Добірка наукової літератури з теми "Mutacions genètiques"

La Síndrome de Rett (RTT), és una malaltia del desenvolupament neurològic, d'inici precoç i que afecta quasi de forma exclusiva a les nenes. La seva incidència és de 1:10000-1:15000, i constitueix la segona causa de retard mental més freqüent en dones després de la Síndrome de Down.

La malaltia té dues presentacions clíniques, la forma clàssica i diferents formes atípiques (forma d'inici precoç o congènita, variant amb epilèpsia precoç, variant amb llenguatge conservat, forma fruste i variant amb regressió tardana). El diagnòstic de la RTT es realitza per criteris clínics, que inclouen criteris necessaris, criteris de suport i criteris d'exclusió.

L'objectiu fonamental d'aquesta tesi l'any 1999 era la identificació del gen responsable de la malaltia, però el gen va ser descrit a l'octubre de 1999 per Amir i col., la qual cosa va fer que es modifiquessin els objectius. Actualment sabem que la RTT és una malaltia dominant lligada al cromosoma X, causada en un elevat percentatge de casos per mutacions de novo en la regió codificant del gen MECP2.

MECP2 codifica per la proteïna methyl-CpG-binding protein 2(MeCP2). La proteïna conté dos dominis funcionals: el domini d'unió al DNA i el domini catalític. MeCP2 s'uneix selectivament a dinucleòtids CpG metilats i forma un complex inhibidor mitjançant la seva unió a diferents correpresors, el qual modifica l'estructura de la cromatina i reprimeix l'expressió d'altres gens. MECP2 és, per tant, un gen modulador de processos epigenètics que regula l'expressió d'altres gens.

S'han identificat mutacions en la regió codificant de MECP2 en el 70% de pacients amb RTT, però s'ha vist que el percentatge de detecció de mutacions varia segons la forma clínica de la malaltia. Les mutacions es produeixen de novo en més d'un 99% del casos. Tot i així i degut al risc de mosaïcisme germinal, el diagnòstic prenatal està indicat en l'RTT, independentment del sexe del fetus, sempre que es conegui la mutació en la germana afectada.

En la present tesi, s'ha posat de manifest que barons amb cariotip normal poden presentar RTT clàssica degut a mosaïcisme somàtic per una mutació en el gen MECP2, i que delecions en pauta en la regió C-terminal de la proteïna MeCP2 poden ser variants polimòrfiques sense relació amb la malaltia.

El servei de Neurologia de l'Hospital Sant Joan de Déu, va elaborar un cheklist amb la finalitat d'establir uns barems per a puntuar les diferents variables clíniques característiques de l'RTT, i poder definir el grau d'afectació de les pacients. Per realitzar les correlacions, les pacients han estat classificades en 2 grups, segons el tipus de mutació (portadores de mutacions de canvi d'aminoàcid i portadores de mutacions que produeixen proteïna truncada) i segons la localització de les mutacions (mutacions localitzades dins de MBD o TRD).

Fins el moment, l'anàlisi de mutacions dut a terme per tots els grups que treballem en la RTT ha estat restringida a la regió codificant del gen MECP2 (exons 2, 3 i 4), la qual dóna lloc a la proteïna. En aquesta tesi s'ha estudiat la regió promotora del gen MECP2, i s'ha detectat un canvi en una pacient amb RTT clàssica que podria tenir un efecte patogènic i ser el causant de la malaltia en la pacient: el canvi -5134delC trobat en l'exó1 del gen MECP2 afecta la diana d'un factor de transcripció específic del sistema nerviós i provoca una disminució en la seva afinitat d'unió.

S'ha descrit també, l'existencia d'un splicing alternatiu a la regió 5' de MECP2 que no és específic de teixit, i que podria donar lloc a dues isoformes de MeCP2 divergents a N-terminal.
Desconeixem encara si l'RTT presenta homogeneïtat o heterogeneïtat genètica.

La Fibrosi Quística (FQ; MIM# 219700) és una de les malalties letals més comuns en les poblacions d'origen caucàsic, amb herència autosòmica recessiva. El seu fenotip clínic es caracteritza per l'acumulació de moc viscós en òrgans exocrins, amb conseqüències patològiques en el tracte respiratori, gastrointestinal i urogenital. Mutacions al gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ABCC7; MIM# 602421) són responsables de la malaltia. Fins al moment, ja s'han descrit més de 1600 mutacions en el gen CFTR. La gran majoria són mutacions puntuals de les quals: 42% són mutacions de sentit erroni (missense).
El gen CFTR codifica per una proteïna de membrana de 1480 aminoàcids, que pertany a la gran família dels transportadors ABC. La proteïna CFTR presenta una estructura simètrica, formada per dos motius repetits, cadascun d'ells format per una regió transmembrana (TMD), composada per sis α-hèlix, i una regió citosòlica hidrofílica d'unió a ATP (NBD). Aquests dos motius queden units mitjançant un domini regulador (R), citosòlic i hidrofílic, que és fosforila per PKA i PKC.
El paper principal que desenvolupa el canal CFTR en la part apical de les cèl·lules epitelials és el transport de fluid transepitelial i electròlits a través de la membrana, activitat que ve regulada directament per la fosforilació de PKA. Aquest canal permet el trànsit d'ions de clorur a través d'ell en qualsevol direcció, i es caracteritza per tenir una baixa conductància unitària (la seva conductància és de 7-10 pS).
Existeixen moltes evidències en la literatura on les mutacions de sentit erroni, independentment de la seva localització en el gen CFTR, poden afectar a la funció del canal CFTR a diferents nivells: biogènesi de la proteïna, transport i localització, propietats electrofisiològiques del canal.
Així que l'objectiu general de la tesi va ser l'anàlisi molecular i funcional de vuit mutacions amb sentit erroni (p.P5L, p.S50P, p.E60K, p.R75Q, p.G85E, p.G85V, p.Y89C, p.E92K) localitzades en la regió N-terminal de CFTR, i identificades majoritàriament a la població espanyola.
Per portar a terme els objectius de la tesi, es van generar les vuit mutacions per mutagènesi dirigida en el vector pCMVCFTRNot6.2wt, i es van expressar en cèl·lules epitelials HEK293. Es va analitzar el processament i patró de maduració de les proteïnes mutants per Western blot i la seva localització cel·lular per immunocitoquímica. I posteriorment, es van caracteritzar funcionalment els canals mutants mitjançant la tècnica de Patch clamp en configuració whole cell i excised inside-out.
Vam observar que cinc de les mutacions analitzades, p.S50P, p.E60K, p.G85E, p.G85V i p.E92K, provoquen un processament i una maduració incorrecte de la proteïna. Totes cinc presenten un comportament molt similar a la mutació p.F508del, podent-se classificar aquestes mutacions dins la classe II.
La mutació p.P5L afecta a la funció de CFTR a dos nivells: a nivell de la biogènesi i a nivell de l'activitat del canal. Aquesta mutació provoca una disminució de la densitat de canals a la membrana citoplasmàtica. La conductància i la cinètica del canal també s'alteren.
La proteïna mutant p.Y89C afecta a l'activitat del canal. Aquesta mutació altera específicament la cinètica del canal.
El canal CFTR corresponent a la mutació p.R75Q presenta un patró de maduració i un comportament funcional del canal anàleg a la proteïna CFTR no mutada. Els nostres estudis corroboren la classificació de p.R75Q com a mutació sense expressió clínica.
El comportament sever de la majoria de les mutacions avaluades, afectant la biogènesi i/o l'activitat del canal, ressalta la importància funcional de la cua N-terminal i del segment TM1 en la fisiologia de CFTR.
Over 1,600 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene sequence variations have been identified in patients with cystic fibrosis (CF) and related disorders involving an impaired function of the CFTR chloride channel. However, detailed structure-function analyses have only been established for a few of them.
This study aimed evaluating the impact of eight N-terminus CFTR natural missense changes on channel behavior. By site-directed mutagenesis, we generated four CFTR variants in the N-terminal cytoplasmic tail (p.P5L, p.S50P, p.E60K, and p.R75Q) and four in the first transmembrane segment of membrane-spanning domain 1 (p.G85E/V, p.Y89C, and p.E92K). Immunoblot analysis revealed that p.S50P, p.E60K, p.G85E/V, and p.E92K produced only core-glycosylated proteins. Immunofluorescence and whole cell patch-clamp confirmed intracellular retention, thus reflecting a defect of CFTR folding and/or trafficking. In contrast, both p.R75Q and p.Y89C had a glycosylation pattern and a subcellular distribution comparable to the wild-type CFTR, while the percentage of mature p.P5L was considerably reduced, suggesting a major biogenesis flaw on this channel. Nevertheless, whole-cell chloride currents were recorded for all three variants. Single-channel patch-clamp analyses revealed that the channel activity of p.R75Q appeared similar to that of the wild-type CFTR, while both p.P5L and p.Y89C channels displayed abnormal gating. Overall, our results predict a major impact of the
CFTR missense variants analyzed, except p.R75Q, on the CF phenotype and highlight the importance of the CFTR N-terminus on channel physiology.

La tesi presenta l'anàlisi molecular del gen CFTR a la població espanyola. L'estudi inclou afectats i famílies de fibrosi quística (FQ) així com pacients de les malalties relacionades (agenèsia bilateral de conductes deferents, pancreatitis crònica i bronquiectàsies). La FQ és una malaltia genètica recessiva caracteritzada per malaltia pulmonar crònica, insuficiència pancreàtica i infertilitat en l'home. Per l'anàlisi del gen (250kb) s'han utilitzat dues tècniques de cribatge: l'electroforesi en gels de gradient desnaturalitzant (DGGE) i l'anàlisi de la conformació de la cadena senzilla (SSPC/HD) amb la posterior seqüenciació dels patrons anòmals per tal d'identificar les mutacions. A més s'ha evaluat l'eficiència de l'equip comercial que permet l'anàlisi directa de 31 mutacions freqüents del gen.
L'estudi evidencia l'heterogeneïtat molecular de la població espanyola amb únicament dotze mutacions que presenten una freqüència superior a l'1%. La mutació majoritària al món, F508del, representa el 51% d'al·lels. La mutació G542X és la segona més freqüent amb un 8% d'al·lels. L'equip comercial permet identificar el 76% dels al·lels, el que suposa la total caracterització del genotip en el 59% dels pacients FQ. Amb l'estratègia emprada s'han caracteritzat 108 mutacions que representen el 97% dels al·lels FQ.
A l'ABCD el 85% dels pacients presenten al menys una mutació i/o variant, sent la variant 5T la més prevalent (39%) en aquest grup. Pel que fa als fenotips PC i BQ, un 35% dels pacients presenten al menys una mutació i/o variant CFTR. En general, aquests fenotips (ABCD, PC, BQ) presenten heterogeneïtat molecular encara que amb un espectre de mutacions diferent, predominant les mutacions amb error de sentit. Aquestes mutacions que determinen un canvi d'aminoàcid poden afectar de forma molt diversa la funció i estabilitat de la proteïna. Tanmateix, l'alta freqüència d'individus heterocigots suggereix que aquests tenen una major predisposició a desenvolupar les diferents malalties, probablement, en un context multifactorial.

La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C.
Fins al moment s'han descrit més de 200 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP.
Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la Glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids.
Algunes de les mutacions descrites en el gen GBA són al·lels complexos, que són portadors de diferents mutacions, produïts per processos de recombinació entre el gen i el seu pseudogèn.
En aquest treball presentem el cas d'un individu que va ser dignosticat erròneament com a homozigot per a la mutació N370S, quan realment era portador d'un al·lel complex no descrit fins al moment.
A més, hem volgut caracteritzar millor l'al·lel mutant RecNciI i per a això hem analitzat aquesta mutació en població espanyola i argentina, ja que és molt freqüent en aquesta última població, utilitzant diferents mètodes. D'aquesta manera també hem pogut trobar nous individus que tenien al·lels Rec i no s'havien pogut detectar, i entendre millor els mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests al·lels.
També s'han analitzat mostres de pacients de la malaltia de Gaucher que eren candidats de ser portadors de mutacions en el gen PSAP. Aquest anàlisi ens ha permès decriure una mutació en la Saposina D que juntament amb una altra mutació ja descrita prèviament és la causant de la patologia.
Fins al moment s'han desenvolupat diferents tècniques de teràpia gènica, però en general tenen moltes limitacions. Per una banda els vectors utilitzats poden generar reaccions immunes (adenovirus) o integracions a l'atzar en el genoma (retrovirus). Per altra banda, el gen forani deixa d'expressar-se després d'un cert temps. Per tot això és lògic que s'hagin desenvolupat noves estratègies per a la teràpia de malalties genètiques. Una d'aquestes aproximacions és l'utilització de quimeraplasts, molècules quimèriques de RNA-DNA capaces de promoure la correcció d'una mutació mitjançant els mecanismes de reparació de la cèl·lula. En la malaltia de Gaucher una de les mutacions més freqüents és la L444P. Hem intentat corregir aquesta mutació utilitzant quimeraplasts en fibroblasts d'un pacient de la malaltia de Gaucher homozigot per la mutació L444P.
Els resultats obtinguts mostren una molt baixa, o nul·la, eficiència de correcció. Recentment s'han publicat diferents treballs on descriuen també resultats negatius per altres malalties utilitzant aquesta tècnica, deixant en entredit l'eficàcia d'aquesta tècnica.
Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. La teràpia de reducció de substrat es basa en la inhibició parcial de la glucosilceramida sintasa (GCS), enzim encarregat de sintetitzar glucosilceramida a partir de ceramida i glucosa. D'aquesta manera s'evita l'acúmul de glucosilceramida que provoca la malaltia.
En els darrers anys, els siRNAs (small interference RNAs) s'han utilitzat en diferents tipus d'experiments per inhibir l'expressió gènica. L'objectiu d'aquest treball és la inhibició de la expressió del gen de la GCS mitjançant siRNAs com una possible alternativa terapèutica per a la malaltia de Gaucher.
Vam dissenyar quatre siRNAs per a inhibir el gen GCS humà i els vam transfectar en cèl·lules HeLa. Amb dos d'aquests siRNAs vam aconseguir reduir la expressió de GCS a nivell de RNA. També vam comprovar la reducció tant a nivell d'activitat enzimàtica com de formació de glucosilceramida.
Després d'aconseguir silenciar el gen de la GCS utilitzant siRNAs, vam decidir probar-ho utilitzant shRNAs (short-hairpin RNAs). Els shRNAs són siRNAs generats per un plasmidi on se li ha insertat la seqüència que s'ha de transcriure per formar aquest shRNA. Vam generar dos shRNAs diferents aconseguint inhibir també l'expressió de GCS.
"Characterization of mutations causing Gaucher disease. Gene therapy approach."
The glycosphingolipid (GSL) lysosomal storage disorders are a group of inherited genetic diseases caused by mutations in the genes coding for enzymes involved in GSL catabolism. These diseases are characterised by the accumulation of the GSL substrates within lysosomes of cells, which results in cellular dysfunction and damage. The most common of the glycosphingolipidoses is Gaucher disease (GD), an autosomal recessive trait due to the accumulation of glucosylceramide caused by deficient activity of the enzyme glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45).
The glucocerebrosidase gene, lies on a gene-rich region which includes the metaxin gene and the glucocerebrosidase and metaxin highly homologous pseudogenes. The presence of these repetitions leads to DNA rearrangements. Some of these rearrangements give rise to complex alleles that cause the disease, of which RecNciI is the most prevalent. We analysed Gaucher disease patients from Argentina and Spain bearing this allele, and patients who carried mutation L444P, one of the three changes present in the RecNciI allele.
Only two patients bearing mutations in the PSAP gene, and not in the GBA gene, have been reported. In both cases, one mutant allele remained unidentified. We report here the identification of the second mutation in one of these patients, being the first complete genotype described so far in a SAP-C deficient-GD patient. This mutation, p.Q430X, is the first one reported in the saposin D domain and probably produces a null allele by nonsense mediated mRNA decay.
A number of gene therapy approaches have been developed for the treatment of genetic diseases, most of them based on the use of viral vectors. However, in general they have not been successful and some complications. To overcome these limitations, novel strategies have recently emerged. One of them is chimeraplasty, based on the correction of single-base mutations by mismatch repair mechanisms using chimeric RNA/DNA oligonucleotides, named chimeraplasts. Mutation L444P is one of the most common mutations in many populations. We have attempted to correct mutation L444P in fibroblasts from a Gaucher disease patient using a chimeraplast approach. Our results show a very low efficiency (if any) of chimeraplast correction.
In the last few years, small interference RNAs (siRNAs) have been used in a number of different experimental settings to silence gene expression. Enzyme replacement and substrate deprivation therapies are the current approaches to treat Gaucher disease. We present here a new approach based on the inhibition of the GCS gene using siRNAs as a possible future therapeutic strategy for Gaucher disease. A clear reduction in GCS RNA levels, enzyme activity and glucosylceramide synthesis was achieved. Similar results were obtained when using plasmids expressing shRNAs. Also, siRNAs to inhibit the mouse homolog Ugcg gene were successfully assayed.

La malaltia de Gaucher i la síndrome de Sanfilippo A, anomenada també mucopolisacaridosi IIIA (MPS IIIA), són malalties d'acumulació lisosòmica.En el present treball es mostra la cerca de mutacions responsables de la MPS IIIA en 26 pacients espanyols. S'han identificat 47 dels 52 al·lels responsables de la malaltia, el que correspon al 90% del al·lels mutats. La mutació c.1079delC (abans c.1091delC) és la més prevalent entre els pacients d'origen espanyol amb un 36,5% del total d'al·lels mutats. S'han analitzats també quatre polimorfismes interns per a construir els haplotips associats a les mutacions identificades. Hem comprovat que els cromosomes portadors de la mutació majoritària comparteixen el mateix haplotip [T, T, +ins, G], fet que suggereix un origen únic per aquesta mutació.La cerca de les mutacions responsables de la MPS IIIA serà, i de fet ja ha estat, útil per oferir el diagnòstic molecular a familiars dels pacients afectes per la MPS IIIA. En total, hem realitzat el diagnòstic molecular de 4 possibles portadors i confirmat dos diagnòstics prenatals realitzats enzimàticament. Hem comprovat la patogenicitat d'algunes de les mutacions identificades. Concretament, les mutacions S66W, R74H, Q85R, R206P, L386R, c.1079delC, R433W i R433Q han estat expressades emprat un sistema basat en l'obtenció de baculovirus recombinants mitjançant transposició de lloc específic. Els resultats revelen que totes les proteïnes mutades presenten baixos, sinó nuls, nivells d'activitat malgrat que en les anàlisis de westerns blot es detecta tant la proteïna precursora com la madura. Únicament, la sulfamidasa amb les mutacions p.S66W i p.R206P presenta certs nivells d'activitat enzimàtica.La malaltia de Gaucher està causada per la deficiència en l'activitat beta-glucosidasa àcida. Per tal de determinar la patogenicitat d'algunes de les mutacions responsables de la malaltia de Gaucher identificades en treballs anteriors del nostre grup, s'ha procedit a la seva expressió en cèl·lules d'insecte (Sf9). El sistema d'expressió escollit fou el mateix que per l'expressió de la sulfamidasa. Les mutacions P182L, R257X, Y313H, P391L i N392I presenten nivells d'activitat negligibles. Les mutacions N370S, I402T, D409, L444P i els dobles mutants [L444P;E326K] i [N188S;E326K], presenten nivells d'activitat entre el 6% i el 23% respecte la proteïna salvatge. Les N188S i E326K, presenten nivells d'activitat elevats del 42,7% i 66,6%, respectivament. Aquestes mutacions podrien ser considerades com a "variants modificadores", les quals al trobar-les soles en un al·lel no provocarien la malaltia o provocarien uns efectes molt lleus. En canvi, al trobar-les un combinació amb una segona mutació tindrien un efecte additiu incrementant la patogenicitat de l'altra mutació.En el present treball s'ha avaluat també l'efecte del procés de "nonsense mediated decay" (NMD) sobre quatre trànscrits diferents portadors de les següents mutacions: W(-4)X, R257X, c.1098insA i c.1451delAC. Amb l'ús de diferents tècniques (RT-PCR i digestió; PCR quantitativa; i, el test de la proteïna truncada) hem pogut demostrar que dels trànscrits analitzats únicament els que presenten les mutacions R257X i c.1098insA són degradats pel mecanisme de NMD. Les dades funcionals i mutacionals obtingudes en el present treball ens ajuden a entendre el mecanisme enzimàtic de la sulfamidasa i de la beta-glucosidasa àcida.

La malaltia de Gaucher i la síndrome de Sanfilippo A, anomenada també mucopolisacaridosi IIIA (MPS IIIA), són malalties d'acumulació lisosòmica.
En el present treball es mostra la cerca de mutacions responsables de la MPS IIIA en 26 pacients espanyols. S'han identificat 47 dels 52 al·lels responsables de la malaltia, el que correspon al 90% del al·lels mutats. La mutació c.1079delC (abans c.1091delC) és la més prevalent entre els pacients d'origen espanyol amb un 36,5% del total d'al·lels mutats. S'han analitzats també quatre polimorfismes interns per a construir els haplotips associats a les mutacions identificades. Hem comprovat que els cromosomes portadors de la mutació majoritària comparteixen el mateix haplotip [T, T, +ins, G], fet que suggereix un origen únic per aquesta mutació.
La cerca de les mutacions responsables de la MPS IIIA serà, i de fet ja ha estat, útil per oferir el diagnòstic molecular a familiars dels pacients afectes per la MPS IIIA. En total, hem realitzat el diagnòstic molecular de 4 possibles portadors i confirmat dos diagnòstics prenatals realitzats enzimàticament.
Hem comprovat la patogenicitat d'algunes de les mutacions identificades. Concretament, les mutacions S66W, R74H, Q85R, R206P, L386R, c.1079delC, R433W i R433Q han estat expressades emprat un sistema basat en l'obtenció de baculovirus recombinants mitjançant transposició de lloc específic. Els resultats revelen que totes les proteïnes mutades presenten baixos, sinó nuls, nivells d'activitat malgrat que en les anàlisis de westerns blot es detecta tant la proteïna precursora com la madura. Únicament, la sulfamidasa amb les mutacions p.S66W i p.R206P presenta certs nivells d'activitat enzimàtica.
La malaltia de Gaucher està causada per la deficiència en l'activitat beta-glucosidasa àcida. Per tal de determinar la patogenicitat d'algunes de les mutacions responsables de la malaltia de Gaucher identificades en treballs anteriors del nostre grup, s'ha procedit a la seva expressió en cèl·lules d'insecte (Sf9). El sistema d'expressió escollit fou el mateix que per l'expressió de la sulfamidasa. Les mutacions P182L, R257X, Y313H, P391L i N392I presenten nivells d'activitat negligibles. Les mutacions N370S, I402T, D409, L444P i els dobles mutants [L444P;E326K] i [N188S;E326K], presenten nivells d'activitat entre el 6% i el 23% respecte la proteïna salvatge. Les N188S i E326K, presenten nivells d'activitat elevats del 42,7% i 66,6%, respectivament. Aquestes mutacions podrien ser considerades com a "variants modificadores", les quals al trobar-les soles en un al·lel no provocarien la malaltia o provocarien uns efectes molt lleus. En canvi, al trobar-les un combinació amb una segona mutació tindrien un efecte additiu incrementant la patogenicitat de l'altra mutació.
En el present treball s'ha avaluat també l'efecte del procés de "nonsense mediated decay" (NMD) sobre quatre trànscrits diferents portadors de les següents mutacions: W(-4)X, R257X, c.1098insA i c.1451delAC. Amb l'ús de diferents tècniques (RT-PCR i digestió; PCR quantitativa; i, el test de la proteïna truncada) hem pogut demostrar que dels trànscrits analitzats únicament els que presenten les mutacions R257X i c.1098insA són degradats pel mecanisme de NMD.
Les dades funcionals i mutacionals obtingudes en el present treball ens ajuden a entendre el mecanisme enzimàtic de la sulfamidasa i de la beta-glucosidasa àcida.

El ratón doméstico, Mus domesticus, es un roedor comensal cuyo cariotipo estándar está formado por 40 cromosomas acrocéntricos. En su área natural de distribución, es frecuente la reducción de este número cromosómico debido a la presencia de un tipo de mutación denominada translocación Robertsoniana, que consiste en la fusión céntrica de dos cromosomas acrocéntricos para dar lugar a un cromosoma metacéntrico. En Europa y norte de África se han descrito más de 40 razas cromosómicas, definiendo como raza a un grupo de poblaciones contiguas que comparten el mismo juego de cromosomas Robertsonianos en homocigosis. Es frecuente que entre razas cromosómicas, o entre éstas y las poblaciones estándar se generen zonas híbridas compuestas por individuos con un número cromosómico intermedio entre el de las dos poblaciones que las han formado, y con una elevada frecuencia de heterocigotos para las fusiones que presentan. Muestreos realizados en las cercanías de la ciudad de Barcelona, entre 1981 y 1997, evidenciaron la existencia de poblaciones formadas por ejemplares con un 2n comprendido entre 29 y 39 cromosomas, debido a la presencia de las fusiones Rb(3.8), Rb(4.14), Rb(5.15), Rb(6.10), Rb(9.11) y Rb(12.13), pero no se demostró la existencia de ninguna raza cromosómica. Aún así se sugirió que se trataba de una zona híbrida entre las poblaciones estándar y una raza hipotética con 2n=28.

Las zonas de polimorfismo Robertsoniano son lugares potenciales de especiación, ya sea por un proceso de reforzamiento, o bien por una disminución del flujo genético causada por una reducción en la recombinación a nivel pericentromérico en los cromosomas Robertsonianos. Es por ello importante estudiar aquellos aspectos que pueden determinar un aislamiento genético entre las poblaciones que forman estas áreas. En este marco, los objetivos de la presente tesis fueron: 1) realizar un estudio exhaustivo de la estructura poblacional referente a la presencia de estas fusiones; 2) determinar cómo afecta la heterocigosidad estructural de las translocaciones Robertsonianas a nivel reproductivo en ejemplares pertenecientes a esta zona de polimorfismo cromosómico; 3) valorar el grado de aislamiento genético entre diferentes grupos cromosómicos mediante un estudio comparado de morfología craneana y post-craneana; 4) determinar las posibles relaciones entre el cariotipo y el comportamiento de los animales.

Los resultados obtenidos mostraron que las poblaciones de ratón doméstico ubicadas en la provincia de Barcelona y alrededores forman una zona de polimorfismo Robertsoniano, no pudiendo considerar este conjunto poblacional como una zona híbrida, puesto que no ha sido detectada ninguna raza cromosómica. Las poblaciones de esta área funcionan como unidades panmíticas separadas. Se puso en evidencia la existencia de una nueva fusión, Rb(7.17), no descrita previamente en ninguna población Robertsoniana de la especie. La notable extensión de esta zona (5000 km2) sugiere que la eficacia biológica de los individuos portadores de translocaciones no está severamente afectada. En la línea de células germinales masculinas se apreció una mayor muerte celular en aquellos ejemplares con fusiones Robertsonianas, especialmente cuando más de una translocación ha estado presente en heterocigosis estructural. Se detectó un patrón general en el cambio de forma relacionado con la heterocigosidad estructural y el número cromosómico, aunque dicha variación de forma es de carácter moderado. La diferenciación morfológica de los animales estándar respecto a los ejemplares que presentan polimorfismo Robertsoniano, sugiere un aislamiento genético de estos últimos. La existencia de diferenciación genética dentro de la zona de polimorfismo Robertsoniano vino también avalada por las diferencias significativas detectadas en la pauta de comportamiento, estudiada mediante el patrón diario de la actividad motora (variable regulada por el sistema circadiano). Respecto a esta variable se obtuvo que las fusiones Robertsonianas no afectan a las principales características del reloj circadiano pero sí a la modulación ultradiana del ritmo circadiano. El patrón de actividad motora se mostró como una variable apropiada para la discriminación entre grupos de ratones diferenciados cromosómicamente.

Se concluye que las fusiones Robertsonianas presentes en esta zona han contribuido a la diferenciación morfológica y etológica entre las poblaciones que la forman, circunstancia que sugiere la existencia de diferencias genéticas entre ellas. De aquí se desprende que la zona de polimorfismo presente en la provincia de Barcelona y en sus inmediaciones constituye un escenario muy apropiado para estudiar aspectos relacionados con el proceso de especiación

La febre mediterrània familiar (FMF) afecta unes 10.000 i 100.000 persones d'origen principalment àrab, armeni, turc i jueu i és caracteritza per la recurrència d'episodis autolimitats de febre i inflamació de seroses, sense una causa infecciosa aparent. A la població espanyola, els pacients de FMF descrits són casos aïllats i el recull més extens és el de pacients xuetes de Mallorca. La recent clonació del gen MEFV, al 1997, va constituir un punt d'inflexió en l'estudi de la FMF en els més diversos aspectes de la malaltia i va crear grans expectatives en els camps del diagnòstic, terapèutic i preventiu. A més, l'estudi en poblacions no ancestrals era un camp totalment inexplorat, començant pel fet que es considerava que la FMF no les afectava.
La hipòtesi de treball d'aquesta tesi s'ha basat en què l'estudi de les mutacions del MEFV en els pacients de FMF espanyols, així com la detecció de la possible intervenció de factors modificadors de la malaltia, permetria establir la relació causal de les mutacions al gen MEFV i la FMF i establir-ne les bases genètiques. A més, l'estudi de la dinàmica genòmica del locus MEFV permetria estudiar la història natural de les mutacions més freqüents a la vessant occidental de la Mediterrània.
Les conclusions de l'estudi són, en quant a les bases genètiques de la FMF a la població espanyola, que només el 53% dels pacients de FMF espanyols tenen una o dues mutacions en el gen MEFV, essent l'espectre de mutacions força heterogeni, mentre que el 47% dels pacients espanyols diagnosticats clínicament de FMF no presenta cap mutació al MEFV ni en cap dels gens coneguts responsables d'altres SHFP. Existeix una alta freqüència de pacients heterocigots qüestiona el patró d'herència de la FMF i suggereix l'existència d'almenys un altre locus implicat en la malaltia. D'altra banda, els pacients espanyols diagnosticats clínicament de FMF probable sense mutacions al gen MEFVpodrien manifestar un fenotip de FMF inusual o bé una nova síndrome de febre periòdica, altrament anomenada, FMF-like.
Els pacients de FMF a la població espanyola no pertanyen a cap ètnia relacionada amb les de les poblacions anomenades ancestrals, per la qual cosa l'origen ètnic no s'hauria de considerar un criteri d'exclusió en el diagnòstic clínic de FMF a la població espanyola. Clínicament, els pacients espanyols diagnosticats de FMF constitueixen un grup heterogeni: un subgrup manifesta la simptomatologia clínica típica de la malaltia, on ni l'amiloïdosi ni l'ELE ni l'historial familiar són manifestacions clíniques freqüents, mentre que l'altre subgrup manifesta episodis lleugerament més llargs i amb una major freqüència de limfadenopaties i mialgia. Es conclou que és necessari afegir l'anàlisi de la totalitat dels exons del MEFV en el diagnòstic de la FMF a la població espanyola.
A la població general espanyola s'observa una diversitat d'haplotips del MEFV força limitada causada per l'alt LD dels subhaplotips de cada bloc. L'equilibri de lligament entre els haplotips majoritaris del gen MEFV i l'alt LD de cada subhaplotip suggereix l'existència d'un punt calent de recombinació a l'intró 2, que constituiria un mecanisme plausible de generació dels haplotips majoritaris. Es proposa, per primera vegada, una nomenclatura sistematitzada dels haplotips de SNPs intragènics al gen MEFV, basada en criteris genètics i independentment del grup ètnic on s'han estat descrits. A més, es descriuen Tag-SNPs, per tal d'optimitzar la recerca de futurs estudis.
L'estudi dels haplotips associats a mutacions al MEFV en pacients de FMF revela la proximitat genètica de la població espanyola amb altres poblacions no ancestrals com la italiana o la francesa i una clara distància amb les poblacions ancestrals i estaria d'acord amb l'origen jueu sefardita dels xuetes.

La via Ras-Raf-MAPK regula funcions cel·lulars com la proliferació, la transformació o l'apoptosi. En càncer sol presentar mutacions activants en algun dels tres gens que codifiquen per a Ras (KRAS, HRAS y NRAS) i en un dels gens que codifiquen per a Raf (BRAF). A més, les mutacions de Ras i Raf són events alternatius ja que mai es donen a la vegada en un mateix tumor, suggerint que aquestes mutacions activen a la mateixa via. En càncer colorectal (CCR) la mutació puntual de BRAF V600E s'associa significativament als casos que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) que solen presentar mutacions per inserció o deleció a seqüències repetitives.
En aquesta tesi hem volgut determinar possibles associacions moleculars o clínico-patològiques de la mutació V600E que permetin explicar l'alta capacitat tumorogènica d'aquesta mutació en aquest tipus específic de tumor. Així, en càncer gàstric, que en MSI presenta un patró mutacional molt semblant al colorectal, no hem detectat mutacions de BRAF, ni en casos estables (MSS) ni en MSI, mentre que si que hem confirmat l'associació d'aquesta mutació a MSI en CCR. Sorprenentment, les mutacions de KRAS en càncer gàstric també s'associen significativament a MSI, mentre que en CCR es troben a ambdós fenotips (MSS i MSI).
Per un altre costat, en CCR MSI esporàdic, que sol estar provocat per l'hipermetilació del gen MLH1, no hem trobat cap associació de BRAF-V600E amb mutacions als gens KRAS, APC ni p53. En canvi, si que hem detectat una clara associació de V600E amb l'hipermetilació de MLH1. A més, analitzant els mateixos tumors per la metilació dels gens p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT i THBS1 hem associat BRAF-V600E i l'hipermetilació de MLH1 a un estat d'hipermetilació genòmica. D'una altra banda, no hem trobat cap associació de BRAF amb cap característica clínico-patològica a excepció de la localització ja que BRAF-V600E es detecta significativament en els casos proximals. També hem analitzat casos de CCR de pacients HNPCC, que tenen MSI per mutacions germinals enlloc de per metilació. No hem detectat cap mutació V600E de BRAF en aquests tumors, tant si tenen mutacions germinals a MLH1, MSH2 o MSH6 o no tenen mutació coneguda però compleixen criteris clínics com els d'Amsterdam o els de Bethesda més estrictes. Això confirma que V600E no es dóna específicament als casos MSI sinó en els casos amb hipermetilació de MLH1, i que aquests solen tenir més metilació genòmica que la resta de tumors.
Apart, també hem analitzat KRAS en casos de CCR MSS, MSI esporàdics amb i sense hipermetilació de MLH1 i HNPCC. Així, la freqüència de mutacions a KRAS és més alta si no hi ha hipermetilació de MLH1, independentment del seu origen esporàdic o hereditari. No obstant, en els casos esporàdics aquestes mutacions afecten sobretot al codó 12 mentre que en els casos hereditaris afecten al codó 12 i al 13 equitativament. A més, els casos HNPCC amb mutació a MLH1 tenen una freqüència de mutacions a KRAS menor que si la mutació germinal té lloc a MSH2 o MSH6. Finalment, les diferències mutacionals de KRAS i BRAF en CCR esporàdic i hereditari suggereixen una modulació diferent de la via Ras-Raf-MAPK així com una possible activació d'altres vies moleculars alternatives depenent de l'estat en que es trobi el fons genètic i epigenètic del tumor. A més, l'absència total de la mutació V600E de BRAF a HNPCC la converteix en una eina fiable, ràpida i de baix cost per al diagnòstic molecular com a criteri d'exclusió de càncer familiar.
The Ras-Raf-MAPK pathway regulates functions such as cell proliferation, transformation and apoptosis. In cancer activating mutations are present in the three Ras genes (KRAS, HRAS and NRAS) and in one Raf gene (BRAF). Moreover, Ras and Raf mutations hardly ever are found together in the same tumor suggesting that they activate the same pathway. In colorectal cancer (CRC) the BRAF hotspot mutation V600E is associated to microsatellite instability (MSI), which is characterised by insertion/deletion mutations in repetitive sequences. Here we have determined possible molecular or clinico-pathological associations of V600E to understand its higher tumorogenic capabilities in this subset of tumors.
We found that BRAF was not mutated in gastric cancer with MSI or without (MSS), although gastric and colorectal MSI tumors presented the same mutational patterns. Interestingly, gastric cancer only presented KRAS mutations in MSI tumors. Furthermore, in sporadic MSI CRC (which is usually caused by MLH1 hypermethylation) BRAF-V600E was not associated to KRAS, APC or p53 mutations but it was to MLH1 hypermethylation and to genomic hypermethylation after analysing p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT and THBS1. In addition, V600E was associated significantly to tumors located in the proximal colon. Moreover, tumors from HNPCC (a hereditary form of MSI cancer caused by germline mutations in mismatch repair genes) never had V600E mutations.
We have also analysed KRAS in CRC showing MSS, sporadic MSI with or without MLH1 hypermethylation and HNPCC. We found that KRAS mutation frequency is higher if MLH1 is not hypermethylated, independently of its sporadic or hereditary origin. And although in sporadic tumors these mutations are located in codon 12, in the hereditary ones they are located in codons 12 or 13 equally. Furthermore, HNPCC tumors carrying germline MLH1 mutations have less KRAS mutations than tumors with germline mutations in MSH2 or MSH6. Finally, we concluded that KRAS and BRAF differences in sporadic and hereditary CRC suggest a different Ras-Raf-MAPK modulation and possible alternative activation pathways depending on the genetic and epigenetic background of the tumor. Moreover, V600E is a reliable, fast and cheap tool for HNPCC diagnosis to exclude a hereditary origin.

Esta tesis es una contribución al conocimiento del síndrome de Maroteux-Lamy en el terreno de la genética molecular. El síndrome de Maroteaux-Lamy o mucopolisacaridosis de tipo VI (MPS VI) es una grave enfermedad hereditaria muy poco frecuente en humanos, provocada por la deficiencia de un único gen, que codifica la hidrolasa lisosómica N-acetilgalactosamino-4-sulfatasa o arilsulfatasa B (ARSB).

La primera publicación incluída en la tesis engloba los resultados del análisis de las mutaciones encontradas en el gen ARSB de pacientes españoles y argentinos con MPS VI. Se han identificado todos los alelos responsables de la enfermedad, de los cuales 9 no habían sido publicados anteriormente. Mediante estudios de RT-PCR se han obtenido evidencias de que algunas de las mutaciones podían provocar la destrucción del correspondiente transcrito mutado mediante el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay . El estudio también ofrece datos relativos a la clínica de los pacientes analizados, incluyendo la edad de diagnóstico, los principales síntomas fenotípicos y la concentración de glicosaminoglicanos totales excretados en orina, que constituyen datos importantes a la hora de intentar establecer relaciones genotipo-fenotipo. Cumpliendo con otro de los objetivos de la tesis, se realizó el análisis haplotípico de cuatro mutaciones comunes identificadas en pacientes españoles y argentinos con MPS VI y se apuntó a un posible origen único para dichos cambios.

La segunda publicación presenta los estudios de expresión y caracterización bioquímica de la mayor parte de las proteínas mutadas que no habían sido descritas con anterioridad por otros autores. Por primera vez en la bibliografía, se explicitó que el cDNA mutado se había expresado en el mismo contexto haplotípico que en el paciente en relación con los dos cambios exónicos presentes en las bases de datos de SNPs, p.V358M y p.S384N. Ambas variantes se expresaron también de forma individual, siendo de especial interés los resultados obtenidos para el cambio p.S384N, que tradicionalmente se ha considerado como mutación patogénica sin que se hayan realizado estudios de expresión. El análisis bioquímico de la actividad enzimática in vitro de las proteínas mutadas se completó mediante análisis de western blot. También se realizaron estudios de inmunofluorescencia indirecta para valorar el grado de localización de la proteína ARSB mutada en los lisosomas de fibroblastos de pacientes. Finalmente se realizaron estudios a nivel de RNA para las mutaciones que introducen codones de parada prematuros en la secuencia codificante (sin sentido, de splicing). Mediante el tratamiento de cultivos de fibroblastos de pacientes con el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida, se puso de manifiesto que el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay era responsable de la degradación de los transcritos portadores de cuatro de las mutaciones.

El trabajo que ocupa el tercer artículo es una aproximación a una forma de terapia complementaria a la de sustitución enzimática ya establecida para los pacientes de MPS VI, que se podría aplicar a los pacientes portadores de mutaciones sin sentido. Se trata del primer intento en esta enfermedad de intentar suprimir los codones de terminación prematura mediante el uso de antibióticos aminoglicósidos. Los ensayos se realizaron tanto en células transfectadas como en una línea de fibroblastos humanos. Las mutaciones escogidas permitieron ensayar la influencia del contexto nucleotídico del codón de parada en la determinación de la eficacia de la supresión de terminación. Las células se incubaron en presencia de gentamicina y se compararon los niveles de mRNA y de actividad enzimática con los obtenidos en células sin tratar. Los resultados evidenciaron que, en líneas generales, el tratamiento con gentamicina para la supresión de codones sin sentido incrementa, aunque poco, la capacidad catalítica de la ARSB, y que la eficacia del proceso parece depender del contexto nucleotídico.
Maroteaux-Lamy syndrome or mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI) is a rare lysosomal, autosomal recessive storage disorder caused by a deficiency of the lysosomal enzyme N-acetylgalactosamine 4-sulfatase or arylsulfatase B (ARSB).

The first aim of the thesis was to analyze the spectrum of mutations responsible for the disorder in Spanish and Argentinian MPS VI patients. We identified all the ARSB mutant alleles, nine of them novel. Clinical data of Spanish and Argentinian patients was also provided. Haplotype analysis indicated a common origin for most of the mutations found more than once. It was very difficult to stablish genotype-phenotype correlations. RT-PCR studies showed that some of these alleles could be responsible of the degradation of the ARSB mRNA transcripts by the mechanism of nonsense-mediated RNA decay.

In the second study, functional characterization of seven missense mutations and polyporphisms found in the ARSB gene was presented. All the ARSB mutations studied had a significant effect on enzyme activity. Mutations were expressed on COS-7 cells in their original haplotype context with respect two non-synonymous SNPs, p.V358M and p.S384N. Our results showed that change p.S384N, formerly described as a pathogenic mutation, should be considered a functional polymorphism. Western blot analyses showed that the expressed mutations significantly reduced the amount of mature protein. Sub-cellular localization studies of ARSB proteins in fibroblasts from MPS VI patients were performed. RNA analysis confirmed that nonsense-mediated RNA decay had taken place for all mutant alleles which were candidates for causing RNA degradation by this mechanism.

Finally, we reported the preliminary in vitro assays for restoring some amount of full-length and active ARSB protein, by means of gentamicin-induced translational read-through of premature stop codon mutations on different termination contexts. Gentamicin treatment on transfected COS-7 cells and fibroblasts from a MPS VI patient showed a slight recovery of ARSB activity and cDNA levels.