Literatura académica sobre el tema "Double hybride en levure"

La Petite dernière de Fatima Daas fait entendre la voix d’une narratrice aux prises avec sa double culture franco-algérienne et la découverte de son homosexualité. À travers cet article, notre objectif est d’analyser la façon dont le motif de l’entre-deux – communautaire, linguistique et spatial – façonne l’identité de la narratrice. En travaillant conjointement les notions d’étrangèreté et d’hybridité, nous porterons notre attention sur la géographie personnelle de la narratrice, sur ses déplacements quotidiens autant que sur le voyage vers le pays d’origine, ainsi que sur le conflit intérieur en lien avec la religion musulmane et l’identité homosexuelle. Notre hypothèse est que le refus de choisir entre ces deux identités a priori inconciliables peut se lire comme un signe d’agentivité, voire une véritable posture éthique : dans l’écriture de Fatima Daas se dessinerait en creux une conception relationnelle de l’autonomie.

The work presented in this paper is part of a research program dealing with the thermomechanical behaviour of rock salt. It consists of studying the deferred behaviour by means of multi-step creep tests with changes in deviator and temperature. The test results have revealed the strain-hardening character of rock salt superposed to the influence of temperature and stress. The interpretation of the test results with the model designed by J. Lemaitre, is not completely satisfactory for the entire set of test results because Lemaitre's model is used for the modeling of the viscoplastic behaviour of materials with only one strain hardening variable. Hence, a "hybrid" model introducing a double variable for strain hardening has been proposed. The validation of this model on the creep tests is very satisfactory and confirms the existence of two variables of strain hardening for rock salt behaviour.Key words: rock salt, multi-step creep, strain hardening, J. Lemaitre model.

La recherche vise à analyser les motivations ainsi que les stratégies de conciliation de l’emploi salarié et de l’activité entrepreneuriale au Burkina Faso. Sur la base de 20 entretiens semi-directifs réalisés avec des entrepreneurs hybrides de ce pays de l’Afrique de l’Ouest, les résultats font ressortir des motivations entrepreneuriales mixtes à caractères économiques et non économiques, mais également dépendantes du contexte socio-culturel. Par ailleurs, les entrepreneurs hybrides tentent de concilier leur double rôle d’employé-entrepreneur en déléguant la gestion courante de l’entreprise à un personnel diversifié, tout en contrôlant les activités à distance au moyen d’outils numériques. La recherche met en évidence deux facteurs clés de pérennisation de l’entreprise créée jusqu’ici ignorés dans la littérature, à savoir la présence physique et la contribution mentale de l’entrepreneur hybride. En outre, cette recherche suggère aux pouvoirs publics de soutenir l’entrepreneuriat hybride au regard de sa contribution à l’amélioration du pouvoir d’achat des individus et de sa capacité de création d’emplois.

Admiré ou utilisé, l'animal a pour l'homme un double visage que le jouet exacerbe. Or, la fonction d'apprentissage du deuil réalisée par l'objet transitionnel selon Winnicott semble remise en question par de récents cybers-virtuels doudous habiles à flatter notre désir de simulacre en nourrissant les valeurs de l'enfance, pérennisée à l'envi. Le Hérault privilégié est notre vieux doudou, réinvesti par l'art : animal-homme-super héros ou hybride accompli ; un mixte de tendresse naïve et de brutalité sauvage, histoire de nous permettre de ne pas grandir.

Résumé Représentatif, par son caractère hybride, d’une tendance essayiste dans la prose narrative contemporaine, Un an de Jean Echenoz propose un discours double : d’une part, la fiction ou la représentation du monde, de l’autre, l’investigation ethnologique et la réflexion sociologique. Inspiré par les effets sociaux des arrêtés anti-mendicité de 1996, le roman déplace l’accent du récit d’événements vers le récit de pensées et le commentaire. Le regard « en négatif » qu’adopte le narrateur dissipe l’illusion romanesque et étend l’espace qui entoure le discours de la fiction, transformant l’oeuvre en un « essai romanesque ».

En 2016, nous avons lancé le premier master de Nanoélectronique en Équateur à l’Universidad San Francisco de Quito (USFQ). Il s’agit d’un master en Double Diplôme dont le Master 1 (M1) se fait en Equateur et le Master 2 (M2) soit en France (Institut National Polytechnique de Toulouse, INPT) soit en Italie (Université de Calabres, UNICAL). Parmi les cours proposés le cours de design de microprocesseur de 48h est divisé en 2 parties dont une se concentrant sur le design d’un VSM (Very Simple Microprocessor). Dans une pédagogie de type classe inversée, une approche de type Apprentissage Par Projet (APP) a été choisie en utilisant comme support l’outil de design Microwind, logiciel de design de circuits intégrés incluant une perspective technologique. Ce type de travail a été reproduit tous les ans et Microwind a continué à intégrer de nouveaux noeuds technologiques avec de nouvelle architectures : planar, FinFET et plus récemment Nano-Sheet FET. De cette façon chaque nouvelle promotion peut apprendre à pratiquer l’intégration des VSM « customized » avec la possibilité d’intégrer des noeuds technologiques les plus avancés.

Cet article s’intéresse à l’acquisition du français par les locuteurs russes et polonais servant à la Légion étrangère. Le contexte d’acquisition du français est tout à fait particulier dans ce corps d’armée : plurilinguisme et communication exolingue produisent un input singulier, transformant la langue française en un hybride linguistique à définir, produit de jargon militaire, légionnaire, de mots empruntés aux langues fortement représentées à la Légion et de tournures stéréotypées dont les soldats ne connaissent pas la signification mot à mot. L’étude en cours tend à prouver l’existence d’un véritable légiolecte, permettant l’intercompréhension au sein des régiments, mais confrontant les recrues à de grandes difficultés de communication avec le monde civil. Dans l’étude d’énoncés de légionnaires, nous distinguerons les marques transcodiques de la langue maternelle des recrues des formes hybrides caractérisant le langage de la Légion.

Le cancer de l’ovaire est le plus mortel des cancers gynécologiques. CA125 est le marqueur de progression utilisé pour effectuer le suivi des patientes atteintes de ce dernier. La protéine CA125 est surexprimée au niveau des tissus ovariens tumoraux, mais elle est non détectable avec les moyens d'aujourd'hui au niveau des tissus ovariens normaux. CA125 est une protéine dont les fonctions demeurent inconnues sinon hypothétiques. Dans notre laboratoire, la recherche est axée sur la détermination des fonctions de l’antigène tumoral CA125. Pour cela un projet de maîtrise précédent au miens a permis la mise au point d’un outil nommé anticorps monovalent modifié (ScFv) dans une lignée de cellules tumorales de l’ovaire. Cet outil permet la liaison de la protéine cible, dans notre cas CA125, et empêche sa localisation physiologique à la membrane, éliminant ainsi sa fonction dans la cellule ciblée. Grâce à cet outil, quelques rôles potentiels ont pu être proposés. CA125 aurait des implications dans la prolifération, l’adhésion cellule-cellule, la résistance à l’apoptose et la migration des cellules tumorales de l’ovaire. Pour étudier cette protéine d’un point de vue moléculaire, mon projet principal consistait à effectuer un criblage double-hybride nucléaire chez la levure pour découvrir des interactions protéiques à une échelle cellulaire. En parallèle, l’utilisation de la méthode d’immunoprécipitation avec des cellules tumorales de l’ovaire en tant que projet secondaire avait pour but de vérifier des voies de signalisation spécifiques. Grâce aux résultats précédents obtenus par des expériences antérieures dans le laboratoire ainsi qu'à ceux obtenus pour d’autres mucines, certaines voies de signalisation démontraient un potentiel intéressant pour l’implication de la protéine CA125. Par des expériences d'immunoprécipitation, nous avons découvert que des complexes protéiques contenant la protéine E-cadhérine et la protéine β-caténine contiennent aussi CA125. Ces protéines sont impliquées dans la prolifération et l’adhésion cellulaire. Certaines fonctions hypothétiques de CA125 sont reliées à ces processus cellulaires, c’est-à-dire l’adhésion cellule-cellule et la prolifération cellulaire. Ces interactions protéiques permettront de mieux comprendre l’implication de CA125 dans ces processus cellulaires. Mon projet principal était la mise au point d’un double-hybride nucléaire chez la levure. Pour y parvenir, nous avons dû modifier les protocoles proposés normalement pour ce type de double-hybride. Nous avions choisi d’effectuer notre criblage avec le domaine cytoplasmique de CA125. Par contre, étant donné que ce domaine est très court seulement 31 a.a., le domaine transmembranaire de CA125 a été ajouté au premier domaine mentionné pour favoriser une conformation protéique adéquate. Le domaine cytoplasmique de CA125 a été choisi pour tenter de mieux comprendre d’un point de vue moléculaire les voies de signalisation dans lesquelles cet antigène tumoral est impliqué. Lors du premier essai pilote de double-hybride effectué, nous avons repêché une protéine qui interagit probablement de manière non spécifique avec CA125 selon des statistiques recueillies lors de criblages pour d’autres protéines transmembranaires. Pour remédier à ce problème majeur, nous avons recherché la source de ce problème. Nous avons alors réalisé que les levures utilisées n’étaient pas les Saccharomyces cerevisiae PJ69-4A que nous avions choisies pour effectuer notre double-hybride. Par la suite, les levures ont été maintenues sur des milieux sélectifs pour les PJ69-4A, c’est-à-dire en absence de lysine (Lys -). Pour parvenir à obtenir des colonies positives lors de la transformation de l’ADN de la librairie avec notre construction, il nous a fallu amplifier les transformants en milieu liquide toute la nuit en sélectionnant pour les vecteurs et la levure. Une fois les transformants amplifiés, nous avons obtenu des candidats potentiels qui ont franchi les différentes étapes de sélection du double-hybride. D’autres techniques ont dû être adaptées à nos besoins pour parvenir à mettre au point notre double-hybride nucléaire chez la levure pour notre protéine transmembranaire. Grâce à ces efforts, certains candidats ont été séquencés et la première protéine découverte par ce criblage est RNF5 (ring finger protein 5). Cette dernière est impliquée dans la régulation de la motilité cellulaire. CA125 semble être aussi impliqué dans ce processus. Il est alors possible de relier CA125 à RNF5. Ce premier résultat nous suggère que nous avons réussi à mettre au point un double-hybride nucléaire chez la levure pour l’antigène tumoral CA125.

Nous avons invalide le gene du recepteur de l'insuline (ri) chez la souris par recombinaison homologue et analyse les alterations phenotypiques qui en resultent. Les souriceaux ri (-/-) sont d'apparence normale a la naissance montrant que ri n'est pas indispensable durant la vie foetal. Toutefois, la defaillance de la signalisation par ri conduit rapidement a une hyperglycemie extreme, une hyperinsulinemie et une hyperlipidemie conduisant a un diabete avec acidocetose et steatose hepatique et a la mort des animaux dans la semaine qui suit leur naissance. Le recepteur des igfs (insulin-like growth factors) de type i (rigf-i) ne represente donc qu'un recepteur alternatif partiel pour l'action metabolique de l'insuline, apres la naissance. Nous avons derive une lignee fibroblastique a partir des souriceaux depourvus de ri et montre que rigf-i active par son ligand homologue igf-i ou par l'insuline peut conduire a la stimulation de l'entree du glucose, a l'incorporation du glucose dans le glycogene et a l'incorporation de la thymidine dans l'adn ainsi qu'a l'activation de la pi 3-kinase et de la map kinase. Rigf-i possede donc clairement un potentiel metabolique et pourrait realiser certaines actions de l'insuline. Toutefois, les courbes dose-reponses pour l'effet mitogenique avec l'igf-i ou l'insuline indiquent que les differents couples ligand/recepteur ne seraient pas equivalents. Nous avons par ailleurs etudie l'interaction directe de la sous-unite regulatrice p85 de la pi 3-kinase avec la chaine de ri et de rigf-i dans le systeme du double hybride chez la levure. Ce travail a permis de mettre en evidence des differences qualitatives et quantitatives dans l'interaction de p85 avec ri et rigf-i. L'interaction differentielle de proteines effectrices avec ces deux recepteurs pourrait contribuer a la specialite de signalisation. Nous n'avons pas pu mettre en evidence d'interaction directe des domaines sh2 de deux autres proteines effectrices, syp et gap, avec ri ou rigf-i dans ce systeme.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

La cellule est une machinerie complexe et la connaissance de la totalite de l'information genetique qu'elle contient constitue la premiere etape vers la comprehension globale de son fonctionnement. Nous avons sequence 72971 pb du chromosome xv de la levure saccharomyces cerevisiae dans le cadre du programme europeen de sequencage systematique du genome. Nous avons ainsi identifie 47 genes potentiels dont 21 etaient inconnus mais partagent des similarites avec des genes connus et 6 n'ont de similarite avec aucun gene deja repertorie. Ce programme a revele que la fonction de 31% des 6142 orfs de s. Cerevisiae etait totalement inconnue. Nous avons entame l'analyse fonctionnelle de six nouveaux genes en combinant l'analyse informatique, les methodes de la genetique, et les techniques du double-hybride et de fluorescence. Des mutants de deletion pour les orfs ygl047w et ygl061c nous ont montre qu'elles correspondaient a des genes letaux. Ygl047w est un gene conserve dans differents organismes au cours de l'evolution, il code probablement pour une fonction de base de la cellule. Nous n'avons pas observe de phenotype associe a la deletion des orfs ygl053w, ygl051w et ygl050w. De plus nous avons apporte plusieurs arguments en faveur d'une location des proteines ygl053w et ygl051w, membres de la famille dup 2 4 0, au niveau de la membrane plasmique. Notre mutant de deletion pour l'orf ygl064c est deficient dans la respiration et a perdu son adn mitochondrial. Chez le sauvage la proteine ygl064c est localisee dans la mitochondrie. Ygl064c presente une forte homologie de sequence avec les arn helicases de la famille dead. Ygl064c serait donc une arn helicase mitochondriale necessaire au maintien de l'adn mitochondrial.

La paroi de Saccharomyces cerevisiae est une structure protectrice extracellulaire dont la synthèse est contrôlé par une voie de signalisation cellulaire MAPkinase. Au sein de cette voie, la protéine Knr4 jouerait un rôle dans la coordination de la synthèse de paroi avec l'émergence du bourgeon et la croissance cellulaire. Cette protéine, dont le gène correspondant avait initialement été cloné par complémentation d'un mutant résistant à la toxine killer K9, a fait l'objet d'une étude fonctionnelle. Dans un premier temps, nous avons présenté des arguments expérimentaux suggérant que cette protéine présente une structure secondaire et tertiaire atypique, et qu'elle fait partie d'un complexe protéique. En appliquant des techniques génétiques (létaux synthétiques, double-hybride) et biochimiques (purification des protéines par affinité en tandem), nous avons pu établir une carte d'un réseau de l'interaction "in vivo" de cette protéine. L'ensemble des partenaires protéiques identifiés ont confirmé que cette protéine intervenait dans deux processus biologiques majeurs : la synthèse de la paroi et l'établissement de la polarité de la cellule. Enfin, nous avons montré que la phosphorylation de deux résidus sérine (S200/S203) semble nécessaire pour obtenir une interaction optimale avec ses partenaires
The cell wall of Saccharomyces cerevisiae is a protectrice extracellular structure. Its synthesis is mainly under controlled by a MAP kinase signalisation pathway. Related to this pathway, the protein Knr4 implicated in the coordination of the cell wall synthesis with bud emergence. This protein, whose gene was originally isolated by complementation of a mutant resistant to the toxin killer K9, has been the subject of a functional study. First, we provided several experimental arguments suggesting that this protein displays an unfolded secondary and tertiary structure and takes part of a multiprotein complex. Secondly, by applying genetic (Synthetic lethal and Two-hybrid system) and biochemical techniques (Tandem affinity Purification) we established a map of an "in vivo" interaction network for this protein. The interaction identified show that Knr4p is associated to two major biological processes: the cell wall synthesis and the establishment of the cellular polarity/bud emergence. Furthermore, we showed that the phosphorylation of two serines residues (S200/S203) seems necessary to obtain an optimal interaction of this protein with its partners. Taken together, these results consolidates the notion that Knr4 is one of the proteic elements physically connecting the cell wall synthesis and the budding machinery during cell growth

Une propriété clé des systèmes biologiques est la présence d'un réseau d'interactions protéiques, crucial pour toute fonction cellulaire comme par exemple la régulation du métabolisme énergétique. Deux enzymes clé impliquées dans cette régulation sont la créatine kinase (CK), dont la fonction consiste dans la gestion du stock et du transfert d'énergie, et la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), qui régule l'homéostasie énergétique au sein de la cellule et de l'organisme entier. Dans un premier temps un crible de double hybride en levure original fut appliquée afin d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction de la CK cytosolique du cerveau (BCK) et de l'AMPK dans le cerveau humain. Différents candidats d'interaction furent identifiés, dont des protéines membranaires associées aux vésicules (VAMP) interagissant avec les deux kinases. L'interaction AMPK-VAMP fut confirmée par co-immunoprecipitation à partir de vésicules synaptiques, mais ne menait pas à la phosphorylation de VAMP, suggérant que VAMP recrute AMPK pour la régulation de processus d'endo- et d'exocytose. Une seconde stratégie combinant un essai d'interactions biophysique, basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), avec des essais de phosphorylation in vitro permit la sélection de cibles AMPK isoforme spécifique. Une de ces cibles fut la fumarate hydratase, dont la phosphorylation préférentielle par l'AMPK221 provoque une augmentation de l'efficacité enzymatique in vitro. Finalement, une classe de candidats d'interaction, les glutathion S-transferases GSTM1 et -P1, fut caractérisée en détail par un panel de méthodes d'interactomique (SPR, double hybride, co-immunoprécipitation). Cette étude les identifie comme interacteurs fiables à haute affinité ainsi que nouveaux substrats de l'AMPK. Dans le cas de GSTP1 la phosphorylation par AMPK provoque une augmentation de son activité enzymatique suggérant un rôle direct de la signalisation par AMPK dans la défense contre le stress oxydatif.

Divers stimuli tels que l'ischémie, l'hypoxie et l'exercice peuvent induire la déplétion en ATP provoquant une déregulation de l'homéostasie énergétique. Cependant, les cellules disposant de mécanismes compensatoires pour contrebalancer et compenser le déficit de l'état énergétique cellulaire. Deux enzymes clés participent à la régulation du métabolisme énergétique cellulaire. La créatine kinase (CK) peut réagir immédiatement comme transporteur d'énergie. D'autre part la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), régule au niveau cellulaire et du corps en entier la livraison et la consommation d'énergie. Dans ce travail de thèse, les outils de base pour realiser un criblage des cibles de l'AMPK ont d'abord été mis en place. Ce sont les protocoles multidimensionnelles pour la purification de protéines par HPLC et le criblage in vitro de cibles membranaires de l'AMPK, dont le sous-fractionnement des membranes et la separation par électrophorèse de type blue native PAGE. Différents candidats potentiels de l'AMPK ont été obtenus, et deux ont été confirmés par phosphorylation in vitro. Ensuite, une interaction entre les deux enzymes, l'AMPK et la CK, a été confirmée pour la première fois in vitro et in vivo. L'AMPK phosphoryle la créatine kinase cytosolique du cerveau (BCK) sur la serine 6 in vitro et in vivo. Cette phosphorylation a été mis en evidance à l'aide de tests de phosphorylation et d'un anticorps généré spécifique de la phospho-Ser6. Le system de double hybride en levure a montré que cette phosphorylation est acompagné par une interaction transitoire impliquant spécifiquement l'AMPK active et BCK non phosphorylé. La phosphorylation médiée par AMPK n'affecte pas l'activité enzymatique de BCK mais localise la kinase dans le réticulum endoplasmique (RE) in vivo. Le travail presente dans ce manuscript confirme une interaction entre les deux enzymes clefs dans l'homeostasis energetique. La caracherization in vitro et in vivo de la phosphorylation de la BCK par l'AMPK suggère que l'AMPK regule probablement l'associattion de BCK aux compartements subcellulaires et pas l'activité enzymatique. Cette localisation est induite par l'AMPK en cas de stress énergetique et peut soutenir des processus fortement dépendant de l'ATP dans ce microenvironnement, comme par exemple le pompage de calcium.

La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d’une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d’intérêt, il est alors possible d‘observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l’aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d’obtenir une qualité d’image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d’utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d’intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l’étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l’insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s’associent de manière transitoire dans la membrane. L’observation sur la durée de ces foci, et l’analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l’ensemble de la membrane de manière uniforme. L’analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante ΔclsA, on n’observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l’incorporation d’un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d’interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d’etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l’état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane
In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis

A key property of complex biological systems is the presence of interaction networks crucial for all levels of cellular function, including the regulation of cellular energy. Two enzymes take center stage in the regulation of cellular and whole-body energy metabolism. Creatine kinase (CK) functions as an intracellular energy storage and transport system playing a crucial role in the acute response to increasing energy demands. AMP-activated protein kinase (AMPK) regulates cellular and whole-body energy delivery and consumption. We first applied an original cytosolic Y2H screen to identify new protein-protein interactions of cytosolic brain type CK (BCK) and AMPK in human brain. Various interaction candidates were identified, among them vesicle associated membrane proteins (VAMPs) interacting with both kinases. AMPK-VAMP interaction was confirmed by co-immunoprecipitation from synaptic vesicles, but did not lead to VAMP phosphorylation, suggesting that VAMP rather recruits AMPK for a regulation of exo- and endocytotic processes. A second strategy combining a biophysical interaction screen (Surface Plasmon Resonance, SPR) with an in vitro phosphorylation assay revealed rather AMPK isoform-specific targets. One is fumarate hydratase, which is preferentially phosphorylated by AMPK221, leading to an increase in enzyme activity in vitro. Finally, one class of interaction candidates, the glutathione S-transferases GSTM1 and -P1, were characterized in detail by a panel of interactomics methods (Y2H, SPR, co-immunoprecipitation) as reliable, high affinity interactors and identified as new AMPK substrates. In case of GSTP1, this leads to an increase in its enzymatic activity, suggesting a direct role of AMPK signaling in oxidative stress defense
Une propriété clé des systèmes biologiques est la présence d'un réseau d'interactions protéiques, crucial pour toute fonction cellulaire comme par exemple la régulation du métabolisme énergétique. Deux enzymes clé impliquées dans cette régulation sont la créatine kinase (CK), dont la fonction consiste dans la gestion du stock et du transfert d'énergie, et la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), qui régule l'homéostasie énergétique au sein de la cellule et de l'organisme entier. Dans un premier temps un crible de double hybride en levure original fut appliqué afin d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction de la CK cytosolique du cerveau (BCK) et de l'AMPK dans le cerveau humain. Différents candidats d'interaction furent identifiés, dont des protéines membranaires associées aux vésicules (VAMP) interagissant avec les deux kinases. L'interaction AMPK-VAMP fut confirmée par co-immunoprecipitation à partir de vésicules synaptiques, mais ne menait pas à la phosphorylation de VAMP, suggérant que VAMP recrute AMPK pour la régulation de processus d'endo- et d'exocytose. Une seconde stratégie combinant un essai d'interactions biophysique, basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), avec des essais de phosphorylation in vitro permit la sélection de cibles AMPK isoforme spécifique. Une de ces cibles fut la fumarate hydratase, dont la phosphorylation préférentielle par l'AMPK221 provoque une augmentation de l'efficacité enzymatique in vitro. Finalement, une classe de candidats d'interaction, les glutathion S-transférases GSTM1 et -P1, fut caractérisée en détail par un panel de méthodes d'interactomique (SPR, double hybride, co-immunoprécipitation). Cette étude les identifie comme interacteurs fiables à haute affinité ainsi que nouveaux substrats de l'AMPK. Dans le cas de GSTP1 la phosphorylation par AMPK provoque une augmentation de son activité enzymatique suggérant un rôle direct de la signalisation par AMPK dans la défense contre le stress oxydatif

La dystrophine, proteine impliquee dans la dystrophie musculaire de duchenne (dmd), et son complexe etablissent un lien entre la matrice extra- cellulaire et le cytosquelette du muscle squelettique. Mon travail s'est articule en deux parties : (i) la recherche de proteines associees a la dystrophine dans le tissu cerebral et cardiaque et (ii) l'etude de l'implication de l'apoptose dans differentes pathologies musculaires, dont la dmd. La dystrophine et ses partenaires possedent de nombreuses isoformes tissu- et developpement- specifiques. Cette panoplie s'enrichit encore de proteines apparentees a la dystrophine et de leurs isoformes. Neanmoins, en dehors du muscle squelettique, les partenaires de cette famille de proteines sont tres mal connus. Pourtant, une meilleure connaissance de l'agencement de ces proteines dans des tissus comme le coeur ou le cerveau, permettrait de mieux comprendre les defauts cardiaques et cognitifs associes a la dmd. Nous avons, dans un premier temps, recherche de nouveaux partenaires proteiques de la dystrophine dans ces deux tissus par la technique du double- hybride dans la levure. Ce travail nous a permis de valider in vivo l'interaction de l'1- syntrophine avec la dystrophine, de cloner la sequence humaine de l'1- syntrophine, et de preciser sa region d'interaction avec la dystrophine. Enfin, nous avons caracterise un nouveau potentiel partenaire de l'extremite carboxy- terminale de la dystrophine et de l'utrophine dans le cerveau. De nombreux travaux ont recemment rapporte l'existence d'un processus apoptotique dans le muscle mdx, modele murin de deficience en dystrophine, mais aussi dans de nombreuses autres pathologies musculaires comme la deficience en merosine, la denervation ou encore l'ischemie-reperfusion myocardique. Toutefois, l'intervention de ce processus dans la physiopathologie de ces affections n'etait pas demontree jusqu'a present. Nous avons developpe des lignees de souris transgeniques surexprimant la proteine humaine bcl- 2 specifiquement dans le muscle et le coeur, et teste la capacite de ce facteur anti- apoptotique a ameliorer, par une diminution de l'apoptose, le phenotype observe dans ces quatre pathologies. Les principaux resultats de cette etude sont les suivants : - bcl- 2 ne semble pas capable de proteger le muscle de l'atrophie musculaire induite par une denervation, malgre l'observation d'une baisse significative du nombre de noyaux en apoptose, suggerant que ce processus intervient peu dans le phenotype musculaire pathologique. - en revanche, la surexpression de cette proteine permet de reduire significativement l'etendue des lesions d'ischemie- reperfusion myocardiques induites par occlusion temporaire de l'artere interventriculaire anterieure de la souris. Cet effet protecteur est associe a une amelioration de la fonction cardiaque et a une diminution de l'apoptose. Ainsi, la composante apoptotique observee au cours de la phase aigue de l'infarctus du myocarde constitue-t-elle un reel enjeu therapeutique dans lequel le facteur bcl- 2 pourrait jouer un role essentiel.

Le présent travail s’attache à montrer l’exploitation momentanée d’un parler hybride en plein essor dans les milieux scolaires du Cameroun septentrional : le franfulfulde. La manifestation de cette activité individuelle et quotidienne que Valin appelle praxéogénie est alors perçue et présentée comme un véhicule propice à l’expression de contacts de langue et de la diversité culturelle en francophonie du sud. Nous nous intéressons à ce parler hybride de par son double aspect de parler composite et de discours. En tant que parler, il présuppose un système de signes et des codes; et en tant que discours, il s’inscrit dans une logique individuelle. Pour cerner les manifestations de ce postulat, nous nous sommes servi de l’approche sociolinguistique de Christian Baylon qui s’intéresse à l’étude de la langue et ses manifestations sociales. Cette réflexion nous a permis non seulement d’observer la création lexicale, les opérations syntagmatiques et transformationnelles, mais également de prendre en considération ce que pourrait être les intentions réelles des usagers du franfulfulde.