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La sénescence est un état d’adaptation des cellules au stress qui contribue au vieillissement et au développement de nombreuses maladies. Étudier les voies moléculaires modulant l’induction, le maintien ou l’échappement de la sénescence est compliqué par la contamination des populations de cellules sénescentes par des cellules proliférantes pré- ou post-sénescentes. Pour contourner cette difficulté, nous avons développé un protocole de tri par cytométrie en flux, fondé sur trois marqueurs majeurs de sénescence (l’activité SA-β-galactosidase, la taille et la granularité des cellules), qui permet de trier des cellules sénescentes viables, à des degrés choisis d’engagement dans le phénotype.

Le vieillissement de l'organisme prédispose à de nombreuses pathologies chroniques telles que l'insuffisance cardiaque (IC). Des études récentes ont montré que l'accumulation de cellules sénescentes dans les organes au cours du vieillissement est associée à l'apparition de ces pathologies. La sénescence cellulaire a initialement été décrite comme un arrêt stable du cycle cellulaire permettant de limiter la prolifération des cellules dont l'ADN est endommagé. Ce processus s'accompagne de profondes modifications de la fonction cellulaire, avec notamment l'acquisition d'un phénotype sécrétoire associé à la sénescence. La sénescence peut être induite par un raccourcissement des télomères ou par l'exposition à des signaux de stress, tels que le stress oxydant ou l'irradiation, qui entrainent l'activation de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN et l'expression des gènes suppresseurs de tumeurs (p16INK4a, p21CIP1, p53). Ces inhibiteurs du cycle cellulaire sont classiquement utilisés comme marqueur de sénescence car leur expression augmente de manière ubiquitaire au cours du vieillissement. Toutefois, ces marqueurs ne sont pas spécifiques du tissu concerné et un des objectifs de ma thèse a été d'identifier de nouveaux marqueurs de sénescence tissu-spécifiques qui pourraient caractériser un vieillissement cardiaque pathologique. Le vieillissement cardiaque se caractérise par une hypertrophie des cardiomyocytes, une sensibilité accrue au stress et une prédisposition à l'IC. Les cardiomyocytes étant des cellules post-mitotiques, les mécanismes de sénescence mis en jeu, les marqueurs associés et leur rôle potentiel dans l'IC demeurent à l'heure actuelle peu caractérisés. Au cours de ce travail de thèse nous avons donc entrepris : 1) d'étudier le rôle des télomères et des dysfonctions mitochondriales dans l'induction de la sénescence du cardiomyocyte et 2) d'identifier des marqueurs spécifiques. Nous avons tout d'abord montré que les cardiomyocytes de souris âgées expriment les marqueurs classiques de la sénescence comme p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concernant les mécanismes inducteurs, nous avons étudié l'implication des dommages télomériques (telomere associated foci, TAF). Au cours du vieillissement, nous avons observé une augmentation du nombre de TAFs par cardiomyocytes en association avec l'hypertrophie. De plus, l'induction de TAFs in vitro est suffisante à l'activation de la voie de sénescence p53/p21CIP1 et l'hypertrophie dans une lignée de cardiomyoblastes H9c2. La formation des TAFs est augmentée chez des souris avec une dysfonction mitochondriale et est associée à l'activation des voies p53/p21CIP1. Par ailleurs, les cardiomyocytes âgés présentent une dérégulation des gènes impliqués dans la biologie mitochondriale pouvant rendre compte de l'augmentation des TAFs. Par l'analyse haut débit du transcriptome (RNAseq) nous avons identifié six nouveaux gènes qui sont surexprimés dans les cardiomyocytes sénescents (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15, Tgfb2). La comparaison d'expression de ces gènes dans le cœur avec d'autres tissus et avec le stroma cardiaque lors vieillissement a permis de confirmer la spécificité d'expression de ces marqueurs au niveau des cardiomyocytes. Nous avons validé cette signature dans deux modèles in vitro de sénescence induite par le stress et démontré que l'expression de certains de ces marqueurs est dépendante de la voie p53. De plus, l'expression de Prom2 est associée à l'hypertrophie des cardiomyocytes. En conclusion, nous avons démontré, qu'avec le vieillissement, les cardiomyocytes présentent un programme de sénescence associé à une dysfonction mitochondriale et une augmentation des TAFs. Cette sénescence se caractérise par l'activation des voies classiques de sénescence (p16INK4, p53/p21CIP1), une hypertrophie et l'acquisition d'une signature spécifique. Ces marqueurs offrent de nouvelles perspectives dans la compréhension de la sénescence cardiaque et dans son implication potentielle dans l'IC
Ageing of the organism is associated with several chronic pathologies such as heart failure (HF). Recent studies have demonstrated the link between the accumulation of senescent cells during ageing and age-associated diseases. Cellular senescence, originally defined as a stable cell cycle arrest, acts as a tumorigenic repressor by limiting the proliferation of DNA damaged cells. Despite this protective effect, senescence is characterized by deep remodeling of cell biology which drives functional disorders, such as the acquisition of a senescence-associated secretory phenotype (SASP). Senescence can be induced by telomeric attrition and by exposition to cellular stress signals such as oxidative stress or irradiation, which induce telomeric damage, activation of the DNA Damage Response (DDR) and increased expression of antitumoral genes (p16INK4a, p21CIP1, p53). These genes are classically used as markers of senescence because their expression increases in several tissues during ageing but they are not tissue-specific. Therefore, At the cardiac level, ageing is characterized by cardiomyocytes hypertrophy, increased sensitivity to stress and highest risk of developing HF. Cardiomyocytes are post- mitotic cells and the senescence inductor mechanisms, specifics markers and their role in HF remains poorly understood. This thesis project is articulated around two aims, 1/ studying the role of telomeric damages and mitochondrial dysfunction in triggering cardiomyocyte senescence and 2/ identification of specifics markers. Fisrtly, we shown that aged cardiomyocytes overexpress classic markers of senescence such as p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concerning the inductors mechanisms, we studied the implication of telomeric damages (telomere associated foci, TAF). During ageing, we found an increased number of TAFs per cardiomyocytes and their association with hypertrophy. Moreover, TAF- induction in cardiac H9c2 in vitro activated the p53/p21 pathway and induced senescence. These data confirmed the role of TAFs in cardiomyocyte senescence induction. Furthermore, aged cardiomyocytes exhibit a global alteration of genes involved in mitochondrial biology, oxidative stress and metabolism in aged cardiomyocytes that could play a prominent role in TAF accumulation with ageing. In a second part of the study, by using a next generation sequencing method (RNA-seq) we identified 6 new genes highly expressed in senescent cardiomyocytes (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15 and Tgfb2). Expression comparison with other senescent organs and cardiac stromal cells confirmed these new genes as cardiomyocyte specific. Thanks to an in vitro approach, we validate this signature by using different models of stress-induced senescence in cardiac H9c2 cells and demonstrated the implication of the p53 in the regulation of some of these genes. Moreover, Prom2 expression is associated with cardiomyocytes hypertrophy. In conclusion, we demonstrated that, with ageing, cardiomyocytes display a senescence phenotype associated with mitochondrial dysfunction and TAFs. This process is characterized by classic markers (p16INK4, p53/p21CIP1), hypertrophy and new identified signature. These new markers offer innovative perspectives in the understanding and the identification of the cardiac senescence and their potential deleterious role in heart failure

La sénescence cellulaire est un mécanisme de suppression cellulaire caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Les cellules sénescentes ont également un secrétome spécifique qui influe sur les cellules voisines, pouvant induire leur entrée prématurée en sénescence, l'apoptose, la prolifération cellulaire et le développement tumoral. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier une nouvelle protéine sécrétée par les fibroblastes sénescents et de caractériser ses fonctions dans les cellules sénescentes et dans les cellules tumorales. Nous avons mis en évidence la protéine WNT16B. Elle est surexprimée dans plusieurs modèles de sénescence cellulaire obtenus à partir de fibroblastes pulmonaires. Dans un modèle de souris transgénique, WNT16B est également associée avec l'accumulation de cellules sénescentes dans les lésions précancéreuses pulmonaires. WNT16B est impliqué dans le mécanisme de sénescence cellulaire. En effet, l'inhibition de WNT16B prévient l'entrée en sénescence, en empêchant l'activation de p53 et l'expression de p21/WAF1, et donc l'arrêt du cycle cellulaire.Nous avons finalement associé l'expression de WNT16B avec la présence de cellules sénescentes dans des tumeurs prélevées chez des patients atteints de carcinomes pulmonaires non à petites cellules. Cette expression est corrélée avec une meilleure survie pour les patients ayant reçu un traitement chimiothérapeutique. Ce dernier résultat fait donc le lien entre traitement, sénescence cellulaire et survie, et illustre le rôle potentiel des marqueurs des cellules sénescentes pour le suivi des patients. Globalement, ces travaux ont donc non seulement permis d'identifier WNT16B comme nouveau marqueur des cellules sénescentes, mais ils ont également ouvert des perspectives d'utilisation de ce marqueur pour l'identification, le traitement et le suivi des patients atteints d'un cancer.

Les nodosités racinaires, issues de la symbiose qui s’établit entre le soja et Bradyrhizobium japonicum, sont caractérisées par une sénescence précoce. Notre but était de trouver des marqueurs moléculaires de ce phénomène. Un gène codant une cystéine protéase est exprimé de manière différentielle durant le développement nodulaire. Par hybridation in situ nous avons montré que ce gène s’exprime à la périphérie de la zone centrale, progresse vers son centre et finit par envahir tous les tissus, ceci est col-localisé avec des événements de mort cellulaire programmée et une accumulation d’H2O2. Un lien possible entre ces trois processus et leur rôle lors du développement nodulaire sont discutés. Par differential display 3 ADNc ont été isolés. Deux d’entre eux, correspondant à un gène codant une noduline22, sont réprimés durant la sénescence et un rôle probable dans des échanges de métaux. Le troisième clone correspond à un gène surexprimé durant cette sénescence, avec une fonction putative dans des processus de mobilisation
The root nodules, resulting from the symbiotic interaction between soybean and Bradyrhizobium japonicum are characterized by an early senescence. Our goal was to find molecular markers of this process. A gene cong for a cysteine protease is differentially expressed during the development of nodules. In situ hybridisation experiments revealed that this gene is expressed as the periphery of the central zone, progresses through the central zone and finishes by being present throughout the nodule. This is co-localized with programmed cell death events and an accumulation of H2O2. A possible links these 3 processes and their role during nodule development is discussed. By differential display, 3 cDNAs were isolated. Two of them corresponded with a gene coding for a nodulin 22, which is repressing during senescence, and is proposed to function in metal changes. The third clone corresponded to a gene over-expressed during senescence and with a putative function in the mobilisation process

Dans ce manuscrit, nous démontrons par le biais de dimères forcés que toutes les propriétés oncogéniques de la protéine TWIST1, telles qu'évaluées par le biais de nombreux tests in vitro (tests de complémentation, inhibition de la sénescence oncogénique, induction de l'EMT et tests de coopération oncogénique…), sont spécifiquement attribués au complexe TWIST1-E12. L'insertion de mutations ponctuelles, définies d'après l'analyse de modèles de simulation in silico développés au sein du laboratoire (Bouard et al., 2013) et perturbant la dimérisation du complexe ou encore son interaction avec l'ADN conduit à une perte complète de l'activité, validant l'importance des deux partenaires dans l'activité oncogénique de la protéine de fusion. La détection du complexe TWIST1-E12 dans des carcinomes mammaires canalaires in situ humains, récapitulant les phases précoces de l'initiation tumorale, par la technique de Proximity Ligation Assay (PLA) ainsi que la sensibilité accrue de souris transgéniques à développer des carcinomes mammaires lorsque le complexe hétérodimérique est exprimé dans les cellules épithéliales luminales mammaires, renforce la conclusion que le complexe TWIST1-E12 est la (ou l'une des) forme(s) active(s) de la protéine TWIST1 dans le cadre de la carcinogenèse mammaire
Among embryonic transcription factors, TWIST proteins (TWIST1 and TWIST2) display the particularity to behave as master regulators of both RB and p53-oncosuppressive pathways. These embryonic transcription factors annihilate the induction of numerous cyclin-kinase inhibitors, including p16INK4A, p15INK4B and p21CIP1, abrogating thereby cell commitment to a senescence program or their death through apoptosis in response to an oncogenic activation. By doing so, TWIST proteins cooperate with mitogenic oncoproteins such as Ras in promoting cell transformation in vitro and breast and lung carcinogenesis in vivo (Ansieau S. et al. Cancer Cell ; Morel A-P. et al., PLoS ONE ; Tran P.T. et al., PLoS Genetics). Strikingly, TWIST depletion in numerous cancer cell types associates with a reactivation of failsafe programs, suggesting that some tumor cells remain addictive to TWIST for survival and proliferation (Ansieau et al., 2008). In support of this hypothesis, silencing TWIST expression in a TWIST + RAS-driven lung carcinogenesis mouse model displays a cytostatic effect (Tran P.T. et al., PLoS Genetics). Based on these observations, we aim at identifying TWIST specific inhibitors and evaluate the efficiency of such molecules in eradicating tumor cells in vitro as well as in vivo. TWIST proteins either behave as homodimeric (TT) or heterodimeric (TE) complexes (in association with E2A proteins), both complexes displaying distinct and sometimes even antagonistic functions during the embryonic development (Firulli B.A. et al., Nature Genetics ; Connerney F. et al., Dev. Dynamics). Ongoing experiments, comparing activities of tethered TWIST dimers, strongly support the assumption that an oncogenic potential is specifically allotted to the heterodimer. To screen for specific chemical inhibitors, we first established the in silico structure of the bHLH domain of TWIST complexes bound to their cis-responsive elements, by analogy with the NeuroD/E47 crystallographic structure. Relevance of these models has been confirmed through analysis of Twist1 variants associated with a loss of function in Saethre-Chotzen patients (Bouard et al., J. Biomolecular Structure & Dynamics). Strikingly, structural analysis highlights the importance of lateral loops in stabilizing the protein-DNA complex and in specifying the DNA sequence targeted

Comprendre les mécanismes de sénescence ou développer de nouveaux anti-cancéreux impose d’utiliser des modèles biologiques divers et complémentaires. De par sa facilité de mise en œuvre, la culture cellulaire est une des méthodes les plus employées. Cependant, travailler sur des cellules isolées ne permet pas toujours d’extrapoler les résultats à des conditions plus complexes comme un organisme entier. Les biologistes disposent alors de modèles intégrés plus ou moins évolués : levures, poissons (zebrafish …), grenouille (xénope …), insectes (drosophile …), rongeurs (souris, rats …), chien, primates, etc. Cependant leur mise en œuvre est souvent difficile, tant d’un point de vue administratif que technologique.L’objectif de notre travail a été d’initier le développement de deux nouveaux modèles biologiques intégrés (Caenorhabditis elegans et Hypsibius dujardini), beaucoup plus facilement manipulables, pour des études en oncopharmacologie et sénescence.Le potentiel de Caenorhabditis elegans a été évalué au travers de deux axes : (i) nous avons utilisé le nématode pour déterminer les potentiels toxiques, mutagènes et cancérogènes de gaz candidats au remplacement du gaz SF6 (ii) à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer, nous avons mis au point un test fonctionnel original : la mesure de la respiration mitochondriale du nématode entier.Nous avons choisi de développer comme second modèle, Hypsibius dujardini, beaucoup moins travaillé que C. elegans. C’est un tardigrade connu pour sa résistance aux conditions extrêmes, notamment à la dessication. Afin de mieux comprendre cette résistance, nous avons choisi d’analyser le fonctionnement mitochondrial de cet organisme en sortie d’anhydrobiose, en utilisant des marquages mitochondriaux et en mesurant sa respiration à l’aide du Seahorse XF24 Analyzer
Biological models are necessary to understand how organisms works, how evolution of living run, to test new treatments or to perform toxicological assessments as well. Cellular culture is one of the methods employed because it is easy to use. However, working on isolated cells doesn’t always allow to challenge of the results with more complex conditions as found in full organisms. Biologist needs to develop new biological models for new assessments but the new model choice can be a problem. Murine model, frog, drosophila, yeast, zebrafish,… have each other some benefits and limits. Their choice is directly linked with their use and with the type of research we intend to make.The aim of our work was to develop biological models to oncopharmacology and aging studies.The nematode model with Caenorhabditis elegans was used in several projects. One study was made on gases. They were tested in terms of toxicity, mutagenicity and cancerogenicity. On the other hand, a new tool was developed for prospective studies on either toxicology or mechanistic with the mitochondrial respiration measure with the Seahorse XF24 Analyzer device.The second biological model studied is the tardigrade and more exactly Hypsibius dujardini. Tardigrades are extremely resistant organisms to harshest conditions. They can resist to desiccation. To gain insights on tardigrade resistance, we have choice to analyze the mitochondrial dynamics in the course of anhydrobiosis exit by using mitochondrial dyes and respiration measurements

Le vieillissement s'accompagne d'un déclin des propriétés régénératrices de la plupart des tissus, et l’accumulation de cellules sénescentes au cours de l’âge est associée à ce déclin. La sénescence est une réponse cellulaire dû au raccourcissement des télomères ou à l’exposition aux stress provoquant une accumulation de dommages à l’ADN et / ou un stress oxydant. Cette réponse cellulaire est caractérisée par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, une augmentation de l’activité β-galactosidase associée à la sénescence ainsi que la sécrétion du Senescence-Associated Secretory Phenotype ou SASP composé de cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et protéases. La composition de ce SASP et par conséquent son rôle, dépendent du type cellulaire et de la nature du stress inducteur de sénescence et contribue aux effets délétères des cellules sénescentes. Parmi les tissus affectés, les muscles du squelette représentent un paradigme pour explorer les stratégies régénératives. Grâce à une population de cellules souches musculaires qui peuvent s'activer, proliférer et se différencier pour former de nouvelles myofibres, le muscle possède une remarquable capacité de régénération après blessure. Au cours du vieillissement et dans certaines dystrophies musculaires, ce potentiel s’épuise en raison de l'entrée progressive des cellules souches musculaires en sénescence. Le développement d’une sénotherapie basée sur l’utilisation de composés sénolytiques, capables d'éliminer les cellules sénescentes constitue donc une stratégie prometteuse. Cependant, les composés actuellement disponibles se caractérisent par un manque de spécificité. Ce travail de thèse a consisté à concevoir, synthétiser et évaluer pour la première fois deux nouveaux types de composés bifonctionnels innovants avec une sélectivité optimisée en ciblant la DPP4, protéase membranaire surexprimée sur la surface des cellules sénescentes. Le premier composé est la conjugaison entre le sénolytique puissant et un ligand de haute affinité de la DPP4 permettant un adressage moléculaire. La seconde est caractérisée, en plus, par un linker immolable, sensible à l’activité β-galactosidase associée à la sénescence permettant la libération spécifique du sénolytique au sein des cellules sénescentes. Les évaluations de ces composés ont été réalisé sur différentes lignées rendues sénescentes par différents stress et comparés à des sénolytiques et sénormorphiques de référence. En conclusion, les molécules bifonctionnelles développées au cours de cette thèse possèdent un pouvoir sénolytique similaire à la Piperlongumine, agent sénolytique utilisé pour la conception avec une sélectivité améliorée vis-à-vis des cellules non-sénescentes comparative aux sénolytiques de référence, Quercetin et Dasatinib par exemple. L’étude du mode d’action de la Piperlongumine a également été étudié, en particulier de l’état métabolique quelques cibles intracellulaires. Nos données constituent ainsi une excellente base pour développer un nouveau format de sénomodulateurs avec une sélectivité améliorée à des fins de régénération musculaire
Ageing is accompanied by a decline in the regenerative properties of most tissues, and the accumulation of senescent cells as we age is associated with this decline. Senescence is a cellular response due to telomere shortening or exposure to stresses causing an accumulation of DNA damage and/or oxidative stress. This cellular response is characterized by an irreversible cell cycle arrest, an increase in the β-galactosidase activity associated with senescence and the secretion of the Senescence-Associated Secretory Phenotype or SASP composed of cytokines, chemokines, growth factors and proteases. The composition of this SASP, and therefore its role, depends on the cell type and the nature of the senescence-inducing stress, and contributes to the deleterious effects of senescent cells. Among the tissues affected, skeletal muscle represents a paradigm for exploring regenerative strategies. Thanks to a population of muscle stem cells that can activate, proliferate and differentiate to form new myofibers, muscle has remarkable capacity for regeneration after injury. During the ageing process and muscular dystrophies, this potential is depleted as muscle stem cells gradually enter senescence. The development of senotherapy based on the use of senolytic compounds capable of eliminating senescent cells is therefore a promising strategy. However, the compounds currently available lack specificity. This thesis involved designing, synthesizing and evaluating for the first time two new types of innovative bifunctional compounds with optimized selectivity targeting DPP4, a membrane protease overexpressed on the surface of senescent cells. The first compound is characterized by a conjugation between a potent senolytic and a high-affinity ligand for DPP4, enabling molecular addressing. The second is additionally characterized by an immolative linker, sensitive to the senescence associated β-galactosidase activity, enabling specific release of the senolytic within senescent cells. These constructs were evaluated on different cell lines rendered senescent by various stresses and compared with reference senolytics and senormorphics. In conclusion, the bifunctional molecules developed during this thesis have a senolytic power similar to that of Piperlongumine, the parent senolytic agent used for design purposes, with improved selectivity towards non-senescent cells compared with reference senolytics such as Quercetin and Dasatinib. The mode of action of Piperlongumine was also studied in particular metabolism disruption, and intracellular targets. Hence, our data constitute an excellent basis to develop a new format of senomodulators with improved selectivity for muscle regeneration strategy purposes

Les Microvésicules (MVs) sont des marqueurs circulants de l’activation cellulaire au cours de la dysfonction du greffon et l’athérothrombose. Les MVs de la cellule bêta ou intratissulaires vasculaires, sont peu connues. Le suivi longitudinal de 19 patients transplantés d’îlots pancréatiques par les MV- PSA-NCAM+ sanguines témoigne d’une altération précoce du greffon avant l’identification des marqueurs clinique et biologique de la perte du greffon. La cinétique de libération des MVs leucocytaires, endothéliales et hépatiques suggère leur intérêt pour l’identification de la cause de la perte du greffon et pour la surveillance de l'immunosuppression. Après validation d’une méthode d’extraction douce des MVs tissulaires sur des plaques d’athérome, nous avons mesuré l’accumulation de MVs pro-sénescentes dans l’aorte de rats âgés, qui étaient réduite par l’ingestion d’EPA : DHA (6 :1), avec une baisse des propriétés pro-sénescentes identifiée sur les cellules endothéliales d’artères coronaires en culture. Le contrôle des MV nocives par cytoprotecteur du vaisseau réduirait la sénescence endothéliale
Microvesicles (MVs) are circulating markers that reflect cellular activation during graft dysfunction and atherothrombosis. Data on graft tissue MVs or vessel are scarce. The longitudinal follow-up of 19 patients with pancreatic islets transplants showed that circulating MV-PSA-NCAM+ typifying the early graft loss of islet graft prior its detection using the clinical and biological markers of graft loss. In addition, the kinetics release of leukocyte, endothelial and hepatic MV suggest their interest in identifying the cause of graft loss and in monitoring of immunosuppression. Using a new tissular MV mild extraction process validated with arteriosclerotic plaques, we evidenced an accumulation of pro-senescent MVs in the aorta of old rats that was significantly reduced by EPA: DHA (6 :1) intake as well as their pro-senescent properties on coronary artery endothelial cell cultures. Altogether, the pharmacological control of the release of noxious MVs using vessel cytoprotectors would limit the consequences of endothelial senescence

Les microparticules (MP) sont des vésicules de la membrane plasmique émises après stress cellulaire. Nous avons étudié le rôle des MPs leucocytaires extraites de la rate de rats comme marqueur du vieillissement et effecteurs de la senescence et de la dysfonction endothéliales induites par les fortes concentrations de glucose (HG). L’émission basale de MP augmente avec l’âge qui favorise leur génération en réponse au LPS ou au PMA/ionophore A23187 (MPLPS, MPPMA/I). Les MP de rats âgés mais pas de jeunes induisent la sénescence de cellules endothéliales primaires d’artères coronaires (AC) de porc. MPLPS ou MPPMA/I de rats jeunes, mais pas MPCTL (cellules non traitées) réduisent la relaxation dépendante de l’endothélium d’anneaux d’AC en réponse à la bradykinine avec sous-expression de eNOS, surexpression de COX2, ICAM-1, VCAM-1. HG favorise l’émission des MP de rate. Dans les AC en HG, la vasoconstriction en réponse au U46619l est diminuée de manière dépendante du SGLT1/2 et de l’EDHF
Microparticles (MP) are plasma membrane vesicles shed from stimulated cells. We investigated whether leukocyte MP extracted from rat spleen are reliable markers of aging and effectors of high glucose (HG)-induced endothelial senescence and dysfunction. Data indicate that ageing enhances MP shedding from spleen cells of middle-age and aged rats and raises MP release in response to LPS, or to PMA and ionophore A23187. Of note, MP from aged but not young rats induced senescence of porcine coronary artery primary endothelial cells. In young rats, MPLPS, MPPMA/I but not from resting cells (MPCTL) reduced the endothelial-dependent relaxation of coronary artery rings (CAR) in response to bradykinin with down-regulation of eNOS, up-regulation of COX-2, ICAM-1, VCAM-1. HG enhanced early and late MP release from spleen cells. Prolonged exposure to HG potentiated endothelial dysfunction in CAR and altered vasoconstriction in response to U46619l in a SGLT1/2 and EDHF dependent manner

Les Cellules Stromales / Souches Mésenchymateuses (CSM) ont un grand potentiel pour de nombreuses applications. Elles sont les cellules les plus utilisées pour les essais cliniques développant des thérapies cellulaires. L’efficacité thérapeutique des CSM est influencée par leur amplification in vitro et d’autres facteurs tels que les paramètres liés au donneur de cellules. Pour améliorer les thérapies à base de CSM, cette étude a ciblé l’étude de leur hétérogénéité grâce à leurs marqueurs de surface, qui permettent de mutualiser la caractérisation des cellules et la possibilité de trier des cellules vivantes. Le premier objectif de ce travail a été de décrire la variabilité des CSM entre et au sein d’échantillons venant de moelle osseuse de donneurs d’âges différents. Le deuxième objectif a été de développer une méthode de tri pour séparer les CSM selon leur expression de CD146 et de comparer les cellules triées. La troisième partie du travail a eu pour objectif de mieux connaître les marqueurs de surface des CSM sénescentes. Les résultats de cytométrie en flux sur les CSM sont soumis à de fortes fluctuations, mais certaines régularités ont pu être mises en évidence. Un ensemble de marqueurs de surface a pu être associé avec l’âge des donneurs : CD146, CD71, CD105, CD44. De plus, des liens entre l’expression de CD146, CD140b et CD71 ont été observés avec la capacité de prolifération des CSM. Des CSM de moelle osseuse provenant de donneurs d’âges différents et à différentes étapes de culture ont pu être triées avec succès selon leur expression de CD146 par une méthode immunomagnétique. Le comportement des CSM triées était encore hétérogène mais il a pu être observé que les CSM exprimant plus fortement CD146 avaient plus souvent de meilleures capacités de différentiation et de migration et étaient moins sénescentes que les cellules exprimant plus faiblement CD146. Une étude protéomique a montré que la plupart des protéines de surface détectées avaient tendance à être moins représentées sur les cellules sénescentes à l’exception de CD157. Les CSM à différentes étapes de culture jusqu’à la sénescence réplicative ont ensuite été suivies par cytométrie en flux. Cette dernière étude a révélé d’importantes fluctuations entre les différents passages, soulignant la difficulté associée à l’utilisation de ces marqueurs. Les marqueurs CD146, CD71, CD140b et CD157 méritent d’être suivis pour le contrôle qualité des CSM provenant de moelle osseuse
Mesenchymal Stromal / Stem Cells (MSC) hold great potential and are currently the most used in clinical trials with cell-based treatments. MSC quality and therapeutic effectiveness are influenced by in vitro expansion but also by other factors such as donor parameters. To ameliorate the success rate of MSC therapies, this study focused on MSC heterogeneity. To put together cell characterization and ways to act when facing cell heterogeneity, this work was oriented toward the study of surface markers that can be monitored on living cells, and can serve to sort them. The first objective was to describe initial MSC surface markers variability between and within different bone marrow MSC samples from donors of different ages. The second objective was to develop a sorting method to separate MSC according to CD146 expression and compare the sorted cells. The third objective was to widen MSC surface markers knowledge by focusing on senescent MSC. Surface markers of early passage and replicative senescent cells were compared with proteomics and flow cytometry. Flow cytometry results on MSC were shown to be submitted to strong fluctuations. However, some regularities were strong enough to stand out. A group of surface markers were found to be associated with donor age: CD146, CD71, CD105, CD44. CD146, CD140b and CD71 were also correlated with proliferation rate. CD146 expression had the particularity to be relatively stable in culture and turned out to be the most heterogeneously expressed when looking at cell population within the samples. Cultivated MSC from bone marrow coming from donor of different ages and at different culture steps were sorted successfully according to CD146 expression with immunomagnetic method. MSC behavior remained heterogeneous after sort but it could still be observed that most CD146high cells had more often better differentiation and migration capacities and were less senescent than their CD146low counterpart. Proteomics study showed that almost all surface proteins expression tended to decrease on replicative senescent MSC, except one marker that increased: CD157. MSC at different stages of culture until replicative senescence were then studied by flow cytometry. This study revealed strong fluctuation in marker expression between different passages, highlighting again the variability of MSC behavior and the difficulty to predict it. CD146, CD71, CD140b, CD157 and SSC deserve to be followed for MSC quality control

Le cancer du sein, malgré de nettes améliorations dans son diagnostic et sa prise en charge thérapeutique, reste la 1ère cause de décès chez les femmes. Différents paramètres permettent d’expliquer cette forte mortalité, tels que le manque actuel de biomarqueurs permettant de prédire la progression de la maladie. Des données préliminaires acquises par le laboratoire ont permis d’identifier la protéine DDB2 (Damaged-DNA binding 2) comme potentiel candidat pour la prédiction de la progression du cancer du sein. Une analyse in silico de bases de données transcriptomiques a permis de valider le rôle prédictif du gène codant DDB2 pour la progression métastatique des tumeurs mammaires, leur réponse à la chimiothérapie adjuvante, et le risque de récidive post-traitement. De plus, les cas de résistances aux thérapies, et les lourds effets secondaires soulignent le besoin actuel de nouvelles alternatives thérapeutiques. Le succès du cisplatine dans le traitement de nombreux cancers, dont celui du sein, a attiré l’attention des recherches sur les complexes organométalliques. C’est dans ce cadre que s’inscrit une autre partie des recherches du laboratoire qui étudie les effets cellulaires de complexes organométalliques à base de fer dans le modèle du cancer du sein. Des études préliminaires avaient mis en évidence la capacité de 2 complexes à base de Fer, appelés AIM2 et AIM3, à induire une inhibition de la prolifération de lignées cancéreuses mammaires (MDA-MB231 et T47D) et d’une lignée mammaire saine (MCF-10A). Cet effet cytostatique, qui s’étend jusqu’à 120h de traitement avec seulement 30% de cellules en phase sub-G1, a été associé avec une induction de la sénescence. De plus, nos résultats ont montré que cette sénescence est réversible uniquement dans la lignée mammaire saine, mais pas dans les lignées cancéreuses mammaires. Enfin, les résultats de cette thèse ont permis de mettre en évidence un effet potentialisateur des complexes face au Tamoxifène, à la Doxorubicine, au 5-Fluorouracile et à la radiothérapie dès 24h de prétraitement de différentes lignées mammaires. Ces résultats permettent d’envisager l’utilisation clinique des complexes AIM2 et AIM3 comme agent potentialisateur de la mort induite par différents traitements, mais également comme agents sénostatiques (induisant la sénescence) pour réduire le volume tumoral avant chirurgie
Breast cancer still remains the first cause of death in women, despite the improvement in its diagnostic and treatments. Many factors may explain this high mortality, such as the lack of biomarkers for the progression of breast cancer. Preliminary data acquired by the laboratory has identified the DDB2 (DNA-Damaged Binding 2) protein as a potential candidate for the prediction of breast cancer progression. In this work, an in silico analysis of several transcriptomic databases validated the predictive value of the ddb2 gene in the metastatic progression of breast tumors, their response to adjuvant chemotherapy, and the risk of relapse post-treatment. Moreover, cases of resistance against treatment, and the severe side effects highlights the need of new therapeutic alternatives. The success of cisplatin in the treatment of different cancers, including breast cancer, drew the attention of research to the organometallic family. In that extend, the laboratory is studying cellular effects of new iron-based organometallic compounds on breast cell lines. Preliminary data have revealed the anti-proliferative effect of two iron-based organometallic compounds, named AIM2 and AIM3, on 2 breast cancer cell lines (MDA-MB231 and T47D), and on 1 normal mammary breast cell line (MCF-10A). This cytostatic effect, which extend up to 120h of treatment with only 30% of cells in the sub-G1 compartment, has been associated with the induction of senescence. Moreover, our data showed that this senescence is reversible only in the normal mammary cell line, and not in the cancer cells. Finally, our work showed that a 24h pretreatment of different cell lines with our compounds lead to a chemo-and-radiopotentialisation effect. This work suggests the possible clinical use of AIM2 and AIM3 as chemo-and-radiosensitizers, as well as senostatic agents (senescence inductors)