación de WES en tríos paciente-progenitores ha permitido la identificación de 11 variantes de novo y una variante ligada al cromosoma X patogénicas/probablemente patogénicas en 11 genes implicados en trastornos del neurodesarrollo (KIF1A, VAMP2, SYNGAP1, SATB2, ASXL3, KCNQ3, TBL1XR1, SMARCE1, SPTAN1, SLC6A1 y LAS1L). La tasa diagnostica en nuestra cohorte ha sido del 70,5% (12/17). Además, se han identificado dos variantes deletéreas de novo en dos nuevos genes candidatos (HSF2 i CHMP7) a la SA-like, que no han sido asociados previamente a enfermedad. Los genes identificados en nuestra cohorte no interaccionan directamente con el gen UBE3A, pero sí que intervienen en las mismas vías moleculares (sinapsis, remodelación de la cromatina y regulación de la transcripción). Los resultados muestran que existe una gran heterogeneidad genética en los pacientes SA-like, sólo dos pacientes presentan variantes en el mismo gen (TBL1XR1). En todos los casos, las características clínicas asociadas a los genes identificados se solapan con las del SA. En nuestra cohorte, el 50% de las variantes identificadas son missense, siendo difícil de predecir el impacto de estas variantes sobre la función de la proteína. Pese a que los programas de predicción in silico pueden ayudar a clasificar estas variantes, se necesitan llevar a cabo estudios funcionales que demuestren su patogenicidad. En este proyecto, el análisis funcional de la variante missense p.Arg169T en el gen KIF1A ha demostrado que afecta a la actividad ATPasa del dominio motor, probablemente por un defecto en la unión a los microtúbulos, afectando de manera indirecta a la motilidad de la proteína y al transporte de vesículas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral muestran que el 70,5% de los pacientes SA-like presentan variantes en otros genes que no son UBE3A. Además, se ha demostrado que el WES es una herramienta útil para el diagnóstico de los pacientes SA-like. Se propone que el WES se incluya en el algoritmo diagnóstico del SA, lo que permitirá aumentar la tasa de diagnóstico, ofrecer un correcto asesoramiento genético a la familia y la identificación de nuevas dianas terapéuticas.
Angelman syndrome (AS) is a neurogenetic disorder characterized by severe intellectual disability with absent speech, dysmorphic craniofacial features, neurological problems such as ataxia and/or tremor of the limbs and seizures with a specific pattern in the electroencephalogram (EEG). The behavioral phenotype is characterized by apparent happy demeanor, hyperactivity, attention deficit and sleep disorder. The prevalence is about 1/15.000 of newborns. AS is caused by the loss of expression in neurons of the ubiquitin ligase protein E6-AP encoded by the maternal allele of the UBE3A gene, that is located in the chromosomal region 15q11-q13. The genetic cause remains unknown in around 10% of individuals with the characteristic clinical features of AS (AS-like). In some cases, these patients present syndromes whose clinical features overlap with AS and that are caused by variants in other genes with similar or overlapping functions with that of UBE3A or copy number variants (CNVs). It is believed that there are new genes responsible for AS that have not been discovered yet. Next generation sequencing (NGS) has been broadly used in the recent years to analyze the exome, leading to the identification of new genes responsible for Mendelian disorders. The main goal of this thesis is the identification of new genes responsible for AS by using whole exome sequencing (WES). In a cohort of 17 patients presenting an AS phenotype and in which the genetic causes of AS have been ruled out, the implementation of WES in trios lead to the identification of 11 de novo and one X-linked pathogenic/likely pathogenic variants in 11 neurodevelopmental genes (SYNGAP1, VAMP2, TBL1XR1, ASXL3, SATB2, SMARCE1, SPTAN1, KIF1A, KCNQ3, SLC6A1 and LAS1L). The global yield diagnostic in this study is 70,5%. In addition, two deleterious de novo variants have been identified in two candidate genes for AS-like (HSF2 and CHMP7), not previously associated with disease. The new identified AS-like genes do not interact directly with UBE3A gene product but are involved in the same molecular pathways (synapsis, chromatin remodeling and regulation of transcription). The results obtained show that there is a wide genetic heterogeneity in AS-like patients, only two patients carry variants in the same gene (TBL1XR1). In all cases, the clinical features associated with the genes identified overlap with the ones of AS. In our cohort, missense variants account for 50% of all the pathogenic/likely pathogenic variants identified being difficult to predict their impact on the protein. Even though, in silico tools can help to classify them, functional studies are needed to prove their pathogenicity. In this project, the functional analysis of the missense variant p.Arg169Thr in the KIF1A gene was performed, showing that it affects the ATPase activity of the motor domain, probably, due to defects in microtubule binding and therefore the motility of the protein and the capability of vesicle transport. Altogether, the results obtained in this thesis show that the 70,5% of AS-like patients carry variants in other genes that are not UBE3A. Furthermore, it has been shown that WES is a useful tool for the diagnosis of AS-like patients. We propose that WES should be included in the diagnostic algorithm of AS, which will increase the diagnostic rate, allowing a better patient follow-up, the appropriate genetic counseling to the family and to identify novel therapeutic targets.

A formação continuada de profissionais de Educação e Saúde se constitui como objeto desta dissertação. Na presente pesquisa pretendi planejar, implementar e avaliar os efeitos de um programa de formação continuada de profissionais de Educação e Saúde, oferecendo instruções e orientações de uso dos recursos da Comunicação Alternativa e Ampliada (CAA), para favorecer a comunicação e aprendizagem de crianças com autismo, Asperger e Angelman. Os estudos foram realizados em uma escola regular e em uma instituição especializada, com abordagem clínica-terapêutica-educacional. O universo da pesquisa abrangeu oito profissionais: duas professoras de classes regulares de ensino, uma professora especialista (Atendimento Educacional Especializado), duas estagiárias (estudantes de Pedagogia), exercendo a função de mediadora do aluno com autismo incluído, uma professora da instituição especializada, um auxiliar da professora e uma psicóloga. Também nove crianças fizeram parte desse universo: uma criança com autismo, incluída em classe regular e oito crianças que frequentavam a instituição especializada, sendo duas com Asperger, quatro com autismo e duas com Angelman. Para responder à pergunta principal do estudo: A Comunicação Alternativa e Ampliada pode favorecer a comunicação e a aprendizagem de crianças com autismo, Asperger e Angelman?, foi necessário conhecer os profissionais, as instituições e as respectivas gestoras, bem como o corpo docente, a equipe técnica e as crianças assistidas pelos profissionais, para verificar as suas necessidades, potencialidades, interesses e limitações. Outro elemento fundamental na proposta de formação dos profissionais foram os procedimentos do ensino e da consultoria colaborativa. A pesquisa foi desenvolvida em três estudos, durante o período de julho de 2010 a abril de 2012. Foi utilizado o delineamento intrasujeitos do tipo A-B (estudo I) e A-B-C (estudos II e III) e análise qualitativa dos resultados. Os procedimentos iniciais adotados foram: aplicação de questionários para os profissionais e os responsáveis pelas crianças, entrevistas semiestruturadas com as gestoras das instituições, observações in loco, filmagens das atividades pedagógicas e anotações de campo. Com base nos questionários, entrevistas, observações e anotações foram levantadas as principais dificuldades e necessidades dos profissionais e das crianças e construídos protocolos de observação dos comportamentos destes sujeitos. Durante o desenvolvimento dos estudos foram realizadas filmagens das atividades pedagógicas e anotações de campo, bem como reuniões com os profissionais, para orientações e planejamento das atividades pedagógicas adaptadas a serem desenvolvidas com as crianças, bem como materiais e recursos da CAA. Os resultados apontaram à presença de algumas modificações nos comportamentos dos profissionais e nos comportamentos das crianças. Revelaram ainda, que este trabalho proporcionou aos profissionais a oportunidade de reverem as suas atuações e as suas crenças, com relação à inclusão de crianças com autismo, Asperger e Angelman em ambientes não protegidos. Foi possível verificar as contribuições dos procedimentos e dos recursos da CAA, para favorecer a comunicação, a autorregulação e a aprendizagem dessas crianças e o quanto os procedimentos do ensino e da consultoria colaborativa se apresentam como promissores para o desenvolvimento dos profissionais.
A formação continuada de profissionais de Educação e Saúde se constitui como objeto desta dissertação. Na presente pesquisa pretendi planejar, implementar e avaliar os efeitos de um programa de formação continuada de profissionais de Educação e Saúde, oferecendo instruções e orientações de uso dos recursos da Comunicação Alternativa e Ampliada (CAA), para favorecer a comunicação e aprendizagem de crianças com autismo, Asperger e Angelman. Os estudos foram realizados em uma escola regular e em uma instituição especializada, com abordagem clínica-terapêutica-educacional. O universo da pesquisa abrangeu oito profissionais: duas professoras de classes regulares de ensino, uma professora especialista (Atendimento Educacional Especializado), duas estagiárias (estudantes de Pedagogia), exercendo a função de mediadora do aluno com autismo incluído, uma professora da instituição especializada, um auxiliar da professora e uma psicóloga. Também nove crianças fizeram parte desse universo: uma criança com autismo, incluída em classe regular e oito crianças que frequentavam a instituição especializada, sendo duas com Asperger, quatro com autismo e duas com Angelman. Para responder à pergunta principal do estudo: A Comunicação Alternativa e Ampliada pode favorecer a comunicação e a aprendizagem de crianças com autismo, Asperger e Angelman?, foi necessário conhecer os profissionais, as instituições e as respectivas gestoras, bem como o corpo docente, a equipe técnica e as crianças assistidas pelos profissionais, para verificar as suas necessidades, potencialidades, interesses e limitações. Outro elemento fundamental na proposta de formação dos profissionais foram os procedimentos do ensino e da consultoria colaborativa. A pesquisa foi desenvolvida em três estudos, durante o período de julho de 2010 a abril de 2012. Foi utilizado o delineamento intrasujeitos do tipo A-B (estudo I) e A-B-C (estudos II e III) e análise qualitativa dos resultados. Os procedimentos iniciais adotados foram: aplicação de questionários para os profissionais e os responsáveis pelas crianças, entrevistas semiestruturadas com as gestoras das instituições, observações in loco, filmagens das atividades pedagógicas e anotações de campo. Com base nos questionários, entrevistas, observações e anotações foram levantadas as principais dificuldades e necessidades dos profissionais e das crianças e construídos protocolos de observação dos comportamentos destes sujeitos. Durante o desenvolvimento dos estudos foram realizadas filmagens das atividades pedagógicas e anotações de campo, bem como reuniões com os profissionais, para orientações e planejamento das atividades pedagógicas adaptadas a serem desenvolvidas com as crianças, bem como materiais e recursos da CAA. Os resultados apontaram à presença de algumas modificações nos comportamentos dos profissionais e nos comportamentos das crianças. Revelaram ainda, que este trabalho proporcionou aos profissionais a oportunidade de reverem as suas atuações e as suas crenças, com relação à inclusão de crianças com autismo, Asperger e Angelman em ambientes não protegidos. Foi possível verificar as contribuições dos procedimentos e dos recursos da CAA, para favorecer a comunicação, a autorregulação e a aprendizagem dessas crianças e o quanto os procedimentos do ensino e da consultoria colaborativa se apresentam como promissores para o desenvolvimento dos profissionais.

A síndrome de Prader Willi (PWS) é uma doença de neurodesenvolvimento; a principal hipótese de causa de PWS é a ausência da expressão de SNORD116. O SNORD116 fica na região 15q11-q13 que apresenta vários genes com imprinting genômico e é conhecida por ser controlada pela região de controle de imprinting PWS (PWS-IC) que se localiza sobreposta à região promotora e ao exon 1 do gene SNRPN. Em camundongos, uma proteína zinc finger (Zfp57) foi descrita como importante para o estabelecimento e manutenção do imprinting no Snrpn. Através de análise do ENCODE do Genome Browser, verificamos que outra proteína zinc finger (ZNF274) se liga ao SNORD116. ZNF274 é conhecida por formar um complexo com TRIM28 e SETDB1 que inibe a expressão através da trimetilação da lisina 9 na histona 3 (H3K9me3). No atual estudo mostramos que ZNF274 se liga ao SNORD116 preferencialmente ao alelo materno nas células-tronco pluripotente induzidas (iPSCs). Adicionalmente, as proteínas TRIM28 e SETDB1, que formam um complexo com a ZNF274, estão presentes na região do SNORD116, e a modificação H3K9me3 ocorre preferencialmente no alelo materno nas iPSCs. Na análise funcional, mostramos que o knockdown de SETDB1 isoladamente ou combinado com o knockdown de ZNF274 causa aumento na expressão de SNRPN e SNORD116 nas iPSCs. Além disso, ocorre redução do H3K9me3 e aumento da modificação relacionada à ativação da transcrição, H3K4me2 (dimetilação da lisina 4 na histona 3), na PWS-IC. Os knockdowns também afetam a metilação de DNA, ocasionando o aumento de 5-hidroximetliação de citosinas na PWS-IC. Em outros tipos celulares estudados, neurônios derivados de iPSCs e SHEDs, ZNF274 e a modificação H3K9me3 ocorrem em ambos os alelos dentro do SNORD116. É possível que, nas iPSCs, este complexo proteja a região imprintada da desmetilação do DNA de proteína(s) que atue(m) nessa região somente em células pluripotentes. Nossos achados possibilitam melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no imprinting da região 15q11-q13, principalmente do SNORD116, e, consequentemente, disponibiliza novas ferramentas para o desenvolvimento de futuras terapias para PWS.
Prader-Willi syndrome (PWS) is a neurodevelopmental disorder. Loss of paternal copies of the cluster of SNORD116 C/D box snoRNAs and their host transcript, 116HG, on human chromosome 15q11-q13 imprinted region is considered to be the major responsible for PWS. PWS-imprinting center (PWS-IC) regulates 15q11-q13 imprinting. PWS-IC is located upstream and in the exon 1 of SNURF-SNRPN gene. In mice, Zfp57 plays an important role in establishment and maintenance of Snrpn imprinting. In human, ENCODE database indicates that ZNF274 binds to SNORD116. Moreover, ZNF274 are C2H2/KRAB zinc finger proteins as Zfp57. We have investigated the mechanism of repression of the maternal SNORD116. Here, we report that the ZNF274, in association with the histone H3 lysine 9 (H3K9) methyltransferase SETDB1, is part of a complex that binds to the silent maternal but not to the active paternal alleles in induced pluripotent stem cells (iPSCs). Knockdown of SETDB1 in PWS-specific iPSCs causes a decrease in the accumulation of H3K9 trimethylation (H3K9me3) at SNORD116. We also show that upon knockdown of SETDB1 in PWS-specific iPSCs, expression of maternally silenced 116HG RNA is partially restored. SETDB1 knockdown in PWS iPSCs also disrupts DNA methylation at the PWS-IC where a decrease in 5-methylcytosine is observed in association with a concomitant increase in 5-hydroxymethylcytosine. In iPSCs-derived neurons and stem cells from human exfoliated teeth (SHEDs) ZNF274/SETDB1 complex binding and H3K9me3 modification occur in both alleles. These observations suggest that the ZNF274/SETDB1 complex bound to the SNORD116 cluster may protect the PWS-IC from DNA demethylation during early development, as indicated by iPSCs. Our findings reveal novel epigenetic mechanisms that function to repress the maternal 15q11-q13 region. The better understanding of epigenetic mechanisms provides new tools for future therapy research.

Los síndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) son dos síndromes de desarrollo y conducta que ocurren con una frecuencia 1/15.000-20.000 recién nacidos. Resultan de la pérdida física o funcional de genes regulados por la impronta dentro de la región 15q11-q13. SPW está asociado con la perdida de expresión de alelos paternos, mientras que el SA está asociado con la perdida de expresión de alelo materno. Aproximadamente el 70% de los pacientes SPW presentan deleción en el cromosoma paterno, el 20-30% disomía uniparental materna y el 1% defecto de impronta. En los pacientes SA el 70% presentan deleción en el cromosoma materno, el 6% disomía uniparental paterna, el 2-7% defecto de impronta, el 4-10% mutación del gen UBE3A y en el 10-12% la etiología es desconocida.
El diagnóstico citogenético molecular de estos síndromes se realiza normalmente usando la combinación de varias técnicas debido a que la base genética es compleja. Nuestro laboratorio en 1991 inició los estudios de citogenética, en 1993 los estudios de FISH, en 1994 el análisis de microsatélites y en 1996 el análisis de metilación. De nuestra experiencia proponemos un algoritmo de diagnóstico molecular.
Se han analizado entre los años 1991-2000, 151 pacientes y seis líquidos amnióticos con sospecha de SPW y 147 pacientes y dos líquidos amnióticos con sospecha de SA procedentes del territorio español. Las técnicas empleadas han sido el estudio del cariotipo mediante bandas G, la hibridación in situ fluorescente, el análisis de microsatélites y el análisis de metilación con detección quimioluminiscente.
El diagnóstico de SPW se ha confirmado en 40 pacientes, 28 causado por deleción, cinco por disomía uniparental, dos por defecto de impronta y en cinco no se ha determinado la etiología. El SA se ha confirmado en 47 pacientes, 39 por deleción, cuatro por disomía uniparental y en cuatro no se ha determinado la etiología. Quince pacientes con sospecha de SA y estudio molecular normal han presentado una clínica típica SA, por lo que han sido considerados candidatos a presentar una mutación en el gen UBE3A o ser pacientes de etiología desconocida.
Las características clínicas de los pacientes han sido recogidas por médicos especialistas, correlacionándola con la etiología. Los pacientes SPW con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a los otros grupos en hipotonía neonatal, obesidad, hiperfagia, retraso del desarrollo, hipogonadismo, manos y pies pequeños, anomalías dentales, saliva viscosa, alteraciones de comportamiento y problemas de sueño. Solo se han observado diferencias en problemas de alimentación (93% vs 50%, p=0.070) entre deleción y disomía uniparental, y en facies característica (100% vs. 50%, p= 0.069) entre pacientes con deleción y defecto de impronta.
Los pacientes SA con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a las otras etiologías en retraso en el desarrollo y del lenguaje, ataxia, risa frecuente, aleteo de manos, hipermotricidad, poca atención, microcefalia, convulsiones, EEG anormal, occipital plano, boca ancha, babeo e hipopigmentación. Las frecuencias observadas han sido semejantes a las de estudios previos. En cambio, se han observado diferencias entre deleción y disomía uniparental en problemas de alimentación (100% vs. 0%, p=0.008), protusion de la lengua (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) y comunicación por gestos (23% vs. 75%, p=0.060). Estos resultados señalan que el dismorfismo facial y la comunicación por gestos son menos severos en los pacientes con disomía. Sin embargo, no podemos concluir que el fenotipo de estos pacientes sea menos severo que el de los pacientes con deleción.
Este trabajo ha permitido un mayor conocimiento molecular y clínico de estos dos síndromes que ha llevado a que seamos centro de referencia y asesores de familias afectas.
Prader-Willi (PWS) and Angelman (AS) syndromes are distinct developmental and neurobehavioral syndromes that occur at a frequency of 1/15.000-20.000 live births. Both are a results of a loss of function of imprinted genes mapped to the chromosome region 15q11-q13. PWS is associated with a loss of expression of paternally derived alleles, whereas AS is associated with a loss of expression of maternal allele. The etiology is heterogeneous: approximately 70% of PWS patients present deletion in the paternal chromosome, 20-30% maternal uniparental disomy and 1% imprinting defect. In AS, 70% present deletion in the maternal chromosome, 6% paternal uniparental disomy, 2-7% imprinting defect, 4-10% mutation of the gene UBE3A and 10-12% have an unknown etiology.
Molecular and cytogenetic diagnosis is currently performed using a combination of several techniques due to the complexity of the genetic basis of these syndromes. Our laboratory began in 1991 cytogenetics studies, in 1993 studies of FISH, in 1994 microsatellites analysis and in 1996 methylation analysis. Due to our experience an algorithm for molecular diagnostic was proposed.
Between the years 1991-2000, we analyzed 151 patients and six amniocentesis with suspicion of PWS and 147 patients and two amniocentesis with suspicion of AS from Spain. The techniques used were G-banding karyotype, the fluorescent in situ hybridization (FISH), microsatellite analysis and methylation analysis with chemiluminescent detection.
The diagnosis of PWS was confirmed in 40 patients, 28 with deletion, five with uniparental disomy, two with imprinting defect and in five the etiology was not been determined. AS diagnosis was confirmed in 47 patients, 39 with deletion, four with uniparental disomy and in four the etiology was not determined. Fifteen patients with suspicion of AS and normal molecular study had classical AS phenotype, and they were considered candidates to present a mutation in the gene UBE3A or unknown etiology.
The clinical characteristics of the patients were registered by the specialist physician. The received information was correlated with the etiology. The PWS patients with deletion did not present significant differences from the other groups regarding neonatal hypotonia, obesity, hyperphagia, developmental delay, hypogonadism, small hands and feet, dental anomalies, viscous salivates, behavioural disorders and sleep disturbance. The only differences observed were in feeding problems (93% vs 50%, p=0.070) between deletion and uniparental disomy, and in facies characteristic (100% vs. 50%, p = 0.069) among patients with deletion and imprinting defect.
AS patients with deletion did not present significant differences from the other etiologies in developmental delay, absent speech, ataxia, frequent laughing, flapping of hands, hypermotricity, little attention, microcephaly, seizures, abnormal EEG, occipital groove, macrostomia, drooling and hypopigmentation. The observed frequencies were similar to those of previous studies. On the other hand, differences were observed between deletion and uniparental disomy in feeding problems (100% vs. 0%, p=0.008), protruding tongue (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) and communication through gestures (23% vs. 75%, p=0.060). These results point out that the facial dismorfism and communication by gestures are less severe in the patients with disomy. However, we cannot conclude that the phenotype of these patients is less severe than that of the patients with deletion.
This work gave us a greater molecular and clinical knowledge of these two syndromes allowing us to become a reference and advisory centre for affected families.

A generalização do direito à educação institui uma das mais expressivas conquistas resultantes da modernização das sociedades, conferindo liberdade de aprender a todas as crianças com ou sem deficiência, assim como, o direito à sua construção pessoal e social, ou seja à sua real inclusão. O presente estudo, focaliza-se na Síndrome de Angelman, uma doença rara de base genética que se revela num distúrbio neurológico que causa atraso mental grave, alterações do comportamento, demora no desenvolvimento psicomotor, ausência de fala e deficit de atenção. Quisemos verificar a influência da intervenção terapêutica – hipoterapia – na recuperação ao nível psicomotor, tendo em conta o vínculo afetivo entre criançacavalo. Nesta técnica, hipoterapia, utiliza-se o passo do cavalo, movimento tridimensional, com fins terapêuticos de forma a que os estímulos produzidos em todo o corpo do cavaleiro proporcionem melhorias em termos neuro-musculares e sensoriais. O participante deste estudo é uma criança de 8 anos de idade, do sexo masculino, que apresenta diagnóstico de Síndrome de Angelman. Participaram também a mãe da criança, a psicóloga e fisioterapeuta da Associação Equiterapêutica do Porto e Matosinhos. Através da exploração do paradigma metodológico qualitativo, foi feita previamente uma análise documental (e.g., PEI, ficha de grupo e ficha individual) e configuradas entrevistas direcionadas à mãe da criança, à psicóloga e fisioterapeuta. Foram ainda realizadas seis sessões de observação direta não-participante, relativas às sessões de hipoterapia. Os resultados obtidos neste estudo são indicadores probabilísticos da importância da hipoterapia, contribuindo de forma satisfatória para um melhor desenvolvimento psicomotor (i.e. equilíbrio e ajuste corporal, auto-estima e estabilidade emocional). Ponderamos equitativamente, a hipótese da relação que se estabelece entre criança-cavalo, o vínculo afetivo, estar fortemente associada a esta evolução desenvolvimental. Reiteramos a importância do investimento nesta terapia e na articulação entre os diferentes agentes educativos para uma intervenção mais eficaz e frutífera.
The generalization of the right to education establishing one of the most significant achievements resulting from the modernization of societies, giving children , with or without disabilities, freedom to learn, as well as the right to personal and social construction, promoting its actual inclusion. The present study focuses on Angelman Syndrome, a rare genetic base disease that reveals a neurological disorder that causes severe mental retardation, behavioural disturbances, delayed psychomotor development, lack of speech and attention deficit. The hippo therapy technique uses the horse step, a three-dimensional movement, with therapeutic purposes, so that the stimulus produced around the body of the rider provide improvements in neuro-muscular and sensory terms. The goal of this study was to verify the effect of therapeutic intervention - hippo therapy - its recovery in the psychomotor level, taking into account the affective link between child and horse. The participant of this study is an 8-year-old male child, presenting diagnosis of Angelman Syndrome. The child's mother, the psychologist and physiotherapist of Associação Equiterapêutica do Porto e Matosinhos also participated in the study. The analysis and treatment of data were made using several documents (e.g., PEI, group and individual record sheet) and set directed to the mother of the child, psychologist and physiotherapist interviews. There were also six sessions of direct nonparticipant observation concerning the hippo therapy sessions. The results obtained in this study are probabilistic indicators of the importance of hippo therapy, contributing satisfactorily to a better psychomotor development (e.g. body balance and adjustment, self-esteem and emotional stability, due to the threedimensional movement of the horse). However, these results are only possible due to the affective bound between the child and horse. We reiterate the importance of investment in this therapy and the relationship between the various educational agents in order to achieve a more effective and fruitful intervention.