Дисертації з теми "Connexome"

Dans ce travail, nous nous intéressons à une topologie pour les réseaux de capteurs sans fil. Un réseau de capteurs sans fil peut être modélisé comme un graphe non orienté G = (V,E). Chaque sommet de V représente un capteur et une arête e = {u, v} dans E indique une transmission directe possible entre deux capteurs u et v. Contrairement aux dispositifs filaires, les capteurs sans fil ne sont pas a priori agencé en réseau. Une topologie doit être créée en sélectionnant des noeuds "dominants" qui vont gérer les transmissions. Les architectures qui ont été examinées dans la littérature reposent essentiellement sur les ensembles dominants connexes et les ensembles dominants faiblement connexes. Cette étude est consacrée aux ensembles indépendants faiblement connexes. Un indépendant S ⊂ V est dit faiblement connexe si le graphe GS = (V, [S, V \S]) est connexe, où [S, V \S] est l’ensemble des arêtes e = {u, v} de E avec u ∈ S et v ∈ V \S. Une topologie basée sur les ensembles faiblement connexes permet de partitionner l’ensemble des capteurs en trois groupes, les esclaves, les maîtres et les intermédiaires. Les premiers effectuent les mesures, les seconds rassemblent les données collectées et les troisièmes assurent les communications inter-groupes. Nous donnons d’abord quelques propriétés de cette structure combinatoire lorsque le graphe non orienté G est connexe. Puis nous proposons des résultats de complexité pour le problème de la recherche de l’indépendant faiblement connexe de cardinalité minimale (MWCISP). Nous décrivons également un algorithme d’énumération exact de complexité O∗(1.4655|V |) pour le MWCISP. Des tests numériques de cette procédure exacte sont présentés. Nous formulons ensuite le MWCISP comme un programme linéaire en nombres entiers. Le polytope associé aux solutions de ce problème est complètement caractérisé lorsque G est un cycle impair. Nous étudions des opérations de composition de graphes et leurs conséquences polyédrales. Nous introduisons des inégalités valides notamment les contraintes dites de multibord. Par la suite, nous développons un algorithme de coupes et branchement sous CPLEX pour résoudre ce problème en utilisant des heuristiques pour la séparation de nos familles de contraintes. Des résultats expérimentaux de ce programme sont exposés<br>In this work, we focus on a topology for Wireless Sensor Networks (WSN). A wireless sensor network can be modeled as an undirected graph G = (V,E). Each vertex of V represents a sensor and an edge e = {u, v} in E implies a direct transmission between the two sensors u and v. Unlike wired devices, wireless sensors are not a priori arranged in a network. Topology should be made by selecting some sensor as dominators nodes who manage transmissions. Architectures that have been studied in the literature are mainly based on connected dominating sets and weakly connected dominating sets.This study is devoted to weakly connected independent sets. An independent set S ⊂ V is said Weakly Connected if the graph GS = (V, [S, V \S]) is connected, where [S, V \S] is the set of edges with exactly one end in S. A sensor network topology based on weakly connected sets is partition into three groups, slaves, masters and bridges. The first performs the measurements, the second gathers the collected data and the later provides the inter-group communications. We first give some properties of this combinatorial structure when the undirected graph G is connected. Then we provide complexity results for the problem of finding the minimum weakly connected independent set problem (MWCISP). We also describe an exact enumeration algorithm of complexity O∗(1.4655|V |) (for the (MWCISP)). Numerical tests of this exact procedure are also presented. We then present an integer programming formulation for the minimum weakly connected independent set problem and discuss its associated polytope. Some classical graph operations are also used for defining new polyhedra from pieces. We give valid inequalities and describe heuristical separation algorithms for them. Finally, we develop a branch-and-cut algorithm and test it on two classes of graphs

Les protéines membranaires (PMs) sont les composants fonctionnels principaux des membranes biologiques. Les processus cellulaires fondamentaux sont régulés à l’aide des PMs. Malgré leur importance et leur intérêt scientifique et pharmaceutique, les structures des PMs ne représentent qu’une partie mineure des structures 3D répertoriées. Les PMs humaines sont des cibles particulièrement intéressantes mais parmi plus de 7000 PMs humaines, seules 30 structures ont été élucidées.Les raisons principales qui rendent les PMs très difficiles à étudier sont leur faible abondance et leur nature hydrophobe. En effet, le niveau d’expression des PMs dans leur environnement naturel est habituellement faible et la surexpression hétérologue aboutit souvent à une protéine inactive.Les connexines font partie de la famille des PMs intégrales de vertébrés. Elles sont largement exprimées dans tout le corps et sont impliquées dans les processus essentiels à un fonctionnement physiologique normal. En s’oligomérisant elles établissent des canaux intercellulaires qui forment des jonctions lacunaires. La communication des jonctions lacunaires joue un rôle essentiel dans la fonction des tissus et le développement des organes. Ainsi, les mutations génétiques des connexines provoquent des désordres héréditaires. Les connaissances actuelles portent principalement sur la physiologie des connexines et la perméabilité des pores. Difficiles à produire pure, homogène et en quantité suffisante pour la cristallisation, l’unique structure de résolution atomique de jonction lacunaire est un polymère de la connexine 26. La connexine 43 (Cx43), protéine de jonction lacunaire la mieux étudiée, est exprimée dans tout le corps humain. Les études structurales de microscopie électronique ont montré que le domaine cytoplasmique C-terminal de Cx43 (Cx43CT) est flexible et diminue la qualité de diffraction des cristaux 2D. La troncation de la majorité de Cx43CT améliore la résolution des segments transmembranaires de Cx43. Tronqué au niveau du résidu 263, le mutant Cx43-263T est néanmoins capable de former des cristaux 2D et de s’assembler en jonctions lacunaires. L’œuvre présenté est consacré à l’étude de Cx43, Cx43-263T et Cx43CT.L’optimisation des codons du gène de la connexine et la minimisation de la stabilité de la structure secondaire d’ARNm ont considérablement augmenté l’expression de Cx43 et Cx43-263T. De nouvelles procédures de purification de Cx43-263T et Cx43 ont été élaborées. La protéine purifiée a été reconstituée en polymère amphiphile amphipol A8-35 et caractérisée par des approches de SEC, DLS et SAXS. Des techniques indépendantes ont montré l’auto-assemblage de Cx43-263T fonctionnelle en hexamères.Cx43 homogène a été surexprimée dans E. coli, purifiée et caractérisée par SEC, DLS, DSC et SAXS. L’oligomérisation a été mesurée en fonction de la concentration.Cx43-263T et Cx43 fusionnées à la protéine Mistic ont été surexprimées dans E. coli. La séparation de Mistic de la connexin a été testée avec différentes protéases, jonctions, conditions de clivage et soit in vivo soit in vitro. Toutes les constructions ainsi générées ont démontré une haute résistance aux protéolyses spécifiques. Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane protein constructs) est une séquence de protéine de B. subtilis, qui permet l'adressage des PMs intégrales dans la membrane. Mistic a été surexprimée chez E. coli et la protéine homogène a été purifiée avec divers détergents. Alors que la structure tertiaire de Mistic, solubilisée avec de l'oxyde de lauryldimethylamine, est déjà déterminée, la structure native de Mistic dans un milieu lipidique, qui permettrait de comprendre sa fonction, n’est pas encore disponible. Dans le travail présenté ici, Mistic a été reconstituée dans des lipides différents et utilisée pour des essais initiaux de cristallisation in meso. Mistic a de plus été utilisée pour la production d’anticorps anti-Mistic<br>Membrane proteins (MPs) are major functional components of biological membranes. Keycellular processes are regulated with the help of MPs. Despite high importance and greatscientific and pharmaceutical interest, structures of MPs represent only a tiny fraction of all3D structures in Protein Data Bank. Human MPs are particularly challenging targets. Out ofmore than 7000 human MPs, structures of only about 30 were elucidated.The main reasons which make MPs so difficult to study are their low natural abundance andhydrophobic nature. Expression level of MPs in their natural sources is usually rather low.Heterologous overexpression often leads to inactive protein.Connexins comprise a family of vertebrate integral MPs that are widely expressed throughoutbody and involved in a wide variety of processes essential for normal physiological function.They are able to oligomerize and form intercellular channels which compose gap junctions.Gap junctional communication plays crucial role in normal tissue function and organdevelopment. Connexin gene mutations cause a number of inherited disorders.By now a wealth of knowledge is available about physiology of connexins and their channelpore permeability. However, atomic resolution structure of gap junction channel formed byonly one connexin family member (connexin 26) was determined. This is mostly explained bydifficulty to produce sufficient for crystallization amount of pure and homogenous protein.Connexin 43 (Cx43) is the best-studied gap junction protein, and it is widely expressedthroughout the human body. Initial structural studies by electron microscopy have shown thatflexible C-terminal cytoplasmic domain of Cx43 (Cx43CT) worsens diffraction quality of 2Dcrystals. Removal of most of the Cx43CT improved resolution of transmembrane segments ofCx43. Truncated at residue 263 mutant of Cx43 (Cx43-263T) still was able to form2D crystals and assembled into gap junctions. Thus, the present work is dedicated to the studyof three forms of Cx43, namely Cx43-263T, Cx43CT, and full-length Cx43.Performed in our work connexin gene optimization for E.coli codon bias and minimization ofstability of mRNA secondary structure significantly enhanced expression of Cx43 and Cx43-263T. Procedures for Cx43-263T and Cx43 purification were developed. The purified proteinwas reconstituted into amphipathic polymer amphipol A8-35 and characterized by SEC, DLS,and SAXS. Applied independent techniques showed self-assembling of purified Cx43-263Tinto hexamers demonstrating its functionality.Cx43CT was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity. The protein wascharacterized by SEC, DLS, TSA, and SAXS. The concentration-dependent oligomerizationwas established.In the beginning of our project Cx43-263T and Cx43 were overexpressed in E. coli usingMistic fusion protein. A number of constructs providing various linkers and proteaserecognition sites were generated. To remove Mistic from the produced proteins in vivo and invitro cleavage were tested. All generated constructs demonstrated high resistance to specificproteolysis in wide range of conditions.Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane proteinconstructs) from B. subtilis was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity usingdifferent detergents. While the tertiary structure of solubilized in lauryldimethylamine oxideMistic was determined earlier, the native structure of Mistic in lipid environment elucidatingits function is not available yet. In the present work Mistic was reconstituted into differentlipids and used for initial in meso crystallization trials. Additionally, Mistic was used forproduction of anti-Mistic antibodies

Les douleurs neuropathiques, caractérisées par une prévalence élevée, résultent de la compression ou lésion de nerfs. Les antidépresseurs figurent parmi les traitements de première intention de cette pathologie, toutefois des besoins médicaux restent insatisfaits par ces molécules. Mon travail de thèse s'est intéressé à la connexine 43 (Cx43) astrocytaire impliquée dans le mécanisme d'action des antidépresseurs ainsi que dans les douleurs neuropathiques. La première partie des travaux, réalisée avec des cultures d'astrocytes corticaux de souris, a permis de préciser le lien entre les antidépresseurs et la Cx43 astrocytaire. Alors que son expression s'est avérée inchangée dans notre modèle, un effet hétérogène des antidépresseurs a été observé sur le couplage intercellulaire des astrocytes. L'ensemble des molécules testées a conduit à l'inhibition de l'ouverture des hémicanaux de Cx43 étudiée dans un contexte inflammatoire, notre étude est la première à rapporter cet effet. De plus, les antidépresseurs prescrits dans les douleurs neuropathiques ont induit l'inhibition du couplage et/ou des hémicanaux. La seconde partie de mes travaux a porté sur la combinaison entre l'amitriptyline et la méfloquine. Ceci repose sur les approches combinatoires proposées par Theranexus, start-up avec qui la thèse a été réalisée. Les deux molécules ont présenté une synergie d'effet sur la réduction du couplage astrocytaire in vitro corrélée a une potentialisation de l'action anti-hyperalgésique de l'amitriptyline in vivo, chez le rat lésé au niveau du nerf sciatique. Ces résultats valident l'implication de la Cx43 astrocytaire dans la réponse antinociceptive des antidépresseurs<br>Neuropathic pain, characterised by a marked prevalence, is the consequence of nerve compression or lesion. Antidepressants represent the main treatments of this disease, however, medical needs remain mostly unsatisfied by these molecules. In order to improve this therapeutical approach, my thesis work has focussed on astroglial connexin 43 (Cx43) that has recently been involved in the mechanism of action of antidepressant as well as in neuropathic pain. The first part of my work, performed in primary cultures of mouse cortical astrocytes, has allowed to reinforce the link between antidepressants and Cx43 in astrocytes. Whereas its expression was unchanged in our model, an heterogeneous effect of antidepressants was observed on the intercellular communication of astrocytes. Furthermore, all tested molecules led to the inhibition of Cx43 hemichannel activity in an inflammatory context, our study is the first to report such effect. Interestingly, antidepressants prescribed in neuropathic pain induced inhibition of coupling and/or hemichannels. The second part of my work concerned the combination between amitriptyline and mefloquine. This is based on combinatorial approaches proposed by Theranexus, a start-up partner in this project. The association of the two molecules presented a synergy on astroglial coupling reduction in vitro correlated to a potentiation of the anti-hyperalgesic effect of amitriptyline in vivo, in rats with injured sciatic nerve. These results confirm the implication of the astroglial Cx43 in the antinociceptive response to antidepressants

La communication intercellulaire par jonction gap est impliquée dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaire. La connexine (Cx) 33, un membre de la famille multigénique des protéines des jonctions gap, exerce un effet inhibiteur sur la communication intercellulaire. Dans la première partie de ce mémoire, nous avons étudié les caractéristiques de cette Cx33, les mécanismes moléculaires impliqués dans l'inhibition de la communication jonctionnelle par gap ainsi que son rôle physiologique. Notre étude montre que la Cx33 ne présente pas d'isoformes phosphorylées, à la différence des autres Cxs, excepté la Cx26. Elle est majoritairement exprimée dans le testicule, faiblement dans le cerveau mais est indétectable dans tous les autres tissus étudiés (cœur, cerveau, foie, utérus, ovaire). De plus, nous avons montré l'existence d'une interaction de la Cx33 spécifiquement avec la Cx43, et plus particulièrement avec la forme phosphorylée P1 de cette Cx dans le testicule. Dans les cellules relevantes transfectées avec la Cx33, l'association spécifique Cx33/Cx43 est séquestrée dans un compartiment cytoplasmique correspondant aux endosomes précoces. Par contre, dans les cellules sauvages (en absence de Cx33), la Cx43 est localisée comme attendu, à la membrane plasmique. La séquestration du complexe Cx33/Cx43 dans les endosomes précoces est associée à une inhibition complète du couplage jonctionnel entre cellules adjacentes mesuré par dye coupling. Les Cxs, et en particulier la Cx43, sont essentielles à la spermatogenèse. La cellule de Sertoli, en véritable chef d'orchestre, contrôle localement la prolifération et la différenciation des cellules germinales. Au cours du développement testiculaire, nous avons montré que l'expression de la Cx33 augmente pour atteindre son niveau maximal à la maturité. Par contre, l'expression de la Cx43 reste stable de la période fœtale à l'age adulte. Dans le testicule de rat adulte, la Cx33 est présente à la base du tube séminifère où elle colocalise avec la Cx43. La Cx33 est régulée au cours des stades de la spermatogenèse et présente un pic d'intensité de son expression aux stades IX-X alors que la Cx43 est faiblement exprimée à ces stades. Nous avons montré que la phagocytose (qui a lieu in vivo au stade VIII de la spermatogenèse et peut être stimulée in vitro par les LPS) induit, via la production d'IL-1a, la transcription de Cx33 alors qu'elle inhibe la transcription du gène de la Cx43, dans les cellules de Sertoli. Ces résultats montrent pour la première fois une régulation différentielle des Cx33 et Cx43. De plus, ils suggèrent un nouveau modèle mécanistique de contrôle de la prolifération cellulaire par les jonctions gap, où une Cx native, par un effet dominant négatif, peut inhiber la communication intercellulaire par jonction gap. Sur la base de ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel les cellules de Sertoli, via les jonctions gap Cx43, participeraient au contrôle inhibiteur de la prolifération des cellules germinales. La diminution de l'expression de la Cx43 couplée à l'expression de la Cx33 lèveraient ce frein sertolien et seraient à l'origine d'une nouvelle vague de prolifération des cellules germinales. Dans la deuxième partie de ce mémoire, nous avons analysé les effets de toxicants testiculaires connus sur la Cx43 et d'autres protéines spécifiques des jonctions serrées et d'adhésion dans une lignée de cellules de Sertoli. Nos résultats montrent que la Cx43, l'occludine, ZO-1 et la N-cadhérine sont des cibles précoces des toxicants testiculaires et que cette lignée cellulaire est un bon modèle d'étude in vitro afin d'évaluer des molécules aux effets anti-reproductifs.

Pour tenter d'élucider quelles sont les caractéristiques phénotypiques des cellules de glioblastome que contrôle la Cx43, nous avons inhibé son expression dans les cellules U251. Cette approche nous a permis de confirmer que la Cx43 est impliquée dans divers processus associés au développement des gliomes. En effet, si son absence favorise la croissance cellulaire, elle favorise l'angiogénèse tout en diminuant l'adhérence aux protéines matricielles, l'invasion en chambre de Boyden et l'invasion tissulaire ex vivo. Les capacités invasives des cellules de glioblastome étant responsables de la récurrence de ces tumeurs, nous avons tenté d'appréhender l'implication de la Cx43 dans ce phénomène. Tout d'abord, une analyse protéomique par spectrométrie de masse du sécrétome de cellules C6 de gliome de rat suggère que l'effet pro-migratoire induit par l'expression de la Cx43 est contrôlé, au moins en partie, par une composition différente du pool de protéines secrétées [les cytokines (MCP-1, TGF-β binding protein 1, galectine-1), les enzymes protéolytiques (MMP3, cathepsines B et L1), les composants de la matrice extracellulaire (fibronectine, SPARC et collagène α-1) qont notamment sursecrétés par les cellules C6 de gliome de rat exprimant la Cx43]. Par ailleurs, notre étude démontre l'importance des radeaux liquides dans le phénomène d'invasion cellulaire contrôlé par la Cx43. En effet, la désorganisation chimique de ces microdomaines conduit à une diminution drastique des capacités invasives associée à une inhibition des capacités de communication entre les cellules U251 et entre les cellules U251 et les astrocytes en culture primaire. En conclusion, nos résultats suggèrent que la Cx43 joue un rôle complexe voire contradictoire dans le contrôle du phénotype des cellules de glioblastome. En effet, alors que la Cx43 inhibe la prolifération, elle favorise l'invasion, phénomène nécessitant une correcte organisation des radeaux lipidiques<br>In order to elucidate what are the phenotypic characteristics controlled by Cx43 in glioblastoma cells, we inhibited its expression, by using the shRNA strategy, in human glioblastoma U251 cells. This approach confirmed that Cx43 is involved in various processes associated to glioma development. Indeed, if its sbsence favors cell proliferation under some conditions (growth in soft agar), it increase angiogenesis while decreasing the adhesion to extracellular matrix proteins, the invasion capacity in Boyden chamber and ex vivo tissue invasion. Moreover, since the invasive capacities of glioblastoma cells are responsible for the tumor recurrence, we were interested to see how Cx43 regulates such capacities. First, a proteomic analysis by mass spectrometry of the secretome of rat glioma cells permitted to consider that such a capacity which is induced by the expression of Cx43 is at least partly mediated by a different pool of secreted proteins [citokines (MCP-1, TGF-β binding protein 1, galectin-1), proteases (MMP3, cathepsins B and L1) and extracellular matrix compounds (fibronectin, SPARC, collagen- α-1) are notably oversecreted by rat C6 glioma cells expressing Cx43]. Second, our study demonstrates that lipid rafts are involved in the invasion process controlled by Cx43. Indeed, the chemically-induced disorganization of these membrane microdomains leads to a drastic decrease of the invasive capacities of U251 cells associated with the inhibition of communication capacities between themselves (homocellular communication) or between them and the astrocytes in primary cultures (heterocellular communication). In conclusion, our results suggest that Cx43 play a complex and even contradictory role in the control of the phenotype of glioblastoma cells. Indeed, while Cx43 inhibits the proliferation of U251 cells, it favors their invasive capacities in association with the presence of lipid rafts

Un graphe g est dit 2-arete-connexe si entre chaque paire de sommets de g, il existe au moins deux chaines arete-disjointes. Si les aretes sont munies d'un systeme de poids, et si s est un ensemble de sommets distingues de g, le probleme du sous-graphe steiner 2-arete-connexe de g est de determiner un sous-graphe 2-arete-connexe contenant s, de poids minimum. Ce probleme a des applications dans les domaines des telecommunications et de transport. Dans cette these nous etudions une approche polyedrale pour ce probleme. Dans une premiere partie, nous etudions le polyedre associe a ce probleme. Nous donnons une description lineaire complete de ce polyedre quand le graphe est serie-parallele. Nous discutons par la suite de certains polyedres lies au polytope des sous-graphes steiner 2-arete-connexes. Nous examinons tout particulierement le polytope du voyageur de commerce steiner et nous en donnons une description lineaire complete dans la classe des graphes serie-paralleles. Dans la deuxieme partie, nous etudions une methode de coupes pour le probleme du sous-graphe 2-arete-connexe (ou tous les sommets de s ont le meme comportement). Dans un premier temps nous etudions la famille de contraintes dites de partition. En utilisant un algorithme recent de queyranne pour determiner le minimum d'une fonction sous-modulaire symetrique, nous montrons que le probleme de separation associe a ces contraintes peut etre resolu en temps polynomial. Ces contraintes sont utilisees par la suite dans un algorithme de coupes et branchement pour resoudre certaines instances du probleme du sous-graphe 2-arete-connexe. La meme approche est aussi utilisee pour resoudre des instances du probleme du voyageur de commerce. Les resultats experimentaux montrent que les contraintes de partition sont tres efficaces pour resoudre ces problemes

Depuis plusieurs décennies, la communication intercellulaire par jonctions gap (CIJG) est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse. Cette implication semble complexe par le fait que les connexines pourraient augmenter la capacité d’invasion des cellules cancéreuses tout en diminuant leur prolifération. Ceci était particulièrement observé pour la connexine 43 (Cx43) dans le cas de cellules de gliomes. Or, les propriétés d’invasion des gliomes de haut grade, les glioblastomes multiformes (GBM), les rendent difficiles à supprimer par résection chirurgicale et favorisent leur récidive. Afin de préciser le rôle de la Cx43 dans le contrôle des capacités invasives de cellules de GBM, nous avons utilisé une lignée de cellules de glioblastome humaine U251 exprimant par shRNA des niveaux, en ARNm et protéiques, de Cx43 réduits. Ces clones shRNA des cellules U251 montrent une corrélation entre le niveau d’expression de la Cx43 et le processus d’invasion. Au cours de ce travail, nous avons montré, pour la première fois, que la Cx43 est localisée dans les structures protéolytiques permettant l’invasion, les invadopodes. Nous avons démontré aussi que, par sa localisation, la Cx43 favorise la formation des invadopodes en agissant comme une protéine d’échafaudage qui permet l’interaction de Src de la Cortactine. De plus, l’activité hémicanal de la Cx43, probablement inhibée par le Bisphénol A, possède des effets négatifs sur la cinétique de développement des invadopodes. Une étude du protéome et du sécrétome des cellules U251 et des clones shRNA a permis l’identification des protéines impliquées dans l’invasion et la formation et fonction des invadopodes. En conclusion, la Cx43 participe au processus invasif des cellules de GBM en favorisant la formation et la fonction des invadopodes. Cette nouvelle fonction de la Cx43 semble être la conséquence de ses propriétés de protéines d’échafaudage et hémicanal, et non de son rôle principalement décrit dans la CIJG<br>Since several decades, the gap junction intercellular communication (GJIC) is known to be involved in carcinogenesis. This involvement seems complicated by the fact that connexins could increase cancer cells invasion ability while decreasing their proliferation. This was especially observed for connexin 43 (Cx43) in the case of glioma cells. But high-grade gliomas, glioblastoma multiform (GBM) has invasion properties that make it difficult to remove surgically and promote their recurrence. To clarify the Cx43 role in the control of GBM cells invasive capacities, we used the GBM U251 cell line expressing Cx43 levels, mRNA and protein, reduced by shRNA strategy. Through this approach, we confirmed that Cx43 expression level is associated with the invasive capacity of GBM cells. Furthermore we have shown, for the first time, that Cx43 is localized in invasive proteolytic structures, the invadopodia. We also show that, by its location, Cx43 promotes invadopodia formation by acting as a scaffolding protein that allows Src and Cortactin interaction. Moreover, Cx43 hemichannel activity, probably inhibited by Bisphenol A, has negative effects on invadopodia kinetics development. A proteome and secretome study of U251 cells and shRNA clones allowed the identification of proteins involved in invasion and invadopodia formation and function.In conclusion, Cx43 participates in the invasive process of GBM cells by promoting invadopodia formation and function. This new function of Cx43 seems to be the result of its scaffold proteins and hemichannel properties, but not its role described mainly in CIJG

L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques.<br>The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.

L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques.<br>L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques.<br>The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.<br>The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.

Les jonctions communicantes sont des structures membranaires constituées de canaux intercellulaires, permettant le transfert direct de molécules informatives entre cellules adjacentes. La principale connexine (Cx) du tissu osseux, la Cx43 (protéine constitutive des canaux intercellulaires) joue un rôle crucial dans le développement du squelette. Ainsi, les objectifs de ma thèse ont été de comprendre l'implication de la Cx43 dans la physiopathologie osseuse. La première partie de ces travaux a démontré que la Cx43 et la communication intercellulaire sont essentielles pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en ostéoblastes matures. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés au rôle de la Cx43 dans le développement des sarcomes d'Ewing. Cette tumeur osseuse primitive est caractérisée par la présence d'un facteur de transcription aberrant, EWS-FLI1, aux propriétés oncogéniques. Nos résultats ont mis en évidence que la perte d'expression de la Cx43 dans les sarcomes d'Ewing joue un rôle essentiel dans le développement de la tumeur primitive, de par la capacité de la Cx43 à inhiber la prolifération tumorale et l'ostéolyse associée. Ce travail de thèse apporte une meilleure compréhension du rôle de la Cx43 dans la physiologie et la pathologie osseuse. Le rôle clé de la Cx43 dans le développement du phénotype tumorigénique des sarcomes d'Ewing fait de cette protéine une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de ce cancer<br>Gap junctions are specialized plasma membrane structures composed of intercellular channels which allow the direct transfer of informative molecules between adjacent cells. The major connexin (Cx) of bone tissue, Cx43 (a constitutive protein of intercellular channels) plays a crucial role in skeletal development. Thus, the aim of my thesis was to better understand the involvement of Cx43 in the physiopathology of bone. The first part of this work shows that Cx43 expression and intercellular communication are essential for the differentiation of human mesenchymal stem cells into mature osteoblasts. In the second part of this thesis, we studied the role of Cx43 in the development of Ewing’s sarcoma. This primary bone tumor is characterized by the presence of an aberrant transcription factor, EWS-FLI1, with oncogenic properties. Our results show that Cx43 plays an essential role in primary tumor development, and loss of Cx43 expression in Ewing's sarcoma leads to a stimulation of tumor growth and associated bone osteolysis. This thesis provides a better understanding of the role of Cx43 in bone physiology and pathology. The key role of Cx43 in the development of the tumorigenic phenotype of Ewing's sarcoma permits to consider this protein as a new therapeutic target in cancer therapy

La conduction cardiaque dépend de trois acteurs majeurs : le tissu cardiaque composé des cardiomyocytes, fibroblastes et de la matrice extracellulaire, l’excitabilité par le canal Na+ voltage-dépendant NaV1.5 et le couplage intercellulaire par la connexine 43 (Cx43). Les troubles progressifs de la conduction cardiaque (PCCD) sont une pathologie à évolution lente qui induit une altération de la conduction cardiaque associée à de la fibrose. Des mutations perte de fonction du gène SCN5A, codant pour le canal NaV1.5, ont été associées aux PCCD. L’objectif de ma thèse a été de comprendre, par l’utilisation d’un modèle murin de PCCD (souris hétérozygote pour le gène Scn5a ; Scn5a+/-), les mécanismes moléculaires impliquées dans le remodelage fibrotique. Par l’administration chronique d’un inhibiteur des récepteurs au TGF-β (GW788388), nous avons démontré que la voie canonique du TGF- β est impliquée dans le remodelage fibrotique associé aux PCCD. Nous avons observé un remodelage de l’expression et de la localisation de la Cx43 corrélé avec l’apparition de fibrose. Nous avons démontré que l’activation de l’expression et de phosphorylation de la Cx43 par le Gap-134 permet de prévenir la fibrose ventriculaire. Enfin, un variant MMP-2 p.Gly551Arg pour la métalloprotéinase matricielle MMP-2, a été récemment trouvée chez une famille atteinte de PCCD. Nous avons étudié l’impact du variant MMP-2 p.Gly551Arg sur la fonction et l’expression de la protéine MMP-2 chez les individus de cette famille<br>Three major actors contribute to conduction of the cardiac electrical impulse: the heart tissue constituted by cardiomyocytes, fibroblasts, and extracellular matrix, excitability by the voltage-gated Na+ channel NaV1.5 and cell-cell coupling by connexin43 (Cx43). Progressive Cardiac Conduction Defect (PCCD) is a slowly evolving lifespan disease that progressively affects cardiac conduction associated with fibrosis. Genetic forms of PCCD have been linked to loss-of-function mutations of SCN5A gene product, NaV1.5. The aim of my thesis is to understand, by using a mouse PCCD model (Scn5a heterozygous knockout mice; Scn5a+/-), the molecular mechanisms implicated in cardiac fibrosis. First, we demonstrated that TGF-β canonical pathway activation is implicated in fibrosis occurrence by pharmacology chronic inhibition of TGF-β receptors (GW788388). Second, we observed Cx43 expression and localization remodeling correlated with fibrosis development. Then, we demonstrated that activation of expression and phosphorylation of Cx43, by Gap- 134, prevents ventricular fibrosis. Finally, the MMP-2 p.Gly551Arg variant to the matrix metalloproteinase 2 MMP-2, was recently discovered in a PCCD family. We studied the impact of the MMP-2 p.Gly551Arg variant in function and expression of MMP-2 protein in this family

Les astrocytes périsynaptiques participent activement, au côté des neurones, dans le traitement de l’information cérébrale. Une propriété essentielle des astrocytes est d’exprimer un niveau élevé de protéines appelées connexines (Cxs), et formant les sous-unités des jonctions communicantes. Étonnamment, bien qu’il ait été suggéré très tôt que la Cx30 astrocytaire soit impliquée dans des processus cognitifs, son rôle exact dans la neurophysiologie demeure cependant encore mal connu. Nous avons récemment révélé que la Cx30, via une fonction non-canal inédite, contrôle la force et la plasticité de la transmission synaptique glutamatergique de l’hippocampe en régulant les niveaux synaptiques de glutamate par le biais du transport astrocytaire du glutamate. Cependant, les mécanismes moléculaire et cellulaire impliqués dans ce contrôle, ainsi que sa régulation dynamique par l’activité neuronale et son impact in vivo dans un contexte physiologique restaient inconnus. Dans le cadre de cette problématique, j’ai démontré durant ma thèse que: 1) La Cx30 induit la maturation morphologique des astrocytes de l’hippocampe par l’intermédiaire de la modulation d’une voie de signalisation dépendante de la laminine et régulant la polarisation cellulaire ; 2) l’expression de la Cx30, sa localisation perisynaptique, ainsi que ses fonctions sont modulées par l’activité neuronale ; 3) Le contrôle de la couverture astrocytaire des synapses du noyau supraoptique de l’hypothalamus par la Cx30 fixe les niveaux plasmatiques de base de la neurohormone ocytocine et ainsi favorise la mise en place de comportements sociaux adaptés. Dans l’ensemble, ces résultats éclairent les régulations des Cxs astrocytaires par l’activité neuronale et leur rôle dans le développement postnatal des réseaux neurogliaux, ainsi que dans le contrôle des interactions structurelles astrocytes-synapses à l’origine de processus comportementaux<br>Perisynaptic astrocytes are active partners of neurons in cerebral information processing. A key property of astrocytes is to express high levels of the gap junction forming proteins, the connexins (Cxs). Strikingly, astroglial Cx30 was suggested early on to be involved in cognitive processes; however, its specific role in neurophysiology has yet been unexplored. We recently reveal that Cx30, through an unconventional non-channel function, controls hippocampal glutamatergic synaptic strength and plasticity by directly setting synaptic glutamate levels through astroglial glutamate clearance. Yet the cellular and molecular mechanisms involved in such control, its dynamic regulation by activity and its impact in vivo in a physiological context were unknown. To answer these questions, I demonstrated during my PhD that: 1) Cx30 drives the morphological maturation of hippocampal astrocytes via the modulation of a laminin signaling pathway regulating cell polarization; 2) Cx30 expression, perisynaptic localization and functions are modulated by neuronal activity; 3) Cx30-mediated control of astrocyte synapse coverage in the supraoptic nucleus of the hypothalamus sets basal plasmatic level of the neurohormone oxytocin and hence promotes appropriate oxytocin-based social abilities. Taken together, these data shed new light on astroglial Cxs activity-dependent regulations and roles in the postnatal development of neuroglial networks, as well as in astrocyte-synapse structural interactions mediating behavioral processes

On démontre un résultat dual du théorème de représentabilité de E. H. Brown et l'on décrit quelques applications. La première partie du mémoire contient une caractérisation des foncteurs homotopique covariants représentables par un espace pointé connexe ; on en donne comme application immédiate la construction plus de D. Quillen. La seconde partie décrit une démonstration d'un théorème de J. Lannes qui s'inspire de la technique de la première partie. La troisième partie de ce mémoire en est le coeur : c'est la reproducton d'un article rédigé en collaboration avec P. Goerss et J. Lannes sur la représentabilité de l'homologie modulo P.

L'homologie instanton-symplectique est un invariant associé à une variété de dimension trois close orientée, qui a été dé?ni par Manolescu et Woodward, et qui correspond conjecturalement à une version symplectique d'une homologie des instantons de Floer. Dans cette thèse nous étudions le comportement de cet invariant sous l'effet d'une somme connexe, d'une chirurgie de Dehn, et d'un cobordisme de dimension quatre. Nous établissons une formule de Künneth pour la somme connexe : si Y et Y' désignent deux variétés closes orientées de dimension trois, l'homologie instanton-symplectique associée à leur somme connexe est isomorphe à la somme directe du produit tensoriel de leurs groupes d'homologie instantonsymplectique respectifs, et de leur produit de torsion (après décalage des degrés). Nous définissons des versions tordues de cette homologie, et prouvons un analogue de la suite exacte de Floer, reliant les groupes associés à une triade de chirurgie. Cette suite exacte nous permet de calculer le rang des groupes associés à des familles de variétés, notamment les revêtements doubles ramifiés d'entrelacs quasi-alternés, des chirurgies entières de grande pente le long de certains noeuds, ainsi que certaines variétés obtenues par plombage de fibrés en disques au-dessus de sphères. Nous définissons enfin des invariants pour des cobordismes de dimension 4 prenant la forme d'applications entre groupes d'homologie instantonsymplectique des bords, et prouvons que deux des morphismes intervenant dans la suite exacte de chirurgie s'interprètent comme de telles applications, associées aux cobordismes d'attachement d'anses. Nous donnons également un critère d'annulation pour de telles applications associées à des éclatements<br>Symplectic instanton homology is an invariant for closed oriented three-manifolds, defined by Manolescu and Woodward, which conjecturally corresponds to a symplectic version of a variant of Floer's instanton homology. In this thesis we study the behaviour of this invariant under connected sum, Dehn surgery, and four-dimensional cobordisms. We prove a Künneth-type formula for the connected sum: let Y and Y' be two closed oriented three-manifolds, we show that the symplectic instanton homology of their connected sum is isomorphic to the direct sum of the tensor product of their symplectic instanton homology, and a shift of their torsion product. We define twisted versions of this homology, and then prove an analog of the Floer exact sequence, relating the invariants of a Dehn surgery triad. We use this exact sequence to compute the rank of the groups associated to branched double covers of quasi-alternating links, some plumbings of disc bundles over spheres, and some integral Dehn surgeries along certain knots. We then define invariants for four dimensional cobordisms as maps between the symplectic instanton homology of the two boundaries. We show that among the three morphisms in the surgery exact sequence, two are such maps, associated to the handle-attachment cobordisms. We also give a vanishing criteria for such maps associated to blow-ups

Dans cette thèse, on s'intéresse au groupe de Brauer non ramifié des espaces homogènes à stabilisateur non connexe et à ses applications arithmétiques. On développe notamment différentes formules de nature algébrique et/ou arithmétique permettant de calculer explicitement, tant sur un corps fini que sur un corps de caractéristique 0, la partie algébrique du groupe de Brauer non ramifié d'un espace homogène G\G' sous un groupe linéaire G' semi-simple simplement connexe à stabilisateur fini G, le tout en donnant des exemples de calculs que l'on peut faire avec ces formules. Pour ce faire, on démontre au préalable (à l'aide d'un théorème de Gabber sur les altérations) un résultat décrivant la partie de torsion première à p du groupe de Brauer non ramifié d'une variété V lisse et géométriquement intègre sur un corps fini ou sur un corps global de caractéristique p au moyen de l'évaluation des éléments de Br(V) sur ses points locaux. Les formules pour un stabilisateur fini sont ensuite généralisées au cas d'un stabilisateur G quelconque via une réduction de la cohomologie galoisienne du groupe G à celle d'un certain sous-quotient fini. Enfin, pour K un corps global et G un K-groupe fini résoluble, on démontre sous certaines hypothèses sur une extension déployant G que l'espace homogène V:=G\G' avec G' un K-groupe semi-simple simplement connexe vérifie l'approximation faible (ces hypothèses assurant la nullité du groupe de Brauer non ramifié algébrique). On utilise une version plus précise de ce résultat pour démontrer ensuite le principe de Hasse pour des espaces homogènes X sous un K-groupe G' semi-simple simplement connexe à stabilisateur géométrique fini et résoluble, sous certaines hypothèses sur le K-lien défini par X<br>This thesis studies the unramified Brauer group of homogeneous spaces with non connected stabilizer and its arithmetic applcations. In particular, we develop different formulas of algebraic and/or arithmetic nature allowing an explicit calculation, both over a finite field and over a field of characteristic 0, of the algebraic part of the unramified Brauer group of a homogeneous space G\G' under a semisimple simply connected linear group G' with finite stabilizer G. We also give examples of the calculations that can be done with these formulas. For achieving this goal, we prove beforehand (using a theorem of Gabber on alterations) a result describing the prime-to-p torsion part of the unramified Brauer group of a smooth and geometrically integral variety V over a global field of characteristic p or over a finite field by evaluating the elements of Br(V) at its local points. The formulas for finite stabilizers are later generalised to the case where the stabilizer G is any linear algebraic group using a reduction of the Galois cohomology of the group G to that of a certain finite subquotient.Finally, for a global field K and a finite solvable K-group G, we show under certain hypotheses concerning the extension splitting G that the homogeneous space V:=G\G' with G' a semi-simple simply connected K-group has the weak approximation property (the hypotheses ensuring the triviality of the unramified algebraic Brauer group). We use then a more precise version of this result to prove the Hasse principle forhomogeneous spaces X under a semi-simple simply connected K-group G' with finite solvable geometric stabilizer, under certain hypotheses concerning the K-kernel (or K-lien) defined by X

La surdite de perception atteint un enfant sur 1000 a la naissance. On estimait jusqu'a ces dernieres annees qu'environ un tiers des surdites de l'enfant etait de cause environnementale, un tiers etait de cause genetique cliniquement reconnue, et un tiers etaient des cas sporadiques sans cause retrouvee. Les formes genetiques etaient reconnues soit par l'integration de la surdite dans un syndrome polypathologique genetique (30% de ces formes), soit par l'existence d'une surdite familiale non syndromique (70%) se transmettant alors majoritairement (80%) sur un mode autosomique recessif (formes dfnb). Lorsque nous avons commence ce travail, 29 genes de surdite non syndromiques avaient ete localises sur les chromosomes humains et le gene correspondant est identifie pour 4 d'entre eux, parmi lesquels le gene de la connexine26 (cx26) pour dfnb1. Rien n'etait connu de la prevalence ou des caracteristiques de l'atteinte de l'oreille interne de ces differentes formes genetiques. Au cours de ce travail, nous avons tout d'abord montre par une etude multicentrique chez 65 familles vivant principalement en france, tunisie, nouvelle-zelande, et royaume-uni, que les mutations de cx26 etaient en cause dans la moitie des surdites congenitales dfnb. De plus, une des mutations de ce gene, 30delg, representait 70% des mutations detectees, et au vu de la prevalence des formes dfnb, on pouvait considerer cette mutation 30delg comme une des mutations pathogenes humaines plus frequentes. Pour caracteriser cette forme majoritaire, nous avons mene une etude prospective sur le territoire francais chez 140 enfants sourds : la caracterisation clinique et radiologique de l'atteinte de l'oreille interne couplee a la recherche de mutations de cx26 a permis de determiner le phenotype de dfnb1, de confirmer la prevalence de dfnb1 parmi les surdites congenitales dfnb en france (51%), et de montrer une prevalence elevee de dfnb1 dans le groupe des cas sporadiques de surdite congenitale (31%), permettant de deduire que la majorite des surdites congenitales de cause inconnue etait des formes genetiques autosomiques recessives. Enfin, nous avons montre qu'une mutation particuliere de cx26, w44c, etait responsable de la forme autosomique dominante de surdite dfna3.

La découverte de pathologies humaines liées à un dysfonctionnement ou à des mutations des gènes de connexines (Cx), protéines constitutives des jonctions communicantes, renforce l’importance de la communication jonctionnelle intercellulaire (GJIC). Dans le tissu osseux, plusieurs études ont démontré l’importance des niveaux d’expression et de fonction de la Cx43 dans le contrôle des processus de différenciation ostéoblastique, de minéralisation et dans les réponses cellulaires aux hormones et facteurs de croissance. Les interactions de la Cx43 avec l’endothéline-1 (ET1), peptide impliqué dans le développement de pathologies osseuses, ont été recherchées dans des cultures primaires d’ostéoblastes (OB) de calvaria de souris Cx43+/+ et Cx43+/-. L’analyse de la densité minérale osseuse par microtomographie des animaux testés a démontré un retard d’ossification de la calvaria des souris Cx43+/-. La caractérisation in vitro des OB a révélé une altération de l’expression de la Cx43, de la différenciation ostéoblastique et de la minéralisation. Une analyse pharmacologique approfondie de l’effet d’une périfusion d’ET1 a démontré une réduction significative de l’influx calcique liée spécifiquement aux canaux calciques voltage dépendants de type L dans les OB Cx43+/-. Un effet inhibiteur de l’ET1 sur la différenciation ostéoblastique et la minéralisation corrélé à une réduction du niveau de couplage jonctionnel a été retrouvé pour les deux génotypes tandis qu’un effet mitogénique a été observé seulement pour les OB Cx43+/+. En conclusion, cette étude suggère que le niveau d’expression de la Cx43 module l’effet de l’ET1 sur la différenciation ostéoblastique<br>Dysfunction of gap junctional intercellular communication (GJIC) or mutations of gap junction protein (connexin, Cx) genes have been implicated in various human pathologies. In bone, in vitro and in vivo studies have demonstrated the implication of Cx43 expression and GJIC in mineralization and osteoblastic differentiation. Cumulated data support the fact that Cx43 expression is very important for bone formation and regulation of cellular responses to hormones/growth factors stimulation. In this context, since endothelin-1 (ET1) has been also implicated in bone pathologies, the possible cross talk between Cx43 and ET1 was investigated in calvarial osteoblastic cells (OB) isolated from Cx43+/- and Cx43+/+ mice. Interestingly, microcomputed tomographic analysis revealed a hypomineralization in Cx43+/- newborn mice. In vitro characterization demonstrated that Cx43 expression, osteoblastic differentiation and mineralization processes were significantly reduced in Cx43+/- OB. Pharmacological study of ET1 action revealed that the Cx43+/- genotype was related to a reduced calcium influx through L-type voltage sensitive calcium channels. ET1 induced an inhibitory effect on OB differentiation in both genotypes whereas this peptide has a mitogenic effect only on Cx43+/+ OB. Moreover, the ET1 inhibitory effect on cell differentiation was correlated to a reduced Cx43 expression and GJIC only in Cx43+/+ OB, suggesting an alternative regulatory pathway in Cx43+/- OB. In conclusion, these data strongly suggest that the level of Cx43 expression influences the osteoblastic response to ET1

Les canaux jonctionnels, canaux ubiquiste, qui composent les jonctions gap ou communicantes, permettent les echanges d'ions (couplage electrique) et de petites molecules (inferieures a 900 daltons) (cooperation metabolique) entre cellules adjacentes. Des anticorps antipeptides diriges contre les residus 314-322 et 55-66 de la cx43 ont ete purifies et caracterises pour etudier l'expression de la cx43 et sa topologie. 1. Les techniques d'immunotransfert, d'immunofluorescence et d'immunocytochimie, en microscopie electronique ont permis de montrer que la cx43 est constitutive des jonctions gap des myocytes de cur de rat. Cette connexine n'est cependant pas exprimee par les fibroblastes cardiaques qui sont cependant couples, en co-culture, avec les myocytes. 2. La cx43 est conservee dans le myocarde des mammiferes, y compris l'homme. 3. La cx43 possede un long domaine cooh-terminal qui est cytoplasmique. Les deux boucles extracellulaires de la cx43 sont liees par des liaisons disulfure. 4. La cx43 est exprimee dans le cerveau ou elle est associee aux jonctions gap des astrocytes. La conductance jonctionnelle unitaire des canaux constitues de cx43 est dans les astrocytes, similaire a celle determinee dans les myocytes (40-60 ps)

La communication intercellulaire directe par jonction gap (CIJG) est impliquée dans le maintien de l'homéostasie tissulaire et la coordination des activités cellulaires. Tout dysfonctionnement de la communication intercellulaire dû à une perte d'expression ou à une délocalisation cytoplasmique des protéines constitutives : les connexines (Cx) est associé à des pathologies humaines. Ainsi, lors du processus de cancérogenèse, un défaut de synthèse ou d'adressage membranaire des connexines peut engendrer un phénotype tumoral caractérisé notamment par une prolifération cellulaire accrue. Néanmoins, le rôle des connexines lors des processus plus tardifs conduisant aux métastases n'a pu être clairement défini avec des résultats controversés. Le cancer de la prostate qui évolue majoritairement (80% des cas) vers des métastases osseuses, est associé à une diminution d'expression de connexines dont la Cx43. De plus, cette Cx43 est très impliquée dans l'ostéogenèse et dans la différenciation des cellules ostéoformatrices (ostéoblastes). Afin d'évaluer l'impact de la Cx43 sur le potentiel métastatique et sur l'impact osseux des cellules cancéreuses prostatiques, une surexpression de la Cx43 par infection rétrovirale a été effectuée dans des lignées cancéreuses prostatiques ayant des caractéristiques métastatiques différentes : les cellules PC-3 (très invasives) et les cellules LNCaP (moins agressives). Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de la Cx43 entraîne un effet différent sur les deux lignées. En effet, la Cx43 est restreinte dans le cytoplasme pour les cellules PC-3 alors qu'elle est localisée à la membrane plasmique et établit une communication intercellulaire pour les cellules LNCaP. De plus, une diminution de la prolifération ainsi que des capacités d'adhérence et d'invasion des cellules PC-3 a été observée suite à la transfection. A l'inverse, pour les cellules LNCaP, aucun impact sur la prolifération n'a été observé mais leur capacité d'invasion et d'adhérence a été significativement augmentée par la surexpression de la Cx43. In vivo, l'impact osseux étudié après injections intra-tibiales a montré une augmentation de l'incidence tumorale et de la perte osseuse suite au développement de tumeurs ostéolytiques uniquement pour les cellules LNCaP Cx43. Pour les cellules PC-3, aucune différence n'a été observée après la surexpression de la Cx43 alors qu'une étude préliminaire de la dissémination après injection intracardiaque a permis de montrer un ralentissement du développement des métastases osseuses. Enfin, des co-cultures avec des ostéoblastes murins ont permis de mettre en évidence que les cellules cancéreuses favorisent l'expression par les ostéoblastes de RANKL, un activateur des ostéoclastes, associé à un ralentissement de la différenciation des ostéoblastes. Ces effets observés sont indépendants du niveau d'expression de la Cx43. Seule la prolifération des ostéoblastes est significativement modifiée par la surexpression de la Cx43 dans les cellules cancéreuses prostatiques. En conclusion, les résultats in vitro suggèrent l'implication de la Cx43 dans le processus métastatique des cellules cancéreuses prostatiques avec une augmentation de l'agressivité pour les cellules LNCaP. De plus, la Cx43 semble pouvoir modifier l'impact osseux in vivo en fonction du niveau d'agressivité initial des cellules cancéreuses prostatiques<br>Prostate cancer (PCa) has the highest incidence in men with bone metastasis occurring in 80% of cases and mainly characterized by osteoblastic lesions. The mechanisms by which prostate cancer cells are induced to metastasize to bone are variable and complex, implicating oncogenes, pro-angiogenic factors and adhesion molecules. Among the different interacting molecules, Connexins (Cxs) could participate in this process. Connexins are transmembrane protein involved in Direct Gap Junction Intercellular Communication (GJIC) in order to maintain tissue homeostasis and the coordination of cellular activities. Studies have shown that PCa cells are deficient in some Cx isoforms (Cx32, Cx43) in primary tumors. However, recent studies suggest that Cx43 could be implicated in the last stages of the tumorigenic process as a promoter of cancer cell dissemination with a putative role of heterocellular coupling with environmental cells in the migration, diapedesis and metastatic processes. Furthemore, cumulated data support the involvement of Cx43 and GJIC in the differentiation process of bone-forming osteoblastic cells and bone turnover. Indeed, in vivo, Cx43-null mice presented mineralization defects in craniofacial bones and ribs and in vitro a decreased differentiation potential of OB cells was clearly demonstrated. Therefore, we have investigated the role of Cx43 on the metastatic potential of PCa cells and on their bone impact in vivo. To examine the effects of increased expression of Cx43 gene in PCa cells, we have performed retroviral infection in two well characterized cell lines representing different stages of cancer progression: PC3 (aggressive) and LNCaP (less metastatic). After overexpression, in PC3 cells, Cx43 was restricted to the cytoplasmic part and no cell-to-cell communication was measured. Conversely, in LNCaP cells, Cx43 was mainly observed in appositional membranes and a functional GJIC was demonstrated by gap-FRAP and preloading assays. Moreover after overexpression, phenotypic characterization of both cell types demonstrated significant differences in adhesion, invasion, proliferation and secretome profile. Cx43 appears to alter the behavior of LNCaP making them more aggressive. To study the impact of prostate cancer cells overexpressing Cx43 on bone, intratibial injections in nude mice were performed. Mice were imaged by means of tomographic and scintigraphic analyses vs. Time. Both cell types developed osteolytic tumors. Cx43 overexpression in LNCaP cells induced a 4 fold increase of tumour incidence compared to mock cells. After Cx43 overexpression, tibial bone volume was clearly decreased compared to control confirming the higher osteolytic ability of LNCaP. For PC-3 cells, no difference was observed after Cx43 overexpression but a preliminary study of the spread after intracardiac injection has shown a slowdown in the development of bone metastases. Finally, co-cultures with murine osteoblasts have shown that cancer cells promote the expression of RANKL by osteoblasts, an activator of osteoclasts, with a decrease of the osteoblastic differentiation. These effects are independent of the level of Cx43 expression. Only the proliferation of osteoblasts was significantly modified by Cx43 overexpression in prostatic cancer cells. Our in vitro study demonstrates that Cx43 could influence the metastatic status of PCa cells with increased aggressiveness of LNCaP. In vivo, our data validate the potential implication of this connexin in the bone impact during metastasis

Au niveau des artères intrapulmonaires (AIP) de rats sains, la connexine 43 (Cx43) située au niveau de la jonction myoendothéliale (JME) intervient dans la réactivité à la 5-HT. La 5-HT produit de l’anion superoxyde (O2•) au niveau du muscle lisse et du monoxyde d’azote (NO) au niveau de l’endothélium des AIP. La Cx43 permet alors le passage de l’O2• du muscle lisse vers l’endothélium de façon à diminuer la biodisponibilité du NO et maintenir une contraction physiologique de l’artère pulmonaire. Cependant, l’augmentation d’O2• par d’autres agonistes vasoconstricteurs tels que l’endothéline-1 (ET-1) et la phényléphrine (PHE) et les mécanismes impliqués dans cette augmentation restent encore méconnus dans la circulation pulmonaire. Ainsi, ce travail vise à identifier les agonistes qui provoquent une augmentation de la quantité d’O2• et à mettre en évidence les voies de signalisation mises en jeu au niveau des AIP de rats. Par ailleurs, la Cx43 étant impliquée dans la réactivité des AIP de rats sains à la 5-HT, le rôle de la Cx43 dans la circulation pulmonaire pathologique a été étudié à l’aide d’un modèle de souris hétérozygote pour la Cx43 (souris Cx43+/-) souffrant d’hypertension pulmonaire (HTP) hypoxique chronique (HC). Nous avons montré que l’augmentation d’O2•au niveau des AIP est un mécanisme exclusif de la 5-HT. Cette augmentation provient uniquement d’une augmentation de production par la mitochondrie et les NADPH oxydases via un mécanisme de « ROS-induced ROS release » dépendant de la PKC. La 5-HT agit par le biais des récepteurs 5-HT2A, induit un influx calcique extracellulaire qui augmente la concentration calcique mitochondriale provoquant une augmentation de production d’O2• par le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. De plus, cette voie s’exerce au sein des microdomaines de signalisation, notamment les cavéoles. D’autre part, chez les souris Cx43+/- HTP HC le remodelage des AIPest inhibé et l’hypertrophie ventriculaire droite est freinée. La vasoréactivité des AIP à la 5-HT, à l’ET-1 et à la PHE est modifiée chez les souris Cx43+/- saines et HTP HC par rapport aux souris sauvages. Ces données apportent (1) des éléments de compréhension sur les voies de signalisation mises en jeu dans la production d’O2• en réponse à la 5-HT dans la circulation pulmonaire de rats sains et (2) de connaissances nouvelles sur le rôle de la Cx43 dans les AIP de souris saines et souffrant d’HTP HC<br>Under physiological conditions, in rat intrapulmonary arteries (IPA), connexin 43 (Cx43) localised at the myoendothelial junctions is involved in the reactivity to serotonin (5-HT). 5-HT increases superoxide anion (O2•) in the smooth muscle and nitric oxide (a vasodilator) in the endothelium. O2• will then rapidly pass through Cx43 to scavenge endothelial NO to decrease the bioavailability of the latter and hence maintain IPA contraction in physiological conditions. However, to date, the increase in O2• level by other contractile agonists such as endothelin-1 (ET-1) and phenylephrine (PHE) and the mechanism involved in this increase are still unknown in the pulmonary circulation. The goal of this present work is to identify the contractile agonists involved in the increase of O2• and to highlight the signaling pathways involved in the agonists-induced increase of O2•. As Cx43 plays an important role in IPA contractile reactivity to 5-HT in healthy rats, the role of Cx43 under pathological conditions of the pulmonary circulation has been studied with a mice model heterozygous for Cx43 (Cx43+/-) suffering from hypoxic pulmonary hypertension (HPH). We have shown that O2• increase in rat IPA is exclusive to 5-HT. 5-HT-induced O2• increase in rat IPA is only from an increase in production by the mitochondria and NADPH oxydase via a ROS-induced ROS release mechanism dependent on PKC. Upon binding to 5-HT2A receptors, 5-HT induces an extracellular calcium influx which is responsible for an increase in mitochondrial calcium level and causes an upregulation in O2• production by the complex I of the mitochondrial respiratory chain. Moreover, this signaling pathway takes place in specialized microdomains, namely caveolae. On the other hand, interestingly, in Cx43+/- HPH mice, IPA remodeling is inhibited and right ventricular hypertrophy is less intense. IPA vasoreactivity to 5-HT, ET-1 and PHE is modified in Cx43+/- healthy and HPH mice as compared to wild type mice. These data bring (1) new elements of comprehension in the signaling pathways involved in 5-HT-induced O2• production in healthy rat pulmonary circulation and (2) new insights on the role of Cx43 in mice IPA under physiological and HPH conditions

Le récepteur atypique ACKR3 et le récepteur CXCR4 sont des récepteurs couplés aux protéines G appartenant à la famille des récepteurs CXC des chimiokines. Ces deux récepteurs sont activés par la chimiokine CXCL12 et sont surexprimés dans de nombreux cancers comme les gliomes, dont ils favorisent la prolifération et le caractère invasif. Le récepteur CXCR4 active des voies de signalisation qui dépendent de la protéine Gi et des β-arrestines et s’associe à plusieurs protéines impliquées dans la transduction du signal, le trafic et la localisation cellulaire du récepteur. Par contre, les mécanismes de signalisation impliqués dans les effets d’ACKR3 restent mal connus. Le récepteur déclenche une signalisation dépendant des β-arrestines, mais son couplage aux protéines G dépend du type cellulaire ou se fait par un mécanisme indirect via son association au récepteur CXCR4. Le récepteur ACKR3 s’associe également au récepteur de l’EGF pour induire la prolifération cellulaire par un mécanisme indépendant de sa stimulation par un agoniste. Ces données illustrent l’intérêt de caractériser de façon systématique l’interactome de ces récepteurs pour comprendre leurs rôles physiologiques et pathologiques. Cette thèse a poursuivi cet objectif grâce à la mise en œuvre d’une approche protéomique combinant la purification des partenaires des deux récepteurs par affinité suivie de leur identification par spectrométrie de masse. J’ai ainsi identifié respectivement 19 et 151 partenaires protéiques potentiels des récepteurs CXCR4 et ACKR3 exprimés dans les cellules HEK-293T. Parmi les protéines recrutées par ACKR3, nous nous sommes focalisés sur la connexine 43 (Cx43, une des protéines constituant les jonctions Gap) du fait de la similitude des effets du récepteur et de la Cx43 dans la pénétration des leucocytes dans le parenchyme cérébral, la migration des interneurones et la progression des gliomes. J’ai confirmé par Western blot et par BRET l’association spécifique de la Cx43 à l’ACKR3 et non pas au CXCR4. De la même façon, j’ai montré une co-localisation de la Cx43 et de l’ACKR3 dans des cellules de gliome humain, ainsi que dans les astrocytes de la zone sous-ventriculaire et les pieds astrocytaires entourant les capillaires cérébraux chez la souris, suggérant que les deux protéines forment un complexe protéique dans un contexte biologique authentique. Des études fonctionnelles ont révélé que l’ACKR3 module les fonctions de la Cx43 par différents mécanismes. L’expression de l’ACKR3 dans les cellules HEK-293T (mimant la surexpression du récepteur dans les tumeurs), induit par elle-même une inhibition de l’activité jonctionnelle de la Cx43. De même, la stimulation du récepteur par un agoniste réduit l’activité jonctionnelle de la Cx43 par un mécanisme impliquant l’activation d’une protéine Gi, la β-arrestine2 et l’internalisation de la Cx43. Cette thèse établit donc pour la première fois un lien fonctionnel entre le système constitué par les chimiokines CXCL11, CXCL12 et leur récepteur ACKR3 d’une part et les jonctions Gap d’autre part qui pourrait jouer un rôle critique dans la progression des gliomes<br>The Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) and CXCR4 are two G protein-coupled receptors (GPCR) belonging to the CXC chemokine receptor family. Both receptors are activated upon CXCL12 binding and are over-expressed in various tumours, including glioma, where they have been found to promote proliferation and invasive behaviours. Upon CXCL12 binding, CXCR4 activates canonical GPCR signalling pathways involving Gαi protein and β-arrestins. In addition, CXCR4 was found to interact with several proteins able to modify its signalling, trafficking and localization. In contrast, the cellular pathways underlying ACKR3-dependent effects remain poorly characterized. Several reports show that ACKR3 engages β-arrestin-dependent signalling pathways, but its coupling to G proteins is restricted to either specific cellular populations, including astrocytes, or occurs indirectly via its interaction with CXCR4. ACKR3 also associates with the epidermal growth factor receptor to promote proliferation of tumour cells in an agonist-independent manner. These examples suggest that the extensive characterization of ACKR3 and CXCR4 interactomes might be a key step in understanding or clarifying their roles in physiological and pathological contexts. This thesis addressed this issue employing an affinity purification coupled to high-resolution mass spectrometry proteomic strategy that identified 19 and 151 potential protein partners of CXCR4 and ACKR3 transiently expressed in HEK-293T cells, respectively. Amongst ACKR3 interacting proteins identified, we paid particular attention on the gap junction protein Connexin-43 (Cx43), in line with its overlapping roles with the receptor in the control of leukocyte entry into the brain, interneuron migration and glioma progression. Western blotting and BRET confirmed the specific association of Cx43 with ACKR3 compared to CXCR4. Likewise, Cx43 is co-localized with ACKR3 but not CXCR4 in glioma initiating cell lines, and ACKR3 and Cx43 are co-expressed in astrocytes of the sub-ventricular zone and surrounding blood vessels in adult mouse brain, suggesting that both proteins form a complex in authentic cell or tissue contexts. Further functional studies showed that ACKR3 influences Cx43 trafficking and functionality at multiple levels. Transient expression of ACKR3 in HEK-293T cells to mimic ACKR3 overexpression detected in several cancer types, induces Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) inhibition in an agonist-independent manner. In addition, agonist stimulation of endogenously expressed ACKR3 in primary cultured astrocytes inhibits Cx43-mediated GJIC through a mechanism that requires activation of Gαi protein, and dynamin- and β-arrestin2-dependent Cx43 internalisation. Therefore, this thesis work provides the first functional link between the CXCL11/CXCL12/ACKR3 axis and gap junctions that might underlie their critical role in glioma progression

La communication jonctionnelle par jonctions "gap" via les connexines (cx), proteines constitutives de ces jonctions, participe activement au controle de la proliferation et la differenciation cellulaire. Il est etabli que cette communication jonctionnelle est affectee par des facteurs environnementaux comme certains pesticides capables d'induire une alteration d'expression des cx conduisant dans certains types cellulaires a une proliferation anormale. La cellule de sertoli est le veritable chef d'orchestre de la spermatogenese. La communication locale via les jonctions "gap" qui s'etablit entre les cellules de sertoli et les cellules germinales joue un role majeur dans l'initiation et le maintien de la spermatogenese. L'objectif du present travail est base sur l'hypothese qu'une dysregulation de l'expression des cx testiculaires, sous l'influence de certains polluants environnementaux, pourrait etre a l'origine et/ou associee a certaines pathologies testiculaires (azoospermie secretoire, cancers testiculaires). Pour ce faire, une etude de la regulation de la cx43, connexine majoritaire dans le testicule, a ete realisee dans des testicules avec une spermatogenese normale et pathologique chez des souris (mutants steriles) et chez l'homme (groupe de patients selectionnes presentant une azoospermie secretoire). [. . . ] l'ensemble de ces resultats montrent des modifications d'expression de la cx43 dans le testicule a spermatogenese alteree. Ils suggerent que des polluants environnementaux, tels que certains pesticides, pourraient etre la cause d'alterations de la communication jonctionnelle testiculaire.

Les jonctions gap (JG), qui permettent l'échange direct de cellule à cellule de petites molécules cytoplasmiques, semblent impliquées dans le contrôle de la prolifération et la différenciation cellulaire. Les thyrocytes coexpriment la Cx32 et la Cx43 qui forment de JG distinctes, in vivo. Afin de déterminer le rôle des JG dans la thyroi͏̈de, la communication via les JG a été restaurée dans deux lignée thyroi͏̈diennes communication-déficientes, les cellules FRT et FRTL-5, par transfection stable de l'ADNc de la Cx32 ou de la Cx43. Des travaux antérieurs du groupe avaient montré que l'expression de la Cx32 entraînait un ralentissement de la prolifération cellulaire dans les deux lignées et une augmentation du niveau d'expression de la thyroglobuline (Tg) dans les cellules FRTL-5. Dans les cellules FRT, nous avons trouvé qu'en plus des effets sur la prolifération, la Cx32 accroît leur capacité à former des dômes qui se transforment en structures folliculaires. Dans le présent travail, nous avons trouvé qu'aucun des phénotypes induits par la Cx32 n'est reproduit par la Cx43. En recherchant les mécanismes impliqués dans le ralentissement de la prolifération induit par la Cx32, nous avons trouvé un allongement de la phase G1 du cycle cellulaire dans les deux lignées relié à une augmentation de la proportion de cellules exprimant les inhibiteurs du cycle cellulaire, p27kip1 et p21cip1, par rapport aux cellules parentales ou exprimant la Cx43. Dans le but de déterminer si les JG formées de Cx32 ont le même rôle régulateur in vivo, nous avons prévu de produire des souris transgéniques surexprimant la Cx32 de façon ciblée dans la thyroi͏̈de. Pour cela, nous avons construit un vecteur dans lequel l'ADNc de la Cx32, fusionné à 5' à celui de l'EGFP, est placé sous le contrôle du promoteur de la Tg. Après transfection dans des cellules FRTL-5, la protéine chimérique Cx32/EGFP codée par ce vecteur forme des canaux fonctionnels et reproduit le ralentissement de la prolifération observé avec la Cx32 native. L'expression de ce transgène dans la thyroi͏̈de de souris devrait apporter des informations sur le rôle de la Cx32 dans le contrôle de la prolifération et de l'activité des thyrocytes in situ.

Le thème principal de mon travail est l’utilisation de la notion de connexion comme principe explicatif de notre compréhension des phrases conditionnelles. Ces phrases, dont le prototype est « Si A, B », sont considérées comme étant une des bases de la logique formelle mais aucun consensus n’est encore atteint quant à une sémantique décrivant correctement leur emploi dans le langage naturel. J’utilise tout d’abord le concept de connexion et des considérations linguistiques et psychologiques pour obtenir une classification des conditionnels en plusieurs types présentant chacun des propriétés logiques propres. Partant de cette classification, j’obtiens les types différents de conditionnels suivants : inférentiel, nécessaire, biconditionnel, faible, concessif et épistémique ; et leur fournis une sémantique propre. Celle-ci est suppléée par une méthode des tableaux pour les conditionnels inférentiels, nécessaires, biconditionnel et faibles, débouchant sur des preuves de consistance, de complétude et de décidabilité. L’approche développée ici est novatrice car elle permet d’obtenir des systèmes inédits dont les prédictions sont correctes relativement aux inférences constatées dans le langage naturel. Cette analyse est enrichie par d’autres axes. Le premier concerne la modélisation des croyances du locuteur et permet de rendre compte de la différence entre conditionnels indicatifs et contrefactuels. Le second axe prend en compte l’aspect dynamique du discours et offre ainsi une conception des conditionnels emboîtés. Le dernier axe est un renforcement de la notion de connexion permettant d’obtenir une logique connexive et de modéliser la dénégation des conditionnels<br>The main idea of my work is to use the notion of connection to explain our understanding of the conditional sentences. These sentences, with the general form « If A, B », are considered as a basic block of formal logic but no agreement is actually achieved concerning a correct analysis of their employ in the natural language. First, I use the concept of connection and some linguistic and psychological considerations to obtain a classification of the conditionals in several types with their own logical properties. Starting from this classification, I obtain the following types of conditionals: inferential, necessary, biconditional, weak, concessive and epistemic. Each receives its own semantics. Inferential, necessary, biconditionals and weak conditionals receive also a proof theory, supplied by soundness, completeness and decidability proofs. The approach developed here is new as it allows obtaining singular systems whose predictions are correct relatively to the inferences effectively used in the natural language. This analysis is developed along other lines. The first models the beliefs of the speaker. It allows to give an account of the difference between indicative conditionals and counterfactuals. The second line uses the dynamical aspect of the discourse to offer a design for the embedded conditionals. The last line is a strengthening of the notion of connection, which allows to obtain some connexive logic and to model the denegation of conditionals

Les jonctions gap (JG), zones spécialisées de la membrane plasmique où sont localisés des canaux intercellulaires (CJ), qui permettent le passage direct de cellule à cellule d'ions et de petites molécules. Dans le cœur, les JG permettent la synchronisation des activités électriques et donc des activités mécaniques, et leur dysfonctionnement est à l'origine de troubles du rythme cardiaque. Au cours de ce travail nous avons montré une implication du cytosquelette d'actine dans la régulation de l'activité des CJ composé de connexine 43. La régulation par les mécanismes de phosphorylation/déphosphorlation des protéines pourrait se faire soit par déphosphorylation directe des CJ, soit par l'intermédiaire d'une protéine régulatrice associée qui reste à déterminer. Nous avons également mis en évidence des propriétés indirectes d'un inhibiteur métabolique, l'antimycine A, qui est capable de provoquer la fermeture des CJ indépendamment des concentrations en calcium et en ATP intracellullaires<br>Gap junctions (GJ), specialised areas of membrane where intercellular channels (IC) are clustered, mediates the direct cell-to-cell exchange of small cytoplasmic molecules and of inorganic ions. In the heart, GJ form low-resistance pathway for cell-to-cell conduction of electrical impulses which mediates the synchronisation of electrical and mechanical activities. Dysfunctions of these GJ induce arrhythmias. In this study we demonstrate that actin cytoskeleton is involved in regulation of GJ channels made of connein 43. Regulation of GJ communication by phosphorylation/dephosphorylation processes can occur by dephosphorylating directly connexin 43 or a regulatory protein associated with gap junction channels. We also show that the metabolic inhibitor antymincine A, is able to directly interrupt cell-to-cell communication, even both ATP and calcium concentrations are kept stable

Les insuffisances rénales et cardiaques demeurent des problèmes majeurs de santé publique. Ainsi, mes recherches sont articulées sur 2 axes, l’un cardiaque et l’autre rénal. Notch3 joue un rôle majeur dans la physiopathologie vasculaire: en contrôlant la prolifération et la maturation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), ce récepteur est nécessaire à l’adaptation cardiaque lors d’une hypertension artérielle (HTA). Mes objectifs étaient d’étudier les effets de la suractivation de la signalisation de Notch3 dans les CMLV lors d’une HTA et son implication lors d’un remodelage cardiaque physiologique induit par un entrainement physique modéré (EP). Les souris surexprimant Notch3 dans les CMLV développent une HTA, mais présentent une hypertrophie cardiaque et une fibrose moindres en réponse à l’AngII. De plus, l’EP permet de contrecarrer les défauts liés à l’absence de Notch3 car la cardiopathie des souris Notch3-/- régresse après 5 semaines d’EP. La connexine 43 (Cx43), protéine constitutive des jonctions gap, est anormalement exprimée dans la néphropathie chronique et sa réduction génétique protège contre la maladie. Ainsi, nous avons évalué son rôle dans la l’insuffisance rénale aigüe (IRA). Nous avons montré que les souris Cx43+/- avaient une fonction et une structure rénales améliorées par rapport aux WT après IRA. Cette protection semble liée à une réponse inflammatoire modérée. Cependant, la délétion ciblée de Cx43 dans les cellules endothéliales ou les tubules rénaux ne semble pas reproduire le phénotype observé chez des Cx43+/-. Ainsi, la réduction simultanée de Cx43 dans plusieurs types cellulaires est indispensable contre la progression de l’IRA<br>Renal and cardiac diseases are both major issues of public health. Therefore, my thesis project was articulated in 2 axes, one cardiac and the other renal. Notch3 plays a role in vascular physiopathology: by controlling proliferation and vascular smooth muscle cell (VSMC) maturation and this receptor is necessary for cardiac adaptation during a pressure overload. The objectives of my project were to study the effects of the Notch3 signaling pathway in mouse overexpressing this protein specifically in VSMCs (TgN3ICDSM) during hypertension (HTA), and its role during a physiological cardiac remodeling induced by a program of moderate physical training (PT). We showed that TgN3ICDSM mice develop HTA but show less cardiac hypertrophy and fibrosis in response to AngII-dependent HTA. Furthermore, heart disease regresses in Notch3-/- mice after 5 weeks of PT. Consequently, physical training may be able to counteract some defects related to the absence of Notch3. We have previously reported that the expression of the gap junction protein connexin 43 (Cx43) is abnormally induced in different models of chronic renal disease and its reduction protected against kidney disease. Thus, the aim was to evaluate Cx43 implication in acute kidney injury (AKI). We observed improved renal function and structure in Cx43+/- mice, compared with WT, after renal IR. This protective effect may be due to a limited inflammatory response. However, this protective phenotype was not observed when Cx43 was specifically deleted in endothelial or renal tubular cells. Therefore, simultaneous reduction of Cx43 in several cell types seems necessary against the progression of AKI

Un homeomorphisme de brouwer est un homeomorphisme du plan sans point fixe et preservant l'orientation. La dynamique de ces transformations etant mal comprise, on etudie dans cette these les proprietes topologiques de l'espace de tous ces homeomorphismes. Nous commencons par demontrer qu'il est connexe par arcs. Suite a cette preuve, nous abordons aussi la question des differences dynamiques entre deux homeomorphismes de brouwer qui coincident hors d'un compact. On demontre ensuite que l'espace etudie est localement contractible. Cette preuve nous amene a eclaircir le probleme de la mise en position canonique d'un homeomorphisme du plan sans point fixe sur un cercle. Nous deduisons alors des techniques utilisees precedemment qu'un homeomorphisme de brouwer est toujours non singulier si on ne le regarde que sur un ensemble borne. Au passage, ceci donne un resultat de densite et une autre preuve de la connexite. Enfin, comme introduction au type d'homotopie de l'espace des homeomorphismes de brouwer, nous prouvons que l'inclusion de cet espace dans celui des homeomorphismes du plan preservant l'orientation induit l'application nulle sur les groupes fondamentaux.

A partir de l'établissement d'une approximation in stationnaires en 3D des potentiels retardés pour des courants électromagnétiques sur des polyèdres non-nécessairement convexes, une méthode de résolution pour la simulation de la diffraction par un ensemble non-connexe d'objets est formulée. Une partition de ce dernier est effectuée suivant les inhomogénéités présentes. Le problème est alors traduit en un système d'équations de Maxwell couplées, chacune étant homogène hors d'un élément correspondant de la partition, qui induit la construction d'une solution du problème initial. Par approximation des termes de couplage, il s'en suit une méthode naturellement hybride et parallèle sur un système stable et bien-posé. La restriction de chaque sous-système à un voisinage du support de ses inhomogénéités est obtenue par introduction de conditions aux limites absorbantes de type "PML" dont un formalisme généralisé est étudié. Des exemples numériques illustrent l'ensemble de ces développements.

L'objet de cette thèse sur les réseaux de capteurs est l'étude du déploiement minimal de capteurs lorsque ceux-ci doivent couvrir un ensemble discret de cibles plutôt que des superficies. Après la présentation des caractéristiques d'un réseau de capteurs, et l'intérêt d'un déploiement minimal, nous en proposons une modélisation en théorie des graphes. Nous présentons ensuite un état de l'art décrivant certaines techniques de résolution par la programmation mathématique de diverses problématiques dans ce type de réseau. Nous utilisons plusieurs programmes linéaires en variables mixtes afin de résoudre le problème du déploiement minimal des capteurs sous des contraintes de couverture de toutes les cibles et de connectivité des capteurs entre eux. Finalement, nous concevons une nouvelle heuristique de calcul de placement de capteurs lorsque les cibles sont placées sur une grille à motif carré et nous conjecturons que cette heuristique retourne une solution optimale dans tous les cas<br>The objectif of this thesis on wireless sensor networks is to study the deployment of a minimal number of sensors to cover specific targets instead of continuous areas. After a presentation of the characteristics of wireless sensor networks, and after justifying the interest of an optimal sensor deployment, we propose a graph-theory based model for wireless sensor networks. We then present a state of the art describing various mathematical programming models and resolution techniques regarding a number of optimization problems in such networks. We formulate several Mixed Integer Linear programs to solve the optimal sensor deployment problem under contraints related to the coverage of all targets and connectivity between sensors. Finally, we conceive a new heuristic for sensor placement when targets are placed in a square grid graph, and we conjecture that this heuristic returns an optimal solution in all cases

Les Connexines (Cx) et les jonctions gap, permettant la communication directe de cellule -àcellule, sont impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Le rôle de la Cx32 sur la croissance normale et tumorale de la thyroïde a été étudié chez des souris surexprimant la Cx32 dans la thyroïde (Cx32-T+) ou n’exprimant pas la Cx32 (Cx32- KO). A l’état basal, les souris Cx32-T+ présentent une hypotrophie de la thyroïde. Après activation par la TSH, les souris Cx32-KO développent un goitre plus important que les souris sauvages. Des souris exprimant les oncogènes RET/PTC3 ou E7 dans la thyroïde ont été croisées avec des souris Cx32-KO. L’hypertrophie induite par RET/PTC3 ou E7 et la formation de tumeurs malignes en réponse à RET/PTC3 sont réduites chez les souris déficientes en Cx32. En conclusion, la Cx32 agirait comme régulateur a) négatif de la croissance de la thyroïde activée via la cascade AMPc, et b) positif du développement tumoral induit par les oncogènes RET/PTC3 ou E7<br>Connexins (Cx) and gap junctions, allowing direct cell-to-cell communication, are involved in the control of cell proliferation. The role of Cx32 on normal and tumoral growth of the thyroid has been studied in mice overexpressing Cx32 in the thyroid (Cx32-T+) or deleted for Cx32 (Cx32-KO). In basal conditions, Cx32-T+ mice present a thyroid hypertrophy. After activation by TSH, Cx32-KO mice develop a larger goiter than wild type mice. Mice expressing RET/PTC3 or E7 oncogenes in the thyroid have been crossed with Cx32-KO mice. Hypertrophy induced by RET/PTC or E7 and the formation of malignant tumors in response to RET/PTC3 are reduced in mice deleted for the Cx32. In conclusion, Cx32 would act like as a) a negative regulator on the thyroid growth activated through the cAMP cascade, and b) a positive regulator on the tumoral development induced by RET/PTC3 or E7 oncogenes