Rozprawy doktorskie na temat „Histones méthyltransférase”

La réplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée au niveau de sites spécifiques, appelés origines de réplication, qui sont distribués de manière adéquate le long des chromosomes et actifs une seule fois par cycle cellulaire. Les mécanismes qui contrôlent la position des origines de réplication restent énigmatiques chez les mammifères. Les travaux réalisés pendant cette thèse révèlent que la lysine méthyltransférase PR-Set7 humaine, responsable de la mono-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4, induit un réarrangement chromatinien au niveau des nombreuses origines de réplication des gènes actifs. Celui-ci est caractérisé par la mono- et tri-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4 et la tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Ce profil de méthylation d'histones constituerait un signal épigénétique pour le recrutement sur la chromatine des facteurs nécessaires à la formation des origines de réplication, indépendamment d'un rôle sur la transcription. En effet, la présence d'une forme active de PR-Set7 en amont d'un gène rapporteur est suffisante pour induire cette cascade de méthylation et la formation d'une nouvelle origine de réplication au niveau de ce gène sans en modifier son expression. De la même manière, l'inactivation de l'enzyme dans une cellule conduit à l'inverse à une diminution du nombre total d'origines sans un effet majeur sur l'expression des gènes. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée via le complexe E3 ligase CRL4Cdt2 et la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition au niveau de la chromatine du signal de formation des origines, s'assurant ainsi qu'elles sont actives une seule fois par cycle. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante en effet pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la formation et activation répétées des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). Ces résultats établissent la cascade de méthylation initiée par PR-Set7 pendant la mitose comme le mécanisme épigénétique contrôlant la mise en place et l'activation d'au moins la moitié des origines de réplication chez les mammifères
In order to ensure accurate inheritance of genetic information through cell proliferation, chromosomes must be precisely copied once and only once and then correctly distributed to daughter cells. Chromosome replication occurs during the S phase of the cell cycle and is initiated at discrete chromosomal sites called replication origins. However, the ability to activate replication origins occurs during mitosis of the previous cell cycle and continuing into early G1 phase. This crucial step, called DNA replication licensing, consists of the assembly of a multi-protein pre-Replicative Complex (pre-RC) onto origins, making them competent for replication. During S phase, pre-RC are inhibited by different ways, that ensures that origins are activated only once per cycle and prevents DNA rereplication (multiple initiations from the same origin). In metazoans, functional replication origins do not show defined DNA consensus sequences, thus evoking the involvement of chromatin determinants in the selection of these origins.During my thesis, I have discovered that that the onset of licensing in mammalian cells coincides with an increase in histone H4 Lysine 20 monomethylation (H4K20me1) at replication origins by the methyltransferase PR-Set7. By genome mapping of H4-20me1 signals during the cell cycle, we found that nearly half of origins that fire during S phase are associated with H4-K20me1 during mitosis, when the process of replication licensing is activated. This mitotic H4-K20me1 signature is highly significant for origins located near transcription start sites and promoters that are characterized by the presence of CpG islands and H3-K4me3 signals. Furthermore, tethering PR-Set7 methylase activity to an origin-free genomic locus is sufficient to promote a chromatin remodeling follow by a creation of a functional origin of replication and promotes replication initiation. PR-Set7 and H4K20me1 are cell-cycle regulated, with high levels during M and early G1 and very low in S phase. At the onset of S phase, PR-Set7 undergoes an ubiquitin-mediated proteolysis, which depends on its interaction with the sliding-clamp protein PCNA and involves the ubiquitin E3 ligase CRL4-Cdt2. Strikingly, expression of a PR-Set7 mutant insensitive to this degradation causes the maintenance of H4K20me1 and repeated DNA replication at origins. This photolytic regulation controls the initiation of replication origin.This suggests that a cascade of lysine methylation events, initiated by PR-Set7 during mitosis, would define the position of origins in open chromatin structures

La protéine CARM1 "Coactivator-Associated aRginine Methyltransferase 1" a été initialement identifiée pour sa fonction coactivatrice de la transcription impliquant différents récepteurs nucléaires des hormones. Cette voie d’activation de la transcription est un processus régulé par plusieurs étapes et différentes cascades de signalisation impliquant de nombreux corégulateurs. Dans ce contexte, deux cibles privilégiées ont été identifiées pour l'activité de méthylation de CARM1: l'histone H3 et la protéine CBP. CARM1 est également impliquée dans d’autres processus, comme la maturation des ARN et la transmission du signal cellulaire. Une dérégulation de ces différents processus pouvant induire certains cancers, CARM1 constitue une des nouvelles cibles potentielles en chimiothérapie. Les résultats obtenus durant cette thèse sont répartis en quatre chapitres. Le chapitre 3 présente les structures cristallographiques de domaines isolés de CARM1 résolues seules ou en complexe avec différents cofacteurs. Le chapitre 4 porte sur les études fonctionnelles en solution par la comparaison de différentes constructions et de mutants ponctuels. Ces études mettent en évidences des zones et des résidus cruciaux à l’activité de CARM1. Le chapitre 5 détaille l’étude des interactions entre CARM1 et différents substrats. Ceci a été fait par différentes approches : l’étude de protéines complètes (histone H3 et CBP), de fragments de ces protéines et une approche qui consiste à fixer de façon covalente des peptides de l’histone H3 à un complexe binaire CARM1-cofacteur. Le chapitre 6 porte sur la recherche d’inhibiteurs spécifiques de CARM1, travaux effectués dans le cadre de collaborations
The protein CARM1 "Coactivator-Associated aRginine Methyltransferase 1" was initially identified for its activity to coactivate transcription under the regulation of some nuclear receptors. This kind of activation process is regulated by a large number of coactivators involved at different stages. In this context, CARM1 was identified to methylates two major targets: histone H3 and CBP. CARM1 is also involved in other biological events like RNA processing and signal transmission. Disturbances of these different processes can induce cancers and CARM1 is by the way a new potential pharmacological target in chemotherapy. The results obtained during this thesis work are divided in four chapters. Chapter 3 presents the crystallographic structures of isolated domains of CARM1, alone or in complex with different cofactors. Chapter 4 describes the functional studies in solution by comparisons of different constructions and mutant forms. These studies highlight the crucial role of different areas and residues for the CARM1 activity. Chapter 5 details studies of interactions between CARM1 and selected target substrates (histone H3 and CBP). It has been done by three different approaches: interactions with full length proteins, fragments of these proteins and an approach consisting of covalently bind H3 peptides to a binary complex CARM1-cofactor. Chapter 6 presents a collaborative work done to discover CARM1 specific inhibitors

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le plus fréquent des cancers du foie et une importante cause de mortalité. Les modifications épigénétiques jouent un rôle essentiel dans ce cancer et sont des cibles thérapeutiques intéressantes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l‘histone méthyltransférase (HMT) EZH2, qui augmente dans le CHC et est liée à la résistance au traitement. En tant que sous-unité catalytique du complexe PRC2, EZH2 est responsable de la marque H3K27me3 et la répression de gènes (rôle canonique). Dans le cancer, EZH2 a d’autres fonctions indépendantes de PRC2 et peut contribuer à l’expression de gènes (rôle non canonique). Les inhibiteurs enzymatiques d’EZH2 ne sont pas efficaces sur les tumeurs solides, suggérant que l’activité non catalytique d’EZH2 joue un rôle dans ces cancers. EZH2 est régulé par des modifications post-traductionnelles, telle la O-GlcNAcylation par l’O-GlcNAc transférase (OGT) qui augmente dans le CHC. Nous avons montré que dans le CHC la fraction d’EZH2 associée à OGT est surtout impliquée dans l’expression de gènes. Notre but était de caractériser les mécanismes sous-tendant l’activation de gènes par EZH2/OGT et de déterminer le rôle du complexe PRC2 et c-Myc, qui peut être modulé par OGT et joue un rôle important dans le CHC, dans ces processus. Nous avons montré que EZH2 et c-Myc sont O-GlcNAcylés dans les cellules hépatocytaires et que l’O-GlcNAcylation de EZH2 est importante pour son recrutement aux gènes cibles. Nos données indiquent que c-Myc joue un rôle important dans la régulation de gènes par EZH2/OGT. De manière intéressante, nos résultats suggèrent qu’une partie des fonctions non canoniques d’EZH2 dans les cellules hépatocytaires humaines pourrait être dépendante du complexe PRC2. L’ensemble de nos résultats indiquent qu’OGT et c-Myc contribuent aux fonctions non canoniques d’EZH2 dans des cellules hépatocytaires humaines et apportent de nouvelles connaissances quant au potentiel des régulations épigénétiques comme cible thérapeutique dans le CHC. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires sous-tendant les dérégulations de gènes dans le CHC ouvrira des perspectives pour de nouvelles stratégies thérapeutiques
Hepatocellular carcinoma (HCC), the most common form of liver cancer and leading cause of death, is a heterogeneous disease with no unique driver mutation. Up to 50% of HCCs harbor alterations in epigenetic machineries that represent promising therapeutic targets. During my PhD, I focused on the histone methyltransferase (HMT) EZH2 that is upregulated in HCC and related to therapy resistance. EZH2 is the catalytic subunit of the PRC2 complex responsible for H3K27me3, a repressive epigenetic mark (canonical function). In cancer, EZH2/PRC2 represses the expression of tumor suppressor genes but EZH2 can also activate oncogenes and cell cycle genes in a mostly PRC2-independent manner (non-canonical function). EZH2 HMT inhibitors have demonstrated low efficacy in solid tumors suggesting that HMT independent functions of EZH2 are key in these cancers. EZH2 can be regulated by post-translational modifications, including O-GlcNAcylation by O-GlcNAc transferase (OGT) whose expression is increased in HCC. Our data show that EZH2 and OGT are co-recruited to defined gene promoters in HCC and predominantly promote gene expression. To decipher the molecular mechanisms underlying EZH2/OGT-mediated gene activation in HCC, we assessed the roles of PRC2 and c-Myc that plays an important role in HCC and can be modulated by OGT. We showed that EZH2 and c-Myc are O-GlcNAcylated by OGT in human hepatoma cells and that EZH2 O-GlcNAcylation plays a role in EZH2 target promoter recruitment. Our data also indicate that c-Myc plays an important role in EZH2/OGT-mediated gene regulation. Interestingly, our results suggest that part of the non-canonical functions of EZH2 in human hepatoma cells may be PRC2 dependent. Collectively, our data uncover that OGT and c-Myc promote non-canonical functions of EZH2 in transformed liver cells and provide important insights for epigenetic strategies as potential future anti-HCC therapies. A better understanding of the regulatory networks controlling gene expression in HCC will open perspectives for the design of novel therapeutic strategies for HCC

Les chondrosarcomes sont des tumeurs malignes osseuses, considérés comme radio- et chimio-résistants, du fait de leur environnement hypoxique. Dans ce contexte, cette étude vise à mieux comprendre le rôle de l’hypoxie dans la résistance de ces tumeurs à la chimiothérapie (cisplatine) et à la radiothérapie (rayons X) et à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de sensibiliser les chondrosarcomes aux traitements, par un ciblage épigénétique de la méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27).Dans un premier temps, nous avons montré que, contrairement à ce qui est communément admis, l’hypoxie n’a pas d’effet sur la sensibilité au cisplatine ou aux rayons X dans certains chondrosarcomes alors qu’il augmente la résistance au cisplatine et la sensibilité aux rayons X uniquement dans une lignée de chondrosarcome. Dans un second temps, nous avons montré que le 3-deazaneplanocine A (DZNep) induit l’apoptose dans ces tumeurs, par un mécanisme indépendant de la méthylation de H3K27 et de sa méthylase EZH2 et semblerait agir par la voie Rhoβ/EGFR. Cependant, il provoque des effets secondaires sur la fertilité masculine. Par ailleurs, son association avec le cisplatine potentialise ses effets toxiques sur les chondrosarcomes. Le GSK-J4, quant à lui ralentit la croissance cellulaire des chondrosarcomes et son association avec le cisplatine augmente cet effet. Cette étude souligne que les chondrosarcomes possèdent des mécanismes de régulation cellulaires différents, d’où l’importance de mener des études sur plusieurs lignées cellulaires afin de mieux prédire la réponse aux traitements. De plus, ces travaux démontrent les propriétés anti-tumorales du DZNep et du GSK-J4 dans le traitement de ces tumeurs
Chondrosarcomas are bone malignant tumors, considered as radio- and chemo-resistant, due to their hypoxic environment. In this context, this study aimed to better understand the role of hypoxia in the resistance of these tumors to chemotherapy (cisplatin) and radiotherapy (X-rays) and to identify new therapeutic strategies to re-sensitize chondrosarcomas by epigenetic targeting of H3K27 methylation. First, we showed that, contrary to what is commonly accepted, hypoxia has differential effect on cisplatin or X-ray sensitivity in chondrosarcomas, while it increases cisplatin resistance and X-ray sensitivity only in one cell line. Secondly, 3-deazaneplanocin A (DZNep) induces apoptosis in these tumors by a mechanism independent of H3K27 methylation and its methylase EZH2 and seems to act through the Rhoβ / EGFR pathway. However, it causes side effects on male fertility. In addition, its association with cisplatin potentiates its toxic effects on chondrosarcomas. The GSK-J4, on the other hand, decreases cell growth and its association with cisplatin increases this effect.This study highlights that chondrosarcomas use different cellular regulation mechanisms, showing the importance of conducting studies on several cell lines in order to better predict the response to treatments. In addition, these studies demonstrate the anti-tumoral properties of DZNep and GSK-J4 in the treatment of these tumors

Les modifications post-traductionelles des histones contribuent à l’expression génique et à la stabilité du génome. La méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), une marque associée aux promoteurs de gènes transcrits, est déposé par les methyltransferases hautement conservées de la famille SET1, dans le contexte du complexe COMPASS. SET-2, l’homologue de SET1 chez Caenorhabditis elegans, est responsable de la déposition de H3K4me dans la lignée germinale, et son inactivation provoque une perte progressive de la fertilité. Le but de mon travail de thèse a été d’étudier comment SET-2 et la méthylation de H3K4 contribuent au maintien de la lignée germinale. J’ai montré que l’absence de SET-2 provoque une sensibilité accrue aux dommages à l’ADN. Cependant, les voies de signalisation et de réparation de ces dommages sont fonctionnelles dans le mutant set-2. Par séquençage de l’ADN, j’ai par ailleurs montré que la stérilité progressive observée en l’absence de set-2 n’est pas due à une capacité de réparation réduite. L’ensemble de mes résultats suggère que H3K4me pourrait agir en aval de la signalisation de dommages à l’ADN, en influençant l’organisation de la chromatine aux sites des cassures double brin. J’ai d’autre part mis en évidence une nouvelle fonction pour la méthylation de H3K4 dans l’organisation de la chromatine en montrant que set-2 interagit génétiquement avec le complexe Condensine II et la Topoisomérase II, facteurs clefs de l’organisation mitotique des chromosomes. Des expériences de microscopie par FLIM-FRET ont d’ailleurs validé une fonction de H3K4 méthylée dans l’organisation de la chromatine dans la lignée germinale. Enfin, j’ai montré par analyses transcriptomiques que la protéine CFP-1 du complexe COMPASS est impliquée dans la régulation du programme transcriptionnel de la lignée germinale et que cette fonction est indépendante de SET-2. L’ensemble de mes résultats montre comment la régulation chromatinienne impacte le maintien d’une lignée germinale fonctionnelle à plusieurs niveaux
Post-translational modifications of histones contribute to gene expression and genome stability. Methylation of lysine 4 of histone H3 (H3K4me), a mark associated with actively transcribed genes, is deposited by the highly conserved SET1 family methyltransferases acting in COMPASS related complexes. SET-2, the SET1 homologue in Caenorhabditis elegans, is responsible for the deposition of H3K4me in the germ line, and its inactivation causes progressive loss of fertility. The purpose of my PhD work was to study how SET-2 and the methylation of H3K4 contribute to the maintenance of the germ line. I have shown that the absence of SET-2 causes increased sensitivity to DNA damage. However, the DNA damage-induced signaling and repair pathways are functional in the set-2 mutant. By DNA sequencing, I have also shown that the progressive sterility observed in the absence of set-2 is not due to a reduced repair capacity. Together, my results suggest that H3K4 methylation may act downstream of DNA damage signaling, potentially by influencing the organization of chromatin at the sites of double-strand breaks. I have also described a new function for H3K4 methylation in the organization of chromatin by showing that set-2 genetically interacts with the Condensitin II complex and Topoisomerase II, key factors in mitotic chromosome organization. Moreover, FLIM-FRET microscopy experiments have validated a role for H3K4 methylation in germline chromatin organization. Finally, using transcriptomic analyses, I have described a function for CFP-1, a component of the COMPASS complex, in the regulation of the germline transcriptional program independent of SET-2. Altogether, my results show how chromatin regulation affects the maintenance of a functional germline through multiple mechanisms

Les mécanismes épigénétiques jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes. L’enzyme du complexe répresseur Polycomb II EZH2, capable de triméthyler la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) est impliquée dans la régulation de nombreux processus normaux, tels que le développement et la différenciation cellulaire. Les plasmocytes jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire humorale. La différenciation des lymphocytes B en plasmocytes (PCD) est finement régulée par un réseau de facteurs de transcription impliqué de l’induction et le maintien de l’identité de ces deux types cellulaires. Par ailleurs, peu de mécanismes épigénétiques ont été décrits dans la PCD. En utilisant un modèle in vitro de PCD développé dans notre laboratoire, nous avons mis en évidence une surexpression d’EZH2 dans le stade préplasmablaste (prePB) de la PCD. Grâce à l’analyse globale des séquences d’ADN associées à EZH2 et H3K27me3 dans ce type cellulaire, nous avons montré que l’enzyme était capable de réprimer l’expression de gènes impliqués dans différentes fonctions des lymphocytes B et des plasmocytes. EZH2 est également capable de se fixer sur le promoteur de gènes actifs dans les prePB, impliqués dans la régulation de la prolifération de ces cellules. En outre, nous avons montré que l’inhibition chimique d’EZH2 dans notre modèle résultent en une dérégulation transcriptionnelle associée à une accélération du processus de différenciation. Nos résultats suggèrent qu’EZH2 est impliqué dans le maintien de l’état transitoire, immature et prolifératif des prePBs via la régulation de gènes, dépendante et indépendante de H3K27me3, favorisant l’amplification des cellules à défaut de leur différenciation en plasmocytes. Des anomalies de séquence ou de l’expression d’EZH2 ont été mis en évidence de nombreux cancers hématologiques et solides. Le myélome multiple (MM) est une hémopathie caractérisée par l’accumulation de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse. Nos travaux ont notamment permis d’identifier une surexpression des membres du complexe Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dans les cellules de MM, en association avec leur prolifération. Afin de comprendre le rôle de PRC2 dans le MM, nous avons utilisé un inhibiteur de l’activité méthyltransférase d’EZH2 (EPZ-6438). L’effet de l’inhibiteur d’EZH2 sur la prolifération et la survie des cellules de MM est très hétérogène. En effet, les cellules sensibles présentent un arrêt du cycle cellulaire et entrent en apoptose. De manière intéressante, la résistance des cellules de MM à l’inhibiteur d’EZH2 pourrait être médiée induite par la méthylation des promoteurs des gènes cibles de PRC2. Nous avons ainsi établi un score (EZ-score), basé sur l’expression des gènes, permettant d’identifier des patients de mauvais pronostic pouvant bénéficier d’un traitement avec un inhibiteur d’EZH2. Nous avons également mis en évidence un effet synergique de EPZ-6438 et du Lenalidomide, un agent immuno-modulateurs utilisé en traitement conventionnelle du MM. Cette inhibition de la croissance cellulaire est notamment due à l’induction de l’expression de facteurs de transcription, spécifiques des lymphocytes B, et des suppresseurs de tumeurs en association avec la répression de l’expression de MYC. Aussi, un prétraitement avec l’inhibiteur d’EZH2 permet de surmonter la résistance des cellules tumorales au Lenalidomide. Ces données suggèrent que le ciblage de PRC2 pourrait avoir un intérêt thérapeutique chez les patients caractérisés par un mauvais pronostic et un fort EZ-score. Ainsi, l’inhibiteur d’EZH2 pourrait également permettre de resensibiliser les patients aux chimiothérapies basées sur des agents immuno-modulateurs
Epigenetic mechanisms play an essential role in gene expression regulation. EZH2, the catalytic sub-unit of PRC2, is able to trimethylate the lysine 27 of histone H3 (H3K27me3) and is involved in the regulation of numerous normal processes, such as development and cell differentiation. Plasma cells (PCs) play a major role in the defense of the host organism against pathogens, by producing antigen-specific antibodies. B cell differentiation into PC is mediated by a fine-tuned regulatory network of cell specific transcription factors involved in B and plasma cell identity. Although numerous key actors involved in plasma cell differentiation (PCD) have been described, most of the epigenetic mechanisms associated with this process are yet to be unveiled. Using an in vitro model of PCD developed in our laboratory, we showed that EZH2 is upregulated in the preplasmablast stage (prePB) of the PCD. By analyzing DNA sequences associated with EZH2 and H3K27me3 in this cell type, we highlighted that EZH2 is recruited to and represses through H3K27me3 a subset of genes involved in B cell and plasma cell identity. Interestingly, in prePBs and PBs, EZH2 was also found to be recruited to H3K27me3-free promoters of transcriptionally active genes known to regulate cell proliferation and DNA repair. Inhibition of EZH2 catalytic activity resulted in B to PC transcriptional changes associated with PC maturation induction together with higher immunoglobulin secretion. Altogether, our data suggests that EZH2 is involved in the maintenance of prePBs/PBs transitory immature proliferative state through H3K27me3-dependent and independent gene regulation supporting their amplification. Moreover, while EZH2 overexpression was previously shown to inhibit PCD in mice, this study highlights for the first time that EZH2 inhibition can accelerate normal human PCD by prematurely inducing a plasma cell transcriptional program.EZH2 mutations or abnormal expression were shown to be involved in numerous hematological malignancies and solid tumors. Multiple Myeloma (MM) is a malignant plasma cell disease with a poor survival, characterized by the accumulation of myeloma cells (MMCs) within the bone marrow. We identified a significant upregulation of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) core genes in MM cells in association with proliferation. We used EPZ-6438, a specific small molecule inhibitor of EZH2 methyltransferase activity, to evaluate its effects on MM cells phenotype and gene expression profile. PRC2 targeting results in cell growth inhibition due to cell cycle arrest and apoptosis together with Polycomb, DNA methylation, TP53 and RB1 target genes induction. EZH2 inhibitor induced toxicity was heterogeneous in human myeloma cell lines and primary MM cells from patients. Interestingly, we found that MM cell resistance to EZH2 inhibitor could be mediated by DNA methylation of PRC2 target genes. We established a gene expression-based EZ-score allowing to identify poor prognosis patients that could benefit from EZH2 inhibitor treatment. We also demonstrated a synergistic effect of EPZ-6438 and Lenalidomide, a conventional drug used for MM treatment, through the activation of B cell transcription factors and tumor suppressor gene expression in concert with MYC repression. Moreover, EPZ-6438 pre-treatment was able to overcome MM cells resistance to lenalidomide. These data suggest that PRC2 targeting could have a therapeutic interest in MM patients characterized by high-risk EZ-score values, reactivating B cell transcription factors and tumor suppressor genes. EZH2 inhibitor could also re-sensitize MM patients to chemotherapies based on immunomodulatory agents

Le substrat réel des enzymes impliquées dans les phénomènes ayant trait à l'ADN (transcription, réparation, réplication. . . ) est en fait la chromatine. Les modifications post-traductionnelles des histones jouent donc un rôle majeur dans le contrôle du devenir cellulaire. Une des modifications les plus étudiées est l'acétylation des lysines. Elle est mise en place par les histones acétyl transférases et enlevée par les histones déacétylases. Cette thèse s'attache à étudier les histones déacétylases de classe I. Dans un premier temps en regardant la relation entre les histones déacétylases de classe I et l'histone métyl transférase Suv39H1 et dans un deuxième temps le rôle de HDAC3 lors de l'apoptose des cellules lymphocytaires T
Chromatin is the real substrate of enzymatic reactions which uses DNA as a substrate. Thus, post-translational modifications of nucleosomal histones play major roles in the control of cell fate. One of the best known histone modifications is lysine acetylation. It is catalysed by histone acetyl transferases and removed by histone déacétylases. In a first study, I investigated the functional relationship between class I histone déacétylases and Suv39H1, a histone H3 K9 methyltransferase. In a second study, I investigated the involvement of the histone déacétylase HDAC3 in apoptosis of T lymphocytes

SetD2 est une enzyme épigénétique jouant un rôle important dans l’hématopoïèse et reconnue comme l’unique triméthyltransférase de la lysine 36 de l’histone 3. La marque H3K36me3 permet de recruter des effecteurs ayant des rôles clés dans des processus variés tels que la réparation de l’ADN, la répression de la transcription cryptique et l’épissage alternatif. SETD2 fait partie des 50 gènes les plus mutés dans les cancers, en particulier les carcinomes rénaux à cellules claires et les leucémies. Néanmoins, très peu d’études cherchent à caractériser en détail l’impact réel de ces mutations sur l’activité, la structure et la fonction de SetD2. Par ailleurs, certaines tumeurs exprimant une forme sauvage de SetD2 arborent un faible niveau global de la marque H3K36me3, suggérant des mécanismes pathologiques de régulation de l’activité méthyltransférase de l’enzyme. Dans un premier temps, nous avons cherché à évaluer les effets des métabolites du benzène sur l’activité et la structure de SetD2. En effet, le benzène est un composé indispensable pour l’industrie chimique reconnu comme leucémogène avéré pour l’Homme. Son hématotoxicité est liée à sa métabolisation dans la moelle osseuse en des composés très réactifs comme la 1,4-benzoquinone (BQ) dont les effets génotoxiques sont documentés. Néanmoins, les mécanismes moléculaires de la toxicité du benzène sont à ce jour peu caractérisés. Nous avons mis en évidence que la BQ inhibait de manière irréversible l’activité méthyltransférase de SetD2. Des approches biochimiques nous ont permis de comprendre que cette inhibition était due à la formation d’adduits quinoniques sur les résidus cystéines des doigts de zinc de SetD2, ces derniers ayant un rôle structural et régulateur. Dans un contexte cellulaire, l’inhibition de l’activité de SetD2 par la BQ se traduit par une baisse globale de la marque H3K36me3 dans des lignées hématopoïétiques comme les cellules K562 ou HL60. La seconde partie de notre projet a porté sur la caractérisation des effets de la mutation Y1666C sur l’activité et la structure de SetD2. La position Y1666 de SetD2 est reconnue comme un hotspot de mutation dans les cancers. De plus, cette tyrosine très conservée des enzymes à domaine SET joue un rôle important dans la catalyse enzymatique. Nous avons montré que la mutation Y1666C abroge totalement l’activité enzymatique de SetD2, à la fois sur des substrats histones et non-histones, dans un contexte in vitro ainsi que dans un modèle cellulaire. Afin d’apporter des réponses structurales à notre études, nous avons déterminé la première structure de SetD2 mutée en complexe avec son cofacteur, la SAM. L’analyse de cette dernière nous a permis de mettre en évidence que la perte de l’activité de l’enzyme mutée était due à la chaîne latérale du résidu C1666. En effet, cette dernière se loge directement dans le site de fixation de la lysine méthylable, empêchant ainsi toute interaction entre l’enzyme et son substrat protéique. Ces travaux visent à améliorer la compréhension des mécanismes de l’oncogénèse induite par le benzène et par des mutations d’une enzyme épigénétique clé
SetD2 is an epigenetic enzyme that plays a significant role in hematopoiesis and is recognized as the only trimethyltransferase of lysine 36 of histone 3. The H3K36me3 mark allows the recruitment of effectors with key roles in various processes such as DNA repair, cryptic transcription repression and alternative splicing. SETD2 is one of the 50 most mutated genes in cancers, especially clear cell renal cell carcinomas and leukaemias. However, very few studies attempt to characterize in detail the real impact of these mutations on the activity, structure and function of SetD2. In addition, some tumors expressing a wild type SetD2 have a low overall level of H3K36me3, suggesting that the methyltransferase activity of the enzyme can be regulated by pathological mechanisms. First, we tried to evaluate the effects of benzene metabolites on the activity and structure of SetD2. Indeed, benzene is an essential compound for the chemical industry and is recognized as a class 1 leukemogen for humans. Its hematotoxicity is due to its metabolism in bone marrow into highly reactive compounds such as 1,4-benzoquinone (BQ), whose genotoxic effects have been documented. However, the molecular mechanisms of benzene toxicity are not well characterized. We have shown that BQ irreversibly inhibits the methyltransferase activity of SetD2. Biochemical approaches have allowed us to understand that this inhibition was due to the formation of quinonic adducts on the cystein residues of SetD2 zinc fingers, which have a structural and regulatory role. In a cellular context, inhibition of SetD2 activity by BQ results in an overall decrease in the H3K36me3 mark in hematopoietic cell lines such as K562 or HL60 cells. The second part of our project focused on characterizing the effects of the Y1666C mutation on the activity and structure of SetD2. The position Y1666 of SetD2 is recognized as a mutation hotspot in cancers. In addition, this highly conserved tyrosine of SET domain enzymes plays an important role in enzymatic catalysis. We have shown that the Y1666C mutation completely abrogates the enzymatic activity of SetD2, both on histone and non-histone substrates, in an in vitro context as well as in a cellular model. In order to provide structural answers to our studies, we have determined the first structure of SetD2 in complex with its cofactor, the SAM. The analysis of the structure allowed us to highlight that the loss of activity of the mutated enzyme was due to the lateral chain of the C1666 residue. Indeed, the latter is located directly into the binding site of methylatable lysine, thus preventing any interaction between the enzyme and its protein substrate. This work aims to improve the understanding of oncogenesis mechanisms induced by benzene or mutations of a key epigenetic enzyme

Dans les cellules eucaryotes l’organisation de l’ADN en chromatine n’assure pas seulement la compaction de l’ADN dans le noyau mais sert aussi de structure dynamique qui permet la régulation des processus pour lesquels l’ADN est une matrice comme la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome qui est constitué de 147pb d’ADN qui s’enroule autour d’un octamère d’histones. Le nucléosome possède une structure flexible régulée par les modifications post-traductionnelles d’histones. Les modifications d’histones contribuent à la régulation des fonctions du génome en modérant directement la structure de la chromatine ou bien via le recrutement de protéines spécifiques liant la chromatine. La lysine 20 de l’histone H4 (H4K20) peut être modifiée pour générer 3 niveaux de méthylation : mono- (me1), di- (me2), et tri-méthylation (me3), chaque niveau de méthylation est associé à des fonctions spécifiques. PR-Set7 (aussi appelée Set8, Setd8 ou KMT5A) est l’unique enzyme connue pour catalyser la mono-méthylation H4K20 alors que les niveaux de di- et tri-méthylation sont le résultat de l’activité des enzymes Suv4-20h qui requièrent la mono-méthylation H4K20 induite par PR-Set7 comme substrat. Ces enzymes sont essentielles puisque des études de Knock-Out ont montré que PR-Set7 et les Suv4-20h sont requises pour le développement de la souris et que leur perte dans des modèles cellulaires entraine des dommages ADN et des défauts de cycle cellulaire. Toutefois, les fonctions des différents niveaux de méthylation et des enzymes associées restent peu claires. Le travail réalisé pendant cette thèse a révélé que l’action concertée des enzymes PR-Set7 et Suv4-20h est requise pour le contrôle (i) de l’assemblage de l’hétérochromatine sur l’ADN naissant, (ii) de la liaison du pre-RC sur un groupe d’origines de réplication tardives nécessaires pour la réplication de régions d’hétérochromatine dans le cycle cellulaire suivant. Les deux fonctions dépendent de la conversion de la mono-méthylation H4K20 en tri-méthylation H4K20 et du recrutement spécifique de la protéine liant la méthylation H4K20 ORCA/LRWD1. Ainsi, la déplétion de PR-Set7 par siRNA entraine des défauts de compaction de la chromatine en interphase des cellules qui sortent de mitose, ce qui favorise la fixation non spécifique des sous-unités MCMs et ORCs des complexes pre-RC. Finalement et étant donné le rôle clé de la méthylation H4K20 dans la formation de l’hétérochromatine et la réplication, mon travail de thèse a contribué à révéler que la surexpression de PR-Set7 est un facteur de mauvais pronostic dans le myélome multiple et que l’inhibition de cette enzyme par des composés chimiques pourrait dans le futur avoir un grand intérêt pour le traitement du cancer
In eukaryotic cells, the organization of DNA into chromatin not only ensures its compaction into nucleus, but also serves as a dynamic structure that offers a range of possibilities for regulating DNA transactions, such as transcription, DNA replication and repair. The basic unit of chromatin is the nucleosome, which is constituted of 147 bp of DNA wrapped with an octamer composed of histone proteins. This nucleosome structure is versatile showing distinct variations, including post-translational modifications of histone proteins. Histone modifications contribute to the regulation of genome functions by altering directly the nucleosome structure or through the recruitment of specific chromatin-binding proteins. In this regard, the lysine 20 of histone H4 (H4K20) can be modified to generate three different methylation states: mono- (me1), di- (me2), and trimethylation (me3), with a unique activity being coupled to the specific extent of methylation on this lysine residue. PR-Set7 (also known as SET8 or SETD8) is the sole enzyme that catalyzes H4K20me1, whereas H4K20me2 and H4K20me3 occur through the action of Suv4-20h, which requires PR-Set7-induced H4K20me1 as a substrate. These enzymes are essential since knockout studies have shown that both PR-Set7 and Suv4-20h are required for mouse development and their loss causes DNA damage and cell cycle defects. However, the functions of different H4K20 methylation states and the associated enzymes still remain poorly understood.The work carried out during this thesis reveals that the concerted activity of PR-Set7 and Suv4-20h is required for the timely control of (i) heterochromatin assembly on nascent DNA and (ii) the licensing of a critical subset of late-firing origins necessary for the replication of heterochromatin regions in the following cell cycle. Both functions depend on the conversion of H4K20me1 to H4K20me3 and the specific recruitment of the H4K20me-binding protein LRWD1/ORCA. Accordingly, siRNA-mediated PR-Set7 depletion triggers a defective interphase chromatin compaction in cells that exit of mitosis, which in turn favor a non-specific chromatin loading of ORC and MCMs subunits of pre-replication complexes. Finally and consistent with a key role of H4K20 methylation in heterochromatin formation and replication, my thesis work contributes to reveal that up-regulation of PR-Set7 is a poor prognosis factor in multiple myeloma and that its inhibition by specific chemical compounds might be a great interest for cancer treatment in near future

La méthylation de l'ADN est l’une des marques épigénétiques les plus étudiées et est largement conservée. Mes travaux de thèse présentent le premier méthylome d'une diatomée marine P. tricornutum qui appartient à la famille des Stramenopiles. P. tricornutum présente une méthylation d’environ 6% qui est présente en mosaïque sur l’ensemble du génome. Une méthylation importante a été retrouvé chez les éléments transposables, en particulier les éléments amplifiés récemment de type Copia. L’analyse met en évidence plus de 320 gènes méthylés dans trois contextes génomiques différents : à proximité des éléments transposables, en grappes de gènes méthylés, et dans des gènes uniques. En outre, les gènes largement et complètement méthylés ont été trouvé fortement corrélés avec le silencing transcriptionnel et l'expression différentielle dans des conditions spécifiques. Enfin, il a été constaté que les gènes susceptibles d’avoir été acquis par transfert horizontal de gènes bactériens étaient préférentiellement insérés dans des régions riches en éléments transposables, ce qui suggère un mécanisme par lequel l'expression de gènes étrangers peut être tamponnée à la suite de leur insertion dans le génome. En résumé, P. tricornutum a une faible méthylation de l'ADN et une methylation relativement importante des éléments transposables et seulement quelques gènes méthylés. Ce premier méthylome d’une diatomée Stramenopile ajoute de manière significative à notre compréhension de l'évolution de la méthylation de l'ADN chez les eucaryotes. En ce qui concerne les modifications des histones, la distribution des marques H3K4me2, H3K9me2 et H3K27me3 a été examinée chez P. tricornutum. H3K4me2 est principalement associée à des gènes alors que les deux marques H3K9me2 et H3K27me3 ciblent principalement des éléments transposables. La répartition de H3K27me3 est inhabituelle et différente de ce qui a été observé chez les espèces modèles étudiées à ce jour. Les gènes marqués par H3K27me3 ont tendance à être faiblement exprimés et de façon différentielle. H3K27me3 et H3K9me2 ont tendance à co-marquer non seulement les éléments transposables méthylés, mais aussi des gènes fortement méthylés, ce qui semble être important pour le maintien du silencing des gènes différentiellement exprimés. L'analyse combinatoire de différentes marques d’histones et la méthylation de l'ADN nous a donné un aperçu du paysage de la chromatine chez les diatomées, et aidera à définir les caractéristiques structurales et fonctionnelles conservées
DNA methylation is the most extensively studied and widely conserved epigenetic mark. Here the first whole genome methylome from a stramenopile, the marine model diatom P. tricornutum is reported. In P. tricornutum, around 6% of the genome was methylated in a mosaic landscape. Extensive methylation in transposable elements (TEs), especially in recently amplified Copia-like elements was found. Over 320 genes were found methylated occurring in three different genomic contexts: in the proximity of TEs, in clusters of methylated genes, and in single genes. Furthermore, genes extensively and completely methylated correlated strongly with transcriptional silencing and differential expression under specific conditions. Finally, it was found that genes likely acquired by horizontal gene transfer from bacteria were preferentially inserted within TE-rich regions, suggesting a mechanism whereby the expression of foreign genes can be buffered following their insertion in the genome. In general, P. tricornutum has low DNA methylation with relatively extensive DNA methylation on TEs and a few methylated genes. This first Stramenopile methylome adds significantly to our understanding of the evolution of DNA methylation in eukaryotes. As for the histone modifications, genome wide distribution of H3K4me2, H3K9me2 and H3K27me3 were examined in P. tricornutum. H3K4me2 is mainly associated with genes while both H3K9me2 and H3K27me3 marks target mainly transposable elements (TEs). The distribution of H3K27me3 is unusual and different from what have been profiled in model species so far. The genes marked by H3K27me3 tend to be lowly and differentially expressed. H3K27me3 and H3K9me2 tend to co-mark not only methylated TEs but also heavily methylated genes, which appears to be important for maintaining the silencing of differentially expressed genes. The combinatorial analysis of different histone marks and DNA methylation gave us an overview of diatom chromatin landscapes, and will help to define conserved structural and functional features

Les complexes histones méthyltransférases SET1, hautement conservés de la levure aux mammifères, sont ciblés aux régions promotrices par la protéine CFP1/CXXC, résultant en l’implémentation de la méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), modification post-traductionnelle influençant l’expression des gènes selon le contexte chromatinien. La présence de plusieurs complexes SET1 distincts dans différents systèmes modèles eucaryotes a compliqué l’étude de leurs fonctions dans un contexte développemental. Caenorhabditis elegans contient une seule protéine homologue de SET1, SET-2, et d’uniques homologues des autres sous-unités du complexe, RBBP5, ASH2, WDR5, DPY30 et CFP1. Cependant, la composition biochimique du complexe n’a pas été décrite. En couplant des expériences de co-immunoprécipitation avec des analyses de spectrométrie de masse, j’ai identifié le complexe SET-2/SET1 dans les embryons de C. elegans. D’autre part, j’ai montré que le complexe SET-2/SET1 co-immunoprécipite aussi un autre complexe conservé modifiant la chromatine et j’ai mis en évidence les interactions mises en jeu entre ces deux complexes. Mon analyse génétique a démontré que les mutants de perte de fonction des sous-unités des deux complexes partagent des phénotypes communs, en cohérence avec des fonctions développementales communes. Le laboratoire a également entrepris des expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine montrant un nouveau rôle de CFP-1 dans le recrutement de ce complexe au niveau de sites spécifiques de la chromatine
The highly conserved SET1 family complexes are targeted by CFP1/CXXC protein to promoter regions through multivalent interactions to implement methylation of histone H3 Ly4 (H3K4me), a modification that correlates with gene expression depending on the chromatin context. The presence of distinct SET1 complexes in multiple eukaryotic model systems has hampered studies aimed at identifying the complete array of functions of SET1/MLL regulatory networks in a developmental context. Caenorhabditis elegans contains one SET1 protein, SET-2, one MLL-like protein, SET-16, and single homologs of RBBP5, ASH2, WDR5, DPY30 and CFP1. The biochemical composition of the complex however, has not been described. Through the use of co-immunoprecipitation coupled to mass spectrometry-based proteomics, I identified the SET-2/SET1 complex in C. elegans embryos. Most importantly, I showed that the SET-2/SET1 complex also co-immunoprecipitates another conserved chromatin-modifying complex and I highlighted the interactions involved between these two complexes. My genetic analysis revealed that loss of function mutants of the two complex subunits share common phenotypes, consistent with common developmental functions. The laboratory has also undertaken transcriptomic and chromatin immunoprecipitation experiments showing that CFP-1 has a role in the binding of this complex at specific chromatin regions

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique
In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent la production et le renouvellement continu des cellules sanguines tout au long de la vie d'un individu. Bien que le nombre de CSH augmente avec l'âge, leur capacité à générer la lignée lymphoïde B diminue alors que leur potentiel de différenciation myéloïde est maintenu. Les mécanismes responsables du vieillissement des CSH restent en grande partie inconnus. Mon projet de thèse a consisté à étudier les mécanismes épigénétiques responsables du vieillissement des CSH. Ce travail a montré une diminution de la modification répressive H3K9me3 et de la formation de l'hétérochromatine, impliquant l'histone méthyltransférase SUV39H1 et le miR-125b, dans les CSH avec l'âge. SUV39H1 catalyse la triméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me3), et constitue un des principaux facteurs responsables de la formation de l'hétérochromatine. SUV39H1 est fortement exprimée dans les CSH de sujets jeunes et son inhibition conduit à une baisse du niveau de H3K9me3 et à une diminution de la capacité des CSH à générer des cellules B sans modifier leur potentiel myéloïde. L'expression de SUV39H1 diminue dans les CSH humaines et murines avec l'âge conduisant à une diminution de l'histone 1-13K9me3, et à une désorganisation de l'hétérochromatine associée à une dérépression transcriptionnelle de plusieurs régions génomiques répétées. La réexpression de SUV39H1 dans des CSH âgées augmente leur potentiel de différenciation B. Par ailleurs, mes travaux de thèse ont également permis d'identifier SUV39H1 comme étant un gène cible du miR-125b dans les CSH humaines. L'expression du miR-125b augmente dans les CSH avec l'âge et cette augmentation pourrait conduire à la diminution de SUV39H1 et à l'altération de l'hétérochromatine observées dans les CSH d'individus âgées. De plus, le miR-125b peut également jouer un rôle dans la perte du potentiel B des CSH avec l'âge. La surexpression du miR-125b dans les CSH diminue leur potentiel de différenciation B tandis que l'inhibition de l'activité de ce miR améliore le potentiel de différenciation B des CSH de personnes âgées, atténuant ainsi leur biais de différenciation myéloïde. L'ensemble de ce travail indique que la voie du miR¬125b/SUV39H1 joue un rôle important dans la régulation de la chromatine des CSH et dans la perte du potentiel de différenciation B des CSH au cours du vieillissement
Hematopoietic stem cells (HSC) produce ail blood cell lineages during the life of an indiv idual. With age, there is an increase in the number of HSC, and aged HSC have a reduced ability to generate B lymphoid cells whereas their myeloid lineage potential remains unchanged or even increases. The molecular mechanisms leading to HSC aging remain unclear. The aim of my thesis project was to identify epigenetic mechanisms implicated in the loss of HSC B cell potential with age. This work has allowed us to identify the histone methyltransferase SUV39H1 and regulation of heterochromatin as critical factors in the maintenance of HSC B cell potential. SUV39H1 catalyzes trimethylation of lysine 9 of histone H3 (H3K9me3) and is one of the principal enzymes involved in heterochromatin formation. SUV39H1 is highly expressed in HSC and pharmacological or siRNA-mediated inhibition of SUV39H1 in human HSC results in decreased H3K9me3 and reduced generation of B but not myeloid cells following in vitro differentiation. With age there is a decrease in the expression of SUV39H1 in both human and mouse HSC, leading to a decrease in global levels of H3K9me3. The resulting relaxation of heterochromatin structure leads to transcriptional

Alors que les méthylations sur différents résidus lysine des histones (par exemple H3K4, H3K27 et H3K36) sont bien connues pour exercer diverses fonctions biologiques, leurs interactions et/ou leur mode d’actions demeurent encore peu caractérisés. Par la génétique et des outils de biologie moléculaire, nous visons à étudier les rôles et interconnections des méthylations des H3K4, H3K27 et H3K36 dans la transcription, la croissance de la plante et la régulation du développement chez Arabidopsis thaliana.La première partie de ma thèse est centrée sur les rôles et interconnections des méthylations de H3K4 and K36.ATX1 et ATX2 sont des méthyltransférases de H3K4 alors que SDG8 est une méthyltransférase de H3K36.L’analyse de doubles mutants a révélé que sdg8 est dominant sur atx1 et atx2 pour le temps de floraison et larégulation de la prolifération cellulaire. La triméthylation de H3K36 (H3K36me3) est partiellement dépendante de H3K4me3 mais non-réciproquement. SDG25 a une double activité H3K4me3 et H3K36me3 et les déméthylases de H3K4, LDL1 et LDL2, sont des antagonistes de l’activité de SDG25. Les triples mutants sdg25ldl1ldl2 fleurissent plus tôt que la lignée sauvage, mais plus tard que sdg25 et montrent une augmentation de taille de cellule similaire à celle des mutants ldl1ldl2.La deuxième partie de ma thèse se concentre sur les rôles et interconnections entre les méthylations H3K4/K36 et H3K27. CLF catalyse les H3K27me3 au sein du complexe PRC2. Les doubles mutants sdg8clf etsdg25clf fleurissent plus tôt que les mutants simples et montrent un nombre réduit de cellules par feuille. Unniveau plus élevé de H3K4me3 et dans une moindre mesure de H3K36me3 a été observé dans le cas de déposition de H3K27me3 réduite, et de la même façon, une déposition de H3K4me3/H3K36me3 réduite augmente aussi le niveau de H3K27me3. Distinct du rôle antagoniste rapporté auparavant entre CLF et ATX1,CLF n’a pas montré d’antagonisme avec SDG25 ou SDG8.La dernière partie de ma thèse est centrée sur le mécanisme de SDG26 dans la régulation du temps de floraison. Mes résultats ont montré que SDG26 est une méthyltransférase H3K4 et/ou H3K36 spécifique de la chromatine de SOC1, un intégrateur de la floraison actif. De manière similaire à SDG25 et SDG8, SDG26 ne travaillait pas de façon antagoniste avec CLF. L’analyse de doubles mutants a révélé que sdg26 domine atx2mais sdg25, atx1 and clf est dominant sur sdg26 pours le temps de floraison et la régulation de la prolifération cellulaire. Les triples mutants sdg26ldl1ldl2 fleurissaient encore plus tard que les mutants sdg26 et ldl1ldl2 et a révélé que sdg26 est dominant sur ldl1ldl2 lors de la régulation de la prolifération cellulaire. Les analysesd’interaction avec les autres composants de PRC2, VEL1 et VRN5, ont révélé que sdg26vel1 et sdg26vrn5 fleurissaient encore plus tard que les mutants simples dans des conditions de jours courts et de vernalisation. Ensemble, mes résultats révèlent des couches additionnelles de complexité de redondance et de diversification de fonctions entre et au sein des méthyltransférases et déméthylases, pour la transcription, le temps de floraison et la régulation de la prolifération cellulaire chez Arabidopsis
While methylations at different lysine residues of histones (e.g. H3K4, H3K27 and H3K36) are well known to exert diverse biological functions, their interactions and/or ensemble-actions remain poorly characterized so far.Using genetic and molecular biology tools, we aim to investigate roles and ‘crosstalks’ of H3K4, H3K27 andH3K36 methylations in transcription and plant growth and development regulation in Arabidopsis thaliana.The first part of my thesis focuses on the roles and crosstalks between H3K4 and K36 methylations.ATX1 and ATX2 are H3K4 methyltransferases while SDG8 is a H3K36 methyltransferase. Double mutant analysis revealed that sdg8 dominates over atx1 and atx2 in flowering time and cell proliferation regulation.H3K36 trimethylation (H3K36me3) is partially dependent on H3K4me3 but not vice versa. SDG25 has a dualH3K4me3 and H3K36me3 activity and the H3K4-demethylases LDL1 and LDL2 antagonize SDG25 activity.The sdg25ldl1ldl2 triple mutants flowered earlier than wild type but later than sdg25 and showed an increased cell size similarly to ldl1ldl2 mutantsThe second part of my thesis focuses on the roles and crosstalks between H3K4/K36 and H3K27methylations. CLF within PRC2 complex catalyzes H3K27me3. The sdg8clf and sdg25clf double mutants flowered earlier than the single mutants and showed a reduced number of cells per leaf. An increased level ofH3K4me3 and to a less extent H3K36me3 was observed upon impaired H3K27me3 deposition, and similarly impaired H3K4me3/H3K36me3 deposition also enhanced H3K27me3 level. Distinct from previously reported antagonistic role between CLF and ATX1, CLF did not show antagonism with SDG25 or SDG8.The last part of my thesis focuses on mechanism of SDG26 in flowering time regulation. My result showed that SDG26 is a H3K4 and/or H3K36 methyltransferase specific at chromatin of SOC1, an activeflowering integrator. Similarly to SDG25 and SDG8, SDG26 did not work antagonistically with CLF. Double mutant analysis revealed that sdg26 dominates over atx2 while sdg25, atx1 and clf dominate over sdg26 inflowering time and cell proliferation regulation. The sdg26ldl1ldl2 triple mutants flowered even later than thesdg26 and ldl1ldl2 mutants and showed that sdg26 dominates over ldl1ldl2 in cell proliferation regulation.Interaction analysis with the other PRC2 components VEL1 and VRN5 revealed that sdg26vel1 and sdg26vrn5flowered even later than the single mutants under short day and vernalization conditions.Together, my study revealed additional layers of complexity of overlap and non-overlap functions between and within methyltransferases and demethylases in transcription, flowering time and cell proliferation regulation in Arabidopsis

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique
In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome

De plus en plus de données indiquent que le cancer n’est pas uniquement la conséquence d’altérations génétiques, mais résulte également en partie d’altérations épigénétiques. De façon intéressante, cette dérégulation épigénétique est réversible, faisant des enzymes responsables des cibles thérapeutiques potentielles. En effet, les enzymes de modification de la chromatine et en particulier les Histones Déacétylases (HDACs) et les ADN Méthyltransférases (DNMTs), ont récemment émergé comme de nouvelles cibles prometteuses appelées « drogues épigénétiques » pour le traitement des cancers. Le but de ce projet a été de caractériser l’activité de UVI5008, un dérivé de la psammaplin A qui a initialement été isolée de l’éponge marine Psammaplysilla. Ce composé a été synthétisé dans le laboratoire de l’un de nos collaborateurs, le professeur Angel R. De Lera (Université de Vigo, Espagne), et nous avons pu montrer que ce composé cible spécifiquement plusieurs enzymes épigénétiques et présente une activité anti-tumorale in vitro et in vivo. Nous avons évalué l’activité anti-tumorale potentielle de UVI5008 in vitro sur des lignées de cellules cancéreuses et ex vivo sur des blastes issus de patients leucémiques. Nos résultats indiquent que UVI5008 réduit la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1-M et l’apoptose dans des lignées cellulaires de leucémie myéloïde aiguë (AML) établies et dans des blastes issus de patients AML en culture ex vivo. Des essais enzymatiques in vitro ont permis de mettre en évidence que UVI5008 bloque l’activité de HDAC1, 4 et 6 et augmente l’acétylation globale et spécifique des histones. Outre son activité d’inhibition des HDACs, ce nouvel inhibiteur bloque également la méthylation des îlots CpG situés sur les promoteurs des gènes suppresseurs de tumeur p16/INK4 et RAR-Beta, un récepteur de l’acide rétinoïque. Enfin, nous avons observé que UVI5008 possède des capacités inhibitrices des sirtuines, le niveau d’acétylation de p53 sur le résidu lysine 382 étant augmenté suite à un traitement avec ce composé. Nous avons également pu mettre en évidence une activité antitumorale de UVI5008 in vivo dans des xénogreffes de cellules HCT116 (issues de cancer du colon humain) et de cellules MCF7 (provenant de cancer du sein humain) dans des souris nues, de même que dans un modèle murin de cancer mammaire, les souris MMTV-Myc. Dans ces différents modèles, une augmentation de l’acétylation des histones et de p53K382 a pu être observée in tumouri. De façon importante, l’activité de UVI5008 est spécifique des cellules cancéreuses et sans toxicité importante pour les cellules normales. De plus, son activité est indépendante de p53, ce qui représente un avantage, la majorité des cancers ayant une mutation ou une extinction de l’expression de p53. ErbB2 joue un rôle important dans de nombreuses pathologies humaines. Son niveau est augmenté par amplification génique ou surexpression dans environ 30 % des cancers mammaires humains, de même que dans d’autres pathologies humaines, et cette marque est associée à un mauvais pronostique pour les patients. Nous avons donc choisi de tester l’activité anti-tumorale de UVI5008 sur un autre modèle de tumorigenèse chez la souris par la surexpression de l’oncogène ErbB2 dans la glande mammaire, les souris MMTV-ErbB2, et nous avons pu montrer une efficacité similaire de UVI5008 sur ces tumeurs mammaires. À l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement qui cible simultanément l’ensemble de ces 3 familles d’enzymes que sont les HDACs, les DNMTs et les SIRTs. Nos résultats suggèrent fortement que ces enzymes peuvent être ciblées simultanément par un composé unique, ce qui pourrait représenter un avantage pour les nouvelles thérapies contre le cancer
It is becoming increasingly clear that cancer is a consequence not only of genetic but also of epigenetic alterations. Interestingly, this epigenetic deregulation is reversible making the corresponding enzymes promising drug targets. Chromatin modifying enzymes, in particular histone deacetylases (HDACs) and DNA methyltransferases (DNMTs), have recently emerged as new promising targets of the so-called “epigenetic drugs” for the treatment of cancer. The aim of this project is to characterize the activities of UVI 5008, a derivative of psammaplin A, a natural product that was originally isolated from the marine sponge Psammaplysilla sp. This compound was synthesized by one of our collaborators, Prof. Angel. R de Lera’s lab (Vigo University, Spain) and we were able to show that it targets several epigenetic effector enzymes and displays anti-tumour activity in vitro and in vivo. We have assessed the tumoricidal activity of UVI5008 both in vitro in a panel of cancer cell lines as well as ex vivo in leukemia patient’s blasts. Our results indicate that UVI5008 reduces cell proliferation by inducing G1-M arrest and apoptosis in established acute myeloid leukemia (AML) cells and AML patient’s blasts in ex vivo culture. In vitro enzymatic assays showed that UVI5008 blocks HDAC1, 4 and 6 as well as increases the global and site-specific histone acetylation. Apart from its HDAC inhibitory activity, the novel inhibitor blocks CpG island methylation of the promoters of p16/INK4 and retinoic acid receptors (RAR)-beta tumor suppressors. Moreover, we have observed that UVI5008 has sirtuin inhibitory capacity as it increases the acetylation levels of p53 on lysine 382 residue. We could also show that UVI5008 exerts its antitumor effect in vivo in HCT-116 (human colon cancer) and MCF-7 (human breast cancer) xenografted tumours in nude mice as well as in a mouse breast cancer model MMTV-myc, which was accompanied by increased histone and p53K382 acetylation in tumouri. Importantly, UVI5008 anti-tumoral activity is selective for cancer cells, without significant toxicity to normal cells and is p53-independent which is also promising, as in the majority of cancers p53 is either silenced or mutated. It is well documented that ErbB2 gene plays an important role in human malignancies. It is amplified and /or overexpressed in approximately 30% of human breast carcinomas and in many other types of human malignancies and individuals with ErbB2-overexpressing tumours have significantly poor clinical outcome. Taking into consideration this fact, we have assessed the anti tumour activity of UVI5008 in one more mouse breast cancer model MMTV-ErbB2, which revealed that UVI5008 is equally active in ErbB2 overexpressing breast tumours. To date there is not a single drug that simultaneously targets all these three families of enzymes namely HDACs, DNMTs and SIRTs. Taken together, our data strongly suggest that targeting these enzymes simultaneously by a single drug is a feasible and an attractive paradigm for new cancer therapies

Différents rôles de l'hélicase Pif1 ont été décrit dont le plus documenté est de décrocher la télomérase des télomères en déroulant les hybrides ARN/ADN formés entre l'ARN de la télomérase et l'ADN télomérique. Plus récemment, une nouvelle voie de signalisation des dommages à l'ADN a été mise en évidence, qui inhibe l'action de la télomérase au niveau d'une cassure de l'ADN via la phosphorylation de l'hélicase Pif1. Cette phosphorylation, dépendante de la kinase ATR (Mec1), inhibe la réparation aberrante de la cassure d'ADN par la télomérase. Nous étudions au sein de l’équipe la protéine RPA (Replication Protein A), affine de l'ADN simple-brin, qui recrute à la fois la protéine de recombinaison homologue Rad52 et la protéine Mec1 impliquée dans la cascade de signalisation des dommages de l'ADN. Lors de l'étude de différentes fonctions de l'hélicase Pif1, j'ai mis en évidence une interaction robuste entre Pif1 et RPA. J'ai identifié un allèle de RFA1, rfa1-D228Y, affectant l'interaction Pif1/RPA et montré, grâce à cet allèle, que cette interaction est impliquée dans le recrutement de Pif1 au niveau d'une cassure double-brins (CDB) induite de l'ADN. Enfin, il a été récemment mis en évidence un nouveau rôle de Pif1 dans la stabilité des G-Quadruplexes durant la réplication du brin avancé. En effet, les cellules pif1 présentent un taux d'instabilité du minisatellite CEB1 inséré sur le brin avancé d'environ 56%, correspondant à des réarrangements de l'ADN de type contractions ou expansions. Lors de l'étude de l'interaction Pif1/RPA, j'ai montré que la mutation rfa1-D228Y entraîne une instabilité du minisatellite CEB1 présent sur le brin avancé, similaire à celle observée avec la délétion pif1∆. Nous suggérons un modèle selon lequel RPA recruterait Pif1 au cours de différents processus cellulaires tels que la réponse des dommages à l'ADN ou la réplication des structures particulières de l'ADN telles que les G-Quadruplexes.En parallèle de cette étude, j’ai étudié le rôle de l'histone méthyltransférase Set1 spécifique de la lysine 4 de l'histone H3 dans la régulation de la taille des télomères. J’ai mis en évidence que le raccourcissement des télomères observé dans un mutant set1 est lié à l'absence de di- et tri-méthylation de H3K4 alors que la perte de monométhylation n'a aucun effet. Cependant, le défaut de la taille des télomères dans les cellules set1∆ n'est pas uniquement lié au défaut de méthylation de H3K4 mais semble impliquer une autre activité de Set1 qu’il reste à déterminer. Etonnamment, nous avons observé que la délétion de SET1 aggrave le raccourcissement des télomères des mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation positive de la taille des télomères et inversement, aggrave le rallongement des télomères de mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation négative des télomères. Nous postulons que l’inactivation de Set1 pourrait à la fois inhiber l’activation précoce des origines de réplication des régions subtélomériques et conduire à un sur-raccourcissement de la taille des télomères, à la fois affecter la synthèse du brin complémentaire dans un contexte où celle-ci est affectée (mutant rif1) et conduire à un sur-allongement des télomères. Une seconde hypothèse propose que Set1 régulerait la transcription deTERRA dans des cellules ayant les télomères déprotégés (mutant rif) entraînant le sur-allongement des télomères
Different roles of Pif1 helicase have been described, the best documented being to remove telomerase from telomeres by unwinding the RNA/DNA hybrid between telomerase RNA and telomeric DNA. Recently, it was shown that the DNA damage signaling down-regulates telomerase action at a DNA break via Pif1 phosphorylation. Pif1 phosphorylation is dependent of the checkpoint kinase ATR (Mec1) and prevents the aberrant healing of broken DNA ends by telomerase. In our laboratory, we study RPA (Replication Protein A), a single-strand DNA binding protein which recruits the proteins involved in the DNA damage response and checkpoint regulation, such as the homologous recombination protein Rad52 and Mec1 involved in the DNA damage response. I have identified an allele of RFA1, rfa1-D228Y, that affects the Pif1/RPA interaction and showed using this allele that this interaction is implicated in the Pif1 recruitment at an induced double-strand break. Recently, a new role of Pif1 in the stability of G-quadruplex DNA during the leading strand replication has been described. pif1 cells show an instability about 56% of the human minisatellite CEB1 inserted on the leading strand. During my study of the Pif1/RPA interaction, I showed that the rfa1-D228Y mutant induced a similar instability of CEB1 minisatellite on the leading strand. We suggested that RPA would recruit Pif1 for many cellular processes such as DNA damage response or replication of secondary DNA structures such as G-Quadruplexes.In parallel, I have studied the role of the Set1 Histone methyltransferase which catalyse the methylation of the lysine 4 of histone H3, in the regulation of telomere length. I showed that the telomere shortening observed in set1 mutant is due to the loss of di- and tri-methylation of H3K4 while the loss of monomethylation has no effect. However, the short telomeres in set1∆ cells is not only due to the methylation defect shedding light on a new Set1 activity that remains to be fully characterized.. The SET1 deletion aggravates the telomere shortening of mutants which genes are involved in positive regulation of telomere length and conversely, aggravates the lengthening of mutants which genes are involved in negative regulation of telomere length. We postulated that inactivation of Set1 could affect at once activation of early-replication origins and leads to a telomere shortening, and affect synthesis of complementary strand in a context where this one is affected (mutant rif1) and leads to a telomere lengthening. A second hypothesis propose that Set1 would regulate TERRA transcription in cells with deprotected-telomere (rif mutant) leading to the lengthening of telomeres

Les diatomées sont l'un des groupes de phytoplancton les plus abondants dans les milieux aquatiques et les plus performants sur le plan écologique. Elles colonisent un large éventail d'habitats. Leur physiologie, leur plasticité et leur adaptation rapide aux différentes conditions environnementales les aident à dominer les océans d’aujourd’hui. Par rapport à la régulation génétique, les changements épigénétiques peuvent être flexibles et réversibles et les modifications des histones sont l'un des mécanismes épigénétiques qui peuvent avoir un impact sur l'expression des gènes. Phaeodactylum tricornutum (P. tricornutum) est l'une des espèces de diatomées modèles, également le premier organisme unicellulaire possédant un répertoire complet de modifications post-traductionnelles des histones, ce qui en fait une espèce idéale pour étudier la régulation épigénétique dans les organismes unicellulaires. Dans ce manuscrit de thèse, je me concentre sur les mécanismes de modification des histones chez P. tricornutum, en utilisant la méthode classique de génétique inverse par l’élimination des gènes candidats pour identifier l'enzyme catalytique qui est responsable du dépôt des modifications des histones. Les complexes de protéines du groupe Polycomb (PcG) sont des composants épigénétiques régulateurs conservés au cours de l'évolution qui agissent de manière antagoniste avec les complexes Trithorax (TrxG) pour réguler les gènes qui sont impliqués dans la différenciation et le développement des cellules. Dans le premier chapitre, nous avons étudié la diversité des gènes PcG et TrxG chez les espèces unicellulaires marines, nous rapportons pour la première fois la corrélation entre ces modificateurs épigénétiques et les facteurs de l’environnement, et nous avons également souligné le schéma unique de co-occurrence des marques d'histones chez P. tricornutum. Sur la base de ces découvertes, une étude plus approfondie dans les chapitres deux et trois s'est concentrée sur deux complexes PcG, PRC2 et PRC1. Au total, trois composants principaux ont été identifiés dans les complexes PRC1 et PRC2 respectivement. La deuxième partie du manuscrit de la thèse a exploré la fonction unique de PRC2 et de la marque associée H3K27me3 que je rapporte liée à la morphologie dans P. tricornutum. Le troisième chapitre traite de l’interaction entre H3K27me3 et H2AK119Ubi qui est déposée par le complexe PRC1. Le dernier chapitre décrit une nouvelle modification d'histone détectée chez P. tricornutum. Il est intéressant de noter que cette modification a été trouvée conservée chez les eucaryotes et le dernier chapitre rapporte la caractérisation de cette nouvelle marque et l'identification de l'enzyme modifiant l'histone
Diatoms are one of the ecologically most successful eukaryotic phytoplankton in the world. They are abundant in a wide range of habitats, their physiology, plasticity and fast adaptation to different environmental conditions help them dominate modern Oceans. Compared to genetic regulation, epigenetic changes can be flexible and reversible and histone modifications are one of the epigenetic mechanisms which can impact gene expression. Phaeodactylum tricornutum (P. tricornutum) is one of the model diatom species, also the first unicellular organism with a full repertoire of post-translational modifications of histones, which makes it an ideal species to study epigenetic regulation in single celled organisms. In this thesis manuscript, I focus on histone modification mechanisms in P. tricornutum, utilize classical reverse genetic method: knockout of candidate genes to identify the catalytic enzyme which is responsible of the deposition of histone modifications. Polycomb group protein (PcG) complexes are evolutionarily conserved epigenetic regulatory components that act antagonistically with Trithorax (TrxG) complexes to regulate genes which are involved in cell differentiation and development. In the first chapter we investigated the diversity of PcG and TrxG genes in marine unicellular species, report the correlation of these epigenetic modifiers and environmental factor for the first time, also emphasise the unique co-occurrence pattern of histone marks in P. tricornutum. Based on those discoveries, further study with chapter two and three focused on two PcG complexes, PRC2 and PRC1. In total, three core components of PcG protein were identified in PRC1 and PRC2 complex respectively, the second part of thesis explored the unique function of PRC2 and its associated mark H3K27me3 which I report related to morphology in P. tricornutum. Chapter three discussed the crosstalk between H3K27me3 and H2AK119Ubi which is deposited by PRC1. The last chapter describes a novel histone modification detected in P. tricornutum was found conserved among eukaryotes. The last chapter reports the characterization of this novel mark and identification of the histone writer

La méthylation des histones par des histone-méthyltransférases est essentielle à la régulation de la transcription. Chez les végétaux, plusieurs méthyltransférases jouent un rôle central dans différents processus cellulaires. Lors de ma thèse, j'ai étudié la fonction biologique de deux d’entre elles dans le contrôle des réponses à plusieurs stimuli chez Arabidopsis thaliana. Premièrement, mes résultats ont permis de démontrer que SDG8, une méthyltransférase spécifique de H3K36, contrôlait la transcription de NPR1, un acteur central de l’immunité induite par l’acide salicylique, et en lien avec la RNAPII permettait l’induction transcriptionnelle efficace de plusieurs gènes de défense suite à leur stimulation. Deuxièmement, j'ai démontré que SDG26, une méthyltransférase proche de SDG8, jouait un rôle important dans la réponse aux stress abiotiques. J'ai découvert ainsi que SDG26 régulait la réponse au froid en activant directement la transcription des gènes SOC1 et CBF en se liant à leur chromatine et en déposant H3K36me3. Sachant que l’acide abscissique (ABA) joue un rôle important dans la réponse aux stress abiotiques, j'ai pu constater que SDG26 contrôlait l'accumulation d'ABA en régulant l'expression de gènes liés à son homéostasie. Enfin, j'ai confirmé par une approche génétique que SDG26 était un élément appartenant à la voie de floraison dite autonome. Au sein d'un complexe multi-protéique comprenant l'histone déméthylase FLD, le facteur de transcription homéobox LD, ainsi qu'un composant de COMPASS, APRF1, SDG26 semble contrôler la transcription du répresseur de floraison, FLC, ainsi que de sa cible, l'activateur de floraison SOC1, afin de réguler précisément la transition florale
Histone methylation catalyzed by histone methyltransferase is essential in transcriptional regulation of gene expression. Histone methyltransferases are known to play crucial roles in multiple cellular processes in plants. My PhD work investigated the biological function of two histone methyltransferases in controlling plant responses to various environmental stimuli in Arabidopsis thaliana. In the first part, my results demonstrated that the H3K36-methyltransferase SDG8 transcriptionally regulates NPR1, a central player in salicylic acid-mediated immunity and co-acts with the RNAPII to enable the efficient transcriptional induction of several defense genes upon stimulation. In the second part, my work unraveled that SDG26, another ortholog of the animal H3K36-methyltransferase, plays an important role in plant response to abiotic stresses. By focusing on cold stress, SDG26 was shown to regulate the cold stress response by directly activating the transcription of SOC1 and CBF genes through binding their chromatin and depositing H3K36me3. Interestingly, SDG26 mastered the accumulation of ABA by regulating the expression of ABA homeostasis-related genes, suggesting an involvement of ABA pathway in the cold response. In the last part, using a genetic approach my work established SDG26 as an autonomous flowering pathway component. Accordingly, SDG26 was found in a multiple-protein complex comprising the histone demethylase FLD, the homeobox-domain transcription factor LD, as well as a putative COMPASS component APRF1. This multiple-protein complex was found in controlling the repression of the major flowering repressor FLC as well as the activation of the flowering activator SOC1 to precisely regulate the floral transition

La moelle épinière assure la transmission des messages nerveux entre l’encéphale et le reste du corps et assure la coordination des mouvements rythmiques de la locomotion. Elle est constituée d’un grand nombre de types différents d’interneurones et de neurones moteurs, organisés en circuits neuronaux. Les circuits impliqués dans la transmission des informations sensorielles et dans les mouvements des membres sont localisés respectivement dans les parties dorsale et ventrale de la moelle épinière. Les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification de ces différents types de neurones dans la moelle épinière restent actuellement mal connus. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à la famille des gènes Prdm (PR Domain containing methyltransferase). Ces gènes sont conservés évolutivement. Ils codent pour des facteurs de transcription jouant des rôles importants dans le développement embryonnaire et sont fréquemment impliqués dans des maladies chez l’Homme. Ces facteurs sont caractérisés par la présence d’un domaine PR semblable au domaine SET trouvé dans des protéines à activité histone méthyltransférase et d’un nombre variable de doigts à zinc. Je me suis focalisée essentiellement sur les gènes Prdm12 et Prdm13, des gènes exprimés de manière précoce et localisés dans le système nerveux en développement et dont la fonction était totalement inconnue. Nos résultats ont montré que l’expression de Prdm12 dans la partie ventrale de la moelle épinière est dépendante de l’acide rétinoïque et du facteur de transcription Pax6 et que Prdm12 est restreint au domaine p1 via l’action répressive des facteurs de transcription Dbx1 et Nkx6 exprimés dans les domaines de progéniteurs adjacents. Prdm12 fonctionne comme déterminant de la destinée des interneurones V1, des interneurones impliqués dans le contrôle des mouvements de la locomotion et essentiels à la survie des neurones moteurs. Prdm12 agirait en réprimant, probablement directement, l’expression des gènes Dbx1 et Nkx6.1/2, ses domaines PR et ZnF étant tous deux requis pour son activité. Nos données indiquent aussi que Prdm13, qui est exprimé dans la partie dorsale de la moelle épinière, constitue une cible directe du complexe Ptf1a-Rbpj et qu’il est requis en aval de Ptf1a pour une balance correcte des neurones glutamatergiques et GABAergiques. Elles suggèrent que Prdm13 fonctionnerait, au moins en partie, en bloquant l’activité d’autres facteurs proneuraux tels que Ngn2 (Neurog2) ou Ascl1 (Mash1) présents dans la partie dorsale de la moelle épinière et qui induisent une destinée excitatrice glutamatergique.
Doctorat en Sciences
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Setdb1 est une «histone» lysine méthyltransférase (KMT) appartenant à la famille SUV39, l’une des principales machineries épigénétiques de répression des gènes. Setdb1 établit notamment la mono-, la di- et la tri- méthylation sur la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9).Setdb1 est essentiel pour la survie, la pluripotence et l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs); son knock-out est mortel au stade de la péri-implantation à 3,5 dpc chez la souris. Setdb1 est également nécessaire pour la différenciation de nombreux types de cellules progénitrices : spermatogenèse, neurogenèse, différenciation des chondrocytes et différenciation des muscles squelettiques. De plus, Setdb1 a été associé à plusieurs maladies: il est amplifié dans le mélanome et le cancer du poumon et il est dérégulé dans les cancers du foie, de la prostate, colorectal et du sein, dans la maladie de Huntington et la schizophrénie. Remarquablement, au-delà des histones, Setdb1 méthyle nombreux substrats non-histones, y compris UBF, p53, Akt, Tat et Ing2.Bien que Setdb1 ait toujours été associé à son rôle nucléaire, il s'avère que Setdb1 est la seule KMT de la famille SUV39 à avoir également une localisation cytoplasmique, dans plusieurs types de cellules, y compris les mESCs, les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) et les cellules HeLa. Cependant, la fonction de Setdb1 dans le cytoplasme reste totalement inconnue. Pour étudier le rôle cytoplasmique de Setdb1, nous avons utilisé des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), dans lesquelles Setdb1 est essentiel. Nos résultats montrent que Setdb1 cytoplasmique est crucial pour la survie des mESCs: en effet, le nombre de cellules apoptotiques augmente après la perte de Setdb1 cytoplasmique. Nous avons constaté que le Setdb1 cytoplasmique affecte la synthèse de protéines dans les mESCs. Nous montrons en outre que le Setdb1 cytoplasmique interagit avec la protéine Trim71 spécifique de mESC (également appelée Lin41) et avec le facteur de traduction d'initiation eIF3c dans les mESC. Enfin, nous avons démontré que Setdb1 et Trim71 co-régulent ensemble la stabilité et la traduction des mARNs. Nos données actuelles mettent au jour la fonction cytoplasmique essentielle d'une lysine méthyltransférase appelée Setdb1, au début considérée comme étant spécifique uniquement des histones et apportent de nouvelles informations sur la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique médiée par un régulateur épigénétique fondamental
Setdb1 is a “histone” lysine methyltransferase (KMT) belonging to the SUV39 family that methylates lysine 9 of histone H3 (H3K9), one of the major epigenetic machineries mainly involved in gene repression. Notably, Setdb1 establishes mono-, di- and tri-methylation of H3K9. Setdb1, or Eset in mice, is essential for the survival, the pluripotency and the self-renewal of mouse embryonic stem cells (mESCs); Eset knockout is lethal at the peri-implantation stage at 3.5 dpc in mice. Setdb1 is also required for the differentiation of many progenitor cell types: spermatogenesis, neurogenesis, chondrocyte differentiation and skeletal muscle differentiation. Moreover, Setdb1 has been associated with several diseases: it is amplified in melanoma and lung cancer and it is dysregulated in liver, prostate, colorectal and breast cancers, Huntington disease and schizophrenia.Remarkably, beyond histones, Setdb1 methylates many non-histone substrates, such as UBF, p53, AKT, Tat and ING2 proteins. Although Setdb1 has been always associated with its nuclear role, it turns out that Setdb1 is the only H3K9 KMT to have also a cytoplasmic localization, in several cell types, including mESCs, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and HeLa cells. However, the function of Setdb1 in the cytoplasm remains totally unknown. To investigate Setdb1 cytoplasmic role, we have used mouse embryonic stem cells (mESCs), in which Setdb1 is essential. Our results show that cytoplasmic Setdb1 is crucial for the survival of mESCs: indeed, the number of apoptotic cells increases after the loss of cytoplasmic Setdb1. We found that cytoplasmic Setdb1 affects newly protein synthesis in mESCs. We further show that cytoplasmic Setdb1 interacts with mESCs-specific protein Trim71 (also called Lin41) and with the initiation translation factor eIF3c in mESCs. Finally, we reported that Setdb1 and Trim71 together co-regulate mRNA stability and translation. Our current data unravel the essential cytoplasmic function of Setdb1, for long time considered exclusively an “histone” lysine methyltransferase, and provide new insights into the post-transcriptional regulation of gene expression mediated by a fundamental epigenetic regulator

Chez les eucaryotes, le génome est organisé en chromatine, une structure nucléoprotéique essentielle pour la régulation de l’expression génique ainsi que pour le maintien de la stabilité du génome. Les ciliés sont d’excellents organismes modèles pour étudier les mécanismes généraux qui maintiennent l’intégrité du génomes eucaryote. Chez Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par des événements massifs et reproductibles d’élimination d’ADN. D’une part, des éléments répétés (transposons,régions minisatellites), de plusieurs kilobases de long, sont imprécisément éliminés.D’autre part, 45000 séquences courtes et uniques, appelées IES, sont précisément éliminées au nucléotide près. Une classe de petits ARN, appelé scnRNAs, est impliquée dans la régulation epigénétique de l’élimination d’ADN, mais comment les scnRNA contrôlent l’élimination d’ADN reste mystérieux. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle une organisation particulière de la chromatine, en particulier des modifications post-traductionelles des histones associées à des formes répressives de la chromatine, est impliquée dans le processus d’élimination d’ADN. Nous avons montré que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 et la lysine 27 (H3K9me3 et H3K27me3)apparaît transitoirement dans le noyau somatique en développement au moment où se produisent les événements d’élimination d’ADN. Nous avons identifié la protéine de type Polycomb, Ezl1, et montré qu’elle est une histone methyltransferase qui présente une dualité de substrat et catalyse à la fois la mise en place de K9me3 et K27me3 sur l’histone H3. Nous avons montré que la déposition de H3K9me3 et H3K27me3 dans le noyau en développement requiert les scnRNAs. Des analyses de séquençage haut débit ont montré que Ezl1 est requise pour l’élimination des longues séquences répétées germinales, suggérant que les scnRNA guident la déposition des marques d’histones au niveau de ces séquences. Au contraire des régions répétées du génome, les IES montrent une sensibilité différente aux scnRNAs et à Ezl1, suggérant que plusieurs voies partiellement chevauchantes sont impliquées dans leur élimination. Notre étude montre que des caractéristiques intrinsèques des séquences d’ADN, telles que leur taille, peut contribuer à la définition des séquences germinales à éliminer. De manière intéressante, nous avons aussi montré que Ezl1 est requise pour la répression transcriptionnelle des éléments transposables. Nous suggérons que les voies H3K9me3et H3K27me3 coopèrent et contribuent à préserver le génome somatique de Paramecium des parasites génomiques
Eukaryotic genomes are organized into chromatin, a complex nucleoprotein structureessential for the regulation of gene expression and for maintaining genome stability.Ciliates provide excellent model organisms with which to gain better understandinginto the regulation of genome stability in eukaryotes. In the ciliate Parameciumtetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome ischaracterized by massive and reproducible programmed DNA elimination events. Longregions of several kilobases in length, containing repeated sequences and transposableelements are imprecisely eliminated, whereas 45,000 short, dispersed, single-copyInternal Eliminated Sequences (IESs) are precisely excised at the nucleotide level. Aspecific class of small RNAs, called scnRNAs, is involved in the epigenetic regulation ofDNA deletion. How scnRNAs may guide DNA elimination in Paramecium remains tobe discovered. Here, we investigated whether chromatin structure, in particular histonepost-translational modifications known to be associated with repressive chromatin,might control DNA elimination. We showed that trimethylated lysine 9 and 27 onhistone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) appear in the developing somaticmacronucleus when DNA elimination occurs. We identified the Polycomb-groupprotein, Ezl1, and showed that it is a dual histone methyltransferase that catalyzes bothH3K9me3 and H3K27me3 in vitro and in vivo. Genome-wide analyses show thatscnRNA-mediated H3K9me3 and H3K27me3 deposition is necessary for theelimination of long, repeated germline DNA. Conversely, single copy IESs displaydifferential sensitivity to depletion of scnRNAs and Ezl1, unveiling the existence ofpartially overlapping pathways in programmed DNA elimination. Our study revealsthat cis-acting determinants, such as DNA length, also contribute to the definition ofgermline sequences to delete. We further showed that Ezl1 is required fortranscriptional repression of transposable elements. We suggest that H3K9me3 andH3K27me3 pathways cooperate and contribute to safeguard the Paramecium somaticgenome against intragenomic parasites

Les protéines arginine méthyl transférases ("PRMTs") sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels. La protéine CARMI ("Coactivator-associated arginine methyltransferase 1", appelée aussi "PRMT4") a été initialement identifiée par sa fonction co-activatrice de la transcription impliquantplusieurs récepteurs nucléaires des hormones. CARMI est une enzyme qui catalyse la réaction de méthylation sur les histones via un donneur de méthyl naturel, la S-adénosY-L -méthionine (SAM). De nombreux travaux ont montré que CARMI est surexprimée dans les cancers du sein et de la prostate. L' objectif de ce travail est la compréhension à l'échelle moléculaire du mode d'action de CARMI et l'étude du mécanisme de reconnaissances moléculaires et de transferts d' informations gouvernés par la protéine CARMI. La structure cristallographique obtenue de cette enzyme en présence de cofacteur, la S-AdénosyhHomocystéine ou la Sinefungine a eu un effet stabilisant. Ainsi, notre stratégie a été de créer des molécules hameçons basées sur le motif de la SAM capables d' ancrer un peptide mimant la séquence de l' histone H3, pour ensuite les tester en co-cristallisation avec CARMI. Ainsi, grâce à la diffraction aux rayons X, les interactions mises en jeu dans le complexe CARMlImolécules hameçons/peptide pourront être déterminées. Cette stratégie s'est effectuée en trois étapes : la première étape, décrite dans le chapitre 2, a consisté en la synthèse d'analogues de la SAM obtenus grâce à des modifications réalisées autour de l'atome de soufre. Ces composés nous ont permis d' explorer la " poche du sulfonium ". Puis la seconde étape, décrite dans le chapitre 3, a été la synthèse * d'analogues de bisubstrats nécessaires pour l'exploration de la " poche de l'arginine ". Dans une dernière étape, décrite dans les chapitres 4 et 5, nous avons abordé la synthèse d'adduits SAM-peptide pouf pouvoir étudier le " domaine de fixation du peptide ". Dans le quatrième chapitre, la méthode de choix est la création d'un lien covalent entre une molécule hameçon électrophile etun peptide par chimie de click in-situ : par réaction de cycloaddition de Huisgen; par réaction entre des molécules hameçons électrophiles capables de piéger un peptide cystéine ou un peptide arginine. Ces essais se sont révélés infructueux et une nouvelle stratégie a été employée en utilisant des molécules ancres. Dansle cinquième chapitre des molécules ancres ont donc été préformés pour ensuite être testés en cocristallisation dans CARMl.

Chez les eucaryotes, l’expression des gènes dépend en partie du degré de compaction de la chromatine. La structure chromatinienne est régulée par des marques dites épigénétiques,telles que les modifications post-traductionnelles des protéines structurelles de la chromatine, les histones. Ainsi, la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9) sur le promoteur des gènes est essentiellement associée à la répression de la transcription. H3K9 est méthylée par différentes enzymes appelées lysine méthyltransférases (KMTs). L’objectif principal de mon projet de thèse a été de mieux comprendre le rôle de principales KMTs de H3K9, que sontG9a, GLP, Suv39h1 et SETDB1, dans la régulation de l’équilibre entre prolifération et différenciation terminale. Pour cela, j’ai utilisé le modèle de différenciation terminale de cellules du muscle squelettique. En effet, durant la différenciation terminale, les myoblastes arrêtent de proliférer et fusionnent entre eux pour former de longues cellules multi nucléées que sont les myotubes. Ce processus implique, d’une part, l’expression des gènes de différenciation musculaire et, d’autre part, la répression irréversible des gènes associés à la prolifération cellulaire. L’introduction bibliographique de ce travail de thèse est séparée en trois chapitres. Le premier chapitre porte sur la chromatine et ses modifications post-traductionnelles. Le second s’attache à décrire les rôles de la méthylation de H3K9 et, en particulier, des quatre KMTs sur lesquelles j’ai travaillé durant ma thèse : G9a, GLP, SETDB1 et Suv39h1. Dans le troisième chapitre, je présente le modèle de la différenciation terminale du muscle squelettique. Dans la partie "Résultats", je décris deux des principales études que j’ai menées durant ma thèse. La première porte sur les rôles antagonistes de G9a et GLP. La seconde porte sur le rôle de SETDB1 durant la différenciation musculaire. Les résultats que j’ai obtenus sont discutés dans cette partie. Je conclus ce manuscrit en discutant mes résultats de manière plus générale et en proposant des perspectives à long terme. Enfin, une annexe présentera les autres articles de recherche auxquels j’ai participé pendant ma thèse
In eukaryotes, gene expression partly relies on chromatin compaction degree. Chromatin status is controlled by epigenetic marks, such as histones (chromatin structural proteins) posttranslational modifications. As an example, histone H3 lysine 9 (H3K9) methylation on gene promoters is mainly associated with transcriptional repression. H3K9 is methylated by several enzymes called lysine methyltransferases (KMTs). The aim of my thesis project was to understand the role of the H3K9 KMTs, G9a, GLP, Suv39h1 and SETDB1 in regulating the balance between proliferation and terminal differentiation. For this purpose, I used skeletal muscle terminal differentiation as model. Upon muscle terminal differentiation, myoblasts exit, in an irreversible way, from the cell cycle and under go differentiation where cells fusion and form myotubes. During this process, cell cycle genes are permanently silenced and muscle specific genes are activated. Thesis introduction is divided into three chapters. The first chapter focuses on chromatin and post-translational modifications. The second chapter describes H3K9 methylation characteristics and the role of the four KMTs that I studied during my thesis project: G9a,GLP, Suv39h1 and SETDB1. In the third chapter, the skeletal muscle terminal differentiation model is described in details. Results section reports my two major studies outcomes and their discussion. The first concerns the antagonistic roles of G9a and GLP regarding the muscle terminal differentiation and the second focuses on the role of SETDB1 during muscle differentiation. Finally, I conclude this manuscript by a plainer discussion followed by long term perspectives and an appendix presents other research articles, in which I collaborated during my PhD

La méthylation de l'histone H3 Lysine 9 (H3K9me) est une marque de l'hétérochromatine progressivement déposée au cours du développement. Elle contribue à la restriction de certains destins cellulaires. Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), les niveaux de H3K9me augmentent lors de la différentiation, constituant alors une barrière à la reprogrammation à l'état pluripotent. Cependant le couplage entre les niveaux d'H3K9me et la pluripotence n'a encore jamais été formellement étudié. On a ainsi identifié SUV39H1, une methyltransferase responsable de la propagation di/tri H3K9me (H3K9me2/3), comme une cible indirecte du réseau des facteurs de transcription de la pluripotence (pTFs). En effet, le pTF OCT4 active l'expression d'un ARN long non-codant Suv39h1as anti-sens à Suv39h1. Suv39h1as réprime l'expression de Suv39h1 en modifiant la chromatine au locus et possiblement en modulant l'expression de ses isoformes. L'absence de Suv39h1as induit l'augmentation de SUV39H1 ainsi que de H3K9me2/3, menant à une accélération de la spécification irréversible au cours de la différentiation. Ainsi, OCT4, Suv39h1 et Suv39h1as constituent un circuit permettant de coupler les niveaux d'H3K9me à la pluripotence dans les mESCs. De plus, une lignée de souris knock-out pour Suv39h1as a été créée et nous avons démontré que cette régulation est aussi présente dans l'ovocyte
Histone H3 Lysine 9 (H3K9) methylation, a mark of heterochromatin, is progressively implemented during development to contribute to cell fate restriction as differentiation proceeds. For instance, in mouse Embryonic Stem cells (mESCs) the global levels of H3K9 methylation are rather low and increase only upon differentiation. Conversely, H3K9 methylation represents an epigenetic barrier for reprogramming somatic cells back to pluripotency. How global H3K9 methylation levels are coupled with the acquisition and loss of pluripotency remains unknown. Here, we identify SUV39H1, a major H3K9 di- and tri-methylase, as an indirect target of pluripotency Transcription Factors (pTFs). We find that the pTFs OCT4 activates the expression of an antisense long non-coding RNA to Suv39h1, named Suv39h1as. In turn, Suv39h1as downregulates Suv39h1 expression via the modulation of the chromatin status of the locus and a possible alteration of Suv39h1 isoforms. The loss of Suv39h1as expression triggers increased SUV39H1 expression and H3K9me2/3 levels, leading to accelerated commitment into differentiation. We report, therefore, a simple genetic circuitry coupling the global levels of H3K9 methylation to pluripotency in mESCs. We also created a mouse line deleted for Suv39h1as expression and demonstrated that this regulation is also present during mouse oocyte maturation

Le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii est l'agent pathogène de la toxoplasmose. Cette maladie est gravissime pour le fœtus et pour l'individu immunodéprimé. L'interconversion du parasite de la forme tachyzoïte virulente à la forme bradyzoïte quiescente est au centre de la pathogénèse de cette infection. Ce processus engage une régulation coordonnée des gènes du parasite qui se traduit par une cascade d'évènements moléculaires au niveau de l'ADN. Des études suggèrent un contrôle transcriptionnel de l'interconversion avec l'expression exclusive de certains gènes dans une forme donnée. Cependant, ce parasite et son phyllum se distinguent des autres eucaryotes par une quasi-pénurie des facteurs spécifiques de transcription. Nous avons émis l'hypothèse que le niveau d'expression des gènes du Toxoplasme est étroitement régulé par la structure physique et la nature chimique de la chromatine. Ce manuscrit illustre l'influence majeure du « code histone » sur la différenciation parasitaire. Nous avons identifié plusieurs enzymes en charge de l'écriture de ce code. L'exemple le plus frappant est la découverte d'une methyltransférase TgCARM1 qui méthyle l'arginine 17 de l'histone H3, une marque activatrice de la transcription. Nous avons également identifié le premier complexe co-repressor du Toxoplasme (TgCRC). TgCRC en opposition avec l'acétylase TgGCN5 régule en partie la balance acétylation/déacétylation, qui en retour influe sur la différenciation parasitaire. L'ensemble de nos résultats converge vers l'idée de l'existence d'un « code histone parasitaire » hautement sophistiqué, qui a co-évolué avec celui de la cellule hôte parasitée.

La chromatine est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, mais, ironiquement, constitue l’obstacle principal à la transcription des gènes. Plusieurs mécanismes ont été développés par la cellule pour pallier ce problème, dont l’acétylation des histones composant les nucléosomes. Cette acétylation, catalysée par des histones acétyl transférases (HATs), permet de réduire la force de l’interaction entre les nucléosomes et l’ADN, ce qui permet à la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet état permissif sans conséquence néfaste. Les histone déacétylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement acétyle pour permettre à la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thèse se penche sur la caractérisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recruté aux régions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphorylé de Rpb1, une sous-unité de l’ARN polymérase II. Toutefois, le facteur d’élongation DSIF joue un rôle dans la régulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux régions transcrites. L’activité HDAC de Rpd3S, quant à elle, dépend de la méthylation du résidu H3K36 par l’histone méthyltransférase Set2. La fonction du complexe Set3C n’est pas clairement définie. Ce complexe est recruté à la plupart de ses cibles par l’interaction entre le domaine PHD de Set3 et le résidu H3K4 di- ou triméthylé. Un mécanisme indépendant de cette méthylation, possiblement le même que pour Rpd3S, régit toutefois l’association de Set3C aux régions codantes des gènes les plus transcrits. La majorité de ces résultats ont été obtenus par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine couplée aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design expérimental de ce type d’expérience fera aussi l’objet d’une discussion approfondie.
Chromatin is essential for the maintenance of genomic integrity but, ironically, is also the main barrier to gene transcription. Many mechanisms, such as histone acetylation, have evolved to overcome this problem. Histone acetylation, catalyzed by histone acetyltransferases (HATs), weakens the internucleosomal and nucleosome-DNA interactions, thus permitting the transcriptional machinery access to its template. However, this permissive chromatin state also allows for opportunistic DNA binding events. Histone deacetylases (HDACs) help restore a compact chromatin structure by catalyzing the removal of acetyl moieties from histones. This thesis focuses on the characterization of the function and of the recruitment mechanism of HDAC complexes Rpd3S and Set3C. The Rpd3S complex is recruited to actively transcribed coding regions through interactions with the hyperphosphorylated C-terminal domain of Rpb1, a subunit of RNA polymerase II, with the DSIF elongation factor playing a role in limiting this recruitment. However, the HDAC activity of Rpd3S depends on H3K36 methylation, which is catalyzed by the Set2 histone methyltransferase. The Set3C complex’ function is still not clearly defined. It is recruited to most of its targets through the interaction between the Set3 PHD domain and di- or trimethylated H3K4. However, Set3C recruitment to genes displaying high RNA polymerase II occupancy is independent of H3K4 methylation. The mechanism by which Set3C is recruited to this gene subset is under investigation. These results have mostly been obtained through chromatin immunoprecipitation coupled to tiling microarrays (ChIP-chip). The protocol and experimental design challenges inherent to this technique will also be discussed in depth.