Rozprawy doktorskie na temat „Stimulation cellulaire”

Les ondes acoustiques de surface (SAW) sont actuellement utilisées pour étudier leur interaction avec des particules biologiques pour réaliser des études sur la prolifération, la croissance, la mort et la migration des cellules. Il a été démontré que l'effet de la contrainte de cisaillement sur les cellules joue un rôle majeur dans la modification des cellules fournissant plus de détails sur leur fonction et leurs changements potentiels. Stamp et al. présente une approche par ultrasons de la stimulation dynamique et la cicatrisation des tissus pour des cellules ostéoblastiques de type SaOs-2 en utilisant des ondes acoustiques de surface (SAW) sur une puce. Ses études sont réalisées sans effets secondaires indésirables tels que l'augmentation de la température du substrat ou du flux de nutriments associés aux SAW. Ces résultats montrent que la stimulation mécanique et électrique dynamique induite par les ondes de surface favorise directement la croissance cellulaire et donc une régénération rapide des tissus. S. Brugger présente des études sur la cicatrisation et la croissance cellulaire in vitro sous l'influence de la radiofréquence (rf) des stimuli cellulaires. Ces stimuli sont générés soit par des ondes acoustiques de surface piézoactives (SAW), soit par des champs électriques générés par des microélectrodes. Ses résultats montrent que la stimulation vibratoire des cellules basée sur les ondes acoustiques de surface peut être une alternative au traitement par ultrasons conventionnel. Les contraintes de cisaillement agissant sur les cellules sont responsables des différents changements observés après la stimulation par ondes acoustique, cependant du point de vu expérimental il est impossible de déterminer ces contraintes, une approche par simulation est dès lors nécessaire. Cette thèse vise donc à mettre un point une simulation qui permettra dans un premier temps de comprendre le phénomène d'interaction Rayleigh/Liquide en microcanal ou en goutte et dans un second temps de quantifier les contraintes qui s'exercent sur des particules biologiques lors d'une stimulation par onde acoustique de surface, et de réaliser une étude d'optimisation. En considérant une sonde plongée verticalement dans un puits, nous avons traité le cas des cellules sanguines (circulantes) à une fréquence de 20 MHz et des cellules osseuses (adhérentes) à une fréquence de 40 MHz. Enfin nous avons également pris en compte l'échauffement du liquide<br>Surface acoustic waves (SAW) are currently being used to study their interaction with biological particles to perform studies of cell proliferation, growth, death and migration. The effect of shear stress on cells has been shown to play an important role in cell modification, providing further details on their function and potential changes. Stamp et al. present an ultrasound approach to dynamic stimulation and tissue healing of SaOs-2 osteoblastic cells using surface acoustic waves (SAW) on a chip. These studies are performed without unwanted side effects such as increased substrate temperature or nutrient flux associated with SAW. These results demonstrate that the dynamic mechanical and electrical stimulation induced by surface acoustic waves directly promotes cell growth and thus rapid tissue regeneration. S. Brugger presents studies on in vitro wound healing and cell growth under the influence of radiofrequency (rf) cell stimuli. These stimuli are generated either by piezoactive surface acoustic waves (SAW) or by electric fields generated by microelectrodes. His results show that vibratory stimulation of cells based on surface acoustic waves can be an alternative to conventional ultrasound treatment. Shear stresses acting on the cells are responsible for the various changes observed after acoustic wave stimulation, but it is impossible to determine these stresses experimentally, so a simulation approach is necessary. The goal of this thesis is to develop a simulation that will allow us to understand the phenomenon of Rayleigh/liquid interaction in a microchannel or droplet and to quantify the stresses exerted on biological particles during surface acoustic wave stimulation, as well as to carry out an optimization study. The study investigated the effects of different frequencies on blood cells (circulating) and bone cells (adherent) using a vertical probe immersed in a well with a frequency of 20 MHz and 40 MHz, respectively. Additionally, the research took into consideration the liquid heating

L'ensemble de ce travail est consacre aux anticorps antiphospholipides (apl). Dans une premiere partie, nous avons montre qu'il etait possible de detecter des apl sur des phospholipides en phase lamellaire, grace a la modelisation d'une membrane composee de cardiolipide, phosphatidylcholine et cholesterol a la surface d'une microsphere de verre. La majorite des anticorps detectes ont pu l'etre en l'absence de beta 2-glycoproteine i (#2gpi) et leur reactivite n'etait que peu ou pas modifiee apres addition de cette proteine purifiee. Ceci suggere que la conformation des phospholipides pourrait avoir un role dans l'antigenicite. Nous avons ensuite etudie l'importance du taux de fibrinogene dans la specificite des tests de detection des anticoagulants de type lupiques (la). Le temps de thromboplastine diluee, chez des patients sans la, etant positivement correle au taux de fibrinogene, un facteur de correction, permettant d'ameliorer la specificite de ce test, a ete propose. D'autre part, il a ete montre que les resultats du staclot la$$att$$ et du temps de venin de vipere russel, mais pas ceux du tca 1-10, etaient egalement influences par le taux de fibrinogene. Dans une troisieme partie, nous avons evalue la prevalence de differents anticorps relies aux apl dans deux populations bien distinctes definies sur des criteres cliniques. Il s'agit d'un groupe de patients avec des antecedents de thrombose veineuse et un autre groupe avec des antecedents de pertes ftales. Dans le groupe des thromboses veineuses, les la sont les apl les mieux relies a la precocite ou a la recurrence des accidents thromboemboliques. La tres faible prevalence des anticorps anti-#2gpi rend peu probable leur interet en tant que marqueur de risque thrombotique. Concernant le groupe des pertes ftales, nous avons demontre que les apl a titres eleves ainsi que les anticorps anti-#2gpi et les la n'etaient presents que chez les femmes avec pertes ftales tardives (apres 10 semaines d'amenorrhee) et pas chez celles qui ont eu 3 avortements consecutifs precoces (avant 10 semaines d'amenorrhee). En revanche, dans ce deuxieme groupe, une prevalence importante de microparticules circulantes, d'origine encore inconnue, a ete mise en evidence. Les hypotheses physiopathologiques a l'origine des apl ainsi que le role de la stimulation cellulaire et de l'apoptose dans l'exposition de phospholipides immunogeniques sont discutes.

Un dispositif de stimulation électrique in vitro sur des lignées cellulaires a été optimisé afin de nous permettre d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la SHF. Deux lignées cellulaires (GH3 et PC12) ont été analysées au niveau transcriptomique, protéomique et de la sécrétion hormonale et de neurotransmetteurs. Nous avons comparé les niveaux de sécrétion de PRL des GH3 traitées par SHF, SBF ou par la dopamine ; ainsi que les niveaux des catécholamines (DA, AD et NA) des PC12 traitées par SHF, SBF ou par la 6-OHDA. La synthèse protéique des cellules stimulées a été analysée par les techniques d’incorporation de 35S méthionine et de SELDI-TOF-MS. Enfin nous avons recherché les modifications d’expression génique des cellules stimulées en utilisant la technique des microarray à base d’oligonucléotides longs sur nylon et détection radioactive. Les premières expériences montrent une diminution significative de la quantité de prolactine à un niveau comparable à celui obtenu avec l’inhibiteur conventionnel, la dopamine. De la même façon, la production de catécholamines dans le milieu est inhibée. Les données transcriptomiques montrent l’existence des profils d’expression caractéristique de la neurostimulation à haute fréquence, avec environ 100 gènes discriminants impliqués dans la synthèse protéique, la signalisation calcique, l’énergétique cellulaire pour les principaux. Nous avons confirmé l’impact de la neurostimulation sur la synthèse protéique en SELDI-TOF comme en incorporation de méthionine. Un mécanisme original de SHF peut donc être proposé, impliquant la neutralisation de la synthèse protéique dans l’inactivation réactionnelle des structures neuronale<br>A system for electrical stimulation on cells lines in vitro was optimized for studying cellular and molecular mechanism of high frequency electrical stimulation. Two cells lines (GH3 and PC12) were analysed at the transcriptomic and proteomic level as well as for the impact on hormonal secretion and neurotransmitter release. We compared PRL secretion of GH3 cell by HFS, LFS and dopamine as well as catecolamine (DA, AD and NA) secretion of PC12 cell treated by HFS, LFS and 6-OHDA. Proteomic synthesis of stimulated cells were analysed by 35S methionine incorporation and by SELDI-TOF-MS. At last we have investigated modifications of gene expression of stimulated cells using DNA nylon microarray based on long oligonucleotides and radioactive detection. First experiment demonstrated that HFS induced a significant decrease of the amount of prolactin to a level comparable to the level obtained with dopamine, one well known inhibitor of prolactin. Similarly, the amount of catecholamines detected in the cell culture medium was significantly down regulated. Transcriptomic data manifested the existence of characteristic expression profiles for high frequency electrical stimulation. About 100 discriminatory genes were individualized upon HFS involved in the proteomic synthesis, calcium signalisation and cellular energetic. We confirmed the impact of HFS on protein synthesis with SELDI-TOF technique and methionine incorporation. One original HFS mechanism has been validated, involving protein synthesis neutralisation in the reacted inactivation of neuronal structures. Implication of calcium signalisation and PKC pathway were also suggested

Les lymphomes T périphériques (ou PTCL) sont des lymphomes malins non Hodgkiniens ayant pour cellules d’origine des lymphocytes T (LT) ou Natural Killer matures. Ces lymphomes sont rares, hétérogènes et méconnus. Des arguments issus de la littérature suggérant l’implication de la stimulation chronique du récepteur T à l’antigène (TCR) dans la transformation des LT, nous ont conduits à développer un modèle murin basé sur la stimulation chronique du TCR pour adresser spécifiquement cette question. Dans ce modèle, le transfert de LT p53-/- dans des souris CD3e-/- entraine l’apparition de lymphomes T périphériques (PTCL) clonaux dans 60% des cas avec une médiane de survenue de 230 jours alors que les souris transférées avec des LT wt ne développent pas de lymphomes. Ces PTCL présentent un phénotype T effecteur-mémoire CD62LLo-CD44hi-CD122lo-CD25lo ainsi qu’une profonde downrégulation de l’expression des gènes impliqués dans la voie du TCR illustrant l’impact de la stimulation chronique dans la lymphomagénèse. L’étude de ces lymphomes a révélé qu’ils ne dépendent plus, pour la plupart, de l’engagement du TCR pour leur survie et qu’ils acquièrent des caractéristiques « innate-like » avec notamment l’expression de récepteurs NK inhibiteurs (NKiR) et de récepteurs NK activateurs (NKaR) ainsi que des protéines adaptatrices DAP12 et FceRIg. Cette expression est associée à celle de Syk et PLC?2, impliquées dans la signalisation des NKaR. Nous montrons que les NKaR et leurs voies de signalisation associées sont fonctionnelles et participent à la survie des cellules lymphomateuses, le blocage de certains NKaR retardant notamment le développement lymphomateux in vivo. Nous avons par la suite exploré l’expression des NKR, de Syk et de PLCg2 au sein des PTCL humains et nous montrons ou confirmons que certaines entités expriment des panels variés de NKR ainsi que les effecteurs Syk et PLCg2 suggérant l’existence de mécanismes de lymphomagénèse similaires à ceux identifiés dans notre modèle au sein d’un certain nombres de PTCL humains<br>Peripheral T-cell lymphomas (PTCL) are rare non Hodgkin malignant lymphomas emerging from mature T or NK cells. PTCL are highly heterogeneous and mainly misunderstood. As several evidences pointed the potential role of TCR chronic stimulation in human T-cell lymphomagenesis, we developed a murine model based on chronic TCR stimulation to address this question. In this model, transfer of p53-/- T-cells into T-cell deficient mice (CD3e-/-) triggered PTCL development in 60% of cases with a median survival of 230 days while transfer of wt T-cells in CD3e-/- mice did not lead to PTCL development. These PTCL exhibited an effector-memory phenotype CD62LLo-CD44hi-CD122lo-CD25lo associated with a dramatic downregulation of TCR pathway genes expression consistent with a chronic TCR stimulation highlighting it’s implication in lymphomagenesis. The analysis of these PTCL revealed that a large majority of cases (80%) do not depend anymore on TCR stimulation for their growth and survival and that they acquire innate-like features with expression of inhibitory NKR (NKiR) and activating NK receptors (NKaR) as well as the adaptor proteins DAP12 or FceRIg. Expression of these receptors is associated with the expression of SYK and PLC?2, which are classical key effectors downstream of NKaR. We show that these NKaR are functional and can mediate TCR-independent activation in mPTCL and that this signaling is involved in cell survival/proliferation as in vivo blockade of NKG2D and NKp46 delays PTCL development in PTCL transplantation experiments. In parallel, we studied NKR, Syk and PLCg2 expression in human PTCL and found that some entities express a large range of these receptors as well as Syk and PLCg2, suggesting similar lymphomagenesis mechanisms in some human PTCL

La thematique generale de ces travaux de these est la plasticite des fonctions vestibulaires examinee par une double approche comportementale et immunohistochimique chez le chat et le rat. Le volet comportemental consiste en une etude electrophysiologique de la reorganisation des mecanismes de stabilisation du regard apres lesion unilaterale ou bilaterale du nerf vestibulaire. Les resultats obtenus chez les animaux leses testes aux stades precoce ou compense montrent l'emergence de processus de substitution sensorielle d'origine visuelle et labyrinthique ou comportementale caracterisee par l'apparition d'une nouvelle strategie motrice de coactivation des muscles antagonistes du cou. Le volet immunochistochimique decrit les modifications de l'expression fos soit apres neurectomie vestibulaire unilaterale, soit apres variation du vecteur gravitaire modifiant l'activite le systeme otolithique. Apres lesion vestibulaire, une expression fos asymetrique est detectee au sein des noyaux vestibulaires et dans des structures associees, caracterisee par une induction precoce qui refleterait des modifications cellulaires directement liees a la deafferentation des noyaux vestibulaires, et une induction retardee serait correlee a la mise en place de mecanismes de plasticite cellulaire. L'exposition prolongee de rats dans un milieu hypergravitaire n'est pas source d'expression fos, alors qu'une transition de courte duree d'un milieu hypergravitaire vers un milieu hypogravitaire, ou l'inverse, entraine une forte expression fos. Ces resultats temoignent d'une activation de voies vestibulo-corticale et vestibulo-vegetative. Par ailleurs, ce sont les memes structures du tronc cerebral qui sont fos-positives apres lesion vestibulaire ou stimulation otolithique, suggerant que ce sont les memes reseaux neuronaux qui sous-tendraient la plasticite post-lesionnelle et la plasticite adaptative du systeme vestibulaire.

D-53 est un immunomodulateur prescrit à titre préventif dans les cas d'infections récidivantes des voies aériennes supérieures et administre par voie orale. Le but du travail présenté a été de caractériser cet effet immunostimulant sur les populations de lymphocytes b du sang périphérique et des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses. Les techniques d'immunofluorescence sur coupes de tissus et sur suspensions cellulaires d'une part et la technique d'Elispot d'autre part ont permis de caractériser les cellules b à différents stades de leur différenciation. Les résultats obtenus ont mis en évidence une augmentation du nombre de cellules activées spécifiques des quatre bactéries dont les ribosomes composent le d-53 dans le sang périphérique et dans les amygdales d'enfants traites trois semaines par d-53. Cette stimulation est ciblée spécifiquement vers ces quatre germes. L'immunogenicité des fractions ribosomales a également été démontrée par la mise en évidence d'une activation des cellules spécifiques des fractions ribosomales composant d-53. Chez l'animal, la caractérisation des cellules b spécifiques dans d'autres territoires muqueux fait apparaitre un ciblage préférentiel de ces cellules dans les territoires associés à la sphère orl au détriment des structures profondes telles que les ganglions mésentériques. Enfin, une analyse cinétique révèle une recirculation rapide des cellules activées présentes dans le sang périphérique dans l'heure qui suit l'ingestion. Le mode de stimulation par d-53 administré par voie orale apparait comme un système d'étude adapté à l'analyse de l'activation et de la recirculation des lymphocytes b. Ces cellules activées, par les fractions ribosomales contenues dans d-53, au niveau des structures lymphoïdes de l'intestin recirculent vers les structures lymphoïdes associées aux muqueuses des voies supérieures ou elles finissent leur différenciation et secrètent leurs immunoglobulines

Le caractère aléatoire de la fermentation malolactique des vins impose l'étude de procédés d'activation de la croissance et de l'activité malolactique des bactéries lactiques. Les enveloppes de levures agissent de deux façons sur la fermentation: élimination des produits toxiques du métabolisme des levures, favorisant la croissance et la dégradation de l'acide malique, libération de facteurs nutritionnels utilisés par les bactéries (acides aminés, vitamines entre autres)

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs<br>Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies

L'expression de recepteurs fonctionnels -amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazole-propionate (ampa)/kainate a des stades precoces du developpement du systeme nerveux central (snc) souleve la question de leur role au cours de l'embryogenese. Nous avons d'abord analyse, chez le rat, les effets du blocage ou de la stimulation des recepteurs ampa/kainate sur des cellules dissociees de rhombencephale en culture, modele qui facilite le controle des parametres experimentaux. L'exposition a des antagonistes (competitifs aussi bien que non competitifs) provoque une mort cellulaire importante si le traitement a lieu pendant les premiers jours in vitro (jiv). En revanche, l'application de kainate ou de trifluoromethyl-ampa n'entraine des pertes cellulaires neuronales que si elle est plus tardive. L'exposition precoce aux agonistes modifie le niveau d'activite des recepteurs permeables aux cations divalents sans affecter la survie cellulaire. Le deficit en neurones (mais pas en cellules gliales) observe dans les cultures traitees est du essentiellement a une forte augmentation de la mort cellulaire (en partie de type apoptotique) et non a une baisse de la proliferation. Un deuxieme modele (cultures de tranches de rhombencephale et de moelle epiniere d'embryons de rat de 13 et 14 jours) a confirme la sensibilite des cellules embryonnaires au blocage ou a la stimulation des recepteurs. Ensemble, ces donnees suggerent que les cellules neurales dotees de recepteurs ampa/kainate, et peut-etre secondairement d'autres cellules, necessitent un niveau approprie d'activation de ces recepteurs pour leur survie et leur maturation. Nous avons pu constater que des recepteurs ampa/kainate fonctionnels existent chez l'homme a des stades embryonnaires. La consommation maternelle de substances susceptibles d'alterer l'activite de ces recepteurs pourrait perturber la formation du snc, si ces substances traversent la barriere placentaire.

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs<br>Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies

L'activation des lymphocytes T est initié à la fois de TCR et l'engagement du co-récepteur. CD28 est le plus important sur ​​les cellules T naïves. Cette activation doit être strictement réglementé, depuis son apparition inexacte pourrait être de conséquences néfastes. Nous avons signalé que TCR et CD28 début signalisation génèrent mécanisme de détection de coïncidence dans l'initiation de l'activation des cellules T naïves. Tout d'abord, nous avons constaté que TCR déclenchement avec ligand apparenté pMHC ou anticorps augmente considérablement la liaison 2D du CD28 à ses ligands B7 et dépend à la fois la queue cytoplasmique de CD28 et l'activité de Src kinases. En outre, on a observé une interaction TCR-pMHC pour améliorer la phosphorylation sur tyrosine de CD28 induite lors de l'engagement de B7. L'analyse du récepteur déclenché par événements de signalisation dans les cellules CD4 + naïves cellules T ont montré que seul TCR ou la stimulation de CD28 est seulement capable d'induire une Ca2 faible ou minimal + réponse en dépit de la phospholipase facilement détectée C- une phosphorylation, mais la stimulation concomitante des deux voies suscité efficacement forte et soutenue + entrée Ca2 impliquant les canaux CRAC. Ainsi, notre étude a révélé apparition de la détection de coïncidence à deux étapes importantes au cours de la TCR et CD28 déclenchée par l'activation des cellules T naïves, se liant à savoir le ligand et le déclenchement des récepteurs et la mobilisation intracellulaire, qui fournit d'importantes nouvelles connaissances sur le mécanisme de l'initiation de la réponse immunitaire primaire, ainsi que sa régulation<br>T cell activation is initiated by signaling pathways triggered upon ligand engagement of the TCR and co-stimulatory receptors, respectively, with CD28 being the major one among the latter class of molecules on naïve T cells. At the same time, such activation needs to be tightly regulated, since its improper occurrence might be of detrimental consequences. We report here that interactions between TCR and CD28 early signaling pathways generate coincidence detection mechanism in the initiation of naïve T cell activation. First, we found that in naïve CD4+ T cells, TCR engagement with pMHC cognate ligand or antibody significantly increases the 2D binding of CD28 to its B7 ligands and this increase depends on both the cytoplasmic tail of CD28 and activity of src kinases. Moreover, TCR-pMHC interaction was observed to enhance the tyrosine phosphorylation of CD28 induced upon B7 engagement. Analysis of the receptor-triggered signaling events in naïve CD4+ T cells showed that alone TCR or CD28 stimulation was only capable of inducing a weak or minimal Ca2+ response in spite of the readily detected phospholipase C-1 phosphorylation, but the concurrent stimulation of both pathways efficiently elicited strong and sustained Ca2+ mobilization involving the CRAC channels. Our study has thus uncovered occurrence of the coincidence detection at two major steps during the TCR- and CD28-triggered activation of naïve T cells, namely the ligand binding and triggering of the receptors and the intracellular mobilization, which provides important new insights into the mechanism of primary immune response initiation as well as its regulation

Depuis la mise en evidence de similitude entre des facteurs de croissance (fc) et des produits d'oncogenes, differents evenements biochimiques precocement induits par les fc sont decrits, cependant, leur chronologie n'est pas clairement determinee. Mise en evidence d'un nouvel evenement precoce: une stimulation du renouvellement de l'atp dans des cultures quiescentes de cellules 3t3 swiss incubees en presence de fc ou d'un promoteur de tumeur, utpa: activation de l'echange sodium-proton et de l'atpase sidium-potassium. Les mouvements cellulaires, induits precocement par les fc de par le tpa, sont impliques dans la degradation et le renouvellement rapides de l'atp. De plus, ils favorisent la stimulation par les fc de l'accumulation de certains arn messagers (actine et c-fos) et de la synthese d'arn ribosomiques

Introduction et : ’exposition chronique à une hypoxie (diminution du taux d’oxygène) sévère engendre des effets délétères sur le système musculaire, entrainant des conséquences néfastes sur la masse musculaire squelettique. L'hypoxie provoque un déséquilibre de l'homéostasie protéique (balance entre anabolisme et catabolisme), en diminuant la synthèse des protéines (principalement régulée par la voie PI3K-Akt-mTOR) tout en augmentant la dégradation des protéines (principalement par autophagie et dégradation protéasomique). En revanche, les stimulations mécaniques (activité physique) et la supplémentation nutritionnelle, en particulier les acides aminés essentiel branché (BCAA), induisent l'activation de la voie mTOR tout en inhibant les voies cataboliques du muscles squelettiques chez l'homme, l’animal et cellules musculaires misent en culture. Sur un modèle in vitro de cellule musculaire squelettique, nous avons essayé de déterminer si la combinaison de la stimulation mécanique, la supplémentation nutritionnelle et une période de réoxygénation post-stimulation pourrait inverser les effets délétères de l'hypoxie sur l'homéostasie protéique.Protocole expérimentalPour vérifier notre hypothèse, nous avons utilisé un modèle de cellule musculaire squelettique en culture (C2C12). Après quatre jours de différenciation les myotubes C2C12 ont été placés dans une chambre hypoxique à 4% de O2 pendant 24h. Á la suite de cette période d’hypoxie, un programme de stimulation électrique a été appliquée aux cellules musculaires en utilisant un générateur d'impulsions électriques. Á la fin de la stimulation électrique, les myotubes ont tout d'abord été supplémentés avec des acides aminés essentiel branché (BCAA: mélange de leucine, d'isoleucine et de valine ajoutés à un milieu de culture), puis placés pendant 2 heures dans un environnement de normoxie (21% O2) (correspondant à la période de réoxygénation).RésultatsAprès 24 heures d'hypoxie, l'analyse morphologique des myotubes montre une diminution significative de leur diamètre, traduisant l'activation des voies de dégradation des protéines aux dépens des voies de synthèse des protéines. Appliqué séparément, chaque traitement a peu d’effet sur la voie mTOR et la morphologie des myotubes. Alors que, la combinaison de la stimulation électrique, de la supplémentation en BCAA et de la réoxygénation conduit à une augmentation de la phosphorylation de protéines clés impliquées dans la voie de synthèse des protéines (Akt, mTOR, p70S6K, GSK-3β), reflétant ainsi leur état d'activation. De plus, l'analyse morphologique montre une augmentation significative du diamètre du myotube et de l'indice de fusion (reflétant l'état de différenciation), signe de la présence d'une hypertrophie musculaire.ConclusionNos résultats suggèrent que la voie mTOR (l’une des voies principales de l’anabolisme) répond à une combinaison de stimulation électrique, de supplémentation en nutriments et de réoxygénation par phosphorylation de régulateurs clés de la synthèse des protéines, pouvant ainsi inverser la perte de protéines induite par l'hypoxie<br>Background and aims : Chronic exposure to severe hypoxia has deleterious effects on the muscular system, in particular on skeletal muscle mass. Hypoxia leads to imbalance of protein homeostasis, decreasing protein synthesis (mainly regulated through PI3K-Akt-mTOR pathway) while increasing protein degradation (mainly through autophagy and proteasomal degradation). In contrast, mechanical stimuli and nutrients, particularly the branched-chain amino acids (BCAA), induce activation of the mTOR pathway in human and rat skeletal muscle as well as and in cultured muscle cells, and decrease protein catabolism. In a model of skeletal muscle cell culture, we attempt to determine whether the combination of mechanical stimulation, nutritional supplementation and reoxygenation could reverse the deleterious effects of hypoxia on protein homeostasis.Experimental methodsWe induced a hypoxic stress on skeletal muscle murine cells differentiated into myotubes C2C12: four days after differentiation, the C2C12 myotubes were placed into a hypoxic chamber at 4% O2 for 24h. Electrical stimulation was applied to the cells using a pulse generator to provide electric pulses. Following the ES treatment, myotubes were firstly supplemented with branched-chain amino acids (BCAA: mixture of leucine, isoleucine and valine added to culture media) while placed to normoxia during 2 hours (corresponding so to a reoxygenation protocol).ResultsAfter 24 hours of hypoxia, the morphological analysis of myotubes shows a significant decrease in their diameter, translating the activation of protein degradation pathways at the expense of protein synthesis pathways. When applied separately, each treatment has little effect on the mTOR pathway and morphology of myotubes. However, the combination of electrical stimulation, supplementation BCAA and reoxygenation lead to an increase of the phosphorylation of key proteins involved in protein synthesis pathway (Akt and p70S6 kinase), thus reflecting their activation state. In addition, morphological analysis shows a significant increase in myotube diameter and fusion index (reflecting the state of differentiation), a sign of the presence of muscle hypertrophy.ConclusionOur preliminary results suggested that mTOR pathway responds to a combination of electrostimulation, nutrient supplementation and reoxygenation by phosphorylation of key regulators of protein synthesis, and could reverse the protein loss induced by hypoxia

Au sein des tumeurs cérébrales telles que les gliomes, les macrophages infiltrants sont abondants et associés à un mauvais pronostic. Leur plasticité fonctionnelle joue un rôle essentiel dans le développement tumoral. En effet, ils présentent un phénotype pro-tumoral et anti-inflammatoire favorisant la croissance tumorale et l’inhibition de la réponse immunitaire. Par ailleurs, ils contribuent au développement d'une résistance face aux chimiothérapies. Le but de ce projet a donc consisté au développement d’une stratégie thérapeutique permettant de réorienter les macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire et anti-tumoral. Pour cela, nous avons ciblé la proprotéine convertase 1/3 qui a récemment été démontrée comme étant un acteur clé de la reprogrammation des macrophages. Ainsi, nous avons démontré que l'inhibition de cette enzyme au sein des macrophages entraîne une sécrétion spontanée de facteurs pro-inflammatoires. De plus, la combinaison de l’inhibition de la proprotéine convertase 1/3 à la stimulation du récepteur de type Toll 4 (TLR4) avec du Paclitaxel induit la sécrétion de facteurs anti-tumoraux efficaces contre une lignée cellulaire de gliome. Nous avons également démontré que l’inhibition de plusieurs proprotéines convertases grâce à un inhibiteur commercial réduisait considérablement la viabilité et l’invasion de cellules de gliome cultivées en présence de macrophages. Outre son activité anti-tumorale directe, cet inhibiteur diminue la capacité immunosuppressive des cellules cancéreuses ainsi que les fonctions pro-tumorales des macrophages. Enfin, nous avons démontré qu'un traitement avec le Poly (I:C), ligand du TLR3, complète l'action de l’inhibiteur de proprotéines convertases. Cette stratégie est donc encourageante pour la reprogrammation des macrophages dans le cadre d’une nouvelle thérapie contre les gliomes<br>In brain tumors such as gliomas, infiltrating macrophages are abundant and associated with a poor prognosis. Their functional plasticity is essential for tumor development. They exhibit anti-inflammatory and pro-tumoral phenotype promoting tumor growth and immunosuppression. Moreover, they impact the efficacy of chemotherapy and may lead to drug resistance. Therefore, this project aims to reorient macrophages towards a pro-inflammatory and anti-tumoral phenotype. For this purpose, the proprotein convertase 1/3 (PC1/3) has been targeted since it plays a key role to skew their phenotype. Indeed, we showed that macrophages released spontaneously pro-inflammatory factors after PC1/3 inhibition. Besides, PC1/3 inhibition combined with TLR4 activation with Paclitaxel induced the secretion of anti-tumoral factors effective against a glioma cell line. To go further, we also inhibited various proprotein convertases with a commercial inhibitor. We found that such treatment reduced the viability and the invasion of glioma cells in co-culture with macrophages. In addition to its direct anti-tumoral activity, it decreased the immunosuppressive capacity of cancer cells as well as the pro-tumoral functions of macrophages. Finally, we also demonstrated that stimulation of TLR3 with Poly (I:C) sustained the activity of the proprotein convertases inhibitor. Therefore, proprotein convertases inhibition associated with TLR activation is a promising strategy to reactivate tumor-associated macrophages and develop a potent anti-glioma therapy

Les inositol lipides sont directement impliques dans la cascade de signalisation intracellulaire. Leur role majeur comme precurseurs de seconds messagers, inositol-1,4,5-trisphosphate et diacylglycerol, apres l'action de phospholipase c est maintenant bien etabli. Par contre, les inositol lipides phosphoryles en position 3 de l'inositol par une phosphoinositide 3-kinase pourraient etre des seconds messagers regulant certaines isoformes de proteine kinases c, ainsi qu'influencer l'organisation du cytosquelette, l'adressage des vesicules intracellulaires et l'activation des integrines. L'adhesion cellulaire via l'integrine #i#i#b#3 sur une matrice de fibrinogene entraine des modifications du cytosquelette. Les variations du metabolisme des inositol lipides ont ete etudiees dans deux modeles cellulaires humains riches en integrine #i#i#b#3, la plaquette sanguine et les cellules erythroleucemiques hel-5j20. Une activite phospholipase c est stimulee apres adhesion des deux types cellulaires. Par contre, seules les plaquettes adherentes stimulent une activite phosphoinositide 3-kinase et l'adp secrete est un cofacteur important de l'activation de l'enzyme. Les resultats montrent pour la premiere fois que l'integrine #i#i#b#3 stimule une activite phospholipase c et que l'adhesion cellulaire provoque l'activation d'une phosphoinositide 3-kinase. Une activite phosphoinositide 3-phosphatase specifique des 3-inositol lipides mono- et bisphosphate a ete mise en evidence. L'enzyme est presente dans les membranes et le cytosol ; l'activite 3-phosphatase est plus importante dans le cytosol. L'activation par le facteur de croissance de l'epiderme (egf) des cellules a431 ne permet pas l'accumulation des 3-inositol lipides ni la stimulation de l'activite 3-phosphatase. L'augmentation de l'activite phosphoinositide 3-kinase retrouvee dans les immunoprecipites anti-phosphotyrosine de cellules a431 stimulees suggere que la compartimentalisation differente des deux enzymes pourrait etre une voie de regulation de la synthese des 3-inositol lipides

Parmi les causes de décès d'origine cardiaque, les troubles du rythme occupent une place majeure, particulièrement les troubles auriculaires. Cette situation alarmante a motivé une recherche intense, mais qui est limitée par la disponibilité de modèles expérimentaux permettant de reproduire les mécanismes cellulaires de déclenchement et d'extensions de ces anomalies. Qu'ils surviennent sur un cœur sain ou pathologique, qu'ils soient bénins ou potentiellement dangereux (risque de mort subite), les troubles du rythme constituent un chapitre important de la cardiologie. Ils posent d'importants problèmes d'ordre diagnostique, pronostique, et thérapeutique. Ils peuvent se produire au niveau atrial (nœud auriculo-ventriculaire, plus tronc du faisceau de HIS avant sa division) ou ventriculaire (après la division du faisceau de HIS en ses deux branches droite et gauche), et ils obéissent à différents mécanismes, au premier rang desquels les réentrées et les hyperautomatismes. Cette thèse s'intéresse à l'étude et la modélisation des troubles du rythme cardiaque à l'échelle cellulaire. Ainsi la problématique de la thèse peut être résumée succinctement par ces quelques mots clés : système non-linéaire, modèles cardiaques, ondes spirales, défibrillation.... Une des questions qui a été soulevée est : comment optimiser le processus de défibrillation pour qu'il soit le moins contraignant pour le patient ? Nous avons commencé par nous intéresser à la défibrillation par stimulation électrique. La stimulation externe peut terminer la fibrillation mais peut aussi éventuellement générer de nouvelles ondes dans le tissu cardiaque. Ce dernier effet de stimulation semble inévitable, si l'énergie de stimulation dépasse certains seuils. Nous nous sommes posé alors une question: comment peut-on terminer la fibrillation en appliquant une stimulation sous le seuil pour éviter d'engendrer d'autres problèmes. Après quelques pistes de réflexion, nous nous sommes orientés vers une stratégie hybride de stimulation qui permet d'atteindre cet objectif. En parallèle de ces travaux, nous avons travaillé aussi sur un système expérimental à base de MEA (Multi Electrodes Array). Ce système nous permet d'acquérir des signaux de cellules cardiaques de rats nouveau-nés en culture in vitro. Etant donné que les données recueillies peuvent être bruitées et erronées, nous avons utilisé des ondelettes pour le débruitage et la méthode de décomposition par les valeurs singulières pour éliminer les mauvais signaux. Comme mentionné précédemment, la stimulation peut provoquer de nouvelles ondes dans le tissu, ceci a été observé expérimentalement sous forme d'ondes spirales. Les prochains travaux serviront à approfondir " la stimulation hybride " au niveau théorique. Ensuite en profitant de notre plateforme MEA, nous allons tester la stratégie de défibrillation par stimulation hybride au niveau expérimental.

Les mécanismes par lesquels les charges mécaniques et électriques agissent sur le tissu osseux dans son ensemble, et sur les ostéoblastes, en particulier, sont encore mal compris. La réponse des ostéoblastes soumis à un seul type de stimulus physique a été comparée à celle obtenue par des combinaisons de plusieurs signaux mécaniques et/ou électriques. Dans la perspective d'améliorer l'ostéointégration des biomatériaux, nos études ont porté principalement sur les deux composants essentiels pour le succès de la greffe d'un biomatériau : la matrice extracellulaire (MEC) qui sert d'interface entre le biomatériau et l'hôte ainsi que les facteurs angiogéniques. Nous avons étudié les réponses des ostéoblastes à des contraintes mécaniques complexes basées sur des signaux de " basse amplitude haute fréquence " (BAHF) appliquées à un modèle de culture 3D (hydroxyapatite macroporeux). Nous montrons donc qu'une stimulation mécanique simple (3Hz) peut être potentialisée par des BAHF appropriées (25 Hz). Un dispositif a été développé pour appliquer des contraintes mécaniques très BAHF sur des modèles de culture 2D. La synthèse de la MEC est favorisée et ses propriétés ostéogéniques sont augmentées sous BAHF. Les BAHF n'ont pas d'effet sur le VEGF. Un autre dispositif a permis d'appliquer un champ électrique aux cultures cellulaires. Quelques paramètres nous indiquent que les cellules perçoivent le champ électrique, mais nous retenons que le VEGF n'est pas affecté. En revanche, la combinaison de ces stimulations physiques (contrainte mécanique très BAHF et champ électrique) augmente l'expression de plusieurs facteurs impliqués dans l'angiogénèse (VEGF, TGFβ1, FGF2...). Les sollicitations complexes définies dans cette thèse pourraient être un outil pour fonctionnaliser un substitut osseux cellularisé

J’ai étudié trois protéines qui participent à deux vois différentes de méchano-transduction qui est la conversion des stimuli physiques en un signal biochimique.Dans une culture cellulaire en 2D, lorsque les cardiomyocytes sont étirés, MLP est transloqué vers le noyau. Sans translocation, les cellules ne parviennent pas à répondre à la stimulation. Les patients porteurs de mutations dans MLP développent une cardiomyopathie comme les souris MLP knock-out (MLP-/-). Mon objectif a été d’élucider le rôle de MLP dans ces cardiomyopathies en surexprimant des mutations de MLP dans les cardiomyocytes isolés des souris MLP-/- néonataux. Dans les cultures 2D mais pas 3D, MLP n’était pas transloqué vers le noyau après l’étirement des cellules. Bien que je n’aie pas pu résoudre ce problème, j’ai mis au point les expériences nécessaires à la poursuite de ce projet.Nesprins s’intègrent dans un complexe transmembranaire de l’enveloppe nucléaire (EN), le LINC complexe, qui connecte le cytosquelette à l’intérieur du noyau. Les myoblastes isolés des patients porteurs des mutations de Nesprin ou de Lamin, qui est associé au LINC complexe, ont présenté des noyaux déformés ainsi que des anomalies de réponses méchanosensibles : Si cultivées sur supports mous, les cellules affichaient un niveau élevé de fibres musculaires stressées et d’adhésions focales. Le knock-down de FHOD, une cible en aval de ROCK et SRC, qui également étaient actives dans ces myoblastes, a réduit ce phénotype. Bien que l’on ait émis l’hypothèse que les mutations dans Nesprins et Lamins conduisent à une instabilité mécanique de l’EN, ces résultats indiquent que les voies de signalisation par l’EN sont perturbées aussi<br>I studied three striated muscle proteins that are participating in two different pathways of mechanotransduction, which is the translation of a physical stimulus into a biochemical signal.When isolated cardiomyocytes are stretched in 2D, MLP shuttles to the nucleus. Without shuttling MLP, these cells fail to respond to the stretch stimulus. Human patients with MLP-mutations develop cardiomyopathies, as well as mice with a knock-out of MLP (MLP-/-). By expressing mutated MLP in neonatal cardiomyocytes of MLP-/- mice, I wanted to elucidate the role of mutant MLP. Surprisingly, MLP did shuttle after stretching of 2D but not 3D cell cultures. Although I could not solve this issue, I prepared the setup for subsequent experiments.Nesprins are part of the nuclear envelope (NE) spanning LINC complex, which connects the cytoskeleton with the nucleus. Myoblasts from patients with mutations in Nesprins or LINC-associated Lamins displayed deformed nuclei and had defects in mechanosensitive responses with an elevated level of stress fibers and focal adhesions on soft surfaces. This phenotype could be rescued by knock-down of formin FHOD1, a downstream target of ROCK and SRC, which also were highly active in the mutant cells. While mutations in Nesprins and Lamins are thought to lead to mechanical instability of the NE, these results indicate that signaling pathways through the NE are disturbed as well

Le peptide LL-37, peptide antimicrobien de l’immunité innée, est associé au développement tumoral. Sur des lignées cancéreuses mammaires. Il augmente le calcium intracellulaire et la migration. via l’activation de la voie PI3K/AKT et de canaux calciques. L’énantiomère (D)-LL-37 induit des effets similaires, excluant une interaction classique ligand-récepteur. Avec sa structure en hélice α amphipathique et sa charge nette +6, l’hypothèse était que le peptide utilise les charges négatives de glycanes sulfatés ou sialylés pour sa fixation membranaire avant d’induire ses activités. Des lectines végétales reconnaissant des structures glycaniques sialylées ou sulfatées inhibent la migration et le signal calcique induits par LL-37 mais l’implication de sialyltransférases n’a pas été démontrée. Des glycoaminoglycanes (GAGs) tels que les chondroïtine et héparine sulfatées, utilisés en tant que compétiteurs, ou une digestion enzymatique des GAGs (Chondroïtinase et héparinase) conduisent à une inhibition de 50 à 100% des activités migratoire et calcique induites par LL-37. L’inhibition de synthèse des GAGs par le Methylumbelliferyl β-D-xyloside ainsi qu’une diminution de la sulfatation par le chlorate de sodium confirment l’implication de ces glycanes sulfatés. Dans la perceptive d’identifier la ou les protéines glycosylées membranaires susceptibles de transduire les effets de LL-37, nous avons utilisé une approche ciblée en invalidant par siRNA la synthèse des protéines arborant des GAGs. Le syndécane 4 est impliqué dans les activités de LL-37. En conclusion, ces résultats soulignent l’implication de GAGs sulfatés portés par le syndécane 4 pour orienter la fixation de LL-37 à la membrane des cellules cancéreuses et médier ses activités pro-tumorales<br>Initially characterized by its antimicrobial activities, LL-37 has also been shown to significantly contribute to tumor development. On breast cancer cell lines, LL-37 increases intracellular calcium and their migration via the activation of PI3K/AKT signaling. Its all-D enantiomer (D)-LL-37 induces similar effects, which excludes an protein-protein interaction of LL-37 in a classic ligand-receptor manner. Its structure of an amphipathic a-helix with a net charge of +6 gave rise to the hypothesis that the peptide uses the negative charges of sulfoglycans or sialic acids to facilitate its attachment to the cell membrane and to induce its activities. Whereas several lectins, specifically attaching to sialylated or sulfated structures, blocked the activities of LL-37 on both calcium increase and cell migration, the suppression of several sialyltransferases had no effect. However, the competitive use of glycoaminoglycans (GAG) and chrondroitin and sulfated heparin, or treatment of the cell surface with chondroitinase and heparinase resulted in an activity loss of 50-100%. Similar results were obtained by confirmed by blocking the synthesis of GAGs with Methylumbelliferyl β-D-xyloside, and by suppression of glycan sulfurylation by sodium chlorate. Using a candidate approach by suppressing proteoglycan synthesis by RNA interference, syndecan 4 was shown to be involved in the activities of LL-37. This leads to the conclusion that sulfated GAGs linked to syndecans 4 guides the association of LL-37 to the membrane of cancer cells, thus being a mediator of its activities

J’ai étudié trois protéines qui participent à deux vois différentes de méchano-transduction qui est la conversion des stimuli physiques en un signal biochimique.Dans une culture cellulaire en 2D, lorsque les cardiomyocytes sont étirés, MLP est transloqué vers le noyau. Sans translocation, les cellules ne parviennent pas à répondre à la stimulation. Les patients porteurs de mutations dans MLP développent une cardiomyopathie comme les souris MLP knock-out (MLP-/-). Mon objectif a été d’élucider le rôle de MLP dans ces cardiomyopathies en surexprimant des mutations de MLP dans les cardiomyocytes isolés des souris MLP-/- néonataux. Dans les cultures 2D mais pas 3D, MLP n’était pas transloqué vers le noyau après l’étirement des cellules. Bien que je n’aie pas pu résoudre ce problème, j’ai mis au point les expériences nécessaires à la poursuite de ce projet.Nesprins s’intègrent dans un complexe transmembranaire de l’enveloppe nucléaire (EN), le LINC complexe, qui connecte le cytosquelette à l’intérieur du noyau. Les myoblastes isolés des patients porteurs des mutations de Nesprin ou de Lamin, qui est associé au LINC complexe, ont présenté des noyaux déformés ainsi que des anomalies de réponses méchanosensibles : Si cultivées sur supports mous, les cellules affichaient un niveau élevé de fibres musculaires stressées et d’adhésions focales. Le knock-down de FHOD, une cible en aval de ROCK et SRC, qui également étaient actives dans ces myoblastes, a réduit ce phénotype. Bien que l’on ait émis l’hypothèse que les mutations dans Nesprins et Lamins conduisent à une instabilité mécanique de l’EN, ces résultats indiquent que les voies de signalisation par l’EN sont perturbées aussi<br>I studied three striated muscle proteins that are participating in two different pathways of mechanotransduction, which is the translation of a physical stimulus into a biochemical signal.When isolated cardiomyocytes are stretched in 2D, MLP shuttles to the nucleus. Without shuttling MLP, these cells fail to respond to the stretch stimulus. Human patients with MLP-mutations develop cardiomyopathies, as well as mice with a knock-out of MLP (MLP-/-). By expressing mutated MLP in neonatal cardiomyocytes of MLP-/- mice, I wanted to elucidate the role of mutant MLP. Surprisingly, MLP did shuttle after stretching of 2D but not 3D cell cultures. Although I could not solve this issue, I prepared the setup for subsequent experiments.Nesprins are part of the nuclear envelope (NE) spanning LINC complex, which connects the cytoskeleton with the nucleus. Myoblasts from patients with mutations in Nesprins or LINC-associated Lamins displayed deformed nuclei and had defects in mechanosensitive responses with an elevated level of stress fibers and focal adhesions on soft surfaces. This phenotype could be rescued by knock-down of formin FHOD1, a downstream target of ROCK and SRC, which also were highly active in the mutant cells. While mutations in Nesprins and Lamins are thought to lead to mechanical instability of the NE, these results indicate that signaling pathways through the NE are disturbed as well

Les abeilles sont confrontées à la menace mondiale du syndrome d'effondrement des colonies (CCD), entraînant des décès de colonies et une diminution de leur nombre, affectant leur contribution environnementale et agronomique dans la pollinisation des plantes et des cultures commerciales, en plus de la production de miel. L'exposition aux pesticides peut être l'une des principales causes conduisant au CCD en affaiblissant le système immunitaire des abeilles et en altérant leurs réponses immunitaires. Les maladies de la nosémose causées par Nosema spp. peuvent avoir une contribution significative au CCD lorsque les abeilles sont exposées à différents pesticides simultanément. Dans cette étude, plusieurs facteurs de risque sont évalués, y compris les néonicotinoïdes les plus utilisés dans le monde, l'imidaclopride et l'amitraz qui est le pesticide utilisé directement en contact avec les abeilles pour traiter l'infection par les acariens. L'effet de ces pesticides est évalué au niveau de la stimulation immunitaire par zymosan A pour imiter l'infection par Nosema. L'effet des pesticides sur les produits cellulaires antimicrobiens, les réponses cellulaires et l'expression de gènes connexes est démontré<br>Honeybee are facing the global threat of colony collapse disorder (CCD) leading colony deaths and decline in their numbers affecting their environmental and agronomic contribution in pollination of plants and commercial crops in addition to honey production. Pesticide exposure may be of the main causes leading to CCD by weakening the immune system of honeybees and impairing their immune responses. Nosemosis diseases caused by Nosema spp. may have a significant contribution to CCD when bees are exposed to different pesticides simultaneously. Multiple risk factors are assessed in this study including the most used neonicotinoids worldwide, imidacloprid and amitraz which is the pesticide used directly in contact with honeybees to treat mite infection. Th effect of these pesticides is evaluated at the level of immune stimulation by zymosan A to mimic Nosema infection. The effect of pesticides on antimicrobial cells products, cellular responses and related genes' expression are demonstrated

Vaccination has important clinical potential in the immunotherapy of both infectious disease and cancer. The central aim of the studies reported in this thesis has been the development of vaccination strategies that will be effective for therapeutic applications in cancer. Using ovalbumin antigen in a mouse model, we have examined a combination of recently developed adjuvants referred to as CASAC (combined adjuvants for synergistic stimulation of cellular immunity) to optimise the efficacy of vaccination induced T cell mediated immunity. These studies have examined the effect of repeated rounds of vaccination with one, or alternating cycles of two different helper peptides. The hypothesis was that repeated stimulation of the same clonal population of CD4+ T helper cells with a single MHC class II peptide could induce anergy, exhaustion, clonal deletion and/or stimulation of regulatory T-cells, resulting in reduced and shorter lived immunity. These studies have also examined the effect of inclusion of other immune regulatory components, and in particular a cocktail of cytokines generated by phytohemagglutinin stimulation of human peripheral blood mononuclear cells (referred to as IRX-2). Another important issue for vaccination mediated immune therapy that was addressed is the age-associated loss of immunological competence (immunesenescence). A comparative analysis is reported of the magnitude and duration of responses to vaccination with a single MHC class-I presented peptide in combination with the same or alternating MHC class-II presented peptides. In addition, we have quantified the number of antigen specific CDS T cells, their effector and memory subsets and in vivo antigen specific cytolytic activity to examine the effect of CASAC vaccination alone or in combination with IRX-2. The induction of immunological responses in young and aged immune backgrounds was also examined. Vaccinations with ovalbumin peptides in the CASAC adjuvant have shown higher percentages and numbers of antigen specific CDS T cells with improved cytolytic activity when helper functions are stimulated by two different class-II peptides used in alternating cycles of vaccination, rather than repeated stimulation by the same class-II peptide. This conclusion can be confirmed with a repeated experiment. Analysis of T cells with a regulatory (Treg) phenotype (CD4+CD25+Foxp3+) showed that their expansion was reduced with the alternating T-helper peptide vaccination regimen. The addition of IRX-2 to the CASAC vaccination regimen was found to enhance the in vivo antigen specific cytolytic activity. This was particularly significant in the aged mice which were found to have increased levels of Tregs.

Apres une immunisation appropriee avec l'antigene ova en acf, les cellules de rates de deux lignees des souris genetiquement selectionnees pour leur forte (hi/pha) ou faible (lo/pha) reponse a la phytohemagglutinine (pha), produisant un facteur stimulant la migration mstf. Le mstf s'exprime au plus haut titre dans le sn des cellules b purifiees des deux souches et en particulier des lo/pha. Un hybridome producteur du mstf est alors obtenu par fusion de cellules b purifiees des lo/pha immunes d'ova+acf avec le thyome akr bw4157. L'analyse du rearrangement des genes de la chaine legere kappa de l'adn de l'hybridome confirme la nature b de la cellule productrice de mstf. Differentes analyses biochimiques du sn d'hybridome telles que la precipitation par les acides, la thermoresistance et l'action des proteases ne modifient l'activite mstf et montrent que le mstf n'est pas une proteine. En revanche, la neurominidase l'abolie et induit la formation de gouttes lipidiques. Ceci suggere l'existence d'acides sialiques indispensables a l'activite du mstf dont la nature serait glycolipidique. Celle-ci est confirmee par l'extraction des lipides par l'alcool ainsi que le test d'affinite hydrophode du sn actif. L'etude chromatographique du sn localise une fraction active eluee au temps 68. 9 mn qui correspondrait a la forme supposee libre du mstf dont le pm serait de 20 kda. La purification de cette lymphokine classee comme suppressive pourrait promouvoir l'etude des reactions immunes telles le rejet d'allogreffe, la transplantation et l'inflammation

Une population de cellules souches pluripotentes residant dans la moelle osseuse genere l'ensemble des cellules sanguines matures au cours d'un processus impliquant des mecanismes d'engagement, de proliferation et de differenciation. Un certains nombre de facteurs de croissance hematopoietiques interviennent dans ces processus, mais leur role exact dans l'engagement d'une cellule pluripotente est encore sujet a debat. Dans ce contexte, la premiere partie de ce travail relate l'etablissement de modeles cellulaires d'etude de la differenciation monocytaire, bases sur des cellules hematopoietiques pluripotentes murines. Nous avons montre que l'expression ectopique du csf-1r murin conduit a l'engagement de ces cellules dans la voie monocytaire, en reponse au csf-1, et a l'extinction concommitante de leur potentiel erythroide. Un role instructif du csf-1 a pu etre mis en evidence dans ce processus. Nous avons ensuite montre que le recepteur humain du csf-1, transfere a un taux equivalent dans les memes cellules, induit un autorenouvellement, sans engagement dans la voie monocytaire et sans alteration du potentiel erythroide. Afin d'identifier la region du csf-1r murin responsable de l'engagement de ces progeniteurs pluripotents, nous avons construit des recepteurs chimeres humain/murin, par echange des principaux domaines fonctionnels. Certains de ces recepteurs chimeres presentent alors une alteration de leurs proprietes mitogeniques, en depit de la forte homologie entre les regions echangees. Par cette strategie, nous avons egalement montre que l'association du kinase insert et de la region c-terminale murines est necessaire pour conferer au csf-1r humain la capacite a induire un engagement. Ceci suggere que le signal de differenciation resulte de l'addition de plusieurs signaux cooperatifs emanant de differentes regions du csf-1r, plutot que d'une voie unique de signalisation. La nature de ces signaux reste cependant a identifier.

De nombreux processus biologiques liés aux membranes cellulaires lipidiques sont encore très mal connus. La présence d'eau et d'ions à l'interface influence les propriétés structurelles et dynamiques de la bicouche lipidique. Les techniques de fluorescence sont très utiles pour étudier les membranes en raison de la grande sensibilité des sondes à leur environnement. Nous avons utilisé la technique de relaxation de solvant (SR) pour explorer l'hydratation et la mobilité de l'eau. Nous avons également réalisé des calculs quantiques (QM) et des dynamiques moléculaires (DM) pour étayer nos expériences. Les résultats SR montrent qu'un petit cation (Na+) est très attiré par la membrane et augmente sa rigidité à l'opposé des cations (NH4+, Cs+) plus gros. Les anions (CI04-, SCN-) s'adsorbent à l'interface plus facilement que Cl-. Ces anions changent la mobilité et l'hydratation des têtes polaires des lipides de la bicouche. Les études SR de la zone hydrophobe de la membrane montrent que les processus de relaxation sont ici très complexes. lis reflètent des processus rapides intramoléculaire (relaxation de torsion, transferts de charge) et des processus intermoléculaires lents. Les calculs QM ont permis de créer les champs de force de trois sondes fluorescentes (Prodan, Laurdan et C-laurdan). Les simulations DM ont permis de déterminer les positions des sondes dans une membrane DOPC. La modélisation reproduit correctement les résultats SR, en particulier les temps de relaxation : de l'ordre de la ps en solvant aqueux et de la ns dans la membrane. Les simulations MD sont complémentaires des méthodes SR et permettent de surveiller le comportement de molécules uniques<br>Many biologically important processes and phcnomena in lipid membranes are still not fully understood. The presence of ions and water molœules has a significant influence on the structural and dynamical properties of lipid bilayers. Fluorescent techniques are versatile tools for studying the lipid membranes, because the fluorescence emission is strongly sensitive to dye environment. We have conducted fluorescent solvent relaxation (SR) experiments to explore the hydration and mobility properties in lipid membranes in the presence of different chaotropic ions. We have also carried out Quantum Mechanical (QM) calculations and Molecular Dynamics (MD) simulations for supporting the SR experiments. SR experiments show that small cation (Na+) is attracted to the membrane and increases rigidity ofbilayer, while larger cations (NH/, Cs+) should not. Large anions (CI04·, SCN') adsorl, at the membrane interface more easily than smaller ones (Cl') and significantly change tl!e mobility and hydration of the headgroup region oflipid bilayer. SR study ofhydrophobic part of the membrane show that SR processes are complex there and reflect botl!: faster, intramolecular (torsional relaxation or fonnation of charge transfer state) and slower, intermolecular (SR) relaxation processes. QM calculatiom were used to create force-field for three fluorescent dyes (Prodan, Laurdan and C-laurdan). MD simulations allow detennining position of the dye in the lipid membrane in the ground state and after excitation and reproduce correctly SR timescale- ps in water and ns in the membrane. MD simulations extend the capabilities of SR method and allow observing the behaviour of individual molecules

Le but de cette thèse est de proposer une modélisation mathématique des stimulations visuelles afin d'analyser finement des données expérimentales en psychophysique et en électrophysiologie. Plus précis\'ement, afin de pouvoir exploiter des techniques d'analyse de données issues des statistiques Bayésiennes et de l'apprentissage automatique, il est nécessaire de développer un ensemble de stimulations qui doivent être dynamiques, stochastiques et d'une complexité paramétrée. Il s'agit d'un problème important afin de comprendre la capacité du système visuel à intégrer et discriminer différents stimuli. En particulier, les mesures effectuées à de multiples échelles (neurone, population de neurones, cognition) nous permette d'étudier les sensibilités particulières des neurones, leur organisation fonctionnelle et leur impact sur la prise de décision. Dans ce but, nous proposons un ensemble de contributions théoriques, numériques et expérimentales, organisées autour de trois axes principaux : (1) un modèle de synthèse de textures dynamiques Gaussiennes spécialement paramétrée pour l'étude de la vision; (2) un modèle d'observateur Bayésien rendant compte du biais positif induit par fréquence spatiale sur la perception de la vitesse; (3) l'utilisation de méthodes d'apprentissage automatique pour l'analyse de données obtenues en imagerie optique par colorant potentiométrique et au cours d'enregistrements extra-cellulaires. Ce travail, au carrefour des neurosciences, de la psychophysique et des mathématiques, est le fruit de plusieurs collaborations interdisciplinaires<br>The goal of this thesis is to propose a mathematical model of visual stimulations in order to finely analyze experimental data in psychophysics and electrophysiology. More precisely, it is necessary to develop a set of dynamic, stochastic and parametric stimulations in order to exploit data analysis techniques from Bayesian statistics and machine learning. This problem is important to understand the visual system capacity to integrate and discriminate between stimuli. In particular, the measures performed at different scales (neurons, neural population, cognition) allow to study the particular sensitivities of neurons, their functional organization and their impact on decision making. To this purpose, we propose a set of theoretical, numerical and experimental contributions organized around three principal axes: (1) a Gaussian dynamic texture synthesis model specially crafted to probe vision; (2) a Bayesian observer model that accounts for the positive effect of spatial frequency over speed perception; (3) the use of machine learning techniques to analyze voltage sensitive dye optical imaging and extracellular data. This work, at the crossroads of neurosciences, psychophysics and mathematics is the fruit of several interdisciplinary collaborations

Electromagnetic fields are present in some environments of everybody life. Some of the most common sources of electromagnetic field that everybody experiments are the sun radiation, the electric current that supplies household (lights, television set, refrigerator, etc) and antennas for telecommunications. In industrial environments the magnetic and electric fields are exploited to the metal treatments and fusion, some magnetic fields are generated by means of electric welding applications or devices that use high intensity electric currents. In residential environment the diffusion of the induction cooktop increases the possibility of domestic exposure to magnetic fields. Nevertheless, electromagnetic fields can also be used with medical purpose. This thesis evaluates the effects due to the interaction between electromagnetic fields and biological tissues. It is to be noted that the interaction of the magnetic field with a conductor material produces induced currents density that circulating in the media might heat it by means of the Joule effect. The most important application of this phenomenon is the treatment and melting of metals that have a large electrical conductivity (in the order of the millions of S/m) and high relative magnetic permeability. Nevertheless, in spite of the tissues of the human body are bad electrical conductors (conductivity in the order of the unity or lower and a unitary relative magnetic permeability), the induced current density might cause muscle contraction. The intensity of these currents depends on the intensity of the magnetic field that generates them and the effect is perceived if overcomes a given threshold. In this case adverse effect, like nerve or muscle stimulation might be induced. Then, every equipment that uses a high intensity electric current produces a magnetic field that might generate an induced current in the biological tissues. Some standards regulate the maximum of the electromagnetic field at which every person can be exposed. Among equipments that generate high magnetic field this work analyzed arc and resistance welding equipments and induction cooktops. In order to evaluate human exposure to magnetic field below 100 kHz, the magnetic flux density and induced current density have been computed using the Finite Element Method. Some simplified models of the human body have been implemented. The computation results obtained in these simplified volumes by means of numerical methods have been compared with these ones obtained using models that describe accurately the tissues of the human body. Electric and magnetic fields can be exploited in some medical applications. For instance, the magnetic and electric fields are used in malignant tumor therapies. For instance, examples are the thermal ablation or the tissues heating in localized areas (laser, radiofrequency antennas, thermoseed, etc). A technique of new application is the Magnetic Fluid Hyperthermia (MFH), which the original idea is of 1950, but the first prototype device is of the end ninety. This technique uses magnetic nanoparticles inserted in the treatment areas. Nanoparticles are heated by means of an external time-varying magnetic field of suitable frequency and intensity and act as an internal source of heat. In this case the aim is reached a temperature close to a therapeutic value (42-43°C for the mild hyperthermia or overcome 60 °C for the thermal ablation). Electric fields can also be used in order to stimulate different areas of the brain. An initial study shows some simulation results obtained in both human and rat brains. Moreover, in this case an experimental set up for measurements in vivo in a rat’s head has been developed. All the computations of thermal and electromagnetic fields have been solved using Finite Element Analysis. Some of the algorithms for the solution of coupled magnetic and thermal problems and the code for the optimization procedure have been implemented inside a commercial software tool. In particular, the optimization algorithm included in the Finite Element Analysis tool is an Evolution Strategy code. In order to calculate magnetic field, magnetic flux density, induced current density and electric field for the solution of the Maxwell equations, different formulations have been used, whereas the thermal problem has been solved using the heat transfer equation, including the Pennes term that describes the effect of the blood perfusion. Optimization codes have been used in order to design a Magnetic Fluid Hyperthermia device. At first, optimization the uniformity of the magnetic field has been optimized, under the hypothesis that magnetic nanoparticles are uniformly distributed in tissues. This step has allowed the generation of a first design of the magnetic field source. In a second step, the optimization code has been used to search the temperature uniformity in the treated areas; then, the coupling of a magnetic with a thermal problem has been developed. In this case, the transition from the magnetic problem to the thermal one has required the computation of the power density generated by means of magnetic nanoparticles, from the value of the intensity of the magnetic field, using an analytical relation that depend also on instantaneous temperature and physical characteristics and the concentration of magnetic nanoparticles. The optimization of the temperature uniformity in the treated area, also in term of temperature rate, can be also seen from the point of view of the design of the magnetic field source that is the magnetic fluid design (dimensions and concentration of nanoparticles). Both these aspects have been investigated. Finally, the problem of the real distribution of nanoparticles in tumor tissues has been investigated in term of temperature disuniformity, due to the different nanoparticles concentration. An algorithm for the optimization of the points of injection of nanoparticles in situ has been developed, in order to limit the temperature disuniformity related to nanoparticles local concentration. Some computations of the electric field have been performed in order to evaluate the feasibility to reach internal structures of the brain with electric fields, applying a voltage to suitable points of the external skull. The frequency of the applied voltage is 4 MHz, an unusual frequency for the instrumentation normally used to measure electric potentials in vivo in laboratory animals. The experimental part has been developed in order to compare the voltage computed with the Finite Element models with the voltage measured inside the brain tissue using glass micropipettes. It is to be noted that at 4 MHz the micropipette has a different impedance from the one it has in the normal use of instruments (below 1 kHz). A measurement set up has been designed in order to convert the signal measured by means of a micropipette and an oscilloscope, considering the real impedance of the micropipette. The potential at the micropipette point is derived by means of calibration curves evaluated through specific experiments. Measurements have been used to validate the Finite Element simulations of electric fields. The main results of this thesis are models of living organisms implemented for biomedical applications in order to evaluate the effect of electromagnetic fields in biological tissues. Moreover, different formulations have been used to solve electromagnetic problems, and the solution of magnetic and thermal coupled problems has been proposed. Optimization algorithms have been used for the design of magnetic devices and treatment planning (e.g. position of the magnetic field source as a function of the patient and treatment area) or in the magneto fluid drug composition (size of nanoparticles and concentration).<br>I campi elettromagnetici sono diffusi in molti ambienti industriali e residenziali. Alcune delle più comuni sorgenti di campo elettromagnetico sono le radiazioni solari, la corrente elettrica che alimenta gli elettrodomestici (luci, televisore, frigorifero, ecc.) e le antenne per le telecomunicazioni. Negli ambienti industriali i campi elettrici e magnetici sono utilizzati per la fusione e il trattamento dei metalli, in particolare alcuni dispositivi per la saldatura possono generare campi elettromagnetici di intensità elevata. In ambiente residenziale la diffusione del piano di cottura a induzione ha aumentato la possibilità di esposizione della popolazione a campi magnetici che potrebbero essere intensi. Inoltre i campi elettromagnetici possono essere utilizzati a scopo medico in alcune terapie. Questa tesi analizza l'interazione tra campi elettromagnetici e tessuti biologici. È da notare che l'interazione del campo magnetico con un materiale conduttore produce correnti indotte che circolano nel materiale e producono calore per effetto Joule. L'applicazione più importante di questo fenomeno è il trattamento e la fusione dei metalli che hanno una elevata conducibilità elettrica (dell'ordine dei milioni di Sm-1) ed alta permeabilità magnetica relativa. Nonostante i tessuti del corpo umano siano cattivi conduttori elettrici (conducibilità dell'ordine l'unità o più bassa e una permeabilità magnetica relativa unitaria), la densità di corrente indotta può causare la contrazione muscolare. L'intensità di queste correnti indotte dipende dall'intensità del campo magnetico che le genera e il loro effetto è percepibile se superano la soglia di stimolazione dei nervi o dei muscoli. Quindi, ogni apparecchiatura che utilizza una corrente elettrica produce un campo magnetico che può generare correnti indotte nei tessuti biologici. Alcune norme regolano il massimo valore del campo elettromagnetico a cui ogni persona può essere esposta. Tra le apparecchiature che generano campi magnetici questo lavoro analizza le saldatrici ad arco e a resistenza e i piani di cottura a induzione. Al fine di valutare l'esposizione umana al campo magnetico sotto i 100 kHz, si valuta l’induzione magnetica e la corrente indotta in opportuni volumi che simulano il corpo umano mediante il metodo degli Elementi Finiti. La corrente indotta calcolata con i modelli semplificati del corpo umano è stata confrontata con quella calcolata utilizzando modelli che descrivono con precisione i tessuti del corpo umano. Campi elettrici e magnetici possono inoltre essere utilizzati in alcune applicazioni mediche. Ad esempio, il campo magnetico ed elettrico possono trovare impiego nella terapia dei tumori. Esempi sono l'ablazione termica dei tessuti o il riscaldamento di zone localizzate (laser, antenne a radiofrequenza, thermoseed, ecc.). Una tecnica di nuova generazione è l’ipertermia magneto fluida, la cui idea originaria risale agli anni ‘50, ma il primo prototipo è della fine degli anni novanta. Questa tecnica utilizza nanoparticelle magnetiche inserite nelle aree da trattare. Le nanoparticelle sono riscaldate per mezzo di un campo magnetico tempo variante esterno di frequenza e di intensità adeguate e agiscono come una fonte interna di calore. In questo caso la temperatura raggiunta dai tessuti deve raggiungere la soglia terapeutica (42-43°C per l'ipertermia o superare i 60 °C per l'ablazione termica). Il campo elettrico può essere utilizzato anche per stimolare diverse aree del cervello. Un primo studio mostra alcuni risultati di simulazione ottenuti sia in un cervello umano sia di ratto. Inoltre, per questo esempio è stato sviluppato un set up sperimentale per misure in vivo nei tessuti della testa di un ratto. Il calcolo del campo termico ed elettromagnetico è stato risolto utilizzando il Metodo degli Elementi Finiti. Inoltre sono stati implementati alcuni algoritmi per la soluzione di problemi di accoppiamento magnetico e termico e un codice per la procedura di ottimizzazione. Il codice di ottimizzazione, di tipo Evolution Strategy, è stato implementato all'interno di un software commerciale per risolvere problemi elettromagnetici e termici mediante il metodo degli Elementi Finiti. Per la soluzione delle equazioni di Maxwell per il calcolo del campo magnetico, l’induzione magnetica, la densità di corrente indotta e il campo elettrico sono state utilizzate diverse formulazioni, mentre il problema termico è stato risolto utilizzando l'equazione di trasferimento del calore, includendo il termine Pennes che descrive l'effetto della perfusione sanguigna. I codici di ottimizzazione sono stati utilizzati principalmente per la progettazione di un dispositivo per l’ipertermia magneto fluida. Per un primo disegno della sorgente di campo magnetico si è ottimizzata l’uniformità del campo magnetico, sotto l'ipotesi che le nanoparticelle magnetiche fossero distribuite uniformemente nei tessuti. In seguito il codice di ottimizzazione è stato utilizzato per cercare l'uniformità della temperatura nelle zone da trattare, e quindi è si è risolto un problema magnetico-termico accoppiato. In questo caso il passaggio dal problema magnetico a quello termico ha richiesto il calcolo della densità di potenza generata dalle nanoparticelle magnetiche a partire dall'intensità del campo magnetico. In questo caso si è utilizzata una relazione analitica che valuta la potenza a partire dalla temperatura istantanea dei tessuti, le caratteristiche fisiche delle nanoparticelle magnetiche e l’intensità e la frequenza del campo magnetico. L'ottimizzazione dell’uniformità della temperatura nella zona trattata, anche in termini di rateo di temperatura, può essere vista come progettazione sia della sorgente del campo magnetico sia del magnetofluido (dimensioni e concentrazione delle nanoparticelle) . Entrambi questi aspetti sono stati indagati. Infine è stato valutato l’effetto della reale distribuzione delle nanoparticelle nei tessuti tumorali sulla disuniformità di temperatura legata alla disuniformità della concentrazione delle nanoparticelle. In questo caso, per limitare la disuniformità di temperatura correlata alla concentrazione delle nanoparticelle, si è sviluppato un algoritmo per l'ottimizzazione dei punti di iniezione in situ delle nanoparticelle. Infine è stata studiata la distribuzione del campo elettrico creato da una differenza di potenziale applicata alla scatola cranica per valutare la fattibilità di raggiungere le strutture interne del cervello. Il segnale di tensione utilizzato è a 4 MHz, una frequenza non usuale per la strumentazione normalmente utilizzata per misurare i potenziali elettrici in vivo su animali. Per confrontare la tensione calcolata con i codici numerici con quella misurata all'interno del tessuto cerebrale usando micropipette di vetro, è stato studiato un set up di misura. La micropipetta alla frequenza di 4 MHz ha impedenza differente rispetto quella che si ha nel normale uso dello strumento (frequenze inferiori a 1 kHz). Mediante l’esperimento progettato si sono ottenute delle curve di taratura per convertire il segnale misurato con la micropipetta e l’oscilloscopio. Tali curve tengono conto della reale impedenza della micropipetta. Queste misurazioni sono state utilizzate per validare le simulazioni numeriche del campo elettrico. I principali risultati di questa tesi sono i modelli di organismi viventi implementati per valutare le interazione dei campi elettromagnetici con i tessuti biologici. In particolare, per risolvere i problemi elettromagnetici e di accoppiamento magnetico e termico sono state utilizzate diverse formulazioni. Inoltre, per la progettazione dei dispositivi magnetici, la pianificazione del trattamento (posizionamento della sorgente di campo magnetico in funzione paziente) e la composizione del magneto fluido (dimensioni e concentrazione delle nanoparticelle) sono stati utilizzati algoritmi di ottimizzazione.

La stimulation transcrânienne à courant direct (tDCS) est une technique d’électrostimulation non invasive qui fait actuellement l’objet d’études cliniques. Mon projet de maîtrise, ici présenté, visait à approfondir nos connaissances des mécanismes sous-jacents ces effets par l’application de champs électriques à courant direct (DCEFs), qui sont créés dans le cerveau pendant la stimulation, sur des cellules neuronales, microgliales et astrocytaires ainsi que sur des explants de l’aire tegmentale ventrale in vitro. Les résultats présentés suggèrent que les DCEFs promeuvent la régénération axonale des neurones. Ils proposent également que son utilisation ne réduise pas l'état d'activation de la microglie activée, mais puisse augmenter celle de la microglie quiescente à haute intensité. Finalement, les astrocytes sont fortement allongés perpendiculairement au DCEF. Les résultats supportent ainsi le potentiel neuroregénérateur de la tDCS qui lui était attribué et son utilisation ne modifierait pas l'état d'activation de la microglie.<br>Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive electrostimulation technique studied used in clinical studies. My master's project, presented here, aimed to deepen our knowledge of the mechanisms of action underlying these effects by the application of direct current electric fields (DCEFs), which are produced during the stimulation, on neuronal, microglial and astrocytic cells and ventral tegmental area in vitro. The results presented suggest that DCEFs promote axonal regeneration in neurons. They also put forward that its usage does not reduce the activation state of activated microglial cells, but can increase it in quiescent microglial cells at high intensity. Finally, the astrocytes are strongly elongated perpendicularly to the DCEF. The results thus support the neuroregenerative potential it was attributed and its modification would not modify the microglia activation state.

Parkinson’s disease, the second most common neurodegenerative disease, is characterized by the loss of dopaminergic neurons within the substantia nigra. Currently, the treatments available for PD are symptomatic treatments that do not stop the progression of the disease. Trophic molecules, such as glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF), have been evaluated as potential therapeutic molecules that could stop the loss of neurons and potentially restore some of the neurons that have already been lost. However, these trophic molecules are large making them difficult to produce and delivery. Here we characterize three peptides (DNSP-5, DNSP-11, and DNSP-17) to determine it they are stable and offer protective effects similar to GNDF allowing them to be potential therapeutic molecules. The data presented here involves the evaluation of the molecular and cellular mechanism of DNSP-5, DNSP-11, and DNSP-17, which are derived from prosequence of GDNF. Initial studies were carried out to evaluate the physical characteristics of these three peptides to determine their viability as potential therapeutic molecules. The structure and stability of these peptides were evaluated. Based on the data it was determined that the three peptides do not interact in vitro, allowing for further individual evaluations of the peptides. It was also determined that the peptides were stable when stored at both -80°C and 37°C for one month, allowing them to both potentially be stored during treatment. Cell culture assays and proteomic profiling were utilized to determine binding partners and potential mechanisms through which DNSP-11 may be able to mediate apoptosis. It was determined that DNSP-11 was able to interact with a variety of binding partners that are involved in metabolism. These studies have aided in the understanding of neurotrophic factor prosequence function, but will also serve as a starting point for the development of novel trophic factors for PD treatment. Finally, the interaction between DNSP-11 and GAPDH was evaluated as a potential anti-apoptotic mechanism. GAPDH has previously shown to play a role in mediating apoptotic pathways. It was hypothesized that the observed interaction between DNSP-11 and GAPDH could mediate that role of GAPDH in apoptosis and afford DNSP-11 its observed anti-apoptotic effects. It was observed that while DNSP-11’s interaction with GAPDH may play a role in its anti-apoptotic effects, it does not appear to be the only mechanism involved. Based on this data, it is likely that the other metabolic binding partners play a role in DNSP-11’s anti-apoptotic mechanisms and therefore, these interactions should be further evaluated.

The research of functional stimulation of neural tissue is of great interest within the field of clinical neuroscience to further develop new neural prosthetics. A technique which has gained increased interest during the last couple of years is the stimulation of nervous tissue using infrared laser light. Successful results have been reported, such as stimulation of cells in both the central nervous system, and in the peripheral nervous system, and even cardiomyocytes. So far, the details about the stimulation mechanism have been a question of debate as the mechanism is somewhat hard to explain. The mechanism is believed to have a photo-thermal origin, where the light from the laser is absorbed by water, thus increasing the temperature inside and around the target cell. Despite the mechanism questions, the technique holds several promising features compared to traditional electrical stimulation. Examples of advantages are that it is contact free, no penetration is needed, it has high spatial resolution and no toxic electrochemical byproducts are produced during stimulation. However, since the laser pulses locally increase the temperature of the tissue, there is a risk of heat induced damage. Therefore, the effect of increased temperatures must be investigated thoroughly. One method of examining the changes in temperature during stimulation is to model the heating. This thesis is based on the work from four papers with the main aim to investigate and describe the response of heating, caused by laser pulses, on central nervous system cells. In paper one, a model of the heating during pulsed laser stimulation is established and used to describe the dynamic temperature changes occurring during functional stimulation of cerebral cortex cells. The model was used in all four papers. Furthermore, single cell responses, as action potentials, as well as network responses, as activity inhibition, were observed. In paper two, the response of rat astrocytes exposed to laser induced hyperthermia was investigated. Cellular migration was observed and the migration limit was used to calculate the kinetic parameters for the cells, i.e., the reaction activation energy, Ea (321.4 kJ⋅mol-1), and the frequency factor, Ac (9.47 x 1048 s-1). Furthermore, a damage signal ratio (DSR) for calculating a threshold for cellular damage was defined, and calculated to six percent. In paper three, the response of hyperthermia to cerebral cortex cells was investigated, in the same way as in the second paper. Fluorescence staining of the metabolic activity was used to reveal the heat response, and by using the limit of the observed increased fluorescence the kinetic parameters, Ea (333.6 kJ⋅mol-1), and Ac (9.76 x 1050 s-1), were calculated. The DSR for the cells was calculated to five percent. In paper four, the behavior of action potentials triggered by laser stimulation was investigated. More specifically, the time delay from the start of a laser pulse to the detection of an action potential, delta-t, were investigated. Two different behaviors for the initial action potentials were observed: fast decreasing delta-t and slow decreasing delta-t. The results show the dynamic behavior of action potential responses to infrared light. The work of this thesis show the dynamic changes of the temperature during optical stimulation, using an infrared laser working at 1,550 nanometers. It also shows how the changes cause astrocytes to migrate for pulses several seconds long, and neurons to fire action potentials for pulses in the millisecond range. Furthermore, a damage signal ratio was defined and calculated for the cell systems.

Cardiovascular complications associated with elevated levels of glucose in the blood (Hyperglycemia, HG) is a growing health concern. HG is known to be associated with a variety of cardiovascular morbidities including higher incidence of electrical disturbances. Although effects of chronic HG have been widely investigated, electrophysiological effects of acute hyperglycemia are relatively less known. Further, hyperglycemic effects on adrenergic response is not widely investigated. We used excised ventricular tissues from mice to record trans-membrane potentials during a variety of pacing protocols to investigate cellular/tissue level electrophysiological effects of acute hyperglycemia and adrenergic stimulation (1µM Isoproterenol, a β-adrenergic agonist). A custom program was used to compute action potential durations (APD), maximal rates of depolarization (dv/dtmax), and action potential amplitudes (APA) from the recorded trans-membrane potentials. From these computed measures, electrical restitution and alternans threshold were quantified. Restitution was quantified using the Standard Protocol (SP; basic cycle length BCL= 200ms), Dynamic Protocol (DP; 200-40ms or until blockade) and a novel diastolic interval (DI) control protocol with Sinusoidal Changes in DI. Results from 6 mice show that acute hyperglycemia causes prolongation of the APD. Effects of adrenergic stimulation during acute hyperglycemia were partially blunted compared with non-hyperglycemic state, i.e. hyperglycemia minimized the decrease in APD that was produced by adrenergic stimulation. Similar, but less consistent (across animals) effects were seen in other electrophysiological parameters such as alternans threshold. These results show that acute hyperglycemia may itself alter cellular level electrophysiology of myocytes and importantly, modify adrenergic response. These results suggest that in addition to long term re-modeling that occurs in diabetes, acute changes in glucose levels also affect electrical function and further may contribute to systemically observed changes in diabetes by blunting adrenergic response. Therefore, further investigation into the electrophysiological effects of acute changes in glucose levels are warranted.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015<br>La maladie d’Alzheimer (MA) est la plus fréquente cause de démence mondialement et son incidence augmente en parallèle au vieillissement de la population. La pathogenèse de cette maladie neurodégénérative, actuellement sans traitement curatif, est associée à l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) dans le parenchyme et la vasculature du cerveau en réponse à l’élimination déficiente de ce peptide neurotoxique. Des évidences épidémiologiques et expérimentales soulignent le rôle crucial du système immunitaire inné dans la MA. Plus précisément, plusieurs études suggèrent que les phagocytes mononucléaires (microglies, monocytes et macrophages cérébraux) constituent des cellules pivots pour combattre l’accumulation d’Aβ. Les études incluses dans cette thèse de doctorat avaient comme objectif d’accroitre les connaissances concernant le rôle des phagocytes mononucléaires dans la pathologie du modèle murin APP/PS1 de la MA. Un nombre croissant d’études indique que les Toll-like receptors (TLRs) seraient critiques pour la clairance d’Aβ par les phagocytes mononucléaires. Nous avons donc étudié le rôle de la protéine adaptatrice myeloid differentiation factor 88 (MyD88), qui permet la transduction du signal intracellulaire de la plupart des TLRs. Nous avons observé une augmentation des niveaux d’Aβ solubles et une aggravation des déficits cognitifs dans les souris APP/PS1 avec une signalisation MyD88 défectueuse, vraisemblablement suite à une réduction de la phagocytose des phagocytes mononucléaires et une coordination défaillante de la réponse immunitaire innée. La stimulation des TLRs pourrait ainsi avoir un grand potentiel thérapeutique pour la MA. Nous avons démontré que des injections systémiques répétées du ligand TLR4 monophosphoryl lipid A (MPL) dans les souris APP/PS1 ont mené à une réduction significative des niveaux d’Aβ et une amélioration des fonctions cognitives. Le MPL induit une forte réponse phagocytique des phagocytes mononucléaires tout en générant une réaction inflammatoire modérée. Finalement, en utilisant la microscopie intravitale biphotonique, nous avons dévoilé que les monocytes patrouilleurs en état basal sont attirés et rampent sur la face luminale de veines contenant de l’Aβ, capturent l’Aβ et ont la capacité de regagner à nouveau la circulation sanguine. L’ablation sélective des monocytes patrouilleurs dans les souris APP/PS1 a induit une augmentation significative des niveaux d’Aβ dans le cortex et l’hippocampe. Ensemble, ces données démontrent que les phagocytes mononucléaires sains et fonctionnels peuvent promouvoir l’élimination d’Aβ et constituent une cible thérapeutique prometteuse pour la MA.<br>Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia worldwide and its incidence is rising in parallel with the aging population. The pathogenesis of this neurodegenerative disease, currently without curative treatment, is associated with the accumulation of amyloid-β (Aβ) in the brain parenchyma and cerebral vasculature in response to the impaired clearance of this neurotoxic peptide. Epidemiological and experimental evidence underline the crucial role of the innate immune system in AD. More precisely, several studies suggest that mononuclear phagocytes (microglia, monocytes and cerebral macrophages) constitute pivotal cells to fight the accumulation of Aβ. The studies enclosed in this doctoral thesis intended to better understand the role of mononuclear phagocytes on the pathology of the APP/PS1 mouse model of AD. Accumulating evidence indicates a critical role of Toll-like receptors (TLRs) in the clearance of Aβ by mononuclear phagocytes. We thus investigated the role of the myeloid differentiation factor 88 (MyD88), which is the adaptor protein for most of these innate immune receptors, transducing the intracellular signal from TLRs to the nucleus. We observed increased soluble levels of A oligomers and enhanced cognitive deficits in APP/PS1 mice with impaired MyD88 signalling, likely through reduced phagocytosis of mononuclear phagocytes and an impaired coordination of the innate immune response. Compounds that stimulate TLRs to clear Aβ may therefore have great therapeutic potential in AD patients. We demonstrated that repeated systemic injections of the TLR4 ligand monophosphoryl lipid A (MPL) in APP/PS1 mice led to a significant reduction in Aβ load and improved cognitive function. MPL induced a potent phagocytic response by mononuclear phagocytes while triggering a moderate inflammatory reaction. Finally, using live intravital two-photon microscopy, we discovered that patrolling monocytes in steady state are attracted and crawl onto the luminal walls of Aβ-positive veins, uptake Aβ and are able to circulate back into the bloodstream. Selective removal of patrolling monocytes in APP/PS1 mice induced a significant increase of Aβ load in the cortex and hippocampus. Overall, these studies demonstrate that healthy and functional mononuclear phagocytes can promote the elimination of Aβ and constitute a promising therapeutic target for AD.

Mills et al, 1988 ont proposé l'utilisation pour certaines tumeurs d'une nouvelle forme de thérapie par émission d'électrons Auger induite par stimulation Mössbauer, en utilisant la combinaison d'un vecteur afin de cibler la zone tumorale sensible (bléomycine (BLM)) et d'un émetteur Auger (le 57Fe). Notre travail a consisté à développer cette technique. Nous avons montré que seuls 7 isotopes Mössbauer peuvent être utilisés. L'étude chimique de la complexation du fer à la BLM a été effectuée puis une analyse par spectrométrie Mössbauer des complexes BLM-57Fe et BLM-57Fe ADN et déduit les vitesses spécifiques d'irradiation. Après avoir constaté l'absence d'efficacité (en terme de taux de survie) sur 2 types cellulaires (SW480 et E. Coli), nous avons développé un modèle plasmidique et modulé : le nombre de molécules BLM-57Fe, le facteur f, dose d'irradiation. Nous n'avons pas retrouvé d'efficacité additionnelle définit en terme de cassures double brins (CDB). Nous avons alors vérifié par modélisation Monté Carlo ( modèle BLM-57Fe-plasmide) que les électrons émis par cascade Auger du 57Fe sont efficaces. Nous avons confirmé expérimentalement l'efficacité (en terme d'induction de CDB) en utilisant le modèle plasmide-BLM-55Fe (émetteur radioactif). La stimulation Mössbauer n'est donc pas une technique appropriée en thérapie<br>Mills and al (1988) proposed to treat superficial tumours a new type of therapy using electrons Auger emission induced by Mössbauer effect. This technique is a combination of a vector to target cellular tumour DNA (here bleomycin (BLM)) and an Auger emitter ( a Mössbauer isotope:57Fe). In this work we define the place of this new therapy, and we show that only seven Mössbauer isotopes can be used. We study chemically the BLM-Fe complex. After, a Mössbauer spectroscopy analysis of the BLM-Fe and BLM-Fe-DNA complex is performed and found velocities to achieve the resonance effect. The survival rates studies on two cellular types (SW480 and E. Coli) found any efficacy. A plasmidic model is developed. We enhance: the number of BLM molecules (1012 and 1013), the non-recoil f-factor, the irradiation dose and we don't found any efficacy defined as double strands breaks (DSB). A Monte Carlo study using BLM-Fe complex with a peace of DNA plasmid is built. This model permitted to show a great efficacy in terms of DSB. Those results are confirmed by a model using BLM-55Fe (radioactive isotope) on PGEM4Z plasmid. It can be conclude that Mössbauer effect is not the appropriate technique in radiotherapy

Proliferating cells have unique metabolic requirements beyond those of quiescent cells. Specifically, blood forming hematopoietic stem cells, during periods of severe blood loss, switch from a quiescent glycolytic state to a state dependent on mitochondrial metabolism during differentiation and proliferation. This dissertation attempts to define some of the signaling details of this switch by using erythropoietin receptor signaling as a model. In cytokine-dependent Ba/F3 cell line expressing the receptor for erythropoietin (EpoR) (Ba/F3-EpoR), chemical inhibition of mitochondrial function by rotenone decreases in erythropoietin(Epo)-stimulated proliferation. This observation led to the examination of whether Epo could stimulate mitochondrial function. To further assess the role of mitochondria in cell proliferation and the metabolic functions of Epo, levels of oxidative phosphorylation markers and signaling molecules important for mitochondrial biogenesis were measured. Western blotting scans showed increased protein levels of cytochrome oxidase subunit IV (CoxIV) and Complex III core protein 2 following 24 hours of Epo treatment. Interestingly, inhibition of Janus Kinase 2 (Jak2), the tyrosine kinase associated with Epo receptor, by AG490 elicited a similar decrease in CoxIV to Epo withdrawal even in the presence of Epo. In addition, Epo increased the levels of the mitochondrial biogenesis regulator AMP-activated protein kinase α (AMPKα) in a Jak2-dependent manner within Ba/F3 cells. Both total and phosphorylated (activated) AMPKα were increased following Epo stimulation. Treatment with the AMPK inhibitor Compound C decreased Epo stimulation of CoxIV, suggesting a linear signaling cascade from Jak2 to mitochondrial biogenesis through AMPKα. Examining potential mechanisms, direct binding of AMPKα to (EpoR) and Jak2 were observed through immunoprecipitations of transfected lysates in a manner exclusive to AMPK regulator subunits β and γ. Furthermore AMPKα was found to be tyrosine phosphorylated in an Epo and Jak2 dependent manner. Taken together, data in this dissertation suggests a role for Epo in regulating mitochondrial biogenesis in cytokine dependent cells through a potential mechanism of forming a signaling complex between EpoR, Jak2, and AMPKα. This signaling complex may provide intersection between Epo's signaling in cell proliferation and metabolism through AMPKα.

Hypercholesterolemia is a risk factor for osteoporosis but the underlying mechanism is unknown. Previous evidence suggests that osteoporosis results from an impaired regulation of osteoblasts by fluid pressure fluctuations in the bone matrix. Recently, our laboratory showed that enhanced cholesterol in the cell membrane, due to hypercholesterolemia, alters leukocyte mechanosensitivity. We predict a similar link between osteoblasts and hypercholesterolemia leading to osteoporosis. Specifically, we hypothesize that extracellular cholesterol modifies the osteoblast sensitivity to pressure. MC3T3-E1 cells were exposed to hydrodynamic pressures regimes (mean=40mmHg, amplitude=0-20mmHg, frequency=1Hz) for 1-12 hours. To assess the impact of membrane cholesterol enrichment, cells were pre-treated with 0-50 µg/mL cyclodextran:cholesterol conjugates. We assessed the pressure effects on mitosis and F-actin stress fiber formation (SFF) of cells. Exposure of cells to 50/30 mmHg pressure transiently increased the number of cells in the S- and G2M-phases of mitosis after 6 and 12 hours, respectively. Relative to controls, osteoblast-like cells exposed to all pressures exhibited significantly (p

The objective of this study was to investigate the effects of electrical stimulation on the cellular chemistry and proliferation of C2C12 muscle cell line. The cells were cultured under the condition of AC electrical stimulation using interdigitated electrode arrays. This research was conducted by applying electrical signals for up to 24 hours to C2C12 muscle cells. After 24 hours, the electrical impedance, cell morphology, proliferation and viability were recorded. The results demonstrated that electrical stimulation have a positive impact on the cell growth of C2C12. These results obtained would aid in future study on improving the techniques of culturing C2C12 muscle cells and also in the field of electrical conductivity in cell proliferation. Lastly, the results obtained also would provide essential information to the studies related to gene and protein expression of cellular and subcellular components after being exposed to electrical stimulation.

Topical antigen (Ag) application mimics natural Ag exposure across the skin. Soluble Ag introduced through this route requires cross-presentation by dendritic cells (DCs) to generate CD8 T cell responses, including skin-homing T cells. DCs process Ag for display to other immune cells, and stimulate T cells to release cytokines or directly lyse infected cells. Some T cells are further stimulated to express homing markers allowing them to enter non-lymphoid tissue such as the skin or the gut.