Дисертації з теми "Inhibiteurs de points de contrôle immunitaire"

Les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (IPCI) ont révolutionné la prise en charge de certains cancers avancés mais leur succès dépend de divers facteurs génétiques, biologiques et environnementaux. De multiples études rétrospectives ont montré des associations négatives entre l’usage d’un inhibiteur de pompe à proton (IPP) et la réponse clinique à un IPCI. Ces IPP sont également connus pour perturber la composition du microbiote intestinal, un élément clé dans la modulation de la réponse immunitaire aux IPCI. Nous avons émis l’hypothèse que la dysbiose induite par les IPP pourrait être à l’origine d’un effet défavorable des IPP envers la réponse tumorale aux IPCI. Nous avons utilisé des modèles murins de cancer en greffe sous-cutanée pour étudier la réponse immunitaire antitumorale au cours d’un traitement par IPCI de manière concomitante ou non à un traitement IPP (oméprazole). Nos premiers résultats ont montré des modifications du microbiote intestinal chez les souris traitées par oméprazole, toutefois sans effet sur l’efficacité des IPCI. La dysbiose intestinale associée aux IPP chez l’Homme étant probablement due au passage de bactéries orale dans l’intestin, nous avons transplanté un microbiote oral humain chez les souris pour reproduire cet effet chez la souris. La présence de ce microbiote oral associée au traitement IPP semble compromettre le contrôle de la progression tumorale chez les souris, mais devra être confirmé. En parallèle nous avons montré in vitro que l’oméprazole exerce un effet direct sur les fonctions effectrices des lymphocytes T et NK, notamment sur l’expression de FasL membranaire. L’administration d’oméprazole chez la souris a par ailleurs été associé à une diminution de l’expression de FasL à la membrane des cellules T/NK isolés des tumeurs ou du sang périphérique. Ces travaux encouragent à approfondir la recherche du rôle de bactéries orales dans l’effet de l’oméprazole sur la réponse immunitaire antitumorale mais suggèrent également de considérer l’effet direct de l’oméprazole sur les fonctions immunitaires au sein des tumeurs
Immune checkpoint inhibitors (ICIs) have revolutionized the management of many advanced cancers, but their success depends on genetic, biological, and environmental factors. Multiple retrospective studies have shown negative associations between the use of proton pump inhibitors (PPIs) and clinical response to ICIs. PPIs are also known to modify the composition of the gut microbiome, a key factor in modulating the immune response to ICIs. We hypothesized that PPI-induced dysbiosis could be responsible for the negative association to clinical outcomes in cancer patients. We used murine models of subcutaneous cancer grafts to study the antitumor immune response during ICI treatment, either concomitantly or not with PPI treatment (omeprazole). Our initial results showed changes in the gut microbiome in mice treated with omeprazole, but without any impact on the efficacy of ICIs. Since the PPI-associated intestinal dysbiosis in humans is likely due to the translocation of oral bacteria into the intestine, we transplanted a human oral microbiome into mice to mimic this effect. The presence of this oral microbiome, combined with PPI treatment, appeared to impair tumor progression control in mice but needs further experiments. In parallel, we demonstrated in vitro that omeprazole exerts a direct effect on the effector functions of T and NK cells, particularly on the expression of membranebound FasL. Additionally, omeprazole administration in mice was associated with decreased FasL expression on the surface of T/NK cells isolated from tumors or peripheral blood. These findings encourage further research into the role of oral bacteria in the effects of omeprazole on the antitumor immune response, while also suggesting that the direct impact of omeprazole on immune functions within tumors should be considered

En raison du manque d'efficacité et de la toxicité des thérapies conventionnelles contre le cancer, la recherche s'est concentrée sur le développement de nouvelles stratégies. Ces efforts ont été à l'origine de l'essor de l'immunothérapie, dont les acteurs les plus récents sont les anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôles immunitaires (PCI). Parmi ces inhibiteurs des PCI, on retrouve les anticorps ciblant la protéine de surface « Programmed Cell Death 1 », les anti-PD1, et ceux ciblant son ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », les anti-PDL-1. Ces anticorps ont démontré une efficacité spectaculaire dans plusieurs types de cancers, et sont aujourd'hui couramment utilisés en clinique comme thérapies dans le mélanome, le cancer du poumon, de la vessie et du rein. Cependant, ces traitements ne profitent pas à tous les patients atteints de cancer, avec en moyenne 60% de résistance innée, et 25% de résistance acquise après une réponse primaire aux anticorps, variable selon le type de tumeur. Les phénomènes impliqués dans la résistance sont à l'heure actuelle peu connus. Ainsi, l'objectif de mon projet de recherche consistait à établir des modèles in vivo de résistance acquise aux anti-PD1 et anti-PDL 1. Pour ce faire, nous avons utilisé des tumeurs syngéniques de rein (RENCA), de vessie (MB49 et MBT-2) et de colon (MC38) et des souris immunocompétentes, que nous avons rendues résistantes aux traitements en les soumettant à des séries de réimplantation de tumeurs et de traitements, induisant une pression de sélection jusqu'à l'obtention d'un phénotype résistant. Le succès du blocage de l'axe PD1/ PDL-1 étant fortement lié à l'état du microenvironnement tumoral, nous avons mis en place un protocole d'immunophénotypage. Nous avons ainsi pu observer les cellules au profil « anti-tumoral », telles que les cellules T, les Natural Killer, et les macrophages M1, mais également les cellules ayant une fonction immunosuppressive, telles que les macrophages M2, les MDSC, les Treg. Enfin, certaines études ayant identifié une sur-régulation des PCI inhibiteurs alternatifs dans les cas de résistance acquise à l'anti-PD1, nous avons également observé l'expression de LAG3, TIM3 et TIGIT en plus de l'expression de PD1 et PDL-1. Nous avons ainsi pu déterminer que la résistance semble très fortement dépendante du modèle tumoral, même si nous avons pu identifier une diminution des macrophages M1 anti-tumoraux dans l'ensemble des modèles résistants à l'anti- PD1, et une augmentation des Treg dans les modèles résistants à l'anti-PDL-1, suggérant un mécanisme commun de résistance propre respectivement à l'anti-PD1 et à l'anti-PDL-1. Suite à l'identification par Zaretsky et al. de gènes impliqués dans la voie interféron dans des cas de résistance acquise de mélanome traité à l'anti- PD1, nous avons également décidé d'étudier le profil moléculaire des tumeurs résistantes. Cela nous a permis d'identifier 5 gènes communs entre les modèles anti- PD1 et anti-PDL-1 résistants, dont SERPINF1 et FCNA qui semblent prometteurs comme cibles à valider. Enfin, en parallèle de l'établissement et de la caractérisation des modèles de résistance acquise, nous avons testé de nouvelles approches thérapeutiques de potentialisation des anticorps anti-PD1 et anti-PDL-1 en combinaison avec des chimiothérapies de référence pour le cancer étudié. Nous avons ainsi démontré une potentialisation dans les modèles sauvages de cancer du côlon MC38 et de la vessie MB49, aucun effet de la combinaison dans le modèle de cancer du sein métastatique 4T1, et une inhibition de l'effet de l'anti-PDL-1 avec la combinaison dans le modèle de vessie MBT-2. L'immunophénotypage nous a permis de constater ici aussi des différences très importantes entre les modèles tumoraux, au niveau basal et après traitement [etc...]
Because of the limited efficacy and the toxicity of conventional therapies to fight cancer, researchers focused on the new trategies. These efforts lead to the emergence of immunotherapies, whose msot recent actors are the monoclonal antibodies targeting immune checkpoint (ICP). Among those ICP inhibitors, we found antibodies targeting the surface protein « Programmed Cell Death 1 », called anti- PD1, and those targeting its ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », called anti- PDL-1. Those antibodies shown a great efficacy in a wide diveristy of cancers, and are currently used for clinical practice in the case of melanoma, lung cancer, bladder cancer and renal cell carcinoma. However, those treatments don’t benefit to all tumor bearing patients, with a mean of 60% of innate resistance, and 25% of acquired resistance following a primary response, variable according to tumor type. Phenomena involved in resistance are currently poorly described. In this context, the aim of my project was to establish in vivo preclinical models of acquired resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1. To do that, we used syngeneic renal cancer (RENCA), bladder cancer (MB49 and MBT-2), and colorectal cancer (MC38), and immunocompetent mice, that we have made resistant by serial reimplantations of tumors pieces and serial treatments, inducing a selection pressure until we obtained a resistant phenotype. The efficiency of PD1/PDL-1 axis blocking is strongly linked to the microenvironment composition, as a result we realized an immunophenotyping protocol. We observed anti-tumor cells as T cells, Natural Killer cells, and M1 macrophages, but also cells harboring immunosuppressive functions, as M2 macrophages, MDSC, and Treg. Moreover, some studies have identified an upregulation of alternatives ICP in the context of acquired resistance to anti-PD1, so we also observed the expression of LAG3, TIM3 and TIGIT besides PD1 and PDL-1 expression. We shown that resistance is strongly dependant to the tumor model, even if we identified a decrease of anti-tumor M1 macrophages is models resistant to anti-PD1, and an increase of Treg in models resistant to anti-PDL-1, suggesting a common mechanism of resistance specific to respectively anti PD1 and anti-PDL-1. Following Zaretsky and al. identification of genes involved in interferon pathway in the case of acquired resistance to anti-PD1 in melanoma, we decided to study the molecular profile of resistant tumors. We identified 5 common genes differently modulated between anti-PD1 and anti-PDL-1 resistant models, including SERPINF1 and FCNA which seems to be promising as targets to validate. Lastly, in parallel to establishment and characterization of preclinical models of acquired resistance, we tested new therapeutical approches of anti-PD1 and anti- PDL-1 potentiation in combination with reference chemotherapies. We shown a synergy in wild-type colorectal and bladder cancers (MC38 and MB49), no effect of the combination in metastatic breast cancer 4T1, and an inhibition of anti-PDL 1 effect in bladder cancer MBT-2. Immunphenotyping of tumors allowed us to observe here also high differences between tumor models, both at baseline and after treatments initiation. To conclude, even if our results need a validation with patients samples, we demonstrated that different cellular and molecular modifications could be involved in resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1, and that resistance could be bypass with chemotherapy combination, according to tumor type

Les checkpoints immunitaires sont des récepteurs qui régulent négativement les réponses des lymphocytes T déclenchées par les récepteurs d'antigène (TCR) par les récepteurs de co-stimulations. Les thérapies basées sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux visant à bloquer ces récepteurs ont considérablement amélioré l'efficacité des thérapies contre le cancer. Le checkpoint immunitaire BTLA régule l'activation des lymphocytes T et la maintenance des lymphocytes T CD8+ en périphérie en inhibant la signalisation émanant du TCR par l'intermédiaire de la tyrosine-phosphatase à domaine SH2, SHP-1. BTLA est exprimé au sur les lymphocytes T en cours de développement dans le thymus au stade de la sélection positive mais on ignore ses fonctions biologiques dans ce contexte. THEMIS est une protéine de signalisation essentielle au développement des lymphocytes T et au maintien des lymphocytes T CD8+ dans les tissus périphériques. La délétion du gène codant pour THEMIS est associée à un défaut de la sélection positive des thymocytes et à une lymphopénie. THEMIS stimule la sélection positive et le maintien des lymphocytes T CD8+ en inhibant l'activité catalytique de SHP-1. Nous avons émis l'hypothèse que THEMIS puisse stimuler la sélection positive et le maintien des lymphocytes T CD8+ en réprimant les fonctions inhibitrices de BTLA. Nous avons montré que la délétion du gène codant pour THEMIS dans des modèles de souris accroit la capacité de BTLA à inhiber l'activation et la différentiation des lymphocytes CD4+ et CD8+.THEMIS est recruté à BTLA et réprime l'activité phosphatase de SHP-1 en augmentant l'oxydation de sa cystéine catalytique. La déficience en THEMIS n'a cependant pas d'effet sur les fonctions inhibitrices du checkpoint immunitaire PD-1 qui dépend principalement de la tyrosine-phosphatase SHP-2. Nous montrons que la délétion du gène codant pour BTLA restaure la sélection positive dans les souris déficientes pour THEMIS, indiquant que THEMIS stimule la sélection positive en bloquant la signalisation inhibitrice de BTLA. THEMIS stimule aussi le maintien des lymphocytes T CD8+ périphériques en diminuant la capacité de BTLA à inhiber les signaux de survie déclenchés par les récepteurs à l'IL-2 et à l'IL-15. Ces résultats suggèrent que les signaux inhibiteurs déclenchés par les checkpoints immunitaires dépendent des interactions avec leurs ligands mais sont aussi contraints par des protéines intracellulaires qui modulent le seuil à partir duquel ces récepteurs sont capables d'inhiber les lymphocytes T. Ces résultats ont des conséquences dans la compréhension des mécanismes thérapeutiques impliqués dans le traitement du cancer et dans les mécanismes liés à l'émergence des maladies auto-immunes
Immune checkpoints are receptors that negatively regulate T lymphocyte responses triggered by antigen receptors (TCR) via co-stimulatory receptors. Therapies based on the use of monoclonal antibodies targeting these receptors have significantly improved the efficacy of cancer therapies. The immune checkpoint BTLA regulates T lymphocyte activation and maintenance of peripheral CD8+ T lymphocytes by inhibiting signaling emanating from the TCR through the SH2 domain-containing tyrosine phosphatase, SHP-1. BTLA is expressed on T lymphocytes during development in the thymus at the positive selection stage, but its biological functions in this context are unknown. THEMIS is a signaling protein essential for T lymphocyte development and maintenance of CD8+ T lymphocytes in peripheral tissues. Deletion of the gene encoding THEMIS is associated with a defect in positive selection of thymocytes and lymphopenia. THEMIS promotes positive selection and maintenance of CD8+ T lymphocytes by inhibiting the catalytic activity of SHP-1. We hypothesized that THEMIS may promote positive selection and maintenance of CD8+ T lymphocytes by repressing the inhibitory functions of BTLA. We have shown that deletion of the gene encoding THEMIS in mouse models increases BTLA's ability to inhibit activation and differentiation of CD4+ and CD8+ lymphocytes. THEMIS is recruited to BTLA and represses SHP-1 phosphatase activity by increasing oxidation of its catalytic cysteine. Deficiency in THEMIS, however, has no effect on the inhibitory functions of the immune checkpoint PD-1, which primarily depends on the tyrosine phosphatase SHP-2. We show that deletion of the gene encoding BTLA restores positive selection in THEMIS-deficient mice, indicating that THEMIS promotes positive selection by blocking BTLA's inhibitory signaling. THEMIS also promotes maintenance of peripheral CD8+ T lymphocytes by reducing BTLA's ability to inhibit survival signals triggered by IL-2 and IL-15 receptors. These results suggest that inhibitory signals triggered by immune checkpoints depend on interactions with their ligands but are also constrained by intracellular proteins that modulate the threshold at which these receptors are able to inhibit T lymphocytes. These findings have implications for understanding the therapeutic mechanisms involved in cancer treatment and the mechanisms underlying the emergence of autoimmune diseases

Les anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant les inhibiteurs de checkpoints immunitaires, tels que PD-1 et CTLA-4, ont pour objectif d'induire la réactivation de l'immunité anti-tumorale. Cependant, une limite à l'utilisation de ces immunothérapies anti-cancéreuses est l'émergence de toxicités auto-immunes ou irAEs (« immune-related adverse events »). La survenue d'effets secondaires spécifiquement associés à ce type de traitement est observée chez 30 à 90% des patients. De plus, les toxicités peuvent nécessiter une réduction ou un arrêt de l'immunothérapie. Des premières études ont démontré une importante implication des lymphocytes T, ciblés par les immunothérapies, dans l'émergence d'effets secondaires. Cependant, une contribution importante des lymphocytes B dans les réponses anti-tumorales suggèrent également un rôle de l'immunité humorale dans ces toxicités. Une étude phénotypique et fonctionnelle des lymphocytes B périphériques et des autoanticorps circulants a donc été conduite sur deux cohortes de patients atteints de cancer solide, traités par immunothérapie et développant ou non des toxicités. La caractérisation des lymphocytes B périphériques au cours du traitement a été réalisé par cytométrie spectrale. De plus, un protocole de culture de lymphocytes B triés nous a permis d'étudier leur capacité de production d'anticorps et leur association avec l'émergence de toxicités. Des approches complémentaires ont été réalisées afin d'évaluer l'auto-réactivité sérique et plasmatique des patients au cours de l'immunothérapie, notamment chez des patients développant des effets secondaires cardiaque et/ou musculaire. L'étude des fonctions pathogéniques des auto-anticorps issus de patients et présentant des réactivités contre des antigènes cardiaques a été réalisée sur des lignées de cardiomyocytes et dans un modèle de sphéroïdes cardiaques. Chez les patients atteints de mélanome et développant des toxicités, une faible expression de molécules inhibitrices (FcγRIIB, CD85j et LAIR-1) à la surface des lymphocytes B périphériques a été observé. Par ailleurs, les lymphocytes B issus de patients atteints de cancer du poumon et développant des toxicités présentent une forte expression du marqueur d'activation CD95 et de re-circulation CXCR5. D'autre part, un enrichissement en populations de lymphocytes B hautement différenciées et activées a été identifié avant l'initiation du traitement chez les patients ayant développé des toxicités. De plus, nous avons identifié chez des patients présentant des toxicités des titres élevés d'auto-anticorps. Ces auto-anticorps peuvent être dirigés contre des autoantigènes cardiaques et musculaires chez des patients atteints de myocardites et/ou myosites. Pour finir, des résultats préliminaires ont permis d'identifier une fixation des auto-anticorps réactifs contre des antigènes cardiaques sur des lignées de cardiomyocytes. Le traitement de sphéroïdes cardiaques avec ces auto-anticorps peut induire une altération de leur contractilité et de la cinétique calcique associée. Nous avons donc mis en évidence une forte activation des lymphocytes B périphériques, associée à une production d'auto-anticorps, chez des patients ayant développé des effets secondaires. Ces résultats soutiennent un rôle potentiel de l'immunité humorale dans les mécanismes sous-jacents à l'émergence d'effets secondaires faisant suite aux immunothérapies anti-checkpoints immunitaires
Immune checkpoints inhibitors (ICI) have revolutionized the treatment of previously incurable malignancies. Unfortunately, the use of ICI also induces a bystander breakdown of peripheral tolerance leading to immune related Adverse Events (irAEs) in 30-90% of treated patients, drastically reducing quality of life and requiring therapy dose reduction or discontinuation. As ICI directly target T cells, they have been considered the main culprit for irAEs. Nevertheless, T cells cannot fully explain adverse events, and the role of B cells and their associated mechanisms have not been characterized. We therefore studied the involvement of peripheral B-cell compartment in irAEs, using both phenotypic and functional approaches, in two cohorts of solid cancer patients treated with anti-PD-1 and/or anti-CTLA-4 monoclonal antibodies. Deep phenotyping of B-cell subsets throughout the treatment and at the onset of irAEs has been performed by multi-parametric spectral flow cytometry. Subsequently, to analyze the functions of B-cell subsets, notably their ability to produce antibodies, we set-up a B-cell culture system allowing in vitro differentiation of B cells into antibody-secreting cells. This gave us the opportunity to analyze the antibody production by circulating B cells and their association with irAEs occurence. The screening of circulating B cells phenotype and function was conducted alongside the evaluation of the serum and plasma reactivity of cancer patients by complementary approaches (ELISA, Western Blot, Immunofluorescence assays). We found that, before treatment, patients that develop ICI-induced irAEs exhibit a significantly lower expression on B cell subsets of the FcγRIIB, CD85j and LAIR-1 inhibitory receptors in melanoma patients and higher expression of the CD95 and CXCR5, respectively activating and lymphoid organs re-circulatory markers in lung cancer patients. In addition, increased in baseline abundance of hyper-activated IgD- memory B cell subset or plasmablasts precursor were observed in patients that will undergo irAEs. Moreover, a part of irAEs patients exhibit baseline or ICI-induce circulating autoantibodies which could be directed against the related tissue of irAEs occurrence. Indeed, patients experiencing cardiac/muscular irAEs demonstrated autoantibodies directed against cardiac tissues and well-defined cardiac/muscle antigens. Finally, IgG derived from cardiac/muscular irAEs patients bound to human cardiomyocytes and perturbed the calcium kinetic and the contractibility of cardiac spheroids. These findings highlight a predisposition of irAEs incidence in patients with baseline highly activated and differentiated circulating B cells associated with autoantibody production. Overall, these results support the potential role of the humoral adaptative immunity in the mechanisms of ICI-induced irAEs

Mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et mieux cibler les traitements, selon les caractéristiques de la personne et de sa tumeur, font l'objet de recherches intensives , dans le cadre de la médecine cancérologique de précision et personnalisée. Celle-ci commence à intégrer les horloges circadiennes moléculaires, qui génèrent des oscillations périodiques d'environ 24 h du métabolisme, de la prolifération et de la mort cellulaire, ainsi que des réponses aux substances toxiques ou thérapeutiques. De nombreuses études expérimentales, cliniques et épidémiologiques ont montré le rôle important du système circadien dans toutes les étapes de la cancérogenèse, depuis l'initiation et la promotion jusqu'à la progression et la dissémination métastatique. Le système circadien influence aussi la tolérance et l'efficacité des traitements anticancéreux tant dans les modèles expérimentaux que chez les patients. Constatant une apparente grande homogénéité des réponses temporelles à l'immunothérapie des cancers dans ma pratique clinique, j'ai recherché le rôle du moment d'administration et des rythmes circadiens dans l'efficacité des inhibiteurs de points-de-contrôle immunologiques. En effet, cette dernière décade a vu émerger l'immunothérapie comme traitement de référence de plusieurs types de cancer. Cependant tous les patients n'en bénéficient pas, et la guérison ne concerne qu'un faible nombre d'entre eux. Mon travail de thèse a d'abord mis en évidence le rôle de l'heure d'administration des inhibiteurs de point de contrôle immunologique sur leur efficacité et leur tolérance chez des patients atteints de cancer du poumon non-à petites cellules, avec notamment un quadruplement de la survie des patients traités le matin en comparaison de l'après-midi ou la soirée. J'ai ensuite montré, dans une première méta-analyse puis dans une revue de synthèse, que l'administration matinale de l'immunothérapie doublait en moyenne la survie et la survie sans progression des patients atteints de huit types différents de cancer. J'ai alors proposé les mécanismes circadiens principaux capables d'influencer l'efficacité de l'immunothérapie au cours des 24 heures. Enfin, mon travail montre que l'administration matinale d'un inhibiteur de point de contrôle immunologique permet aussi de doubler son efficacité en comparaison d'une administration l'après-midi, malgré son association avec une chimiothérapie immunosuppressive. De plus, les horaires des quatre premiers cycles récapitulent de façon satisfaisante la quasi-intégralité de l'effet chrono-immunothérapeutique. En conclusion, la découverte d'un impact majeur de l'heure d'administration de l'immunothérapie anticancéreuse sur son efficacité est en faveur d'une synchronisation inter-patients des mécanismes circadiens de sa pharmacodynamie vis-à-vis des cellules du système immunitaire. La caractérisation des différences inter-patients de la synchronisation circadienne pourrait encore permettre l'optimisation personnalisée de cette chronoimmunothérapie
A better understanding of physiopathological mechanisms and better-targeted treatments, according to the characteristics of the patient and his/her tumor, are the focus of intensive research, within the framework of precision and personalized cancer medicine. Precision medicine is now beginning to integrate molecular circadian clocks, which generate periodic oscillations of around 24 h in metabolism, cell proliferation and death, as well as responses to toxic or therapeutic drugs. Several experimental, clinical and epidemiological studies have demonstrated the important role of the circadian timing system in all stages of carcinogenesis, from initiation and promotion to progression and metastatic dissemination. The circadian timing system also influences tolerance and efficacy of anti-cancer treatments, both in experimental models and in patients. After my initial observation of an apparent great homogeneity in the temporal responses to cancer immunotherapy in my clinical practice, I have been investigating the role of dosing time and circadian rhythms in the efficacy of immune checkpoint inhibitors. Indeed, immunotherapy has emerged as a standard anticancer treatment for several cancer types in the last decade. However, not all patients benefit from it, and only a small number are cured. My current thesis project results first highlighted the role of the time of administration of immune checkpoint inhibitors on their efficacy and tolerability in patients with non-small cell lung cancer, with a four-fold increase in survival of patients treated in the morning compared with the afternoon or evening. I then showed, in a first meta-analysis and then in a review, that morning administration of immunotherapy doubled on average the survival and progression-free survival of patients with eight different types of cancer. I then propose the main circadian mechanisms that can influence the efficacy of immunotherapy over the course of 24 hours. Finally, my work shows that morning administration of an immune checkpoint inhibitor also doubles its efficacy compared with afternoon administration, despite its combination with immunosuppressive chemotherapy. Moreover, the administration times of the first four immunochemotherapy cycles recapitulate the chrono-immunotherapeutic effect of the treatment over its full duration the vast entire. In conclusion, the discovery of a major impact of the time of administration of cancer immunotherapy on its efficacy is in favor of between-patient synchronization of the circadian mechanisms of its pharmacodynamics vis-à-vis immune system cells. The characterization of between-patient differences in circadian synchronization could further enable personalized optimization of cancer chronoimmunotherapy

Article 1 : Inhibiteurs de points de contrôle dans le carcinome rénal papillaire métastatique : le carcinome papillaire à cellules rénales (pRCC) est le CCR à cellules non claires (nccRCC) le plus courant et une entité distincte, bien qu'hétérogène, associée à de mauvais pronostics. Le paysage thérapeutique du pRCC métastatique (mpRCC) reposait jusqu'à présent sur des thérapies ciblées, imitant les développements antérieurs dans le carcinome rénal métastatique à cellules claires. Cependant, les antiangiogéniques ainsi que les inhibiteurs de mTOR ne conservent qu'une activité limitée dans le mpRCC. Alors que le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) est actuellement en cours chez les patients atteints de mpRCC, notre objectif était de discuter des données d'activité précoces et du potentiel de futures stratégies thérapeutiques en monothérapie ou en association. L'expression de points de contrôle immunitaires tels que PD-L1 et de cellules immunitaires infiltrantes dans le pRCC pourrait fournir des informations sur leur immunogénicité potentielle, bien que celle-ci soit actuellement mal décrite. Sur la base de données rétrospectives et prospectives, l'efficacité de l'ICI en monothérapie reste limitée. Les associations avec des inhibiteurs de la tyrosine-kinase, notamment avec des inhibiteurs anti-MET, présentent des taux de réponse prometteurs et pourraient entrer dans la norme de soins chez les patients non traités. Un travail collaboratif est nécessaire pour affiner le paysage moléculaire et immunitaire du pRCC et poursuivre les efforts visant à mettre en place des essais cliniques prédictifs basés sur des biomarqueurs dans ces tumeurs rares.Article 2 : Analyses complètes du microenvironnement tumoral immunitaire dans le carcinome papillaire à cellules rénales. Contexte : le carcinome papillaire à cellules rénales (pRCC) est le CCR à cellules non claires (nccRCC) le plus courant et associé à de mauvais résultats dans le contexte métastatique. Dans cette étude, nous avions pour objectif d'évaluer de manière exhaustive le microenvironnement tumoral immunitaire (TME), largement inconnu, des patients atteints de pRCC métastatique et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Méthodes : nous avons effectué une analyse quantitative de l'expression génique du TME en utilisant la méthodologie du compteur MCP, sur 2 cohortes indépendantes de pRCC localisés (n=271 et n=98). Nous avons ensuite caractérisé le TME, en utilisant l'immunohistochimie (n = 38) et le séquençage d'ARN (RNA-seq) (n = 30) sur des pRCC métastatiques de la cohorte prospective de l'essai AXIPAP. Résultats : le clustering non supervisé a identifié 2 « sous-types de TME » dans chacune des cohortes : le « immuno-enrichi » et le « immuno-faible ». Au sein de la cohorte de l'essai AXIPAP, le cluster « immuno-enrichi » était significativement associé à un plus mauvais pronostic. selon la médiane de survie globale à 8 mois (IC95%, 6-29) versus 37 mois (IC95%, 20-NA, p=0,001). Les 2 signatures immunitaires, Teff et JAVELIN Renal 101 Immuno signature, prédictives de La réponse aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (IPC) dans le ccRCC était significativement plus élevée dans le groupe « enrichi sur le plan immunitaire » (p < 0,05 ajusté). Enfin, 5 gènes différentiellement surexprimés ont été identifiés, correspondant principalement aux populations de lymphocytes B. Conclusion : pour la première fois, en utilisant RNA-seq et IHC, nous avons mis en évidence un sous-type immunitaire TME spécifique du pRCC métastatique, significativement plus infiltré par la population T et Bimmune. Ce groupe « immunoenrichi » semble avoir un pronostic plus défavorable et pourrait avoir une valeur prédictive potentielle de réponse à l’immunothérapie, justifiant la confirmation de ces résultats dans une cohorte de pRCC métastatiques traités par CPI et en association avec des thérapies ciblées
Article 1: Checkpoint inhibitors in metastatic papillary renal cell carcinoma : papillary Renal Cell Carcinoma (pRCC) is the most common non-clear cell RCC (nccRCC) and a distinct entity, although heterogenous, associated with poor outcomes. The treatment landscape of metastatic pRCC (mpRCC) relied so far on targeted therapies, mimicking previous developments in metastatic clear-cell renal cell carcinoma. However, antiangiogenics as well as mTOR inhibitors retain only limited activity in mpRCC. As development of immune checkpoint inhibitors (ICI) is now underway in patients with mpRCC, we aimed at discussing early activity data and potential for future therapeutic strategies in monotherapy or combination. Expression of immune checkpoints such as PD-L1 and infiltrative immune cells in pRCC could provide insights into their potential immunogenicity, although this is currently poorly described. Based on retrospective and prospective data, efficacy of ICI as single agent remains limited. Combinations with tyrosine-kinase inhibitors, notably with anti-MET inhibitors, harbor promising response rates and may enter the standard of care in untreated patients. Collaborative work is needed to refine the molecular and immune landscape of pRCC, and pursue efforts to set up predictive biomarker-driven clinical trials in these rare tumors. Article 2 : Comprehensive analyses of immune tumor microenvironment in papillary renal cell carcinoma. Background : papillary Renal CellCarcinoma (pRCC) is the most common non-clear cell RCC (nccRCC), and associated with poor outcomes in the metastatic setting. In this study, we aimed to comprehensively evaluate the immune tumor microenvironment (TME) ,largely unknown, of patients with metastatic pRCC and identify potential therapeutic targets. Methods : we performed quantitative gene expression analysis of TME using MCP-counter methodology, on 2 independent cohorts of localized pRCC (n=271 and n=98). We then characterized the TME, using immunohistochemistry (n=38) and RNA-sequencing (RNA-seq) (n=30) on metastatic pRCC from the prospective AXIPAP trial cohort. Results: unsupervised clustering identified 2 "TME subtypes", in each of the cohorts : the “immune-enriched” and the “immune-low”.Within AXIPAP trial cohort, the “immune-enriched” cluster was significantly associated with a worse prognosis according to the median overall survival to 8 months (95%CI, 6-29) versus 37 months (95%CI, 20-NA,p=0.001).The 2 immune signatures, Teff and JAVELIN Renal 101 Immuno signature, predictive of response to immune checkpoint inhibitors (CPI) in ccRCC, were significantly higher in the “immune-enriched” group (adjusted p<0.05). Finally, 5 differentially overexpressed genes were identified, corresponding mainly to B lymphocyte populations. Conclusion : for the first time, using RNA-seqand IHC, we have highlighted a specific immune TME subtype of metastatic pRCC, significantly more infiltrated with T and Bimmune population. This “immune-enriched” group appears to have a worse prognosis and could have a potential predictive value for response to immunotherapy, justifying the confirmation of these results in a cohort of metastatic pRCC treated with CPI and incombination with targeted therapies

Les myosites forment un groupe hétérogène de pathologies auto-immunes partageant une atteinte musculaire des patients. Les myosites sont séparées en 5 sous-entités : les dermatomyosites (DM), les syndromes des anti-synthétases (ASyS), les myosites à inclusions (IBM), les myopathies nécrosantes auto-immunes (IMNM) et les myosites induites par inhibiteur de point de contrôle immunitaire (ICI). Les mécanismes physiopathologiques, le phénotype clinique et le pronostic de chaque sous-entité sont différents. Parmi les myosites, ce travail s’est concentré sur les IMNM et les myosites induites par ICI, leur pronostic étant le plus sombre. Des études transcriptomiques à haute résolution, spatiale ainsi qu’en cellule unique ont permis d’étudier le tissu musculaire des patients atteints de ces myosites. Dans les myosites induites par ICI, ces études ont confirmé la cytotoxicité de lymphocytes T CD8 et leur rôle central, principalement celui des populations de lymphocytes T résidents mémoires identifiés dans le muscle ainsi que des macrophages. Nous proposons un modèle pathogénique basé sur la réaction de lymphocytes T résidents mémoires aux traitements ICI. Dans les IMNM, des sous-groupes de macrophages ont été identifiés composés respectivement des macrophages pro-inflammatoires, anti-inflammatoires et de macrophages accompagnés de progéniteurs fibro-adipeux (FAP). Nous proposons que la nécrose stimulerait les macrophages et induirait leur recrutement ce qui permettrait la prolifération des FAP à l’origine de la fibrose exacerbée des patients. La compréhension de ces mécanismes parmi d’autres permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer le pronostic des patients
Myositis are a heterogeneous group of autoimmune pathologies characterized by muscle damage in patients. Myositis are separated into 5 subgroups: dermatomyositis (DM), anti-synthetase syndromes (ASyS), inclusion body myositis (IBM), autoimmune necrotizing myopathies (IMNM) and immune-checkpoint inhibitor (ICI)-induced myositis. The pathophysiological mechanisms, clinical phenotype and prognosis of each subgroup are different. Among myositis, this work focused on IMNM and ICI-induced myositis, which have the poorest prognosis. High-resolution, spatial and single-cell transcriptomic studies have made it possible to study the muscle tissue of patients with these myositis. In ICI-induced myositis, these studies have confirmed the cytotoxicity of CD8 T cells and their central role, mainly of a population of resident memory T cells identified in the muscle, as well as macrophages. We propose a pathogenic model based on the reaction of resident memory T cells to ICI treatments. In IMNM, subgroups of macrophages have been identified composed respectively of pro-inflammatory macrophages, anti-inflammatory macrophages, and macrophages close to fibro-adipogenic progenitors (FAP). We propose that necrosis can stimulate macrophages and induce their recruitment, which would allow the proliferation of FAPs at the origin of exacerbated fibrosis in patients. Understanding mechanisms among others makes it possible to consider new therapeutic targets and improve patient prognosis

Contexte. Les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire sont le traitement de première ligne incontesté des mélanomes de stade IV et sont pourvoyeurs d’effets indésirables, souvent immuno-médiés. Il existe une prise en compte croissante des événements immuno-médiés dans la décision thérapeutique et une volonté d’individualisation des prises en charges des patients atteints de mélanome métastatique. Une caractérisation plus fine ce ces événements permettrait une meilleure prédiction de leur survenue et de leurs impacts. Nos connaissances des événements immuno-médiés proviennent majoritairement des essais cliniques randomisés de phase III, par le recueil des données de sécurité le temps de l’étude. Elles ne permettent pas la mise évidence des signaux de sécurité tardifs, survenant très à distance de l’essai clinique, ou des signaux de sécurité rares, non notifiés dans les publications qui en découlent. Matériel et méthodes. Une méta-analyse de sécurité conduite sur les essais cliniques randomisés de ClinicalTrials.gov vise à identifier des signaux de sécurité rares permettant davantage d’exhaustivité. Nous avons déterminé le type et l’incidence des effets rares (représentés par les effets cardiovasculaires) associés à l’exposition aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire dans le mélanome de stade IV. Des études « post-commercialisation » ont été conduites sur trois bases de données : RIC-Mel et Vigibase® préalablement constituées, et Melskintox, constituée spécifiquement pour le recueil des effets immuno-médiés cutanés. Ces études de « vraie vie » permettent d’interroger le type, l’incidence et l’impact des effets immuno-médiés dermatologiques à risque de sous-notification et de caractériser l’ensemble des effets immuno-médiés tardifs à distance de l’instauration de l’inhibiteur de point de contrôle immunitaire car le suivi issu des essais cliniques randomisés est trop court pour être informatif. Enfin, nous avons discuté la sécurité de réintroduire un inhibiteur de point de contrôle immunitaire après un évènement immuno-médié. Résultats. La méta-analyse nous permet d’identifier certains évènements immuno-médiés non identifiés initialement dans les essais cliniques randomisés car ils sont rares et non systématiquement recherchés, comme certains évènements cardiovasculaires. Ils peuvent pourtant être graves (myocardite, péricardite). Certains, comme la dyslipidémie, laissent supposer un long délai d’apparition, permis par l’allongement de la survie des patients présentant un mélanome et traités par inhibiteurs de points de contrôle immunitaire. En étude de cohorte de vraie vie, d’autres évènements tardifs et sévères peuvent survenir très à distance de l’initiation du traitement (après deux ans) et affecter tous les organes. Les patients atteints d’un mélanome SSM semblent plus à risque de présenter un effet indésirable tardif. Certains évènements immuno-médiés fréquents et rarement graves sont imparfaitement recherchés et la diversité des présentations cliniques peu connue. Les pronostics semblent être différents selon que l’effet immuno-médié cutané est une dermatose inflammatoire bénigne, un trouble pigmentaire, une toxidermie ou une dermatose bulleuse. Enfin, les données de pharmacovigilance concernant la réintroduction sont variables selon l’effet immuno-médié initial, suggérant un taux de récurrence plus élevé pour la néphrite et les évènements immuno-médiés cutanés. Discussion et perspectivesUn évènement immuno-médié doit être connu et reconnu au regard de son impact thérapeutique, et faire l’objet de modalités de surveillance adaptées. La personnalisation du parcours de soin et des propositions thérapeutiques se fera par une connaissance plus fine des données de sécurité et une meilleure caractérisation des évènements immuno-médiés
Background. Immune checkpoint inhibitors are the undisputed first-line treatment for stage IV melanoma, and are associated with adverse events, often immuno-related. Immune-related events are increasingly taken into account in therapeutic decisions, and there is a desire to individualize the management of patients with metastatic melanoma. A more detailed characterization of these events would enable better prediction of their occurrence and impact. Our knowledge of immuno-related events comes mainly from randomized phase III clinical trials, through the collection of safety data for the duration of the study. This does not allow us to identify late-onset safety signals, occurring long after the clinical trial, or rare safety signals not always reported in the publication. . Materials and methods. A safety meta-analysis conducted on randomized clinical trials from ClinicalTrials.gov aims to identify rare safety signals allowing greater comprehensiveness. We determined the type and incidence of rare events (represented by cardiovascular events) associated with exposure to immune checkpoint inhibitors in stage IV melanoma. Post-marketing studies have been carried out on three databases: RIC-Mel and Vigibase®, set up beforehand, and Melskintox, specifically set up to record cutaneous immune-related effects. These “real-life” studies make it possible to investigate the type, incidence and impact of dermatological immune-related events at risk of under-reporting, and to characterize all late-onset immune-related events late after the introduction of the immune checkpoint inhibitor, since follow-up from randomized clinical trials is too short to be informative. Finally, we discussed the safety of reintroducing an immune checkpoint inhibitor after an immuno-related event. Results. The meta-analysis enables us to identify some immuno-related events not initially identified in randomized clinical trials because they are rare and not systematically investigated, such as cardiovascular events. However, they can be serious as myocarditis and pericarditis. Some, such as dyslipidemia, suggest a long delay in onset, made possible by the extended overall survival of melanoma patients treated with immune checkpoint inhibitors. In real-life cohort studies, other severe late-onset events may occur long after from the initiation of treatment (after two years), affecting all organs. Patients with SSM melanoma appear to have a higher risk of late-onset adverse events. Certain frequent and rare serious immune-related events are imperfectly investigated, and the diversity of clinical presentations is poorly understood. The prognosis seems to differ depending on whether the cutaneous immuno-related effect is a benign inflammatory dermatosis, a pigmentary disorder, drug-related rash or bullous dermatosis. Finally, pharmacovigilance data on reintroduction vary according to the initial immune-related event, suggesting a higher recurrence rate for nephritis and cutaneous immuno-related events. Discussion and perspectivesThe occurrence of an immune-related event must be known and recognized with regard to its therapeutic impact, and be the subject of appropriate monitoring modalities. A more detailed knowledge of safety data and a better characterization of immune-related events will enable us to tailor our treatment pathways and proposals

Les découvertes scientifiques liées à la radiothérapie sont en progression continue et près de 60 % des patients diagnostiqués d'un cancer sont traités par radiothérapie. Cependant, ce traitement fait face à de nombreuses limitations dues à la radiorésistance et aux effets secondaires infligés sur les tissus sains. Pour surmonter ces problèmes, un intérêt particulier a été suscité sur le rôle que pourrait jouer la nanomédecine dans l'amélioration de la réponse anti-tumorale médiée par le système immunitaire. Dans ce contexte, nous avons décidé d'évaluer la capacité de la combinaison de nanoparticules de Gadolinium (AGuIX) avec les rayonnements ionisants (RI) à stimuler une réponse immunologique anti-tumorale et à augmenter l'efficacité de la radiothérapie associée à des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. AGuIX sont de très petites nanoparticules composées d'une matrice de polysiloxane et de chélates de gadolinium. Grâce aux propriétés magnétiques du Gadolinium, ces nanoparticules jouent le rôle d'agent de contraste, en plus de ses propriétés radiosensibilisantes, permettant ainsi un meilleur ciblage et un index thérapeutique renforcé.Nos travaux révèlent la capacité de AGuIX + RI à induire une instabilité génomique et à stimuler les voies de signalisation cellulaire immunomodulatrices. En parallèle, nous démontrons le potentiel anti-tumoral de la combinaison d'AGuIX + RI en évaluant la croissance tumorale et la survie globale à l'aide d'un modèle préclinique de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs. Nos résultats suggèrent un effet synergique de la combinaison d'AGuIX + RI sur la croissance tumorale en stimulant le système immunitaire. Enfin, nous révélons la capacité de la combinaison d'AGuIX + RI à surmonter la résistance aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. En conclusion, nos travaux montrent que la combinaison d'AGuIX + RI stimule des voies de signalisation immunomodulatrices, induit une forte réponse anti-tumorale synergique et permet de surmonter la résistance aux immunothérapies
Scientific discoveries linked to radiotherapy are in continuous progress and almost 60% of cancer diagnosed patients are treated with radiotherapy. However, radiation therapy still faces many limitations due to radioresistance and the side effects inflected on healthy tissues. To overcome these factors, a particular interest has been aroused on the role that nanomedicine could play in the improvement of immune-mediated anti-tumor response. In this context, we decided to assess the ability of the combination of Gadolinium nanoparticles (AGuIX) with ionizing radiation (IR) to stimulate an anti-tumor immunological response and to increase the effectiveness of radiotherapy combined to immune checkpoint blockers.AGuIX are very small nanoparticles composed of a polysiloxane matrix and gadolinium chelates. Thanks to the magnetic properties of gadolinium, these nanoparticles play the role of a contrast agent, in addition to its radiosensitizing properties, thus allowing a better targeting and an enhanced therapeutic index.Our work reveals the ability of the AGuIX+IR combination to induce genomic instability and to stimulate immunomodulatory cell signaling pathways in treated human and murine cancer cells. In parallel, we demonstrate the anti-tumor activity of this combination by assessing tumor growth and overall survival using a preclinical model of immunocompetent mice bearing tumors. Our results strongly demonstrate a synergistic effect of AGuIX + IR combination on tumor growth and overall survival by stimulating the immune system. Finally, we reveal the capacity of AGuIX + IR combination to overcome immune checkpoint blockers resistance.In conclusion, our work shows that the combination of AGuIX+IR stimulates immunomodulatory signaling pathways, induces a strong synergistic anti-tumor response and helps overcoming resistance to immunotherapies

Les cancers, notamment les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC), sont particulièrement fréquents chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Cependant, malgré cette association, les profils moléculaires et immunologiques des CBNPC chez les PVVIH restent encore mal connus. L'avènement des immunothérapies antitumorales, en particulier des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI), a révolutionné la prise en charge de nombreux cancers, dont certains touchent fréquemment les PVVIH. Cependant, les PVVIH ont été systématiquement exclus des essais cliniques évaluant l'utilisation des ICI en oncologie. Par conséquent, les données disponibles sur le profil de toxicité de ces traitements et leur impact immunovirologique sur l'infection par le VIH restent limitées. Dans la première partie de ce travail, nous avons comparé prospectivement les caractéristiques immunogénomiques de 27 CBNPC provenant de 15 PVVIH et de 12 patients immunocompétents (IC). Les charges mutationnelles tumorales, les profils moléculaires, le nombre de néoépitopes prédits, ainsi que leur restriction prédite par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I/II étaient similaires dans les deux groupes. Cependant, les réponses T aux néoépitopes, détectées chez 4/11 PVVIH et 5/11 IC, étaient exclusivement dirigées contre des néoépitopes restreints au CMH de classe II chez les PVVIH, tandis que chez les patients IC, la moitié des réponses ciblaient des néoépitopes restreints au CMH de classe I. De plus, un faible nadir de CD4 était associé à l'absence de réponses spécifiques aux néoépitopes chez les PVVIH. Enfin, les microenvironnements tumoraux des CBNPC chez les PVVIH présentaient des proportions plus faibles de neutrophiles et une diminution des marqueurs de la fonction des cellules T. Ainsi, malgré des profils moléculaires similaires, l'infection par le VIH altère gravement les réponses immunitaires antitumorales chez les patients atteints de CBNPC, en particulier celles dirigées contre les néoépitopes restreints au CMH de classe I, ce qui plaide en faveur de l'utilisation d'immunothérapies basées sur les néoépitopes restreints au CMH de classe I dans cette population. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié, à travers une revue systématique de la littérature, et des études dédiées, le profil de toxicité, l'impact immunovirologique (charge virale et taux de CD4), ainsi que l'effet des ICI sur le réservoir et l'immunité anti-VIH chez les PVVIH, dans le cadre d'une stratégie de « shock and kill » visant à éradiquer le VIH. Nos recherches ont montré que le profil de toxicité des ICI chez les PVVIH est comparable à celui observé dans la population générale. De plus, nous avons démontré que les ICI n'ont pas d'effet négatif sur les marqueurs de l'infection par le VIH, comme la charge virale et le taux de CD4. Enfin, notre étude portant sur 32 PVVIH traités par anti-PD1 en monothérapie, a révélé une diminution précoce, modérée et transitoire du réservoir VIH, sans augmentation significative de l'immunité anti-VIH. L'augmentation précoce sous ICI d'autres points de contrôle immunitaires, tels que CTLA4 et TIM3, pourrait expliquer cet impact limité in vivo sur le réservoir VIH et l'immunité antivirale des anti-PD1. Ainsi, l'utilisation des anti-PD1 en monothérapie ne semble pas constituer une stratégie prometteuse de « shock and kill » pour éradiquer le VIH. Au total, nous avons démontré que le VIH altère fortement la réponse immunitaire antitumorale chez les patients atteints de CBNPC, malgré des profils tumoraux moléculaires similaires. Toutefois, l'utilisation des ICI chez les PVVIH n'est pas associée à un risque accru de toxicité et montre une efficacité comparable à celle des patients immunocompétents. Nos résultats soutiennent le développement de vaccins personnalisés ciblant les néoépitopes restreints au CMH de classe I, en combinaison avec les ICI, pour les PVVIH atteints de CBNPC
Cancers, particularly non-small cell lung cancers (NSCLC), are notably more frequent among people living with HIV (PLWHIV). However, despite this association, the molecular and immunological profiles of NSCLC in PLWHIV remain poorly explored. Characterizing these immunogenomics features in malignant tumors has become critical for understanding the mechanisms of oncogenesis and developing more effective antitumor therapies. The advent of immunotherapies, especially immune checkpoint inhibitors (ICIs), has revolutionized cancer treatment, including cancers that frequently affect PLWHIV. However, PLWHIV have been systematically excluded from clinical trials evaluating ICIs in oncology. As a result, data on the safety profile of these treatments and their immunovirological impact on HIV infection remain limited.In the first part of this work, we prospectively compared the immunogenomics features of 27 NSCLC from 15 PLWHIV and 12 immunocompetent patients (IC). Tumor mutational burdens, molecular profiles, number of predicted neoepitopes, and their MHC-class I/II predicted restriction were similar in both groups. However, monofunctional T cell responses to neoepitopes, detectable in 4/11 PLWHIV and 5/11 IC, were exclusively directed against MHC-class-II-restricted neoepitopes in PLWHIV while half were directed against MHC-class-I-restricted in IC. A low CD4 nadir was associated with the lack of neoepitope-specific responses in PLWHIV. Furthermore, PLWHIV tumor microenvironments displayed lower neutrophils proportions and decreased T cell function markers. Thus, despite similar molecular profiles, HIV-infection severely impairs antitumor immune responses in patients with NSCLC, particularly to MHC-class-I-restricted neoepitopes, supporting the use of MHC-class-I-restricted neoepitope-based immunotherapy in this population. In the second part of this work, we conducted a systematic review of the literature, dedicated clinical studies, and biological sub-studies to assess the toxicity profile, immunovirological impact (viral load and CD4 count), as well as the effects of ICIs on the HIV reservoir and anti-HIV immunity in PLWHIV, as part of a “shock and kill” strategy for an HIV cure. Our research demonstrated that the toxicity profile of ICIs in PLWHIV is similar to that observed in the general population. We also identified specific risk factors in this population associated with the occurrence of severe immune-related adverse events, such as long-term HIV infection, low CD4 count, positive cytomegalovirus serology, and a history of oncological surgery. Additionally, we showed that ICIs do not have a negative impact on HIV infection markers, such as viral load and CD4 count. Finally, our study of 32 PLWHIV treated with anti-PD1 monotherapy, with monitoring of plasma viral load, anti-HIV immunity, and the viral reservoir, revealed an early, moderate, and transient reduction in the HIV reservoir, without a significant increase in anti-HIV immunity. The early upregulation of other immune checkpoints, such as CTLA4 and TIM3, under ICI treatment may explain the limited in vivo effect on the HIV reservoir and antiviral immunity of anti-PD1 therapy. Thus, the use of anti-PD1 monotherapy does not appear to be a promising “shock and kill” strategy for eradicating HIV. Overall, we demonstrated that HIV significantly impairs the antitumor immune response in patients with NSCLC, despite similar molecular tumor profiles. However, the use of ICI in PLWHIV is not associated with an increased risk of toxicity and shows efficacy comparable to that observed in IC patients. Our results support the approach of personalized vaccines targeting MHC class I-restricted neoepitopes, combined with ICIs, for PLWHIV with NSCLC

De nombreuses données suggèrent que le succès thérapeutique de certaines chimiothérapies conventionnelles, radiothérapies, ainsi que des thérapies ciblées est dû à leur capacité a induire la mort cellulaire immunogène (ICD), ce qui stimule la libération ou l'exposition des motifs moléculaires associés à un dommage (DAMPs) conduisant à leur reconnaissance par le système immunitaire, rétablissant ainsi l'immunosurveillance. En utilisant un criblage non polarisé, le crizotinib a été identifié en tant qu'inhibiteur de tyrosine-kinase ayant la capacité de stimuler la libération de caractéristiques distinctives de l’ICD. Des expériences faites par la suite ont montréque le crizotinib induit l'exposition de la calreticulin, la sécrétion d'ATP et la libération d’HMGB1, ainsi que le stress du réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et humaines, notamment en combinaison avec les agents non immunogènes tel que le cisplatine. L’ICD causée par la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie a aussi été observée dans les cellules du cancer bronchique non à petites cellules (NSCLC), cellules ne possédant pas de mutations activatrices d’ALK ou ROS1 ; cela suggère un mode d'action hors-cible. Des études comparatives ont montré que seule la conformation utilisée en clinique, l’isoforme (R)-crizotinib, a la capacité de stimuler l’ICD ; le (S)-énantiomère ne possède pas ces caractéristiques. Combinées au cisplatine, les cellules fibrosarcome MCA205 et les cellules cancéreuses du poumon TC-1 traitées avec le crizotinib ont vacciné efficacement les souris immunocompétentes syngéniques contre la croissance des cellules vivantes de même type. Le crizotinib a amélioré l'efficacité de la chimiothérapie dans trois modèles de cancer du poumon orthotopiques : transplantable, induit par des carcinogènes et induites par les oncogènes. De façon remarquable, l’effet du crizotinib est aboli si un des signaux de l’ICD est bloqué. L'efficacité anticancéreuse dans chaque modèle s’est révélé être lié à l'infiltration de lymphocytes T, montrant l’implication d’une réaction immunitaire. Cela a été confirmé par des expériences chez des souris immunodéficientes (nu/nu, déficientes en thymodépendantes lymphocytes T) et dans des souris immunocompétentes dans lesquelles l’interféron gamma a été neutralisé à l’aide d’un anticorps ; l’effet du crizotinib était aboli dans les deux modèles. La combinaison du crizotinib avec le cisplatine a entraîné un accroissement de l'expression de PD-1, PDL-1 et CTLA-4 dans la tumeur, s’accompagnant par conséquent d'une sensibilisation importante des NSCLC à l'immunothérapie avec des anticorps anti-PD-1 et CTLA-4. Ainsi, la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie conventionnelle et les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire peuvent être actifs contre le NSCLC. Les données présentées dans cette thèse pourraient faciliter la conception d’essais cliniques afin d’établir de nouvelles stratégies combinatoires pour le traitement des NSCLC
Accumulating evidence suggests that certain conventional chemotherapies, radiotherapies, as well as targeted therapies mediate their long-term therapeutic success by inducing immunogenic cell death (ICD), which stimulate the release or exposure of danger-associated molecular patterns from or on cancer cells, causing their recognition by the immune system, thus reinstating immunosurveillance. An unbiased screen identified crizotinib as a tyrosine kinase inhibitor that is potent in provoking hallmarks of ICD. In subsequent low-throughput validation experiments, crizotinib promoted Calreticulin exposure, ATP secretion, HMGB1 release, as well as ER stress in both human and murine cancer cells, especially if it is combined with normally non-ICD inducing chemotherapeutics such as cisplatin. ICD induced by the combination of chemotherapy and crizotinib was also observed in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cells lacking activating mutations of the crizotinib targets ALK and ROS1, suggesting an off-target-mediated mode of action. Comparative studies indicated that exclusively the clinically used (R) isoform of crizotinib was efficient in inducing cell death and stimulating ICD hallmarks whereas the (S) enantiomer lacked those characteristics. When combined with cisplatin, crizotinib-killed fibrosarcoma MCA205 cells as well as lung cancer TC-1 cells efficiently vaccinated syngeneic immunocompetent mice against a re-challenge with live cancer cells of the same types. Crizotinib improved the efficacy of chemotherapy with non-ICD inducers (such as cisplatin and mitomycin C) on three distinct (transplantable, carcinogen- or oncogene induced) orthotopic NSCLC models, none of which relied on the activation of ALK or ROS1. Of note these anticancer effects were completely lost if any of the ICD signals was blocked. These anticancer efficacies in different models were linked to an increased T lymphocyte infiltration as a sign of an immune response and were lost if such tumors grew on immunodeficient (nu/nu) mice that are athymic and hence lack thymus-dependent T lymphocytes, or on immunocompetent mice with a neutralization of interferon-. The combination of cisplatin and crizotinib led to an increase in the expression of CTLA-4, PD-1 and PD-L1 in tumors, coupled to a strong sensitization of NSCLC to immunotherapy with antibodies blocking CTLA-4 and PD-1. Hence, a combination of crizotinib, conventional chemotherapy and immune checkpoint blockade may be active against NSCLC, and these data might facilitate the design of clinical trials to evaluated novel combination regiments for the treatment of NSCLC

La modification post-traductionnelle des chimiokines par la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4 ou CD26) régule négativement le trafic des lymphocytes, et son inhibition améliore la migration des lymphocytes T et l'immunité anti-tumorale en préservant la forme fonctionnelle de CXCL10. En étendant ces résultats initiaux aux humains et à un modèle préclinique de carcinome hépatocellulaire, nous avons découvert un nouveau mécanisme par lequel l'inhibition de DPP4 améliore les réponses anti-tumorales par le recrutement des éosinophiles. Plus précisément, l'administration d'inhibiteurs de DPP4 (DPP4i) conduit à des concentrations tumorales plus élevées de CCL11 (ou eotaxine) et à une augmentation de la migration des éosinophiles exprimant CCR3 dans les tumeurs. Un meilleur contrôle de la croissance tumorale a été observé lors du traitement par DPP4i, un effet conservé chez les souris Rag2–/– mais abrogé uniquement lors de la déplétion des éosinophiles ou de l'inhibition de leur dégranulation. Nous avons également démontré que l'expression tumorale d’IL-33 était nécessaire et suffisante pour une réponse anti-tumorale médiée par les éosinophiles et que ce mécanisme contribuait à l'efficacité des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le contrôle tumoral est médiée par IL-33 et les éosinophiles, mécanisme ici révélé lorsque les mécanismes endogènes de régulation immunitaire par DPP4 sont inhibés
Dipeptidyl peptidase-4 (DPP4 or CD26)–mediated post-translational modification of chemokines has been shown to negatively regulate lymphocyte trafficking, and its inhibition enhances T cell migration and tumor immunity by preserving functional CXCL10. In extending these initial findings to humans and pre-clinical hepatocellular carcinoma models, we discovered a new mechanism whereby DPP4 inhibition improves anti-tumor responses by eosinophil recruitment. Specifically, administration of DPP4 inhibitors (DPP4i) resulted in higher concentrations of CCL11 (or eotaxin) and increased CCR3-mediated eosinophil migration into mouse tumors. Enhanced tumor control was observed upon treatment with DPP4i, an effect strikingly preserved in Rag2–/– mice, and abrogated only upon depletion of eosinophils or inhibition of their degranulation. We further demonstrated that tumor expression of IL-33 was necessary and sufficient for eosinophil-mediated anti-tumor responses, and that this mechanism contributed to checkpoint inhibitor efficacy. These findings provide new insight into IL-33- and eosinophil-mediated tumor control, revealed when endogenous mechanisms of DPP4 immune regulation are inhibited

Les myosites sont des maladies auto-immunes rares qui peuvent survenir soit de manière spontanée, les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII), soit être induites par des traitements comme les inhibiteurs de points de contrôle immunitaire (ICI). Parmi les myosites, ce travail s’est concentré sur l’étude de deux entités : les myosites nécrosantes auto-immunes (MNAI) et les myosites induites par les ICI. Les MII sont divisées en sous-groupes homogènes en termes de phénotype clinique, biologique et histologique en partie grâce à l’identification des auto-anticorps spécifiques de myosite. Chacune de ces entités est associée à des anticorps qui jouent un rôle dans la survenue de la maladie par des mécanismes différents. Au cours des MNAI, les auto-anticorps anti-SRP (Signal recognition particle) semblent jouer un rôle pathogène direct via l’activation de la voie classique du complément. Treize auto-anticorps anti-SRP issus de prélèvement de patients ont été produits dont cinq auto-anticorps reconnaissant de manière spécifique la SRP par deux techniques différentes. Ces auto-anticorps anti-SRP humains seront utilisés pour développer des modèles de MNAI et comprendre leurs mécanismes d’action au cours de la pathologie ainsi que leurs cibles antigéniques. Concernant les myosites sous ICI, les anticorps monoclonaux thérapeutiques, dirigés contre les molécules de co-stimulation inhibitrices, induisent une rupture de tolérance immunitaire au sein du tissu musculaire. La description de séries de patients issus de base de pharmacovigilance a permis d’identifier un phénotype clinique spécifique associé à un mauvais pronostic notamment en cas d’atteinte cardiaque associée. L’étude de la réponse immunitaire systémique et du profil transcriptomique musculaire a mis en évidence un rôle central des lymphocytes T cytotoxiques et des macrophages dans la physiopathologie de la maladie. L’identification des mécanismes physiopathologiques est une étape essentielle à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patients
Myositis is a rare autoimmune disease that may occur spontaneously, idiopathic inflammatory myopathies, or be induced by treatments such as immune checkpoint inhibitors (ICI). Among myositis, this work focused on the study of two entities: immune-mediated necrotizing myopathy (IMNM), and ICI-induced myositis. Inflammatory myopathies are separated into homogeneous subgroups in terms of clinical, biological, and histological phenotype thanks to the identification of myositis-specific autoantibodies. Each of these entities is associated with antibodies that play a role in the occurrence of the disease by different mechanisms. In IMNM, anti-SRP (signal recognition particle) autoantibodies appear to play a direct pathogenic role via activation of the classical complement pathway. Thirteen anti-SRP autoantibodies from patient samples were produced, including five autoantibodies specifically recognizing SRP by two different techniques. These human anti-SRP autoantibodies will be used to develop models of IMNM and to understand their mechanisms of action as well as to define their antigenic targets. Regarding ICI-induced myositis, therapeutic monoclonal antibodies directed against inhibitory co-stimulatory molecules induce a break of immune tolerance within the muscle tissue. The description of a series of patients from pharmacovigilance database allowed us to characterize a specific clinical phenotype associated with a poor prognosis, particularly in the case of associated myocarditis. The study of the systemic immune response and of the muscle transcriptomic profile has highlighted a central role of cytotoxic T lymphocytes and macrophages in the pathophysiology of the disease.Eventually, the description of pathophysiological mechanisms is mandatory to identify new therapeutic targets and then improve myositis treatment strategy

Le cancer est une maladie provoquée par la prolifération de cellules transformées et incontrôlables par l’organisme entraînant à terme le décès. Elle est de nos jours la première cause de mortalité en France, ce qui en fait un centre d’intérêt majeur pour la recherche. Malgré le large arsenal thérapeutique disponible actuellement en clinique pour lutter contre le cancer (chimiothérapies, radiothérapies, hormonothérapies, …), de nombreux patients ne répondent pas à ces thérapies et le taux de décès est encore très conséquent. Il y a une quinzaine d’années, l’immunothérapie a fait ses premiers pas en clinique et a démontré des effets prometteurs, devenant ainsi une nouvelle arme thérapeutique prometteuse contre le cancer. L’immunothérapie est une approche thérapeutique visant à stimuler le système immunitaire de façon à l’aider à mieux détruire les cellules cancéreuses. L’immunothérapie anti-PD-1/PD-L1 a démontré des effets prometteurs dans divers types de cancers. Néanmoins, malgré une belle efficacité chez certains patients, beaucoup de patients ne répondent pas à ces thérapies dans de multiples types de cancer, dont le cancer colorectal. Dans ce contexte, l’équipe de recherche dans laquelle j’ai effectué mon doctorat a mis en évidence que la protéine de choc thermique HSP110 favorise la prolifération des cellules cancéreuses colorectales et est associée à un mauvais pronostic dans le cancer colorectal. Une molécule inhibitrice de HSP110 appelée i007 a ainsi été développée. L’objectif de ces travaux de thèse repose sur l’évaluation de l’efficacité de la double thérapie anti-PD-L1/i007 dans le cancer colorectal afin d’identifier si l’inhibition de HSP110 peut améliorer l’efficacité des anti-PD-L1. Nous avons pu identifier un effet antitumoral de cette double thérapie, probablement médié par les cellules CD8+ épuisés et la sécrétion de granzyme A, B, interféron γ et perforine. Les macrophages, cellules NK et mastocytes semblent également être impliqués dans la réponse immunitaire induite par la double thérapie, mais leur rôle exact reste à définir. Enfin, une ouverture sur un éventuel nouveau projet cherchant à potentialiser l’effet des anti-PD-L1 a été mis en lumière, en combinant les anti-PD-L1 à des anti-LAG-3
Cancer is a disease caused by the proliferation of transformed cells that cannot be controlled by the body, ultimately leading to death. Today, it is the leading cause of death in France, making it a major focus of research interest. Despite the wide range of cancer treatments currently available in clinical practice (chemotherapy, radiotherapy, hormone therapy, etc.), many patients do not respond to these therapies, and the death rate is still very high. Some fifteen years ago, immunotherapy took its first clinical steps and demonstrated promising effects, becoming a promising new therapeutic weapon against cancer. Immunotherapy is a therapeutic approach designed to stimulate the immune system to better destroy cancer cells. Anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy has shown promising effects in various types of cancer. However, despite their efficacy in some patients, many do not respond to these therapies in multiple cancer types, including colorectal cancer. In this context, the research team in which I carried out my PhD demonstrated that the heat shock protein HSP110 promotes colorectal cancer cell proliferation and is associated with poor prognosis in colorectal cancer. This led to the development of an HSP110 inhibitor molecule called i007. The aim of this thesis work is to evaluate the efficacy of anti-PD-L1/i007 dual therapy in colorectal cancer, and to identify whether HSP110 inhibition can improve the efficacy of anti-PD-L1. We were able to identify an antitumor effect of this dual therapy, probably mediated by depleted CD8+ cells and the secretion of granzyme A, B, interferon γ and perforin. Macrophages, NK cells and mast cells also appear to be involved in the immune response induced by double therapy, but their exact role remains to be defined. Finally, an opening to a possible new project seeking to potentiate the effect of anti-PD-L1 was highlighted, by combining anti-PD-L1 with anti-LAG-3

Le cancer de l’ovaire (CO) est le cancer gynécologique le plus mortel, affectant approximativement 1 femme sur 70 dont seulement 45% survivent 5 ans après leur diagnostic. Dans la majorité des cas le CO est diagnostiqué à un stade avancé et une chirurgie de cytoréduction complète n’est pas envisageable d’emblée. La chimiothérapie peut précéder l’intervention chirurgicale : on parle alors de chimiothérapie néoadjuvante (CTNA). Malgré des taux de réponse objectifs de 80% à la CTNA, la grande majorité des patientes récidivent et deviennent résistantes à la chimiothérapie. Ainsi, il existe un besoin urgent d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes. L’immunothérapie, en particulier les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI) comme les anti-PD-L1, a montré un fort potentiel contre plusieurs cancers. Au diagnostic, les tumeurs de l’ovaire présentent fréquemment un nombre élevé de lymphocytes infiltrant la tumeur et le degré d’infiltration est corrélée positivement avec la survie. Ces données nous suggèrent que le CO représente un bon candidat pour cette stratégie thérapeutique. Malheureusement, les résultats à ce jour ont été décevants dans le CO récidivant. En effet, seule une minorité de patiente (<15%) présente une réponse aux anti-PD-L1. Les stratégies d’immunothérapie testées à ce jour contre le CO se sont calquées sur les approches efficaces contre le cancer du poumon ou le mélanome. Or, le CO n’est pas une tumeur immunogénique comme le poumon, mais une tumeur qui baigne dans un microenvironnement particulièrement immunotolérant et l’évasion immunitaire dans les CO pourrait être le résultat d’une surexpression concertée de plusieurs inhibiteurs immunitaires. De plus, ces essais ont été conduits chez des patientes lourdement pré-traitées, à un stade où leur système immunitaire était probablement trop faible pour combattre la maladie. Introduire l’immunothérapie plus tôt dans le traitement, en combinaison avec la CTNA par exemple, pourrait permettre d’améliorer la réponse. En effet, nous avons précédemment montré que la chimiothérapie induisait une augmentation significative de l’infiltrat immunitaire en faveur d’une réponse immunitaire anti-tumorale. Partant de ces hypothèses, nous avons proposé l’essai clinique IneOV qui évalue l'impact d'une CTNA avec un anticorps anti-PD1 seul ou en association avec un anti- CTLA-4, chez des patientes récemment diagnostiquées. Un profilage immunitaire a été effectué à partir des échantillons tumoraux et corrélé avec la réponse au traitement. Les résultats préliminaires ont démontré un taux de réponse pathologique complète et un taux de résection de 18% et 70%. Nous avons également montré que les patientes ayant une meilleure réponse au traitement présentaient une infiltration immunitaire plus élevée. Les macrophages représentaient la population immunitaire intra-tumorale la plus abondante donc cibler cette population plutôt que les lymphocytes pourrait être plus pertinent dans le CO. Nous avons montré que le récepteur CD47 était fortement exprimé dans le CO et qu’il participe à l’inhibition de la phagocytose des cellules tumorales en interagissant avec SIRPα sur les macrophages, contribuant ainsi à l’évasion immunitaire. De plus, la polarisation des macrophages influençait directement leur capacité de phagocytose. L’ensemble de ces résultats pourrait permettre dans le futur, le développement de nouveaux essais cliniques de combinaisons innovantes dans les CO
Ovarian cancer (OC) is the leading cause of death among gynecological malignancies, affecting approximately 1 in 70 women with only 45% surviving 5 years after diagnosis. This disease typically presents at an advanced stage, and optimal debulking with platinum-based chemotherapy remains the cornerstone of management. In patients where complete resection cannot be achieved, neoadjuvant chemotherapy (NACT) followed by interval debulking surgery and adjuvant chemotherapy is a suitable alternative associated with lower morbidity. Although most OC patients will respond effectively to current management, 70% of them will eventually develop recurrence and chemoresistance. There is a tremendous need for new treatment approaches. Immunotherapy, particularly immune checkpoint inhibitors (ICI) like anti-PD-L1, has shown strong potential against various cancers. Many OC tumors demonstrate tumor infiltrating lymphocytes and the degree of infiltration is correlated with survival, suggesting that anti-PD-L1/PD-1 therapies could be effective. Unfortunately, results to date have been disappointing in relapsed OC. Trials have reported very modest single-agent activity with various antibodies targeting PD-1 resulting in response rate ranging from 4 to 15%. Immunotherapy strategies tested so far against OC have been modeled on effective approaches for lung cancer or melanoma. However, OC is not an immunogenic tumor like lung cancer but is surrounded by a highly immunotolerant microenvironment, and immune evasion in OC may result from the concerted overexpression of multiple immune inhibitors. Moreover, these trials were conducted in heavily pretreated potentially immune exhausted OC patients. Introducing immunotherapy earlier in treatment, combined with NACT, could improve responses. We previously demonstrated that chemotherapy significantly increases immune infiltration, promoting an anti-tumor immune response. Based on these hypotheses, we proposed the clinical trial IneOV, which evaluates the impact of NACT combined with an anti-PD1 antibody, either alone or in combination with an anti-CTLA-4, in newly diagnosed patients. Immune profiling was conducted on tumor samples and correlated with treatment response. Preliminary results have demonstrated a complete pathological response and resection rates of 18% and 70%, respectively. We also showed that good pathological response is associated with high levels of immune infiltration. Macrophages represented the most abundant intratumoral immune population, suggesting that targeting these cells rather than lymphocytes could be more relevant in OC. We demonstrated that the CD47 receptor is highly expressed in O and inhibits the phagocytosis of tumor cells by interacting with SIRPα on macrophages, contributing to immune evasion. Additionally, macrophage polarization directly influenced their phagocytic capacity. These findings may pave the way for future clinical trials exploring innovative combination therapies in OC

Le récepteur ILT4 est un point de contrôle immunitaire, principalement exprimé par les cellules myéloïdes du système immunitaire. Dans le contexte cancéreux, ILT4 participe au développement tumoral en maintenant un microenvironnement immunitaire protumoral et en activant directement la prolifération tumorale. L’activation d’ILT4 par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I non-classique HLA-G induit des cellules myéloïdes tolérogènes. De plus, l’expression ectopique d’ILT4 a été rapportée dans plusieurs types de cancers. L’interaction entre l’angiopoiétine-like2 (ANGPTL2) et l’ILT4 promeut la prolifération de cellules de cancer du poumon non à petites cellules et inhibe leur apoptose. Cibler ce nouveau point de contrôle immunitaire par des anticorps bloquants est donc une approche prometteuse en immunothérapie. A la lumière de certaines limitations des anticorps conventionnels bloquants en thérapies des tumeurs solides, nous avons investigué le potentiel d’inhibiteurs basés sur des VHH. Ce petit format d’anticorps, dérivé des anticorps homodimériques de camélidés, allie les propriétés de spécificité des anticorps à celles des petites molécules. Grâce au criblage par phage-display d’une banque immunologique obtenue par immunisation d’un alpaga, nous avons sélectionné un VHH hautement affin et spécifique pour ILT4, qui inhibe l’interaction entre le récepteur et ses deux ligands. Nous avons démontré l’effet biologique antagoniste du VHH in vitro sur des modèles de cellules tumorales et de macrophages de type M2 protumoraux issus de monocytes. Ces premiers résultats de caractérisation supportent le développement futur de ce nouveau format d’anticorps VHH bloquant ILT4 en immunothérapie antitumorale
ILT4 (Immunoglobulin-Like Transcript 4) is an immune checkpoint receptor mainly expressed by myeloid immune cells. In cancer context, ILT4 participates in tumor development by maintaining a protumoral immuno-microenvironment and directly promoting tumor cell proliferation. ILT4 interaction with the non-classical MCH class I molecule HLA-G induces an immunosuppressive microenvironment by promoting tolerogenic myeloid cells. Moreover, the ectopic expression of ILT4 has been reported in several solid tumors. The activation of ILT4 by Angiopoietin-like-2 (ANGPTL2) promotes non-small cell lung tumor cell proliferation and inhibits cell apoptosis. Targeting this new immune checkpoint with blocking antibodies is therefore a promising cancer immunotherapy approach. In light of several drawbacks of classical IgG blocking antibodies in solid cancer, we investigated the potential of VHH-based inhibitors. This small monoclonal antibody format, derived from camelid homodimeric antibodies, combine the binding capacities of antibodies to the properties of small molecules. After immunization of an alpaca and phage-display screening, we selected a VHH with high affinity and specificity to ILT4 that inhibits the interaction of the receptor with both ligands. We validated the VHH’s biological antagonist activity on tumor cells and monocyte-derived pro-tumoral M2 like macrophages in vitro. These results support the potential of this new VHH-based antibody targeting ILT4 in cancer immunotherapy

La prise en charge du cancer au stade avancé ou métastatique a été profondément modifiée avec l’arrivée des inhibiteurs des points de contrôle immunologiques (immune-checkpoint inhibitors (ICI)). Ces anticorps monoclonaux immuno-modulateurs ont été développés pour soit déclencher une nouvelle réponse immunitaire anti-tumorale, soit réactiver une réponse existante pour lutter contre le cancer. L’espérance de vie des patients traités par ce type de thérapie est plus longue par rapport à ceux traités par les thérapies usuelles. Par conséquent, la puissance statistique requise dans un essai clinique randomisé (ECR) ayant pour objectif principal d’estimer l’effet relatif du traitement sur la survie globale (SG), critère de référence en oncologie, peut être difficile à atteindre. Dans ce contexte, il est important d’identifier et de valider des critères de substitution de la SG chez les patients traités par ICI afin notamment de permettre un accès précoce à ces traitements innovants. Nous avons tout d’abord effectué une revue systématique de la littérature des différents critères cliniques intermédiaires associés à la SG chez les patients traités par ICI. Puis, à partir des conclusions de cette revue et de la connaissance de la spécificité du mécanisme d’action des ICI, nous avons évalué les propriétés de substitution d’un nouveau critère, le « temps jusqu’à l’initiation d’un traitement systémique ultérieur » (time to next treatment (TNT)), chez les patients atteints d’un mélanome avancé ou d’un carcinome à cellules rénales avancé, à partir de modèles statistiques récemment développés pour la validation de critères de substitution. D’après les résultats de ces analyses, le TNT semble être un critère de substitution prometteur dans ces 2 populations. Nous encourageons les promoteurs d’ECR d’ICI à recueillir la date d’initiation du traitement systémique ultérieur afin de pouvoir réaliser des analyses similaires de plus grande ampleur et de confirmer ainsi nos résultats
Advanced cancer treatment has been recently revolutionized by the development of the immune-checkpoint inhibitors (ICI). These immunomodulatory monoclonal antibodies are designed to either elicit a novel anti-tumoral immune response or revitalize an existing one to fight against cancer. Patients with cancer are living longer due to these improved therapies. Powering a study for overall survival (OS), the gold standard primary endpoint in randomized controlled trial (RCT) of anticancer drugs is becoming increasingly challenging. Therefore, it is of importance to identify and validate novel surrogate endpoints (SE) for OS in ICI-treated patients for expediting patients’ access to innovative and potentially life extending medicines. We first systematically reviewed published studies reporting on an association between alternative endpoints and OS in ICI-treated patients. Then, based on the learnings from this systematic literature review and from the specificity of the mechanism of action of ICIs, we evaluated the surrogacy properties of an emerging intermediate endpoint in solid tumors, namely time to next treatment (TNT), in ICI-treated patients with advanced melanoma and renal cell carcinoma (aRCC), through recent innovative statistical models for the validation of SE. Based on the results of these surrogacy analyses, TNT seems a promising SE for OS in RCTs of ICI-treated patients with advanced melanoma and aRCC. We encourage sponsors of RCTs of ICI to carefully collect the date of subsequent systemic treatment, so that surrogacy analyses could consequently be performed with a larger number of RCTs in order to confirm our findings

Les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) représentent un groupe hétérogène de pathologies développées aux dépend des progéniteurs myéloïdes immatures normaux, caractérisées sur le plan moléculaire par des modifications de l'expression de facteurs transcriptionnels aboutissant à un blocage de la maturation, et par une activation aberrante de molécules de la transduction du signal conférant aux cellules leucémiques des avantages prolifératifs et de survie. Dans ce travail, nous avons montré que la protéine kinase CHK1, impliquée dans le maintien de l'intégrité du génome en contrôlant l'arrêt du cycle cellulaire à la transition G1/S et G2/M après dommages constitutifs à l'ADN, prolonge son activation après dommages dans les cellules de LAM immatures permettant ainsi leur maintien en phase G2. Cette meilleure efficacité du point de contrôle G2/M des cellules immatures contribue très probablement à la chimiorésistance naturelle observée et largement documentée des cellules leucémiques immatures. De plus, nous montrons que la kinase CHK1 est anormalement activée dans les échantillons de LAM en raison de la présence de dommages à l'ADN constitutifs dans ces cellules. L'étude des caractéristiques cytogénétiques des patients nous a permis de mettre en évidence un haut niveau de dommages dans les LAM de haut risque cytogénétique, en particulier celles avec des cellules à caryotype complexe. L'inactivation de CHK1 par l'inhibiteur UCN-01 et par interférence à l'ARN aboutit à une inhibition des capacités clonogènes des progéniteurs leucémiques et à une chimiosensibilisation vis-à-vis de l'agent chimiothérapeutique ara-C. En revanche, les cellules hématopoïétiques normales CD34+, qui ne présentent pas de dommages constitutifs, sont beaucoup moins sensibles à l'UCN-01. Cet agent n'affecte pas non plus les capacités clonogènes des progéniteurs granulo-monocytaires normaux aux doses utilisées sur les cellules de LAM. Ces résultats nous ont permis de montrer que la kinase CHK1 joue un rôle important à la fois dans la chimiorésistance des cellules leucémiques immatures et dans l'établissement de l'instabilité génétique observée dans les LAM à caryotype complexe. Enfin, ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes sur l'utilisation de composés inhibiteurs des kinases du point de contrôle du cycle cellulaire dans les LAM et en particulier celles présentant le plus mauvais pronostic, les LAM à caryotype complexe
Acute Myeloid Leukemia (AML) is a clonal hematopoietic disorder characterized by the accumulation of malignant hematopoietic progenitor cells with an impaired myeloid differentiation program. The molecular basis of AML is thought to be associated with the acquisition of at least two types of critical cooperating mutations occurring at the hematopoietic stem or committed progenitors level. Class I mutations, affecting tyrosine kinases receptors and key components of cellular signalling pathways, confer growth and proliferative advantages. They are associated with class II mutations, affecting transcription factors thus leading to impaired normal differentiation program. In this study, we were first interested in CHK1, a protein kinase involved in preserving genome integrity by playing a critical role at the intra-S and G2/M cell cycle checkpoint activated in DNA damage response. We have shown that activation of CHK1 was sustained in immature cell lines, leading to a more stringent G2/M checkpoint in response to DNA damage, thus impairing illegitimate entry into mitosis in presence of unrepaired DNA damage and participating in their resistance to genotoxic agents. In a second study, we have demonstrated an abnormal activation of the CHK1 kinase in a large panel of AML patient samples, associated with the presence of constitutive DNA damage in absence of genotoxic stress. Moreover, the level of CHK1 activation is significantly correlated with unfavourable cytogenetic samples, particularly with complex karyotype phenotype. CHK1 inhibition by the pharmacological inhibitor UCN-01 or by RNA interference was found to decrease the clonogenic capacity of the AML progenitors, and to induce a chemosensitisation to ara-C. In contrast, growth of normal hematopoietic progenitors, which do not display constitutive DNA damage, was not impaired by such treatment. Overall, all these results underline the dual role of CHK1 kinase in AML pathology in the chemoresistance of immature leukemic cells and in the establishment of the genomic instability observed in complex karyotype AML. These findings could have major pharmacologic consequences, because they open a therapeutic window for new compounds targeting the cell cycle checkpoint machinery in AML and more particularly in the worst prognostic group with complex karyotype

Les proprotéines convertases (PC) sont d’importantes enzymes impliquées dans l’activation par clivage de précurseurs protéiques dans la voie de sécrétion cellulaire et qui permettent la régulation de la physiologie animale. Toutefois, les PC ont un rôle particulier lors d’infections, puisqu’elles participent à la fois à l’activation de pathogènes et au contrôle de la réponse immunitaire qu’ils induisent. Cette thèse présente le développement d’un inhibiteur peptidique de PC à des fins thérapeutiques contre les pathogènes et se penche sur le rôle de PC1/3, une PC dite neuroendocrinienne, dans le contrôle de la réponse immunitaire au sein des macrophages. Dans un premier temps, l’inhibiteur de PC a été optimisé par peptidomimétique afin de bloquer l’activation de deux pathogènes activés par les PC, l’un viral et l’autre bactérien. Dans un second temps, l’utilisation de shRNA sur un modèle de macrophages en culture NR8383 et du modèle de souris où PC1/3 est inactivée ont permis de déterminer les conséquences physiologiques et moléculaires de l’inactivation de PC1/3 au sein des macrophages grâce au développement d’une approche par spectrométrie de masse. L’approche par spectrométrie de masse s’est avérée être un catalyseur dans cette recherche et a pu être appliquée à l’étude de tissus de patientes atteintes du cancer de l’ovaire, démontrant ainsi tous les avantages de cet outil. En somme, les résultats de cette thèse montrent la faisabilité d’inhiber les PC pour contrôler les infections et ouvrir de nouvelles perspectives sur le contrôle de l’immunité en établissant les bases moléculaires du rôle de PC1/3 dans le maintien de l’homéostasie immunitaire
The proprotein convertases (PCs) are important enzymes mainly involved in the activation of protein precursors into the cell secretory pathway. This critical activation step that generates various biologically active polypeptides makes the PCs a cornerstone in a variety of biological process, including the neuroendocrine system. However, the PCs are described as very special players during infection, since they both activate various pathogens and control the immune response they induce. This thesis presents the development of a PCs peptide inhibitor for therapeutic purposes against pathogens and examines the role of PC1/3, which is mainly associated with the neuroendocrine system, in the control of the immune response in macrophages. As a first step, the PC inhibitor has been optimized by a peptidomimetic approach to block pathogens activation by PC for both a viral pathogen and a bacterial pathogen. In a second step, gene expression control tools have been used (shRNA) on a macrophage NR8383 cell line combined with the use of PC1/3 inactivated mouse (KO) to determine the physiological and molecular consequences of PC1/3 inactivation in macrophages by the mean of mass spectrometry approaches. The mass spectrometry approaches were proven to be a catalyst in this research and were further applied on ovarian cancer tissues studies, demonstrating the benefits of these tools. Overall, the results of this thesis demonstrate the feasibility of inhibiting PC to control infections and establish new avenues to modulate immunity by laying the foundations of PC1/3 molecular functions in the maintenance of immune homeostasis

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité
Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy

Le cancer a provoqué près de 10 millions de décès en 2020, il est prévu qu'il affectera presque 24,5 millions de personnes d'ici 2035 en raison des changements de mode de vie, du vieillissement et des facteurs environnementaux. Le cancer du sein (CS) est le diagnostic de cancer le plus fréquent et la première cause de mortalité oncologique chez les femmes. L'incidence du CS s'accroît avec l'âge, en parallèle avec la prévalence croissante des conditions concomitantes (comorbidités) et des prescriptions de médicaments chroniques (comédications), signalées chez environ la moitié de tous les patients atteints de cancer. L'administration de chimiothérapie avant la chirurgie (NAC) permet aux cliniciens d'évaluer la chimiosensibilité tumorale in vivo. L'objectif de cette thèse est de mener une analyse exhaustive pour étudier les relations complexes entre les lymphocytes infiltrant la tumeur (TILs), checkpoints, les déterminants génétiques, les sous-types de cancer du sein, les comédications, les comorbidités, la réponse au traitement et les résultats oncologiques chez les patients atteints de cancer du sein. Cet objectif sera atteint grâce à une étude intégrative des ensembles de données provenant de preuves du monde réel (RWE), et à une analyse post-hoc des essais contrôlés randomisés (RCTs). La première section de cette thèse offre une revue complète du paradigme dutraitement néoadjuvant dans le cancer du sein, se concentrant sur l'interconnexion de la biologie tumorale, des TILs, de la chimiosensibilité et de la survie. La section suivante cherche à étudier le rôle des comédications dans le traitement du cancer en examinant les associations entre l'utilisation des comédications, les comorbidités, l'infiltration immunitaire et la réponse au traitement. Ce chapitre vise à identifier des interactions insoupçonnées qui pourraient améliorer les résultats pour les patients en découvrant de nouvelles applications thérapeutiques pour des médicaments existants (drug repurposing). De plus, nous entreprenons une analyse approfondie des effets des médicaments concomitants prescrits régulièrement sur la survie du CS en utilisant des données du Système National des Données de Santé (SNDS) de la France. Nous nous efforçons de dessiner une carte détaillée des interactions potentielles entre les médicaments concomitants et la survie dans le contexte de la population française entière. En conclusion, le CS incarne un réseau complexe d'interactions entre la tumeur et le microenvironnement, avec de nombreux facteurs d'influence encore à élucider pleinement. Les contextes néoadjuvants et l'intégration de vastes bases de données peuvent identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et des interactions médicamenteuses, qui sont essentielles pour faire progresser une médecine de précision sûre et rentable
Cancer caused almost 10 million deaths in 2020 and is predicted to affect nearly 24.5 million people by 2035 due to lifestyle changes, aging, and environmental factors. Breast cancer (BC) is the most frequent cancer diagnosis and the first cause of oncology mortality among females. The incidence of BC escalates with increasing âge, paralleling the rising prevalence of co-existing conditions (comorbidities) and chronic médication prescriptions (comedications), reported in roughly half of ail cancer patients. Administering chemotherapy prior to surgery (NAC) allows clinicians to evaluate in vivo tumor chemosensitivity. The objective of this thesis is to perform a comprehensive analysis to investigate the intricate relationships among tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), checkpoints, genetic déterminants, breast cancer subtypes, comedications, comorbidities, treatment response, and oncological outcomes in patients with breast cancer. This objective will be achieved via an intégrative examination of datasets from real-world evidence (RWE) and a post-hoc analysis of randomized controlled trials (RCTs). The opening section of this thesis provides a comprehensive review of the neoadjuvant treatment paradigm in breast cancer, focusing on the interconnectedness of tumor biology, TILs,chemosensitivity, and survival. This research offers valuable insights into the intricate network that governs treatment outcomes. The subséquent segment seeks to study the rôle of comedications in cancer treatment by examining the associations between comedication use, comorbidities, immune infiltration, and treatment response. This chapter aims to identify unsuspected interactions that may improve patient outcomes by discovering novel therapeutic applications for existing drugs (drug repurposing). Moreover, we undertake an in-depth examination of the effects of regularly prescribed concomitant médications on BC survival using data from the French National Health Data System (SNDS). We endeavor to delineate a detailed map of potential interactions between concomitant médications and survival in the context of the entire French population. In conclusion, BC epitomizes a complex network of tumor and microenvironment interactions, with numerous influencing factors yet to be fully elucidated. Neoadjuvant settings and vast database intégration can identify novel therapeutic targets and drug-drug interactions, which are vital for advancing cost-effective, safe précision medicine

Les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) épuisés, sont caractérisés par l'expression de points de contrôle de l'immunité (PCI), par exemple PD-1. Une des approches majeures en immunothérapie, basée sur l'inhibition des PCI, s'est avérée efficace dans le contrôle de la progression tumorale dans plusieurs cancers. Malgré cette avancée, seule une proportion des patients en retire un bénéfice clinique. Afin d'améliorer les réponses à l'inhibition des PCI, il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans l'épuisement des TIL et d'élucider quels lymphocytes T (LT) sont capables de répondre à cette immunothérapie. Au site tumoral, nous mettons en évidence que seuls les LT CD8 spécifiques des antigènes (Ag) tumoraux expriment quatre PCI ainsi que d'autres marqueurs d'épuisement et perdent la molécule de co-stimulation CD28, contrairement au LT CD8 spécifiques circulants. Les TIL CD8 spécifiques sont dysfonctionnels, néanmoins, ils possèdent un potentiel cytotoxique élevé et expriment des marqueurs de résidence. Nous montrons que l'inhibition de PD-1 a une double action sur les LT CD8 spécifiques. Elle rétablit leurs fonctions dans la tumeur et augmente leur prolifération dans la périphérie. De manière importante, l'infiltration des tumeurs par ces TIL spécifiques et épuisés est prédictive de la réponse à la thérapie et de la survie des patients traités par immunothérapie ciblant l'axe PD-1/PD-L1. Les LT CD4 auxiliaires sont essentiels pour l'amorçage de la réponse T CD8. En revanche, leur rôle effecteur dans la tumeur a été moins étudié. Ici, nous montrons que les LT CD4 spécifiques des Ag tumoraux, également épuisés au site tumoral, peuvent être identifiés par des marqueurs qui leur sont propres. Des similarités dans le programme d'épuisement des LT CD4 et CD8 ont été retrouvées. Le blocage de PD-1 sur les TIL CD4 rétablit leur activation, ce qui va permettre la maturation des cellules dendritiques et, par conséquent, l'augmentation de la prolifération des TIL CD8 spécifiques de la tumeur. Nos résultats révèlent que les TIL CD4 et CD8 spécifiques des Ag tumoraux épuisés peuvent être identifiés chez les patients par des marqueurs caractéristiques et qu'ils répondent à l'inhibition du PD-1 en rétablissant les fonctions des LT CD8 de manière directe et indirecte. Ces données identifient des biomarqueurs prédictifs de la réponse à l'immunothérapie et positionnent les LT spécifiques des Ag tumoraux comme des acteurs de la réponse clinique à l'immunothérapie bloquant le PD-1
Exhausted tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) are characterized by immune checkpoint (IC) expression, for instance PD-1. One of the major immunotherapy approaches, based on IC inhibition, has proved efficient in the control of tumor progression in many cancers. Despite this progress, only a proportion of patients experience clinical benefit. To improve responses to IC inhibitors, understanding mechanisms involved in TIL exhaustion and investigating which T cells are able to respond to immunotherapy are required. We investigated both CD8 and CD4 T-cell exhaustion and its relation to tumor antigen (Ag) specificity and to responsiveness to IC inhibition in cancer patients. We demonstrated that CD8 T-cell exhaustion at the tumor site was only attained by tumor Ag-specific cells that were characterized by the sequential acquisition of ICs and by CD28 loss. Their circulating counterparts expressed less ICs and at lower levels and were CD28+. Specific CD8 TILs were dysfunctional, nonetheless, they maintained high cytotoxic potential and expressed tissue residency markers. We showed that PD-1 inhibition has a dual effect on specific CD8 T cells. It rescued their effector functions at the tumor site and enhanced their proliferation in the periphery. Importantly, the quantity of exhausted and specific TILs was predictive of response to therapy and of survival in patients treated with PD-1-targeting immunotherapy. Assessment of CD4 TIL exhaustion underscored similarities with the CD8 exhaustion program, in particular their specificity for tumor Ag and sequential acquisition of ICs although ICs characterizing terminally exhausted CD4 TILs were different than those found in CD8 TILs. Importantly, PD-1 blockade on CD4 TILs restored their helper functions, leading to dendritic cell maturation and, consequently, increased tumor-specific CD8 T-cell proliferation. Our data imply that under anti-PD-1/PD-L1, effector functions of terminally exhausted CD8 TILs is rescued and the tumor site is replenished by memory CD8 T cells which proliferate following direct blockade of PD-1 and through reinvigoration of the helper activity of tumor Ag-specific CD4 T cells. Our results position tumor Ag-specific T cells as major players of responsiveness to PD-1-blocking immunotherapy and identify predictive biomarkers of response to immunotherapy

Des mutations récessives de NBEAL2 ont été décrites chez des patients atteints du syndrome des plaquettes grises (SPG). Ce syndrome se caractérise par une macro-thrombopénie, avec des plaquettes dénuées de granules-alpha, conduisant à des troubles de la coagulation, souvent associés à une splénomégalie. Ainsi, NBEAL2 a un rôle crucial dans le trafic des granules-alpha plaquettaires. En outre, notre laboratoire a montré que les patients avec un déficit en NBEAL2 peuvent présenter des caractéristiques cliniques semblables aux syndromes lymphoprolifératifs auto-immuns ; suggérant un rôle de NBEAL2 dans l'homéostasie immunitaire et la tolérance. Une cohorte internationale plus large de patients SPG a confirmé et décrit de nouvelles anomalies immunitaires chez ces patients (maladies auto-immunes, autoanticorps, lymphopénies). Si le rôle de NBEAL2 dans le trafic des granules est souvent étudié, le mécanisme exact conduisant au développement des manifestations auto-immunes chez les patients SPG reste inconnu. NBEAL2 appartient à une famille de protéines, impliquées dans le trafic vésiculaire, et possédant toutes un domaine BEACH conservé. Dans cette famille de protéines à domaine BEACH, une des protéines les plus proche de NBEAL2 est LRBA. LRBA est impliqué dans le recyclage de CTLA-4, un checkpoint immunitaire inhibiteur. CTLA-4 joue un rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires et la tolérance. Des mutations récessives de LRBA conduisent à des caractéristiques cliniques semblables aux déficiences partielles en CTLA-4 : auto-immunité, infiltrations lymphocytaires et lymphopénie B progressive. En condition physiologique, LRBA empêche la dégradation lysosomale de CTLA-4 et permet son recyclage à la membrane plasmatique. Par analogie avec LRBA, nous avons étudié l'importance de NBEAL2 dans le trafic intracellulaire des checkpoints immunitaires et nous avons apporté un nouveau regard sur son rôle dans les lymphocytes. NBEAL2 est ainsi une protéine d'échafaudage, se liant à LRBA, et impliquée dans le trafic de CTLA-4 ainsi que le trafic vésiculaire en général. Ces travaux apportent de nouvelles connaissances sur la régulation de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés, une nouvelle liste de partenaires pour la protéine NBEAL2 ainsi qu'un nouveau modèle pour le trafic vésiculaire dans lequel est impliqué NBEAL2. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à l'auto-immunité chez les patients atteints du syndrome des plaquettes grises pourrait conduire à un diagnostic plus précoce et un traitement adapté
Recessive NBEAL2 mutations have been reported in patients with Gray Platelet Syndrome (GPS). This syndrome is characterized by a macro-thrombocytopenia, with platelets lacking alpha-granules, leading to bleeding disorders, often associated with splenomegaly. Thus, NBEAL2 plays a crucial role in the trafficking of alpha-granules in platelets. Moreover, our lab has also described NBEAL2 deficiencies in patients presenting clinical features of the autoimmune lymphoproliferative syndrome, suggesting a role of NBEAL2 in immune homeostasis and tolerance. A broader international cohort of GPS patients has been described, revealing immune system abnormalities (autoimmune diseases, autoantibodies, lymphopenia). If the role of NBEAL2 in the traffic of granules is often investigated, the exact mechanism leading to the development of autoimmune manifestations in GPS patients remains unknown. NBEAL2 belongs to a protein family involved in vesicular trafficking, all of which possess a conserved BEACH domain. Within this BEACH-domain containing proteins family, one of the closest members to NBEAL2 is LRBA. LRBA is involved in the recycling of CTLA-4, an inhibitory immune checkpoint. CTLA-4 plays a crucial role in the regulation of immune responses and tolerance. Recessive mutations of LRBA lead to similar clinical features as partial CTLA-4 deficiency: autoimmunity, lymphocytic infiltrations, and progressive B lymphopenia. Physiologically, LRBA prevents the lysosomal degradation of CTLA-4 and allows its recycling to the membrane. By analogy with LRBA, we investigated the importance of NBEAL2 in immune checkpoints intracellular trafficking and we brought new insights on its role in lymphocytes. Thus, NBEAL2 is a scaffold protein, binding LRBA, and involved in CTLA-4 trafficking as well as in vesicular trafficking in general. This work brings new knowledge to the regulation of CTLA-4 in activated T lymphocytes, a list of new partners for NBEAL2 protein and a new model of vesicular trafficking in which NBEAL2 is involved. Finally, a better understanding of the mechanisms leading to autoimmunity in patients with gray platelets syndrome could lead to better diagnosis and treatment management

PD-1 (Programmed Cell death protein -1) est un récepteur co-inhibiteur exprimé à la surface de lymphocytes T (LT) activés. Ce récepteur joue un rôle important dans le maintien de la tolérance périphérique tout en protégeant contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, une expression élevée et permanente de PD-1 et ses ligands PD-L1 et PD-L2 (PD-Ls) perturbe la réponse immunitaire contre les pathogènes et les cellules tumorales. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ciblant l'axe PD-1/PD-Ls représentent aujourd’hui une avancé majeure dans le traitement de différents types de cancer, tant sur le plan de l’efficacité que de la tolérance. Le nivolumab (nivo) et le pembrolizumab (pembro) sont deux anticorps monoclonaux (AcM) anti-PD-1 qui bloquent l’interaction de PD-1 avec ses ligands. Ces AcM ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de multiples types de cancers comme le mélanome, le cancer bronchique non à petites cellules, le carcinome à cellules rénales, etc. Malgré l’importance thérapeutique de nivo et de pembro dans le cancer, aucune étude n’a défini le devenir de PD-1 après la liaison à ces deux AcM. L’objectif de cette étude a été donc d’évaluer l’endocytose de PD-1 suite au liaison à des AcM anti-PD-1 (clone J110, nivo, pembro) et de déterminer s’il y a différence entre nivo et pembro vis à vis leur capacités à induire l'internalisation de PD-1. L’étude de l’endocytose de PD-1 a été réalisé sur des LT humains obtenus à partir du sang périphérique de donneurs sains et activés avec des Ac anti-CD3/anti-CD28 ou concanavaline A afin d’exprimer le récepteur PD-1. L’analyse des données par cytométrie en flux a montré que l’engagement de PD-1 avec l’Ac anti-PD-1 (clone J110) induit son endocytose dans les LT humains et que 50% de la totalité de PD-1 de surface est internalisé dans les premiers 30 minutes suivant l’incubation de cellules à 37°C, suivi d’un taux d’endocytose plus lent (56% en 60min). Notre étude a montré également que la liaison de nivo et de pembro au PD-1 induit son endocytose et que la plupart de récepteur est internalisée dans les 30 min suivant l’incubation de cellules à 37°C. Toutefois, 32 à 50% des récepteurs sont résistants à l’endocytose. L’analyse comparative de nivo et de pembro a révélé une différence statistiquement significative (p=0.03) entre le taux d’internalisation du complexe PD-1/nivo et celui du PD-1/pembro (46% versus 25% en 30min, respectivement). Même à des concentrations élevées de pembro, la liaison de nivo induit une meilleure internalisation de PD-1, ce qui suggère que nivo pourrait être plus efficace. Bien que les ICI comme nivo et pembro sont connus de bloquer l’interaction de PD-1 avec ses ligands, PD-L1 et PD-L2, notre étude a montré pour la première fois que ce deux AcM induisent aussi l’endocytose du récepteur PD-1 dans les LT humains avec des taux différents, et que 32% à 50% de récepteurs PD-1 sont résistants à l’endocytose. Ces résultats pourraient être exploités pour améliorer l’internalisation de PD-1 dans les LT humains et par la suite augmenter les potentiels thérapeutiques de nivolumab et de pembrolizumab dans le traitement du cancer. Mots clés : Récepteur PD-1, Ligands de PD-1, Lymphocytes T, Inhibiteurs de point de contrôle immunitaires, Anticorps anti-PD-1, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytose, Cancer
PD-1 (Programmed Cell death protein -1) is a co-inhibitory receptor expressed on the surface of activated T cells. It plays an important role in maintaining peripheral tolerance and protecting against autoimmune and inflammatory diseases. However, permanent expression of PD-1 and its ligands PD-L1/ PD-L2 (PD-Ls) disrupts the immune response against pathogens and tumor cells. Immune checkpoint blockade (ICB) targeting the PD-1/PD-Ls axis has revolutionized the treatment of many cancers. Nivolumab (nivo) and pembrolizumab (pembro) are two anti-PD-1 monoclonal antibodies (mAb) that block the interaction between PD-1 and its ligands. They have shown promising results in the treatment of multiple types of cancers such as melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell carcinoma, etc. Surprisingly, despite the success of anti-PD-1 in cancer immunotherapy, no-one has defined the destiny of surface PD-1 following antibody binding. Therefore, the objective of my master thesis was to define the fate of surface PD-1 following antibody binding and whether different anti-PD-1 Abs in the clinic differ in their ability to induce PD-1 endocytosis. The study of PD-1 endocytosis was performed on human T lymphocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and activated with anti-CD3/anti-CD28 Ab or concanavalin A to express PD-1 receptor. Data analysis by flow cytometry showed that following anti-PD-1 Ab binding, 50% of PD-1 becomes endocytosed by 30min. In addition, we found that the PD-1 receptor is internalised upon its engagement with nivo and pembro and that most of the receptor is endocytosed within 30 min. However, 32 to 50% of the receptors are resistant to endocytosis. The comparative analysis of nivo and pembro has revealed a statistically significant difference (p=0.03) between the internalisation rate of the PD-1/nivo complex versus PD-1/pembro (46% versus 25% by 30min, respectively). Even at high concentrations of pembro, nivo induces better internalization of PD-1, suggesting that nivo could be more effective than pembro. Our study showed for the first time that ICB involves not only in the blockade of PD-1/PD-Ls interaction, but also in the endocytosis of PD-1 receptors from the surface of human T-cells, which differs between nivolumab and pembrolizumab. These results could be exploited to increase the therapeutic potential of nivolumab and pembrolizumab in cancer treatment. Keywords: PD-1 receptor, PD-1 ligands, T lymphocytes, Immune checkpoint blockade, Anti-PD1 antibodies, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytosis, Cancer