Добірка наукової літератури з теми "Facteur d'épissage"

Chez les organismes multicellulaires la diversité protéique dans chaque cellule et chaque tissu est obtenue initialement en régulant l’expression d’une partie des gènes d’un génome. Ces gènes sélectionnés peuvent ensuite être soumis à un épissage alternatif de sorte que certains exons sont retenus ou exclus dans l’ARNm final. Nous étudions les détails moléculaires de la protéine MEC-8, un facteur d’épissage tissu spécifique chez Caenorhabditis elegans. Les mutants MEC-8 sont responsables d’un phénotype insensible au touché chez Caenorhabditis elegans. Plus précisément, MEC-8 lie le pré-ARNm de mec-2 un composant des récepteurs mécanosensoriels afin de réguler la production d’un isoforme particulier nécessaire pour la transduction du signal mécanosensoriel. Des études portant sur le motif conservé de reconnaissance à l’ARN (RRM) chez des orthologues des vertébrés (RBPMS) et des insectes (couch potato, CPO) ont démontré la présence d’un motif d’homodimérisation dans le domaine RRM1 de MEC-8. Cependant MEC-8 contient aussi un second domaine RRM dans sa partie C-terminale, domaine qui n’est pas retrouvé dans les protéines RBPMS et CPO. Nous avons donc exprimé chaque domaine RRM de MEC-8 indépendamment ainsi que la protéine entière et ces constructions ont été utilisées pour diverses expériences biophysiques. Nous avons ainsi identifié la séquence de liaison optimale pour les deux domaines RRM1 et RRM2. Ces analyses ont aussi été menées sur les domaines homologues issus des protéines RBPMS et CPO qui présentent une forte affinité pour la même séquence d’ARN. Nous avons donc découvert que malgré des différences de fonction et de localisation les membres de la famille RBPMS lient tous le même motif d’ARN. Les détails atomiques des deux RRM en complexe avec leur motif de liaison ont été obtenus en utilisant de la spectroscopie RMN et de la cristallographique des rayons X. Les deux complexes RRM-ligand de MEC-8 présentent de surprenantes similarités dans leur architecture
In multicellular organisms, proteomic diversity in each cell and tissue is provided initially by selective expression of gene subsets from the total genome, which are further subjected to alternative splicing, such that a different pattern of exons can be retained or excluded in the final protein coding mRNA. We are investigating the molecular details of the tissue-specific splicing factor protein MEC-8 from the worm Caenorhabditis elegans. The MEC-8 mutant protein is responsible for a touch insensitive phenotype in Caenorhabditis elegans, relating to its role as an alternative splicing factor. More precisely, MEC-8 can bind to the mec-2 pre-mRNA, a component of mechanosensory receptor, to regulate the production of a certain isoform required for transducing the touch signal. Previous studies of the conserved RNA Recognition Motif (RRM) domain in orthologues from vertebrate (RBPMS) and insect (couch potato; CPO) have demonstrated a homodimerization motif in MEC-8 RRM1. However, MEC-8 also contains a second RRM domain in the C-terminus that is not found in the characterized RBPMS and CPO proteins. We have therefore expressed the independent RNA-binding domains of MEC-8 as well as the full-length protein and have used these constructs in a variety of biophysical assays. We identified the optimal RNA binding sequence for both the RRM1 and RRM2, and quantified the penalty of sequence variations. The investigation has also been extended to the homologous domains from human RBPMS and Drosophila CPO, which show a high affinity to the same RNA sequence. We therefore find that despite differences in function and localization, the members of the RBPMS protein family all bind to the same RNA motif. Atomic details of binding have also been obtained by using a combination of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The ligand-bound complexes reveal a surprising similarity in the architecture of the bound ligand for the first and second RRM domains from MEC-8

L'apoptose est un processus primordial pour le développement et le maintien des organismes eucaryotes. Elle est régulée à différents niveaux de l’expression génique. En fonction des stimuli intra- et extra-cellulaires, les facteurs de transcription régulent l'expression des protéines pro-survies et pro-apoptotiques. Ces facteurs de transcription facilitent la formation du complexe de pré-initiation (CPI) de la transcription pour activer la transcription. Le CPI est composé de l’ARN polymérase II et des facteurs généraux de transcription dont le facteur de reconnaissance du promoteur, TFIID. TFIID est un complexe multi-protéique composé de la protéine de liaison de la boîte TATA (TBP) et de 14 facteurs associés à TBP (TAFs) tel que TAF6 qui nous intéresse. TAF6 est exprimé sous 5 isoformes d'épissage alternatif (?, ?, ?, ð, ? ). TAF6? et TAF6ð sont deux entités antagonistes. Ils sont issus de l’épissage alternatif du deuxième exon de TAF6. Contrairement au variant majoritaire TAF6? qui a une activité oncogénique et antiapoptotique, le variant minoritaire TAF6ð est pro-apoptotique. À l’opposé de TAF6?, l’excision de la partie alternative du deuxième exon empêche la dimérisation de TAF6ð avec TAF9 dans TFIID (TFIID?). Les analyses de puce à ADN ont montré que l'impact sur le transcriptome de la perte de TAF6? est fortement distinct de l'impact causé par l'induction de l’isoforme pro-mort TAF6ð par des oligonucléotides antisens qui bascule l’épissage (SSO pour Splice site Switching Oligonucleotids). En outre, la déplétion du variant d'épissage majeur TAF6? aboutit à la perte de la viabilité des cellules. L'importance de l'induction de TAF6ð dans la mort cellulaire programmée et nos résultats précédents montrant que TAFð induit l’apoptose indépendamment de p53 dans de nombreux types de cellules cancéreuses, nous ont incités à entreprendre une dissection des éléments cis d'ARN qui contrôlent l'épissage du variant TAF6ð. Nous avons développé un système de minigène pour étudier les éléments cis d'ARN qui contrôlent l'expression de TAF6ð. Le minigène inclut la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 3) qui est dirigé par le promoteur CMV et il mime le patron d’épissage alternatif de TAF6? et TAF6ð endogène. Nous avons entrepris une analyse mutationnelle pour identifier les éléments cis de TARN pré-messager de TAF6. Nos données ont mis en évidence un site activateur d'épissage dans l’exon 2 constitutif. Dans l’intron, deux motifs polyC et polyG pourraient réguler l’épissage alternatif de TAF6ð. Ces motifs représentent des sites potentiels de liaison pour les protéines de liaison à l’ADN, hnRNP K et H respectivement. Nous avons donc testé l’effet de la surexpression de hnRNP K et H sur l’épissage alternatif de TAF6 et nous n'avons eu aucuns changement sur l’expression de TAF6ð endogène. De plus, nous avons constaté que la mutation d'un seul nucléotide qui semble perturber la structure secondaire d'ARN au site d’épissage proximal, renverse complètement le patron d’épissage. Cette mutation favorise le choix du site d’épissage distal (un site faible) à la place du site d’épissage proximal (TAF6?). Nos résultats suggèrent aussi qu’un élément régulateur d’épissage qui favorise TAF6? est présent dans l’exon 2 alternatif. Pour permettre l’identification des facteurs d’épissage influençant le choix du site d’épissage, nous avons créé un nouveau système d’épissage rapporteur. Notre nouveau vecteur contient la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 4) modifiée par l’introduction d’un codon stop prématuré (CSP) dans l’exon 2 alternatif et fusionné à la protéine EYFP. La combinaison des essais de transfections transitoires avec les SSOs ont été utilisés pour valider ce système contrôlé par cytométrie de flux. Dans le futur, ce système pourrait être utilisé pour produire une lignée stable afin d'identifier les facteurs d’épissage impliqués dans la régulation de l’épissage alternatif par un criblage d’inhibition (siRNA) ou de surexpression (ADNc). Donc, mon projet présente la première identification des éléments cis qui contrôlent l’épissage du facteur aussi bien que le développement d’un système d'épissage rapporteur créé pour permettre l’identification des protéines d'épissage qui régulent l’expression de TAF6ð. [symboles non conformes]

Les déficits en pyruvate désydrogénase (PDH) constituent une des premières causes d'hyperlactatémie primaire chez les enfants atteints de maladies neurologiques mitochondriales. Un blocage de cette enzyme entraîne une élévation parallèle de la lactatémie et de la pyruvicémie (et du lactate et pyruvate dans le liquide céphalo-rachidien), avec un rapport lactate/pyruvate normal. Ces dosages simples sont le point de départ biologique de la recherche de déficit en PDH pour tous les patients et la majorité des patientes. Nous présentons dans la première partie de ce travail les résultats obtenus au laboratoire pour une cohorte de 30 patients. Dix-huit d'entre eux présentaient un anomalie au niveau du gène PDHA1(Xp22. 1-Xp22. 2), quatre au niveau du gène PDHX (11p13). Pour un patient, nous avons diagnostiqué un déficit en E3 (7p31. 1-7q32), sous-unité commune à trois déshydrogénases mitochondriales dont la PDH. Pour sept patients, nous n'avons pas identifié d'anomalie moléculaire malgré des signes clinico-biologiques trés évocateurs. Ces données sont discutées et comparées à celles de la littérature. Une proposition de conduite à tenir pour le diagnostic, en fonction des nouveaux outils d'analyse enzymatique et moléculaire que nous avons développés. Sera développée à la fin du document. Dans la seconde partie, nous détaillons les investigations moléculaires plus approfondies des déficits en PDH. Nous présentons la mise en place d'outils préliminaires qui permettront l'étude de la fonctionnalité des nouvelles mutations faux-sens chez S. Cerevisiae. Nous revenons en détail sur la détection de deux délétions intragéniques (sur les gènes PDHA1 et PDH X), sur l'étude d'un mosaïcisme somatique chez un garçon présentant une mutation au niveau du gène PDHA1 et sur deux mutations entraînant une dégradation de l'ARNm par le mécanisme de "Nonsense mRNA mediated Decay" (gènes PDHA1 et E3BP). Nous terminons par un récapitulatif des anomalies d'épissage. Dans la dernière partie, nous étudions le mécanisme moléculaire d'une mutation ponctuelle intronique sur la séquence du gène PGHA1, conduisant à une rétention partielle d'un intron au niveau de l'ARNm. Nous montrons par épissage in vitro que cette mutation intronique (IVS7+26G>A)entraîne l'utilisation d'un site cryptique d'épissage, "GT" en position 46 et 47 de l'intron 7. Ainsi que l'avait prédit le programme "ESE finder", nous montrons par UV-crosslinking que la protéine SC35, facteur d'épissage de la famille des protéines SR, se fixe avec une plus grande affinité sur la séquence intronique mutée G>A (ESE), entraînant ainsi une utilisation préférentielle du site donneur cryptique. Nous montrons enfin, qu'une déplétion en SC35 (obtenue par l'utilisation de SiRNA) sur les fibroblastes du patient entraîne une disparition de l'ARNm anormalement épissé. Ce travail démontre l'implication de l'interaction SC35/ESE et le rôle des séquences introniques en pathologie humaine. De plus, il ouvre de nombreuses voies de recherche au niveau de la thérapie des anomalies d'épissage.

La protéine SC35 appartient à la famille des protéines SR (Ser/Arg-rich) connues pour être des régulateurs cruciaux de l'épissage alternatif et constitutif. L'activité de ces protéines est largement régulée par phosphorylation. Alors que plusieurs études ont mis en évidence une dérégulation de l'expression des protéines SR au cours du processus de carcinogenèse, peu de données existent à ce jour concernant les voies de signalisation cellulaire qui contrôlent l'expression et/ou l'activité de ces protéines dans les cellules cancéreuses. Pour la première fois, nous démontrons que SC35 est une protéine acétylée. Cette modification post-traductionnelle met en jeu l'acétyltransférase Tip60 et la déacétylase HDAC6. Nos données mettent aussi en évidence une connexion étroite entre la phosphorylation et l'acétylation de SC35 pour le contrôle de son niveau d'expression et de son activité. Nous démontrons enfin que ces modifications post-traductionnelles de SC35 sont critiques pour l'induction de l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques et pour la mise en place d'un phénomène de sénescence en réponse au sodium butyrate, un inhibiteur d'histones déacétylases, dans différentes lignées cellulaires dérivées de carcinomes pulmonaires humains. La protéine E2F1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Au laboratoire, nous avons identifié la protéine SC35 comme une nouvelle cible transcriptionnelle directe de E2F1 et montré que les deux protéines coopèrent pour induire l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques. Nous démontrons dans ce travail que SC35 gouverne aussi l'entrée et la progression en phase S en contrôlant certains gènes cibles de E2F1 impliqués dans ce contexte, tels que la cycline E. Nous mettons en évidence que la voie de signalisation cellulaire PI3K/AKT est impliquée dans le contrôle de l'expression de la cycline E médié par les deux protéines E2F1 et SC35, notamment via la phosphorylation de SC35. Finalement, nous décrivons une corrélation directe entre le niveau d'expression protéique de la cycline E et de P-SC35 dans une série de tumeurs pulmonaires neuroendocrines. L'ensemble de ces travaux identifie donc de nouvelles voies de signalisation contrôlant les fonctions cellulaires de SC35 et ouvre des perspectives quant aux conséquences biologiques découlant de la dérégulation de l'expression de SC35 dans les cancers bronchiques.

Plusieurs étapes successives sont essentielles àl'expression génique, parmi lesquelles l'élimination de séquencesinternes des transcrits primaires des gènes par lemécanisme d'épissage. Le complexe macromoléculaire quiréalise cette modification des ARN, le spliceosome, est assemblépar étapes par le biais d'interactions protéine-protéine,ARN-ARN et protéine-ARN. D'abord, la ribonucleoprotéineU1snRNP reconnaît le site d'épissage 5', SF1 (SplicingFactor 1) se lie au site de branchement et U2AF(U2snRNP auxilliary factor) au tract de polypyrimidine et ausite 3' (complexe E). U2AF favorise alors l'ancrage deU2snRNP au point de branchement, à la place de SF1, pourformer le complexe A. Ensuite, le recrutement du tri-snRNPU4/U6-U5 conduit au complexe B, et finalement, des réarrangementsstructuraux libèrent U1 et U4 snRNP conduisantau complexe catalytique C. U2AF est un hétérodimère,avec une sous-unité de 35 kDa (U2AF35) liée par son domaineUHM (U2AF Homology Motif) au domaine ULM(UHM Ligand Motif) de la sous-unité de 65 kDa (U2AF65).En outre, U2AF65 présente deux motifs de reconnaissancede l'ARN, un UHM C-terminal et un domaine N-terminal defaible complexité (LCD) riche en arginine-sérine (RS). Dansce modèle, le domaine RS de U2AF65 facilite l'hybridationde U2snRNA au point de branchement et son domaineUHM interagit successivement avec les domaines ULM deSF1 et d'une sous-unité de U2snRNP, SF3b155. In vitro, l'affinitéde U2AF65 pour SF1 est relativement plus élevée quepour SF3b155. Les domaines defaible complexité sont souvent impliqués dans la formationde condensats par séparation de phase liquide-liquide(LLPS), ce qui contribue en particulier à la compartimentalisationde complexes moléculaires dans des organites sansmembrane. Nous avions déjà montré que le domaine RS deU2AF65 favorise la formation de condensats via LLPS. Ici,nous avons recherché les déterminants de ce mécanismeet en particulier la force saline, la température, la longueurdu domaine RS et la composition en acides aminés. Laformation de condensats via LLPS est connue pour êtremodulée par des modifications post-traductionnelles.Nous avons montré que la phosphorylation du domaineRS module la formation de condensats. En utilisant desexpériences de pull-down et des immunoprécipitations,nous démontrons que la délétion du domaine RS empêchel'interaction de U2AF65 à la fois avec SF1 etSF3b155, ce qui indique fortement le rôle du domaine RSdans ces interactions in vivo.En parallèle, nous avons comparé, à l'aide de la spectroscopiepar résonance magnétique nucléaire (RMN), les interactionsdu domaine UHM avec les domaines ULM deSF1 et SF3b155. Les perturbations des spectres HSQC de15N-U2AF65-UHM indiquent que l'interaction de SF3b155avec U2AF65 implique au moins trois ULM distincts, enaccord avec la littérature. Inversement, un dosage de15N-SF3b155-ULM par U2AF65-UHM révèle des perturbationsdes déplacements chimiques d'au moins trois résidustryptophane de SF3b155. Ces spectres HSQC deSF3b155-ULM montrent que ce domaine reste désordonnéen présence de U2AF65, ce qui pourrait faciliter lareconnaissance de plusieurs ULMs et la formation decondensats de U2AF65 en présence de SF3b155.Finalement, nous avons entrepris une collaboration avecla société Synsight afin d'identifier, par criblage in silico,des molécules capables de perturber les interactionsUHM-ULM. Nous avons identifié une petite molécule(C13) interagissant avec le domaine UHM de U2AF65comme le montrent des analyses RMN. La combinaisonde données de RMN et des simulations de dynamiquemoléculaire (MD) a permis d’apporter des informationssur le mode de liaison du C13 dans la poche hydrophobedu UHM. Nous avons également montré que C13 peutmoduler la liaison de U2AF65 à SF3b155. Ces résultatsprometteurs suggèrent que les interactions UHM-ULMpourraient être ciblées pour lutter contre des maladiesspécifiques telles que les cancers
Gene expression requires many layers ofregulation among which splicing consists in the removalof sequences from primary transcripts. For thisprocess, a macromolecular machinery, the spliceosome,undergoes a dynamic assembly through protein-protein, RNA-RNA and protein-RNA interactionsin a stepwise manner. The simplified view of assemblyof the spliceosome is that first, the ribonucleoproteinU1 snRNP recognizes the 5’ splice site, Splicing Factor1 (SF1) binds the branchpoint sequence andU2snRNP auxiliary factor (U2AF) binds the polypyrimidinetract and 3' splice site (complex E). U2AF assiststhe recruitment of U2 snRNP to the branch point sequenceto form the A complex. Later, the recruitmentof U4/U6-U5 tri-snRNP forges the B complex, uponwhich, structural rearrangements release U1 and U4snRNPs leading to the catalytic C complex. U2AF is aheterodimer, with its 35kDa subunit (U2AF35) boundthrough its U2AF Homology Motif (UHM) domain tothe ULM (UHM Ligand Motif) of the 65kDa subunit(U2AF65). In addition, U2AF65 presents two RNArecognition motifs, a C-terminal UHM and a N-terminalarginine-serine (RS) rich low complexity domain(LCD). In this model, the RS domain of U2AF65 stabilizesthe U2snRNA-branchpoint sequence duplex andthe U2AF65-UHM domain recognizes successively theULM motif of SF1 and several ULMs in the U2snRNPsubunit SF3b155. In vitro, the affinity of U2AF65 forSF1 is relatively better than for SF3b155. LCD are often involved in the formation of condensatesthrough liquid-liquid phase separation (LLPS),which contribute for example to the compartmentalizationof biological molecules in membrane-less organelles.We have previously reported that U2AF65promotes the formation of such condensates viaLLPS. In line with this work, we have characterized theU2AF65 interactions supported by condensates formationrelatively to physicochemical parameters, includingsalt concentration and temperature, as wellas the length of the RS domain and its amino acidcomposition. Furthermore, LLPS can be modulatedby post-translational modifications. We havedemonstrated that the phosphorylation state of theRS domain modulates the formation of U2AF65condensates in vitro. Using pulldown experimentsand immunoprecipitations, we demonstrate thatthe deletion of the RS domain prevents the interactionof U2AF65 with both SF1 and SF3b155, whichstrongly indicates the actual contribution of the RSdomain in UHM-ULM interaction.In parallel, we compared, using nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy, the interactions ofthe hydrophobic core of the U2AF65-UHM domainwith the ULM domains of SF1 and SF3b155. Perturbationsof the 15N-U2AF65-UHM HSQC spectrumindicates that SF3b155 interaction with U2AF65-UHM is supported by at least three ULMs, which isconsistent with previous reports. In agreement, increasingthe stoichiometry of U2AF65-UHM against15N-SF3b155-ULM reveals stepwise changes inchemical shift perturbations of at least three tryptophanresidues, in the SF3b155-ULM spectrum. Interestingly,these HSQC spectra of SF3b155-ULMdid not reveal any structuration upon U2AF65-UHMbinding, suggesting a role of this dynamics to favourthe binding to several ULMs and the formationof U2AF65 condensates in the presence ofSF3b155.Lastly, we initiated a collaboration with the Synsightcompany in order to identify molecules ableto perturbate UHM-ULM interactions. Through insilico analyses, we obtained a small molecule (C13)displaying affinity for U2AF65-UHM as evidenced byNMR analyses. Through NMR and molecular dynamics(MD) simulations, we obtained insights intothe C13 binding mode in the U2AF65-UHM hydrophobicpocket. Using an in vitro binding assay, weshowed that C13 can modulate the binding ofU2AF65 to SF3b155. These promising results suggestthat UHM-ULM interactions could be targetedto fight specific diseases such as cancers

Les amplifications de répétitions de triplets CTG dans le gène DMPK humain sont à l'origine de la dystrophie myotonique de type 1 ou DM1. Les répétitions CUG présentes dans les ARNm DMPK séquestrent le facteur d'épissage MBNL1 au sein de foci nucléaires et dérégulent l'épissage des pré-ARNm cibles de MBNL1. Par ailleurs, 9 isoformes de MBNL1, produites par épissage alternative, coexistent dans les cellules. Dans un premier temps nous avons recherché quels exons constitutifs ou alternatifs étaient requis pour la reconnaissance des ARN, la régulation de l'épissage et la localisation cellulaire de MBNL1. Nous avons ensuite entrepris de rechercher par l'approche SELEX les séquences de haute affinité pour MBNL1. Nous avons ainsi identifié une séquence conservée de 12 nucléotides de long, contenant un seul motif de fixation pour MBNL1 et adoptant une structuration tige-boucle particulière. L'importance de cette structuration a été confirmée par l'existence de mutants compensatoires au sein des ARN sélectionnés. Finalement nous avons étudié les mécanismes de régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm de la troponine T cardiaque humaine (hcTNT). Une approche in cellulo nous a permis d'identifier les séquences minimales requises pour la régulation de l'épissage en conditions normales et en présence des répétitions CUG. Au sein de ces séquences nous avons identifié 6 nouveaux sites MBNL1 dont nous avons montré l'importance fonctionnelle in cellulo et in vitro. Nous avons également mis en évidence l'implication d'autres séquences régulatrices dans la régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm hcTNT et un rôle de la protéine hnRNP H dans ces régulations. L'ensemble de ces données apportent de nouveaux éléments d'information importants pour la compréhension de la DM1
Amplifications of CTG motifs in the human DMPK gene are responsible for Myotonic Dystrophy of type 1. The resulting CUG repeats in pre-mRNAs capture the MBNL1 splicing factor, leading to mis-regulation of MBNL1 pre-mRNA targets. Due to the recent discovery of MBNL1 and its numerous isoforms (9) resulting from alternative splicing, little is known on how MBNL1 regulates splicing and how a decreased level of available MBNL1 generates splicing miss-regulations. First, we defined which of the MBNL1 alternative and constitutive exons are required for: i) RNA binding, ii) splicing activity and, iii) MBNL1 sub-cellular localization. Second, for a more precise definition of the MBNL1 RNA binding properties, we performed SELEX experiments using a library of RNA stem-loop structures containing a 18-nt long randomized sequence. Its leads to the identification of 12-nt long sequence adopting a peculiar stem-loop structure, whose importance for MBNL1 binding was revealed by its preservation by compensatory base-pair mutations. Finally, based on the above data, we studied the mechanisms involved in regulation of hcTNT exon 5 splicing. By in cellulo assays, we defined the hcTNT pre-mRNA region required for both normal inclusion and for the trans-dominant effect of CUG repeats. Within this region, we identified six new potential MBNL1 sites and demonstrated their functional role by in vitro and in cellulo assays. We also identified several additional splicing regulatory elements involved in normal and CUG-deregulated exon 5 inclusion and already showed a role of hnRNP H in splicing regulation. Altogether, our data bring new information important for understanding the pathology

Les protéines U2AF65, CAPERα, PUF60 et SPF45 sont des facteurs d'épissage qui possèdent des domaines similaires appelés UHM et qui interagissent pendant les étapes précoces de l'épissage avec des protéines qui possèdent des domaines ULM, comme SF3b155. Par des approches biochimiques, nous avons mis en évidence la formation d'assemblages macromoléculaires par U2AF65 et CAPERα au contact du domaine multi-ULM de SF3b155. En diminuant les taux d'expression des facteurs d'épissage à domaines UHM avec des shRNA et en analysant par qPCR l'épissage de 65 exons cassette, nous avons identifié un rôle activateur de CAPERα, U2AF65 et PUF60 et un rôle répresseur de SPF45 dans l'épissage. Plus particulièrement, CAPERα et U2AF65 activent l'épissage des exons cassette présentant des séquences flanquantes en 5' riches en motifs polypyrimidine. De plus, ces séquences favorisent la formation des assemblages macromoléculaires de U2AF65 et CAPERα. Appuyés par ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel des interactions multivalentes conduisent à la formation d'assemblages macromoléculaires par CAPERα et U2AF65 ; ces complexes ont une affinité particulière d'une part pour les séquences introniques riches en motifs polypyrimidine et d'autre part avec le domaine multi-ULM de SF3b155. L'ensemble de ces interactions favorise la reconnaissance des sites 3' d'épissage
U2AF65, CAPERα, PUF60 and SPF45 are splicing factors that hold similar domains called UHM that interact during the early splicing steps with ULM domains proteins, such as SF3b155. Using biochemical approaches, we highlighted the formation of macromolecular assemblies by U2AF65 and CAPERα in contact with the multi-ULM domain of SF3b155. The inhibition of the expression of the UHM splicing factors by shRNA, followed by a qPCR analysis of 65 cassette exons led us to identify an activating role of CAPERα, U2AF65 and PUF60 and a repressing role of SPF45 in splicing. Particularly, CAPERα and U2AF65 activate splicing of cassette exons presenting long pyrimidine-rich 5' flanking regions. Moreover, these regions favor the formation of macromolecular assemblies of U2AF65 and CAPERα. On the basis of these results, we propose a model in which multivalent interactions lead to CAPERα and U2AF65 macromolecular assemblies; these assemblies present a particular affinity on one hand for long pyrimidine-rich introns and on the other one for the multi-ULM domain of SF3b155. All these interactions promote 3' splice sites recognition

Notre projet consiste à modéliser une forme spécifique de rétinite pigmentaire (RP) en utilisant des cellules iPS de patients. Nous avons d'abord optimisé un protocole de différenciation pour obtenir à partir de cellules iPS des organoïdes rétiniens avec une organisation structurelle plus proche de la rétine in vivo, permettant une maturation avancée des photorécepteurs. Cet outil nous a permis de récapituler entièrement le phénotype RP (dégénérescence des bâtonnets et des cônes), observé chez les patients présentant une mutation du gène RHODOPSINE, codant pour le pigment visuel. Nous avons ensuite utilisé la même approche pour comprendre la pathogénicité des RP liées à des mutations du gène PRPF31, codant pour un facteur d'épissage. Les organoïdes rétiniens ont résumé la dégénérescence des bâtonnets et la perte secondaire des cônes, observées chez les patients. Les cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine présentaient également des défauts organisationnels et fonctionnels. Ces phénotypes dégénératifs rétiniens sont corrélés à un niveau d'expression plus faible de la protéine PRPF31, liant la pathogénicité à un mécanisme d'haploinsuffisance. Nous avons donc développé une stratégie d'augmentation du gène, en apportant une copie fonctionnelle de PRPF31 par CRISPR/Cas9 ou en utilisant un vecteur AAV, qui ont permis le sauvetage de la dégénérescence des cellules rétiniennes
Generation of retinal cells from human iPS cells offers the opportunity to study the effects of specific disease-causing mutations in an in vitro human system. Our project consisted of modeling specific form of Retinits Pigmentosa (RP) using patient iPS cells. We first optimized a differentiation protocol to obtain retinal organoids with a structural organization closer to the retina in vivo, allowing advanced photoreceptor maturation. Using this tool, we were able to fully recapitulate the RP phenotype (degeneration of rods and cones), observed in patients with mutation in RHODOPSINE gene, coding for the visual pigment. Then, we used the same approach to understand the pathogenicity of RP related to mutations in PRPF31 gene, coding for a splicing factor. Retinal organoids summarized the degeneration of mature rods and secondary loss of cones, as observed in patients. Furthermore, PRPF31-mutated retinal pigmented epithelial cells exhibited also structural and functional defective phenotype. These retinal degenerative phenotypes are correlated with a lower level expression of PRPF31 protein, linking causal mutations to an haploinsufficiency mechanism. We thus have developed a gene augmentation strategy, bringing an additional wild type copy of PRPF31 through CRISPR/Cas9 or using an AAV vector, that both allowed the rescue of retinal cell degeneration