Дисертації з теми "Neurodegenerazione"

L’obiettivo del presente lavoro è stata l’identificazione di un ruolo per il recettore degli estrogeni (ER) nel neurosviluppo e nella neurodegenerazione, con particolare attenzione al coinvolgimento delle cellule gliali. E’ noto che gli estrogeni influenzano lo sviluppo, la maturazione ed il differenziamento dei neuroni nel sistema nervoso centrale, e che i suoi recettori mostrano un picco di espressione durante le fasi precoci di neurosviluppo. La zona subventricolare del cervello di topo adulto è una ricca fonte di progenitori neurali. Questi possono essere mantenuti in coltura, in un mezzo chimicamente definito contenente il fattore di crescita epidermico (EGF), sottoforma di neurosfere, che possono differenziarsi in neuroni e glia quando piastrate su laminina in assenza di EGF. Il presente studio ha mostrato che gli ER sono espressi nelle neurosfere sia in sospensione che in adesione, ed in particolare ER mostra un picco di espressione durante le fasi più precoci del differenziamento della neurosfera (6-24 ore). Il trattamento con 17-estradiolo 10nM (17-E2) non influenza significativamente la proliferazione nelle neurosfere in sospensione, ma modifica il differenziamento già dopo 6 ore di piastratura su laminina, con un significativo aumento della percentuale di neuroblasti PSA-NCAM-positivi e, successivamente, a 3 giorni, con un aumento nel numero di neuroni MAP2-positivi. Il trattamento con 17-E2 induce inoltre un aumento nella percentuale di cellule GFAP-positive ed un aumento dei livelli proteici di GFAP, con un effetto marcato a 24 ore di piastratura. In uno studio parallelo, è stata valutata la capacità della glia di mediare gli effetti neuroprotettivi degli estrogeni. Il 17-E2 esercita infatti effetti protettivi anche verso la tossicità da beta-amiloide (AP). Al fine di valutare il coinvolgimento degli astrociti in tale fenomeno, il terreno di coltura condizionato da astroglia pre-trattata con 17-E2 per 4 ore, è stato trasferito su neuroni corticali puri trattati per 24 ore con AP25-35 25M. I risultati ottenuti hanno mostrato una aumentata vitalità dei neuroni corticali, effetto che non appare modificato dal trattamento con l’antagonista dei recettori per gli estrogeni ICI 182,780 addizionato direttamente ai neuroni. Il TGF-1 è stato identificato quale fattore solubile responsabile della neuroprotezione indotta dal 17-E2. I livelli di TGF-1 intracellulare e rilasciato aumentano infatti in seguito al trattamento con 17-E2, ed il contenuto intracellulare di TGF-1 nelle cellule positive si riduce, suggerendo che il 17-E2 stimoli prevalentemente il rilascio di tale citochina. Infine, l’incubazione con anticorpo neutralizzante anti-TGF-1 incide significativamente sulla riduzione della morte neuronale indotta dal terreno condizionato da astrociti trattati con 17-E2. Nell’insieme, i risultati ottenuti puntano verso un ruolo chiave dei recettori degli estrogeni nel neurosviluppo e nella neuroprotezione, ed identificano la glia come target primario per l’azione degli estrogeni.
The aim of the present study was the identification of a role for estrogen receptor (ER) in neurodevelopment and neurodegeneration, focusing on the involvement of glial cells. Estrogen is in fact known to affect development, maturation and differentiation of neurons in the central nervous system and its receptors exhibit a peak of expression during early phases of neurodevelopment. The subventricular zone of the adult mouse brain is a source of progenitor cells which can be grown as neurospheres in a chemically defined medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), and are able to differentiate into neurons and glia when plated on laminin in the absence of EGF. The present study has indicated that ERs are expressed by both floating and adherent neurospheres, with ER showing a peak of expression during the earlier phases of neurosphere differentiation (6-24 hrs). Treatment with 10 nM 17-Estradiol (17-E2) did not significantly affect proliferation in floating neurospheres, but modified progenitor differentiation as early as 6 hours after plating on laminin, with a marked increase in the percentage of PSA-NCAM-positive neuroblasts, and later on at 3 days post-plating with an increase in MAP2-positive neurons. Treatment with 17-E2 also increased the number of GFAP-positive cells and the levels of GFAP protein with a major effect at 24 hours. In a parallel study, the ability of glia to mediate the neuroprotective effect of estrogen has been evaluated. 17-E2 is known to exert neuroprotective activity also against ß-amyloid (ßAP). To evaluate the involvement of astroglia in this effect, the conditioned medium from astrocytes preexposed to 17-E2 for 4 h was transferred to pure rat cortical neurons challenged with 25M AP25-35 for 24 h. The results obtained have shown an increased viability of cortical neurons. This effect is not modified by treatment with the estrogen receptor antagonist ICI 182,780 added directly to neurons. TGF-1 has been identified as the soluble factor responsible for 17-E2-induced neuroprotection. Accordingly, the intracellular and released levels of TGF-1 are increased by 17-E2 treatment, and the intracellular content of TGF-1 in immunopositive cells is reduced, suggesting that 17-E2 stimulates mainly the release of the cytokine. Finally, incubation with a neutralizing anti-TGF-1 antibody significantly modifies the decrease in neuronal death induced by 17-E2 -treated astrocyte-conditioned medium. Taken together these results point to a key role for estrogen receptor both in neurodevelopment and neurodegeneration and identify glia as a major target for estrogen action.

Il danno mitocondriale è associato a molte malattie neurodegenerative, quali: Parkinson, Alzheimer e Sclerosi Laterale Amiotrofica. Queste malattie sono associate anche a cambiamenti di isoforme tramite splicing alternativo di alcuni geni. In questo lavoro dimostriamo che il danneggiamento mitocondriale modula lo splicing alternativo in maniera generale. Cellule di neuroblastoma umano sono state incubate con l’agente chimico paraquat (una neurotossina che danneggia i mitocondri e crea stress ossidativo) e analizzate mediante RT-PCR per il pattern di splicing di 13 geni. Tutti gli mRNAs soggetti a splicing alternativo mostrano un’incremento dell’isoforma più piccola in maniera dose e tempo dipendente. Al contrario degli esoni alternativi, gli esoni costitutivi non cambiano dopo induzione con il paraquat. Dai dati ottenuti usando altre droghe, si evince che la modulazione dello splicing alternativo è correlata con il danno mitocondriale e la conseguente mancanza di ATP. Linee cellulari non neuronali non mostrano gli stessi cambiamenti nello splicing, indicando una selettiva suscettibilità delle cellule neuronali. Dato che una significativa percentuale di mRNAs di mammiferi è sottoposta a splicing alternativo, abbiamo ipotizzato che il danneggiamento mitocondriale causi uno squilibrio tra le varie isoforme dando un importante contributo alla neurodegenerazione. Con lo scopo di identificare eventuali targets farmacologici, abbiamo cercato di capire quale sia la via di trasduzione del segnale che trasmette lo stress mitocondriale al macchinario dello splicing. Due classi di proteine determinano la selezione dei siti di splicing: la famiglia delle proteine SR e la famiglia delle proteine hnRNP; entrambe regolate dalla fosforilazione, che è importante per la loro attività. Le proteine hnRNP ed SR sono state purificate da cellule di neuroblastoma umano di controllo e trattate con paraquat e studiate mediante un approccio sub-proteomico. Mentre le proteine hnRNPs non mostrano cambiamenti, le proteine SR sembrano essere down regolate e defosforilate in seguito a trattamento con il paraquat. Infine, utilizzando diversi inibitori che coinvolgono diversi pathway presenti nella cellula, abbiamo dimostrato che il calcio ha un ruolo nella via di trasduzione del segnale che stiamo osservando. I dati ottenuti non sono ancora conclusivi, ma sicuramente hanno dimostrato una correlazione fra la neurodegenerazione e lo splicing alternativo e hanno posto le basi per capire il modo in cui lo splicing alternativo è modulato nei neuroni in risposta a stimoli esterni.
Mitochondrial damage is linked to many neurodegenerative deseases, such as Parkinson, Alzheimer and Amyotrophic Lateral Sclerosis. These diseases are linked to changes in the splicing pattern of individual mRNAs. Here, we test the hypothesis that mitochondrial damage modulates alternative splicing, not only of a few mRNAs, but in a general manner. We incubated cultured human neuroblastoma cells with the chemical agent paraquat (a neurotoxin that interferes with mitochondrial function, causing energy deficit and oxidative stress) and analysed the splicing pattern of 13 genes by RT-PCR. For each alternatively spliced mRNA, we observed a dose and time dependent increase of the smaller isoforms. In contrast, splicing of all constitutive exons we monitored did not change after paraquat treatment. In addition, we prove that the modulation of alternative splicing by using different drugs correlates with ATP depletion, not with oxidative stress. Such drastic changes in alternative splicing haven’t been observed in cell lines of non-neuronal origin, suggesting a selective susceptibility of neuronal cells to modulation of splicing. Since a significant percentage of all mammalian mRNAs undergoes alternative splicing, we predict that mitochondrial failure will unbalance a large number of isoform equilibriums, thus permitting an important contribution to neurodegeneration. To identify possible drug targets, we tried to understand which is the signal trasduction trasmitting the mitochondrial damage to the splicing machinery. Two classes of proteins determine splice site selection: the hnRNP and the SR proteins. Both of them are phosphorylated and phosphorylation is important for their activity. We have purified hnRNPs and SR proteins from both paraquat-treated and human neuroblastoma control cells and we have studied them with a sub-proteomic approach. While the maps of paraquat-treated and control hnRNPs do not show up significant modifications, the SR proteins appear hypophosphorylated and downregulated by paraquat treatment. Finally, using different inhibitors involving different pathways in the cell, we demonstrate that calcium has a role in the signal trasduction that we are observing. The obtained data are not yet conclusive, but certainly have shown us a correlation between the neurodegeneration and Alternative Splicing. They have laid down the foundation for understanding the way by which the Alternative Splicing is modulated in neurons depending on external stimuli.

La Nicotinamide MonoNucleotide AdenililTrasferasi (NMNAT) è l’enzima chiave per la biosintesi del NAD+, sia nella via de novo che in quelle di recupero (salvage pathways). Nelle vie di recupero, l’NMNAT consente alla cellula di rigenerare il coenzima dalla vitamina B3 (niacina) o PP (Pellagra Preventing) assunta attraverso fonti esogene o ottenuta metabolicamente dalla degradazione intracellulare del dinucleotide stesso. Catalizzando il trasferimento dell’adenilato dall’ATP all’NMN, la forma mononucleotidica della vitamina B3, l’enzima porta alla formazione di PPi e NAD+. Il NAD+ è coinvolto nella cellula in vitali funzioni redox e non redox e la sua carenza è associata ad una vasta gamma di patologie nell’uomo, tra cui malattie neurodenegerative. È stato scoperto che la proteina chimerica WldS, proveniente da una mutazione spontanea sul cromosoma 4 nel ceppo murino C57BL/6J, è in grado di ritardare la degenerazione assonale. La porzione enzimaticamente attiva della proteina chimerica è l’omologo murino dell’enzima umano NMNAT1, una delle 3 isoforme note di NMNAT nei mammiferi che catalizzano la biosintesi del NAD+ in diversi distretti cellulari. Diversi lavori pubblicati hanno mostrato la capacità delle 3 isoforme di conferire protezione in varia misura, anche se non concordano su quale sia l’isoforma responsabile della protezione dalla neurodegenerazione. Per chiarire i meccanismi molecolari alla base del fenomeno sono state studiate proprietà cinetiche e molecolari delle 3 isoforme NMNAT note da mammifero. Tale studio ha permesso di mettere a punto un saggio di determinazione individuale della loro attività applicabile direttamente a estratti tissutali grezzi. Tale saggio consente di rilevare in maniera diretta le alterazioni a carico delle singole isoforme, già osservate in varie patologie cronico-degenerative riguardanti il sistema nervoso, nella pellagra e in stati patologici cellulari definiti “pellagra-like”, strettamente connessi alla carenza nutrizionale della vitamina PP.
Nicotinamide MonoNucleotide AdenylylTransferase (NMNAT) represents the key enzyme of NAD+ biosynthesis, both in de novo and salvaging pathways. For salvage in particular, cellular NMNAT allows regeneration of the coenzyme from vitamin B3 (niacin) or PP (Pellagra Preventing) precursors, available either exogenously or endogenously from intracellular metabolic NAD+ consumption. By catalyzing a transfer reaction of the adenylyl moiety from ATP to NMN, i.e. the mononucleotide form of vitamin B3, the enzyme allows the production of PPi and NAD+. In the cellular environment, NAD+ is involved in important redox and not redox functions, and its deficiency is related to a number of human diseases, among which neurodegenerative diseases in particular. In such context, the protein chimera WldS, arising from spontaneous mutation on chromosome 4 of mouse strain C57BL/6J, has been discovered as an essential neuroprotective agent. In such protein chimera, the enzymatically active fragment is represented by the murine homologue of the human enzyme NMNAT1, one of the three known NMNAT isozymes in mammals accounting for NAD+ biosynthesis in different subcellular compartments. Several papers recently showed a general enzyme capability of conferring neuroprotection but disagreement on which isoform is mainly responsible for such phenotype. In the attempt to clarify the underlying molecular mechanism we investigated on the molecular and kinetic properties of the three known NMNAT isoforms in mammals. This study allowed to develop a novel assay procedure for their individual activity determination directly in crude tissue extracts. This discrimination assay permits a direct measurement of the isoform-specific alteration observed in several chronical and pathological diseases of the nervous system, as well as in pellagra and “pellagra-like” diseases, directly related to nutritional deficiency of vitamin PP.

This doctoral dissertation aims to explore the in vivo role of Positron Emission Tomography (PET) imaging along the dementia continuum, from the preclinical to the prodromal and to the overt dementia phase, to provide a comprehensive picture of the mechanisms underlying neurodegeneration. Evidence in individuals with genetic risk to develop Alzheimer’s dementia suggests that the pathophysiological process leading to neurodegeneration starts years before the clinical diagnosis of dementia. For this reason, it is crucial to investigate biomarkers at the earliest possible stage of dementia. Mild Cognitive Impairment, pre-Mild Cognitive Impairment, and Subjective Cognitive Decline represent conditions with an increased risk of developing Alzheimer’s disease and other dementias, but some individuals will remain stable over time, and others will return to normal cognition. To correctly classify these subjects has significant therapeutic and prognostic repercussions. We investigated the diagnostic and prognostic role of FDG-PET in identifying subjects at risk for developing dementia and individuals with a favorable prognosis. We coupled brain metabolism information with in vivo pathological, structural, cerebrospinal fluid, and neuropsychological and neuropsychiatric data to improve diagnostic classification and predictive accuracy. We also explored the role of in vivo neuroinflammation in different stages of neurodegeneration, including Alzheimer’s disease dementia and Mild Cognitive Impairment. Neuroinflammation is a potential driver of neurodegenerative changes in several conditions, but its beneficial or detrimental role depends on the disease stage. Overall, our results confirm that the preclinical and prodromal stages of neurodegenerative dementias are heterogeneous states, and biomarkers assessment helps to classify or exclude individuals along the trajectory of neurodegeneration.
L'obiettivo di questa Tesi di Dottorato è di indagare il ruolo della PET (Tomografia ad Emissione di Positroni) come metodica di studio di soggetti appartenenti al continuum della demenza, dalle fasi preclinica e prodromica fino alla fase di demenza conclamata, per svelare i meccanismi che sottendono la neurodegenerazione. Lo studio di soggetti con rischio genetico di sviluppare demenza di Alzheimer ha portato all’evidenza che i processi patologici responsabili della neurodegenerazione hanno inizio anni prima delle manifestazioni cliniche della demenza. Per questo motivo è fondamentale identificare ed analizzare i marcatori di malattia il più precocemente possibile. Le condizioni di Mild Cognitive Impairment, pre-Mild Cognitive Impairment e Subjective Cognitive Decline includono soggetti con un rischio aumentato di sviluppare demenza rispetto alla popolazione generale, anche se molti di questi individui resteranno stabili nel tempo ed alcuni torneranno allo stato cognitivo iniziale. La corretta stratificazione di questi individui ha quindi importanti ripercussioni prognostiche e terapeutiche. Abbiamo pertanto indagato il ruolo diagnostico e prognostico della PET-FDG nell’identificare soggetti a rischio di demenza e soggetti con prognosi favorevole. I dati relativi al metabolismo cerebrale sono stati correlati a marcatori di patologia, strutturali, liquorali, neuropsicologici e neuropsichiatrici, per ottenere un’elevata accuratezza diagnostica e prognostica. E’ stata inoltre indagata la presenza di neuroinfiammazione in soggetti in diverse fasi di demenza neurodegenerativa, dalla demenza di Alzheimer alla fase di Mild Cognitive Impairment. La neuroinfiammazione è un importante attore nei cambiamenti degenerativi della demenza, ma il suo ruolo, protettivo o deleterio, dipende della fase di malattia. Nel complesso, i nostri risultati confermano che le fasi preclinica e prodromica di demenza sono condizioni eterogenee, e lo studio dei biomarcatori è necessario per identificare (o escludere) soggetti nella traiettoria della neurodegenerazione.

Hunter Syndrome (mucopolysaccharidosis type II, MPS II) is an inherited metabolic disease belonging to the wide group of lysosomal storage disorders (LSDs), including nearly 50 different pathologies. Although individually rare, these pathologies have a collective incidence from 1:4000 to 1:7000 live births, depending on the analyzed population. Most LSDs are due to single, or more rarely multiple, deficit of lysosomal enzymes, responsible of macromolecules degradation. Unmetabolized substrates result in multiorgan and multisystem diseases, which in the vast majority of the patients seriously affect also the central nervous system. Very little is known on LSDs pathophysiology and even less on the determinants of their neurological impairment. Since ERT (enzymatic replacement therapy) is getting promising results only in treatment of the LSDs without neurological involvement, because the enzyme cannot efficiently cross the blood brain barrier, more attention should be put in handling the cognitive and behavioral components of these pathologies. In this scenario, the comprehension of the neurological pathogenesis of these diseases, and in this specific case, of Hunter syndrome, becomes mandatory. Such understanding, although quite complex, might allow, among others, the development of new specific therapeutic strategies targeted to the brain. In this pre-clinic investigation, the murine MPS II model was used for a complex molecular analysis through high-throughput technology. RNAs from two different brain areas, cortex and midbrain, have been analyzed with next generation sequencing, by using SOliD® (Sequencing by oligo ligation and detection) technology. Although this technology is considered the most specific for RNA sequencing, it has not been extensively used so far due to its very high costs and to the complexity of the data analysis requiring advanced bioinformatics competence and a good capacity of software handling. RNA sequencing is a very powerful technology that, in contrast to microarray, can point out every single cellular transcript indistinctly. This work is a comparative study between brain areas derived from the IDS-knock-out and the healthy control mice. Data obtained, after alignment and filtration, have been classified according to Gene Ontology Domains, and analyzed by functional categories. The analysis has clearly pointed out the involvement of a wide group of genes and pathways implicated in neurological processes. Altered structures and cellular functions have been highlighted both through the analysis of terms that have the same alteration in the two cerebral areas and, in a more specific way, through the analysis of terms related to each area. This approach can underline genes whose altered expression is directly related to the cell pathological condition and, at the same time, genes with differential expression, representing instead specific pathways for the function of the brain area considered. Also the detection of alterations in genes involved in some common neurodegenerative diseases (as Parkinson’s and Alzheimer’s) could be very interesting; common pathways could be hypothesized for the disease development or as a consequence of the pathological state. The last part of this work has focused on some selected pathways that have been chosen as the most interesting candidates for the pathogenesis of the disease: heparan sulphate binding protein, calcium homeostasis, oxidative stress, autophagy, axon guidance, neuroinflammation, correlation with other neurodegenerative diseases and the growth hormone. A significant endocellular alteration, due to progressive increase of glycosaminoglican deposits and also of secondary deposits as gangliosides, could justify the involvement of proteins related to calcium metabolism, detected by the present analysis; since calcium plays an important ubiquitous messenger function in different biological processes, its role of leitmotiv in many pathways emerging from this analysis is not surprising. In conclusion, although very complex, the analysis here presented has highlighted the great power of this technology, due to its ability to detect, not only pathways obviously related to this disease, but also non-suspected pathways, whose role in the determination of the pathological condition has not been yet clarified.
La Sindrome di Hunter (o Mucopolisaccaridosi di tipo II, MPS II) è una patologia ereditaria appartenente al più vasto gruppo delle malattie da accumulo lisosomiale (Lysosomal Storage Disorders, LSDs), comprendente quasi 50 diverse patologie. Tali patologie, sebbene individualmente molto rare, presentano un’incidenza complessiva che va da 1:4000 a 1:7000, a seconda della popolazione considerata. Le LSDs, che risultano per lo più da deficit singoli, e più raramente multipli, di enzimi lisosomiali deputati alla degradazione di molecole complesse, sono devastanti malattie multiorgano e multisistemiche che, in buona parte dei casi, comprendono un coinvolgimento neurologico grave. Poco è noto tuttora sulla patofisiologia di queste sindromi e, ancor meno, sulle cause del loro deficit neurologico. Nel momento in cui alcune di queste patologie trovano finalmente beneficio dall’applicazione della terapia enzimatica sostitutiva, risalta maggiormente la problematica del trattamento della componente cognitiva e comportamentale. Essa infatti non trova beneficio da questi nuovi approcci terapeutici, poiché gli enzimi impiegati non sono in grado di attraversare la barriera emato-encefalica. Nasce da qui la necessità di comprendere la patogenesi neurologica di queste sindromi e, nel caso specifico di questo lavoro, della sindrome di Hunter. Tale comprensione, seppure molto complessa, potrebbe consentire, tra le altre cose, lo sviluppo di specifiche strategie terapeutiche mirate al cervello. In questo lavoro di ricerca preclinica, il modello murino per la MPS II è stato impiegato per effettuare una valutazione molecolare complessa attraverso l’impiego di tecnologie high throughput. RNA derivati da 2 aree cerebrali, la corteccia e il mesencefalo, sono stati analizzati mediante next generation sequencing, impiegando la procedura SOLiD® (Sequencing by Oligo Ligation and Detection). Questa tecnologia, seppure estremamente indicata proprio per il sequenziamento dell’RNA, è stata finora poco utilizzata a questo scopo, a causa dei costi ancora piuttosto elevati, ma soprattutto, a causa della complessità dell’analisi che richiede notevoli competenze bioinformatiche e capacità di gestione dei software. Il sequenziamento dell’RNA è una tecnologia estremamente potente in grado di evidenziare, a differenza della tecnica del microarray, tutti i trascritti cellulari in maniera indistinta. Il lavoro qui presentato è un’analisi di tipo comparativo tra le aree cerebrali dell’animale knock-out per l’IDS e le corrispondenti aree dell’animale sano di controllo. I dati, dopo la fase di allineamento e di filtrazione, sono stati classificati secondo i domini della Gene Ontology e analizzati in base alle principali categorie funzionali. L’analisi ha chiaramente evidenziato il coinvolgimento di molti geni e di parecchie vie specificamente implicati in processi neurologici. L’alterata struttura e funzione cellulare sono state evidenziate sia in modo generico, attraverso analisi di termini ugualmente alterati nelle due diverse aree cerebrali, sia in modo specifico, all’interno di ciascuna area cerebrale. Ciò consente di mettere in risalto i geni la cui alterata espressione è direttamente correlata allo stato di accumulo patologico della cellula e i geni con espressione differenziale che, invece, rappresentano pathways specifici per le funzioni svolte da quell’area cerebrale. Molto interessante potrebbe risultare anche l’alterazione di geni implicati in alcune comuni patologie neurodegenerative croniche quali il morbo di Alzheimer e di Parkinson. Vie comuni potrebbero essere ipotizzate per l’instaurarsi delle malattie o come conseguenza dello stato patologico. La parte finale dell’analisi ha preso in considerazione le vie di segnale e le correlazioni più interessanti, alcune delle quali già precedentemente considerate come potenziali candidati nella patogenesi delle malattie da accumulo lisosomiale: l'eparan solfato binding protein, l'omeostasi del calcio, lo stress ossidativo, il processo dell’autofagia, l'axon guidance, la neuroinfiammazione, la correlazione con altre malattie neurodegenerative e l'ormone della crescita. Una forte alterazione del comparto endocellulare dovuta al progressivo, patologico aumento dei depositi primari di glicosaminoglicani, ma anche di quelli secondari quali i gangliosidi, potrebbe giustificare il coinvolgimento delle proteine implicate nel metabolismo del calcio cellulare, rilevato da questo lavoro. Essendo poi il calcio un messaggero ubiquitario coinvolto in differenti processi biologici non stupisce il ruolo di filo conduttore in molti pathways, evidenziato da questa analisi. In conclusione, seppure fortemente complessa, l’analisi intrapresa in questo studio ha evidenziato le enormi potenzialità della procedura, dovute alla sua caratteristica capacità di mettere in luce, oltre a processi correlati in modo sospetto alla patologia, anche pathways non sospetti o la cui implicazione nella determinazione dello stato patologico non sia ancora stata definita.

Le vescicole extracellulari, che comprendono microvescicole rilasciate dalla membrane plasmatica ed esosomi che originano da corpi multivescicolari, sono vescicole di dimensioni nanometriche ricche di specifiche proteine, lipidi e acidi nucleici. Esse hanno un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare agendo da veicoli di molecole che possono avere una rilevanza sia diagnostica che terapeutica. L’obiettivo principale del progetto è lo sviluppo di un biosensore basato sulla Risonanza Plasmonica di Superficie imaging (SPRi) in grado di rilevare la presenza di vescicole di origine neurale presenti nel plasma umano e di caratterizzarle in base alla presenza e quantità relativa di specifiche molecole di membrana coinvolte nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Abbiamo dimostrato la possibilità di distinguere simultaneamente diverse popolazioni di vescicole extracellulari (neuronali e di origine gliale) circolanti nel plasma periferico e di valutare le differenze nella loro composizione in base alla loro origine cellulare analizzando la presenza e la quantità relativa di un’altra molecola di membrana (ganglioside GM1, che è noto essere coinvolto nella patogenesi dell’Alzheimer). Il biosensore così ottimizzato rappresenta una piattaforma promettente per la caratterizzazione delle vescicole coinvolte in malattie neurodegenerative e per il loro possibile utilizzo come biomarcatori periferici, permettendo un’accurata diagnosi, una corretta stratificazione dei pazienti e un affidabile monitoraggio della progressione della malattia. Inoltre, abbiamo dimostrato la potenzialità della tecnologia SPRi di individuare diversi microRNA per analisi cliniche. Considerando che le vescicole extracellulari contengono microRNA e rappresentano veicoli attraverso cui le cellule possono trasferire le une alle altre messaggi genetici, tale approccio potrebbe essere utilizzato per il miglioramento della rilevazione di biomarcatori periferici trasportati dalle vescicole. Questi risultati hanno dimostrato che la tecnologia SPRi può essere utilizzata per l’identificazione di specifiche componenti biochimiche (proteine, lipidi o microRNA) presenti nelle vescicole extracellulari di origine neurale isolate dal plasma periferico, come biomarcatori di facile accesso andando così ad evitare il prelievo invasivo di liquido cerebrospinale. In parallelo, abbiamo sviluppato un metodo basato sulla spettroscopia Raman per la caratterizzazione biochimica delle vescicole extracellulari che ha la potenzialità di essere utilizzato come metodo di controllo-qualità da svolgere di routine prima dell’utilizzo delle vescicole in vitro o in vivo come agenti terapeutici, dimostrando di essere anche più informativo rispetto ad altre tecniche complementari.
Extracellular vesicles (EVs), including microvesicles shed from the plasma membrane and exosomes originating from multivesicular bodies, are nano-scaled membrane vesicles enriched in specific proteins, lipids and nucleic acids, considered to be crucial intercellular communication vehicles for bioactive molecules with both diagnostic and therapeutic relevance. The main aim of the project is to design a biosensor using Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) in order to detect brain-derived EVs present in human plasma and to characterize them according to the presence and the relative amount of specific membrane molecules involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. We demonstrated the possibility to simultaneously distinguish neuronal and different glial populations of EVs circulating in the peripheral blood and to evaluate differences in their composition according to the cellular origin by analyzing the presence and relative amount of another membrane constituent (GM1, that it’s known to be involved in the pathogenesis of Alzheimer’s disease). The optimized SPRi biosensor represents a promising platform for the characterization of vesicles involved in neurodegenerative diseases and for their possible use as peripheral biomarkers, allowing an accurate diagnosis, a proper stratification of patients and a reliable monitoring of disease progression. Furthermore, we demonstrated the potentiality of using the SPRi technology for the detection of multiple miRNAs for clinical purposes. Considering that EVs contain miRNAs and represent a vehicle through which cells may transfer genetically encoded messages to other cells, this approach could be used for the implementation of the detection of EV-related circulating biomarkers. Our results demonstrated that SPRi technology could be used for the identification of specific biochemical components (proteins, lipids, or miRNAs) of brain-derived EVs obtained from blood as a source of surrogate brain disease-biomarkers of easy access avoiding the invasive collection of cerebrospinal fluid. In parallel, we have developed a method based on Raman spectroscopy for the biochemical characterization of EVs that could be used as a routine quality check method before their in vitro or in vivo use as therapeutic agents being also more informative compared to other complementary techniques.

Le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da disfunzione e perdita di specifiche popolazioni neuronali in risposta ad invecchiamento o eventi tossici o traumatici. Tuttavia, recentemente, è diventato chiaro che la disfunzione astrocitica ha un ruolo importante nei processi degenerativi. Infatti, gli astrociti rappresentano la popolazione cellulare maggiore del Sistema Nervoso Centrale (SNC) e costituiscono l’elemento principale per la sua omeostasi. Alterazioni biochimiche e strutturali degli astrociti durante la neuroinfiammazione rappresentano una risposta fisiologica a danni a carico del SNC per minimizzare e riparare il danno iniziale. Tuttavia, danni cerebrali prolungati forniscono segnali dannosi che possono compromettere le funzioni di astrociti e neuroni e causare neuroinfiammazione cronica. La neuroinfiammazione è un processo caratterizzato da attivazione gliale, che sottende ad un ciclo continuo di eventi infiammatori in cui si ha rilascio di citochine infiammatorie ed altri mediatori neurotossici che causano stress ossidativo e impediscono il ripristino funzionale del parenchima cerebrale. Un altro meccanismo implicato nelle malattie neurodegenerative è rappresentato dalla disfunzione mitocondriale. I mitocondri sono organelli dinamici. In particolare, i processi della dinamica mitocondriale (che coinvolgono cicli alternati di fissione/fusione e il loro trasporto assonale) e della biogenesi sono cruciali per l’omeostasi neuronale e la funzionalità sinaptica. Inoltre, un’alterazione dell’equilibrio tra processi di fissione e fusione può determinare il destino delle cellule neuronali. Queste informazioni supportano l’ipotesi che la disfunzione mitocondriale abbia un ruolo importante nel processo degenerativo, a causa dell’alta richiesta di energia da parte delle cellule neuronali per svolgere le loro funzioni, tra cui neurogenesi e differenziamento neuronale. Ad oggi, la correlazione tra neuroinfiammazione, disfunzione mitocondriale e neurodegenerazione è stata poco studiata. In questo lavoro, abbiamo descritto gli effetti di un certo numero di molecole antiossidanti naturali nel ripristinare la funzionalità astrocitica e la sopravvivenza neuronale in modelli in-vitro di astrogliosi reattiva. Tutte le molecole antiossidanti testate hanno rivelato la capacità di ridurre la proliferazione degli astrociti e ripristinare la sopravvivenza di astrociti e neuroni ed i livelli basali di specie reattive dell’ossigeno (ROS) mediante una differente modulazione di NF-kB in colture cellulari di astrociti e neuroni, suggerendo che NF-kB svolga un ruolo cruciale nel controllo della sopravvivenza neuronale e nelle risposte anti-infiammatorie. Inoltre, in un modello cellulare di differenziamento indotto da Nerve Growth Factor (NGF), abbiamo dimostrato che la differenziazione è accompagnata da un incremento del rimodellamento mitocondriale che richiede la modulazione di fissione/fusione e mitofagia, e l’induzione di proteine e fattori di trascrizione che regolano la biogenesi e il metabolismo mitocondriale, per aumentarne l’efficienza e soddisfare requisiti energetici più elevati. Questo studio ha rivelato un nuovo meccanismo di modulazione della funzionalità mitocondriale dipendente da NGF, importante nella neurogenesi e rigenerazione cerebrale. Nel complesso, i nostri dati identificano i mitocondri come elemento centrale a due meccanismi cruciali nel processo neurodegenerativo: neuroinfiammazione e neurogenesi. Inoltre, morfologia e attività mitocondriale possono essere modulate da un complesso crosstalk di eventi molecolari controllati da NGF o molecole antiossidanti. L’importanza della disfunzione mitocondriale e della sua correlazione a processi di neuroinfiammazione nella patologie neurodegenerative è attualmente oggetto di studio in un modello animale di Parkinson basato sulla neurotossicità di 6-OHDA, come anche il potenziale terapeutico di NGF e molecole antiossidanti.
Neurodegenerative disorders are characterized by dysfunction and loss of specific neuronal populations in response to age-related, or toxic and traumatic events. Recently, it has become clear that astrocytic dysfunction plays a relevant role in neurodegenerative processes. In fact, astrocytes represent the main type of glia in the central nervous system (CNS) and constitute the principal element of the brain homeostatic system. Biochemical and structural changes of astrocytes during neuroinflammation represent a physiological response to CNS injury to minimize and repair the initial damage. Nevertheless, prolonged brain insults provide detrimental signals that can compromise astrocytic and neuronal functions and lead to chronic neuroinflammation. In fact, neuroinflammation is characterized by sustained glial activation (reactive astrogliosis) and the generation of an inflammatory loop, through the release of cytokines and other neurotoxic mediators that cause oxidative stress and limit functional repair of brain parenchyma. Another hallmark of neurodegenerative disorders is represented by mitochondrial dysfunction. Mitochondria are very dynamic organelles. In particular, mitochondrial dynamic processes (involving alternation of fission/fusion cycles and their axonal transport) and biogenesis are crucial for neuronal homeostasis and synaptic function. Moreover, alteration of the balance between fission and fusion can determine the fate of neuronal cells. This knowledge supports the hypothesis that alteration of mitochondrial function and metabolism plays an important role in the neurodegenerative process because neuronal cells require high levels of energy to perform their functions, such as during neuronal differentiation. So far, the correlation between neuroinflammation, mitochondrial dysfunction and neurodegeneration has been poorly investigated. In this study, we describe the effects of a number of natural anti-oxidants in rescuing astrocytic function and neuronal viability following glial activation. All tested dietary antioxidants were able to reduce astrocyte proliferation and restore astrocytic and neuronal survival and basal levels of reactive oxygen species (ROS), via differential modulation of NF-kB binding activity in cell cultures of neurons and astrocytes, suggesting that NF-kB plays a crucial role in the modulation of neuronal survival and anti-inflammatory responses. In addition, in a cellular model of neuronal NGF-induced differentiation, we demonstrated that this mechanism is accompanied by increased mitochondrial remodeling involving modulation of fission and fusion proteins, mitophagy and induction of proteins and transcription factors that regulate mitochondria biogenesis and metabolism to increase their efficiency and meet higher energy requirements. These data revealed a new NGF-dependent modulation of mitochondrial function that appear be important in both neurogenesis and nerve regeneration following brain injury. Overall, our data identify mitochondria as the “core” element of two relevant mechanisms underlying neurodegenerative disorders: neuroinflammation and neurogenesis. Moreover, we show that modulation of their morphology and activity can be achieved by a complex interplay of molecular events that can be controlled by both NGF and dietary factors. The relevance of mitochondrial dysfunction and its connection to neuroinflammation in neurodegenerative diseases is under investigation in the animal model of Parkinson based on 6-hydroxydopamine (6-OHDA) neurotoxicity. This model will be also used to assess the therapeutic potential of NGF and antioxidant molecules.

Studio dei meccanismi neurotossici coinvolti nella neurodegenerazione indotta da mutazione Lrrk2 o da α-sinucleina in modelli ex-vivo o in vitro di malattia di Parkison La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa multifattoriale caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici della substantia nigra. Tra le anomalie genetiche identificate nella malattia di Parkinson (PD), le mutazioni del gene della ripetizione della leucina kinase2 (Lrrk2), come la mutazione missenso G2019S legata all'aumento dell'attività della chinasi, sono le più comuni. Mentre il complesso ruolo di Lrrk2 non è stato completamente chiarito, sono state riportate evidenze che l'attività della chinasi mutata influenza la trasmissione sinaptica. L'iperattivazione del dominio della chinasi di Lrrk2 potrebbe rappresentare un fattore predisponente sia per il rilascio glutammatergico striatale potenziato sia per la vulnerabilità mitocondriale ai fattori ambientali osservati nel PD. Per indagare su possibili alterazioni della suscettibilità striatale alla disfunzione mitocondriale, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche dal nucleo striato di un modello di PD Lrrk2 G2019S, e inoltre abbiamo indagato su possibili alterazioni precoci della neurotrasmissione prodotta dalla mutazione Lrrk2 di G2019S nel PD. Un altro fattore genetico è la presenza di inclusioni intracellulari denominate corpi di Lewy costituiti da aggregati α-Synuclein (α-Syn). Diversi studi hanno dimostrato che l'accumulo di α-Syn nei neuroni dopaminergici umani riduce l'attività del complesso I mitocondriale, aumenta la produzione di specie reattive dell'ossigeno e provoca cambiamenti dei livelli di Ca2+. Lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCX) è un importante regolatore delle concentrazioni di Ca2+ citoplasmatiche e mitocondriali. Abbiamo quindi studiato il possibile ruolo svolto da NCX nella tossicità mitocondriale in un modello in vitro del PD precoce. Abbiamo trovato che in G2019S-Lrrk2 (KI), mentre la trasmissione glutamatergica spontanea basale, facilitazione sinaptica e rapporti NMDA / AMPA erano invariati, la stimolazione del recettore DA D2 da parte del quinpirolo ha ridotto le correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee ed evocate (EPSC). E anche che la stimolazione del recettore D2 ha avuto un effetto neuroprotettivo sulla funzione mitocondriale. Mentre l'inibizione di mNCX esercita un effetto protettivo sul danno neuronale in un modello di PD precoce.
Studio dei meccanismi neurotossici coinvolti nella neurodegenerazione indotta da mutazione Lrrk2 o da α-sinucleina in modelli ex-vivo o in vitro di malattia di Parkison La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa multifattoriale caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici della substantia nigra. Tra le anomalie genetiche identificate nella malattia di Parkinson (PD), le mutazioni del gene della ripetizione della leucina kinase2 (Lrrk2), come la mutazione missenso G2019S legata all'aumento dell'attività della chinasi, sono le più comuni. Mentre il complesso ruolo di Lrrk2 non è stato completamente chiarito, sono state riportate evidenze che l'attività della chinasi mutata influenza la trasmissione sinaptica. L'iperattivazione del dominio della chinasi di Lrrk2 potrebbe rappresentare un fattore predisponente sia per il rilascio glutammatergico striatale potenziato sia per la vulnerabilità mitocondriale ai fattori ambientali osservati nel PD. Per indagare su possibili alterazioni della suscettibilità striatale alla disfunzione mitocondriale, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche dal nucleo striato di un modello di PD Lrrk2 G2019S, e inoltre abbiamo indagato su possibili alterazioni precoci della neurotrasmissione prodotta dalla mutazione Lrrk2 di G2019S nel PD. Un altro fattore genetico è la presenza di inclusioni intracellulari denominate corpi di Lewy costituiti da aggregati α-Synuclein (α-Syn). Diversi studi hanno dimostrato che l'accumulo di α-Syn nei neuroni dopaminergici umani riduce l'attività del complesso I mitocondriale, aumenta la produzione di specie reattive dell'ossigeno e provoca cambiamenti dei livelli di Ca2+. Lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCX) è un importante regolatore delle concentrazioni di Ca2+ citoplasmatiche e mitocondriali. Abbiamo quindi studiato il possibile ruolo svolto da NCX nella tossicità mitocondriale in un modello in vitro del PD precoce. Abbiamo trovato che in G2019S-Lrrk2 (KI), mentre la trasmissione glutamatergica spontanea basale, facilitazione sinaptica e rapporti NMDA / AMPA erano invariati, la stimolazione del recettore DA D2 da parte del quinpirolo ha ridotto le correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee ed evocate (EPSC). E anche che la stimolazione del recettore D2 ha avuto un effetto neuroprotettivo sulla funzione mitocondriale. Mentre l'inibizione di mNCX esercita un effetto protettivo sul danno neuronale in un modello di PD precoce.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia degenerativa di eziologia sconosciuta caratterizzata dalla compromissione dei motoneuroni superiori e inferiori. I fattori di rischio associati all'insorgenza e alla progressione della SLA rimangono sconosciuti. L'ipotesi più accreditata sull'eziopatogenesi della SLA prevede una concomitanza tra fattori genetici e ambientali che possono causare o contribuire allo sviluppo di forme familiari e sporadiche di SLA. Simile ad altre malattie neurodegenerative, la SLA è caratterizzata da un accumulo anomalo di proteine insolubili nel citoplasma dei motoneuroni in degenerazione. In particolare, nella SLA sporadica, si ritiene che l'aggregazione della proteina TDP-43 svolga un ruolo chiave nella degenerazione dei motoneuroni. In questo studio, abbiamo studiato un nuovo possibile biomarcatore per la SLA: double homeobox 4 (DUX4). Infatti, in uno studio di Homma del 2015, è stato dimostrato che la overespressione della proteina DUX4 nei mioblasti di pazienti con distrofia facioscapolomerale (FSHD) può contribuire all'aggregazione di TDP-43. Pertanto, nella prima parte del nostro studio, abbiamo valutato la possibile espressione di DUX4 e la sua correlazione con l'espressione di TDP-43 nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di pazienti con SLA. Successivamente, valutato l’espressione di DUX4 anche in campioni di post mortem, fibroblasti e sui motoneuroni derivati da iPSCs. In conclusione, è stata eseguita una trasfezione di DUX4 in linee cellulari di neuroblastoma umano e abbiamo valutato l'espressione di TDP-43. Nell'ultima parte, abbiamo valutato gli effetti dei farmaci approvati dalla FDA per il trattamento della SLA, Edaravone e Riluzolo, sull'espressione di DUX4. Inizialmente, abbiamo analizzato le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenute da 46 pazienti con SLA e 26 controlli possibili alterazioni nell'espressione di DUX4. Abbiamo riscontrato un aumento significativo dell'mRNA di DUX4 e dei livelli proteici nei PBMC dei pazienti rispetto ai controlli. Secondo i risultati precedenti del nostro gruppo (Arosio et al., 2020), abbiamo successivamente confermato un aumento dei livelli di proteina TDP-43 nelle PBMC della SLA, nonché un aumento delle forme troncate di TDP-35 e TDP-25 e abbiamo verificato una correlazione positiva tra i livelli di proteine DUX4 e TDP-43, TDP-35 e TDP-25 nei campioni di SLA. Inoltre, le nostre analisi di immunofluorescenza delle PBMC ALS hanno mostrato la co-localizzazione di DUX4-TDP-43 nella regione perinucleare con una tendenza ad aggregarsi. Anche gli esperimenti eseguiti sui fibroblasti SLA e sui motoneuroni derivati da iPSCs con l'espansione patologica di C9ORF72 hanno indicato un'analoga maggiore espressione di DUX4. Infine, sono stati condotti studi di immunoistochimica su campioni post mortem di corteccia e midollo spinale ottenuti da pazienti con SLA. I motoneuroni superiori nei campioni di corteccia motoria della SLA hanno mostrato un'immunoreattività a DUX chiaramente rilevabile, mentre quasi nessun segnale era presente nei campioni di controllo. DUX4 invece non è espresso nei campioni di midollo spinale, indipendentemente dallo stato patologico. Infine, abbiamo eseguito in linee cellulari di neuroblastoma umano una trasfezione DUX4 e, dimostrando che la upregolazione di DUX4 dopo la trasfezione ha indotto un aumento della frazione proteica insolubile TDP-43. Ad oggi, nessuna terapia può curare la SLA, sebbene ci siano due farmaci, Riluzolo ed Edaravone, approvati dalla Food and Drug Administration (FDA). Pertanto, nella parte finale di questo studio, abbiamo studiato i possibili effetti di questi due farmaci sull'espressione di DUX4 in linee cellulari di neuroblastoma umano con mutazione SOD1 wild type o G93A. I nostri risultati hanno mostrato che i farmaci hanno ridotto l'espressione di DUX4 in condizioni basali e in seguito allo stress ossidativo indotto dal trattamento con H2O2
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a degenerative neuromuscular disease of unknown etiology characterized by the impairment of both upper and lower motor neurons. The risk factors associated with ALS onset and progression remain unknown. The most accepted hypothesis on the etiopathogenesis of ALS foresees a concomitance between genetic and environmental factors that can cause or contribute to the development of familial and sporadic forms of ALS. Similar to other neurodegenerative diseases, ALS is characterized by an abnormal accumulation of insoluble proteins in the cytoplasm of degenerating motor neurons. In particular, in sporadic ALS, the aggregation of TDP-43 protein is thought to play a key role in the degeneration of motor neurons. In this study, we investigated a novel possible biomarker for ALS: double homeobox 4 (DUX4). In fact, in a study by Homma and colleagues in 2015, it was shown that the overexpression of the DUX4 protein in myoblasts from patients with facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) can contribute to the accumulation and aggregation of TDP-43. Therefore, in the first part of our study, we evaluated the possible expression of DUX4 and its correlation with TDP-43 expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with ALS. Subsequently, we performed in neuroblastoma cell lines a DUX4 transfection and we evaluated the expression of TDP-43 before and after treatment. In the last part of this study, we assessed the possible effects of the two drugs approved by the FDA for the treatment of ALS, Edaravone and Riluzole, on DUX4 expression. We analyzed peripheral blood mononuclear cells (PBMC) obtained from 46 patients with ALS and 26 controls for possible alterations in DUX4 expression. We found a significant (about threefold) increase in DUX4 mRNA and protein levels in PBMCs from patients compared to controls. According to previous results from our group (Arosio et al., 2020), we subsequently confirmed an increase in TDP-43 protein levels in ALS PBMCs, as well as an increase in the truncated forms of TDP-35 and TDP-25, and we showed a positive correlation between DUX4 and TDP-43, TDP-35, and TDP-25 protein levels in ALS samples. In addition, our immunofluorescence analyses of ALS PBMCs showed DUX4-TDP-43 colocalization in the perinuclear region with a tendency to aggregate. Also experiments performed on fibroblasts ALS and iPSCs-derived motor neurons carrying C9ORF72 pathological expansion indicated an analogous increased DUX4 expression. Finally, immunohistochemistry studies were performed on cortex and spinal cord postmortem samples obtained by ALS patients. Upper motor neurons in ALS motor cortex samples showed a clearly detectable DUX-like immunoreactivity, while almost no signal was present in control samples. On the other hand, DUX4 was not expressed in spinal cord samples, regardless of the pathological status. Finally, we performed in a human neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y) a DUX4 transfection and, showing that DUX4 upregulation after transfection induced an increase in the TDP-43 insoluble protein fraction. To date, no therapy can cure ALS, although there are two drugs, Riluzole and Edaravone, have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) for treatment. Thus, in the final part of this study, we investigated the possible effects of these two drugs on DUX4 mRNA and protein expression in neuroblastoma cell lines transfected with human SOD1 wild type or G93A mutation. Our results showed that Edaravone and Riluzole reduced DUX4 expression in basal conditions and following oxidative stress induced by H2O2 treatment.

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia idiopatica del motoneurone caratterizzata dalla progressiva degenerazione dei motoneuroni superiori ed inferiori, che porta a atrofia muscolare, paralisi degli arti e arresto respiratorio. Essendo una patologia multifattoriale, ad oggi non esistono terapie efficaci ma soltanto dei trattamenti sintomatologici. Pertanto, è necessario identificare nuovi composti che possano migliorare l’aspettativa e la qualità di vita del paziente. L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di valutare i potenziali effetti terapeutici dei Growth Hormone Secretagogues (GHS), una famiglia di composti dotati sia di effetti endocrini che extraendocrini, generalmente mediati dal legame con il recettore di ghrelin (GHS-R1a). Abbiamo quindi selezionato tre composti ben caratterizzati nel nostro laboratorio: (i) hexarelin, un agonista del recettore GHS-R1a, dotato di effetti protettivi sul muscolo cardiaco e scheletrico, e di effetti neuro-protettivi; (ii) JMV2894 il cui legame con il recettore GHS-R1a stimola il rilascio di Ca2+ intracellulare in vitro e dell’ormone della crescita in vivo; (iii) EP80317, un antagonista del GHS-R1a ma agonista del recettore CD36, in grado di modulare la produzione di citochine infiammatorie e dotato di effetti anticonvulsivanti e cardioprotettivi. Il primo obiettivo di questo studio è stato quello di determinare le capacità protettive di hexarelin, JMV2894 e EP80317 nelle cellule Neuro-2A trattate per 24 h con H2O2 o con l’associazione di H2O2 e GHS. In un secondo gruppo di esperimenti, gli stessi trattamenti sono stati utilizzati sulle linee cellulari di SH-SY5Y over-esprimenti la forma wild-type dell’enzima SOD1, o la forma mutata SOD1G93A. Nelle cellule Neuro-2A e SH-SY5Y, sia hexarelin che JMV2894 hanno antagonizzato gli effetti di H2O2 (i) aumentando la vitalità cellulare, (ii) riducendo il rilascio di NO2-, (iii) riportando le cellule alla normale morfologia. Hexarelin e JMV2894 hanno ridotto il meccanismo apoptotico e modulato l’attivazione delle mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK 1/2 e p38, e del phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt. La specificità degli effetti dei due GHS è stata dimostrata dall’assenza di effetti significativi del trattamento con EP80317 su tutti i parametri valutati e in tutte le linee cellulari in studio. È interessante sottolineare come nelle cellule SH-SY5Y SOD1G93A, gli effetti di hexarelin e JMV2894 siano ridotti rispetto alla linea SH-SY5Y WT. È ipotizzabile che la minore efficacia dei composti in questa linea cellulare sia dovuta all’elevato livello di stress ossidativo causato dal trattamento con H2O2 e dalla presenta dell’enzima SOD1 mutato, che possiede un aumentato potere ossidativo. Nella serie successiva di esperimenti, abbiamo studiato il ruolo della comunicazione intercellulare fra neuroni e cellule gliali nella modulazione della neurodegenerazione. A tal fine, abbiamo trattato le cellule microgliali N9 con hexarelin o JMV2894 per 48 h e isolato le vescicole extracellulari (VE) dal terreno di crescita. I risultati preliminari ottenuti suggeriscono che i GHS inducono un aumento di rilascio di VE e che queste ultime esercitano degli effetti protettivi. In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che hexarelin e JMV2894 possiedono effetti neuroprotettivi e anti-apoptotici. Ulteriori studi sono necessari per (i) identificare nuovi analoghi più promettenti e (ii) comprendere gli effetti anti-infiammatori e neuroprotettivi delle VE rilasciate dalle cellule microgliali stimolate con i GHS.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an idiopathic motor neuron disease characterized by progressive degeneration of upper and lower motor neurons, resulting in muscle atrophy, limb paralysis, and finally respiratory failure. The pathophysiology of ALS seems multifactorial but remain largely unknown, leading to limited availability of effective therapies. Therefore, there is a strong need to characterize new treatments that not only alleviate symptoms, but also improve survival and quality of life. In this research we focused on the potential therapeutic effects of three drugs belonging to the family of the growth hormone secretagogues (GHSs). The GHSs are endowed with several endocrine and extraendocrine effects that are at least in part mediated by binding to GHS-R1a, the receptor of ghrelin. In particular, we have selected three well-characterized compounds: (i) hexarelin, an agonist of GHS-R1a, which exerts cyto-protective effects at the mitochondrial level in cardiac and skeletal muscles, and could have neuroprotective effects; (ii) JMV2894, an agonist of GHS-R1a, which stimulates Ca2+ mobilization in vitro and growth hormone release in vivo, and modulates mitochondria functioning and ROS production; (iii) EP80317, an antagonist of GHS-R1a and agonist of CD36, which modulate the production of inflammatory cytokines, exerts anticonvulsant activities and has cardio-protective effects. The first objective of this study was to determine the cyto-protective capacity of hexarelin, JMV2894 and EP80317 in Neuro-2A cells subjected to oxidative stress. Neuro-2A cells were incubated for 24 h with H2O2 or with the combination of H2O2 and GHSs to monitor their effects through the quantification of (i) cell viability, (ii) NO2- release, (iii) changes in cellular morphology, (iv) apoptotic response and (v) MAPK and Akt pathways. In a second group of experiments, the same treatments were used on SH-SY5Y human neuroblastoma cells overexpressing the wild type (WT) SOD1 enzyme, or the SOD1G93A mutated protein. In Neuro-2A and SH-SY5Y cells, both hexarelin and JMV2894 were effective in antagonizing the effects of H2O2 by (i) increasing cell viability, (ii) reducing NO2- release, (iii) restoring cell morphology. Hexarelin and JMV2894 reduced apoptotic pathways and modulated the expression of mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK 1/2 and p38, and phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt. The specificity of GHS effects is demonstrated by the absence of significant effects of EP80317 treatments on all the previous parameters in the previous three cellular models. In SH-SY5Y WT cells, hexarelin was more effective than JMV2894 in antagonizing the effects of H2O2. Interestingly, In SH-SY5Y SOD1G93A cells, the effects of hexarelin and JMV2894 were blunted compared to those measured in SH-SY5Y WT cells. It is possible that in these cells the levels of oxidative stress induced by the combination of H2O2 treatment and SOD1G93A mutation was too high to be counteracted by hexarelin and JMV2894 treatments. In the next series of experiments, we have studied the role of cellular communication between neurons and glial cells in modulating the onset and progression of neurodegeneration. To this aim, we have treated N9 microglial cells with hexarelin or JMV2894 for 48 h and then isolated extracellular vescicles (EVs) from the conditioned culture media. The preliminary results obtained suggest that EVs released from cells stimulated with specific GHSs may have potential beneficial effects for neuronal survival and could be a promising strategy for the modulation of oxidative stress. In conclusion, our results demonstrate neuroprotective and anti-apoptotic effects of hexarelin and JMV2894, suggesting that new GHS analogues could be developed for their neuroprotective effects. Further studies are needed to better investigate the anti-inflammatory and neuroprotective effects of EVs-derived from conditioned media of N9 cells stimulated with selected GHSs.

Negli ultimi anni il concetto di unità neurovascolare (NVU) è stato progressivamente definito. La NVU comprende diversi tipi di cellule cerebrali: le cellule endoteliali (CE), gli astrociti, i periciti, i neuroni e la microglia (MG). Ciascuno di essi contribuisce al mantenimento della barriera ematoencefalica (BEE) e all'omeostasi del cervello. Disfunzioni a livello della NVU sono stati associati a diversi disturbi del sistema nervoso centrale (SNC) e a malattie neurodegenerative. Di conseguenza, è aumentata la richiesta di strumenti terapeutici in grado di modulare la NVU. In primo luogo, abbiamo studiato il meccanismo d'azione di liposomi (mApoE-PA-LIP) funzionalizzati con un peptide dell'apolipoproteina-E (mApoE) che conferisce affinità alla BEE e con l’acido fosfatidico (PA) per il legame con la β-amiloide (Aβ), precedentemente utilizzati per promuovere la rimozione di Aβ attraverso la BEE in un modello murino della malattia di Alzheimer (AD) (Balducci et al., 2014). Abbiamo pertanto valutato l’impatto dei mApoE-PA-LIP sulle dinamiche di calcio intracellulare ([Ca2+]i) nelle CE microvascolari cerebrali umane in coltura (hCMEC/D3), come modello in vitro di BEE e negli astrociti in coltura. Il pre-trattamento con mApoE-PA-LIP ha aumentato la [Ca2+]i indotta dall'ATP in entrambi i tipi cellulari, anche in condizioni 0 [Ca2+]e, indicando così che questo aumento è principalmente dovuto al rilascio endogeno di Ca2+ e al coinvolgimento dei recettori metabotropici purinergici (P2Y). Considerando che essi rappresentano un importante bersaglio farmacologico per il trattamento delle disfunzioni cognitive e considerando il loro effetto protettivo nei processi neuroinfiammatori, il potenziamento della trasmissione purinergica potrebbe contrastare la vasocostrizione indotta da Aβ e la riduzione del flusso sanguigno cerebrale (Forcaia et al., 2021). Inoltre, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche su fettine di cervello di topo per valutare se i mApoE-PA-LIP potessero modulare anche la trasmissione sinaptica. In effetti, il trattamento con i mApoE-PA-LIP ha aumentato la frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee (sEPSC), fornendo ulteriore supporto nel promuovere i mApoE-PA-LIP come possibile strumento terapeutico per il trattamento dell'AD. Negli ultimi anni, studi animali e sull’uomo hanno evidenziato che il SNC è un importante bersaglio degli effetti nocivi degli inquinanti atmosferici (Costa et al., 2020), dimostrando anche che l'esposizione ad essi può indurre anche alterazioni della plasticità sinaptica (Hajipour et al., 2020). Pertanto, considerando che l'inalazione di particolato (PM) può contribuire all'insorgenza e alla progressione della neurodegenerazione, ci siamo dedicati alla comprensione dei meccanismi sottesi. Abbiamo così studiato l'effetto diretto del PM sulle hCMEC/D3, che rappresentano la prima interfaccia tra sangue e cervello e la MG, il principale effettore della neuroinfiammazione, utilizzando un materiale di riferimento standard di particelle di scarico diesel (DEP), uno dei principali componenti del PM. Per studiare l'impatto sulla trasmissione purinergica, abbiamo confrontato la MG primaria con quella esposta a DEP (10 µg/cm2 per 24 ore). I nostri dati hanno indicato che la MG trattata mostra una significativa soppressione dei segnali di Ca2+ indotti dall'ATP, probabilmente a causa di un aumento del [Ca2+]i allo stato basale associato alla sua attivazione (Hoffmann et al., 2003), che nei nostri esperimenti potrebbe essere confermato anche dall'analisi morfologica (MG con fenotipo ameboide). Gli stessi risultati sono stati ottenuti nelle hCMEC/D3, indicando che l'esposizione diretta al DEP potrebbe provocare anche l'attivazione delle CE. Questi risultati indicano che il DEP provoca alterazioni fisiologiche della NVU che, sommandosi, potrebbero portare all'abbassamento della soglia individuale all'insorgenza di neurodegenerazione.
In recent years, the concept of neurovascular unit (NVU) has progressively been entered. The NVU comprises multiple types of brain cells, including endothelial cells (ECs), astrocytes, pericytes, neurons and microglia (MG). Each cell type contributes to the maintenance of the transport through the blood–brain barrier (BBB) and brain tissue homeostasis. NVU dysfunctions have been associated with several disorders of the central nervous system (CNS) and neurodegenerative diseases. As a result, demand for therapeutic tools able to modulate the NVU has been increased. We firstly investigated the inner mechanism of action of liposomes (mApoE-PA-LIP) functionalized with a peptide derived from the apolipoprotein-E receptor-binding domain (mApoE) for BBB targeting and with phosphatidic acid (PA) for amyloid-β (Aβ) binding, previously used to promote peptide removal across the BBB and its peripheral clearance in a mouse model of Alzheimer's disease (AD) (Balducci et al., 2014). In light of previous results, we assessed whether mApoE-PA-LIP impacted on intracellular calcium ([Ca2+]i) dynamics in cultured human cerebral microvascular ECs (hCMEC/D3), as an in vitro human BBB model, and in cultured astrocytes. mApoE-PA-LIP pre-treatment increased the ATP-evoked Ca2+ waves in both cell types, also under 0 [Ca2+]e conditions, thus indicating that this increase is mainly due to endogenous Ca2+ release and that metabotropic purinergic receptors (P2Y) are mainly involved. Considering that P2Y receptors represent important pharmacological targets to treat cognitive dysfunctions and their neuroprotective effects in neuroinflammatory processes, the enhancement of purinergic signalling provided by mApoE-PA-LIP could counteract Aβ-induced vasoconstriction and reduction in cerebral blood flow (Forcaia et al., 2021). Moreover, we performed electrophysiological recordings on mouse brain slices to assess whether mApoE-PA-LIP can also modulate the neuronal synaptic transmission. Indeed, mApoE-PA-LIP treatment increased spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) frequency, giving additional support to promote mApoE-PA-LIP as putative therapeutic tool for AD treatment. In recent years, human epidemiological and animal studies put in evidence how the CNS is emerging as an important target for adverse health effects of airborne pollutants (AP) (Costa et al., 2020), demonstrating also that AP-exposure may also induce synaptic plasticity impairment (Hajipour et al., 2020). Thus, taking into account that the inhalation of airborne particulate matter (PM) may contribute to the neurodegeneration onset and progression, we moved furthermore towards understanding the inner underlying mechanisms. In lights of this evidence, we investigated the direct effect of AP on hCMEC/D3, that are the first interface between blood and brain, and MG, the main effector of neuroinflammation, using a standard reference material of diesel exhaust particles (DEP), that is one of the main PM contributors. To study the PM impact on purinergic signalling, we compared untreated primary MG with those incubated with DEP (10 μg/cm2 for 24 hours). Our data showed that DEP-activated MG generated much smaller Ca2+ signals ATP-induced, revealing a significant suppression of the receptor-evoked Ca2+ signals, probably due to an increase in the resting [Ca2+]i associated with MG activation (Hoffmann et al., 2003) that in our experiments could be confirmed also from the morphological analysis that revealed ameboid MG phenotype. The same results have been obtained in hCMEC/D3, indicating that the direct exposure to DEP causes also ECs activation. The here outlined results relating to the DEP-induced effects on ECs and on MG stated that DEP causes NVU physiology alterations which, adding together, could lead to the lowering of individual threshold to the onset of neurodegeneration.

Il lavoro che ho svolto durante il mio corso di dottorato è stato finalizzato a identificare e caratterizzare i geni-malattia associati a rari disturbi neurologici. In particolare ho lavorato sulla caratterizzazione fenotipica e molecolare di due pazienti affetti da una distrofia neuroassonale atipica, in cui una mutazione omozigote all'interno del gene TFG è stata identificata mediante la tecnologia WES (whole exome sequencing). Inoltre, ho anche studiato tre famiglie non correlate con individui affetti da sindrome di Leigh portatori stesse mutazioni bialleliche nel gene NDUFAF6. L'identificazione di una nuova variante intronica è stata integrata con la sua validazione funzionale attraverso l'analisi dell'mRNA. Ho anche descritto due casi con fenotipi clinici neurodegenerativi complessi. La caratterizzazione fenotipica è stata integrata con l’identificazione di due nuove mutazioni in geni-malattia già riportati, rispettivamente DNMT1 e OTX2. Nel paziente con mutazione OTX2, la presentazione molecolare e clinica non è interamente spiegata da una singola mutazione genica e sono stati identificati ulteriori possibili modificatori genetici. Questo caso rappresenta un esempio di come la raccolta dettagliata dei dati clinici e della anamnesi familiare in parallelo all'analisi dei dati NGS sia spesso utile per identificare genotipi compositi a volte associati a sindromi ereditarie complesse. Inoltre, in qualità di partner della rete internazionale europea per le malattie mitocondriali, sono stata anche coinvolto nel progetto GENOMIT; in questo contesto, ho dedicato gli ultimi mesi del mio dottorato di ricerca a studiare la praticabilità di una promettente terapia genetica xenotopica per la sindrome di Leigh e altre condizioni neurologiche associate al deficit del complesso I mitocondriale, utilizzando fibroblasti di pazienti geneticamente modificati come modello sperimentale di malattia.
The work I carried out during my PhD studies has been aimed to identify and characterize disease genes associated with rare neurological disorders. In particular I worked on phenotypic and molecular characterization of two patients with an atypical neuroaxonal dystrophy presentation, in which a homozygous mutation within the TFG gene has been identified by mean of WES (whole exome sequencing) technology. Besides, I also studied three unrelated families with individuals affected by Leigh syndrome and carrying the same biallelic mutations in the NDUFAF6 gene. The identification of a novel intronic variant has been integrated with its functional validation through mRNA analysis. I also described two cases with complex clinical neurodegenerative phenotypes. Phenotypic characterization has been integrated the identification of two novel mutations in already reported disease genes, respectively DNMT1 and OTX2. In the patient with OTX2 mutation, molecular and clinical presentation remains not entirely explained by a single gene mutation and additional possible genetic modifiers were found. This case represents an example of how detailed collection of clinical data and family history in parallel to NGS data analysis is often helpful in order to identify composite genotypes sometimes associated with complicated inherited syndromes. Additionally, as a partner of the European international network for mitochondrial disorders, I was also involved in the GENOMIT project; within this framework, I dedicated the last few months of my PhD to investigate the feasibility of a promising xenotopic genetic therapy for Leigh syndrome and other neurological conditions associated with mitochondrial complex I deficiency, using engineered patient fibroblasts as a cellular model of disease.

Nanoparticles (NPs) are studied as a promising tool to efficiently deliver drugs across biological barriers, which can hinder effective pharmacological treatment for a variety of diseases. One of the key issues to evaluate is the corona, a layer of proteins attached to the surface, formed upon contact of NPs with biological fluids. It is well known that the corona affects bioavailability, toxicity and clearance of NPs. Though the corona is relatively well defined under various conditions, its evolution when it crosses biological barriers was unknown. In my research I utilized gold NPs and a transwell cellular model of the BBB (human brain endothelial cells - hCMEC/D3) to investigate this issue. The protein composition of the corona across the “brain” and “blood” compartments was qualitatively and semi-quantitatively analyzed using SDS-PAGE and MS. The protein corona changed dramatically following passage through the BBB, since many proteins were removed, and 15 out of 381 were enriched in the “brain” side compared to the “blood” side, including alpha-2-macroglobulin and fetuin A. This clearly indicates the dynamic nature of the corona, and the ability or inability of specific proteins bound to NPs to traverse the BBB. The research also established that NP corona in the basolateral side is actually an evolution of the one formed on the apical side ruling out that it is formed in situ by interaction with proteins arriving independently from the apical side. Once beyond the barrier, the corona was stable upon incubation with other proteins Proteins that were enriched upon passage were used to functionalize NPs, demonstrating their ability to boost passage through the BBB and suggesting that physiological proteins could help to more effectively deliver drugs to the central nervous system. Altogether, these results are particularly relevant when developing NPs that are required to traverse any biological barrier and may lead to the more successful design of therapeutic and/or diagnostic nanodevices.
Nanoparticles (NPs) are studied as a promising tool to efficiently deliver drugs across biological barriers, which can hinder effective pharmacological treatment for a variety of diseases. One of the key issues to evaluate is the corona, a layer of proteins attached to the surface, formed upon contact of NPs with biological fluids. It is well known that the corona affects bioavailability, toxicity and clearance of NPs. Though the corona is relatively well defined under various conditions, its evolution when it crosses biological barriers was unknown. In my research I utilized gold NPs and a transwell cellular model of the BBB (human brain endothelial cells - hCMEC/D3) to investigate this issue. The protein composition of the corona across the “brain” and “blood” compartments was qualitatively and semi-quantitatively analyzed using SDS-PAGE and MS. The protein corona changed dramatically following passage through the BBB, since many proteins were removed, and 15 out of 381 were enriched in the “brain” side compared to the “blood” side, including alpha-2-macroglobulin and fetuin A. This clearly indicates the dynamic nature of the corona, and the ability or inability of specific proteins bound to NPs to traverse the BBB. The research also established that NP corona in the basolateral side is actually an evolution of the one formed on the apical side ruling out that it is formed in situ by interaction with proteins arriving independently from the apical side. Once beyond the barrier, the corona was stable upon incubation with other proteins Proteins that were enriched upon passage were used to functionalize NPs, demonstrating their ability to boost passage through the BBB and suggesting that physiological proteins could help to more effectively deliver drugs to the central nervous system. Altogether, these results are particularly relevant when developing NPs that are required to traverse any biological barrier and may lead to the more successful design of therapeutic and/or diagnostic nanodevices.

Neurodegenerative disorders, such as Parkinson’s diseases (PD), are characterized by loss of specific neuronal populations and have been associated with mitochondrial dysfunction and oxidative stress. In addition, endoplasmic reticulum (ER) stress, a severe alteration in the structure and function of the ER with the accumulation of misfolded proteins and alterations in calcium homeostasis, has been suggested to be involved in some neuronal diseases. Finally, disturbed functions of the ubiquitin proteasome system (UPS), responsible for the degradation of cytosolic, ER, and synaptic proteins, is known to contribute to ER stress. The mechanisms through which these alterations impact on cell function are complex. Among them, however, the effect on the spatio-temporal patterns of a key second messenger, such as Ca2+, most likely plays a key role. My PhD program aimed at clarifying this important issue, focusing on simple pathogenetic models. Indeed, although most forms of PD are sporadic and multifactorial, an increasing number of mutations in specific genes were found in rare, genetic forms of the disease. Understanding the molecular pathogenesis of these forms may give important clues to the understanding of the more common sporadic cases, as well as provide some novel insight into the basic cell biology mechanisms. Specifically, mutations in a set of genes (alpha-synuclein, parkin and most recently in DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1, LRRK2/dardarin and Omi/HTRA2) have been associated with familial cases of PD. In all cases, the normal function of the gene products is not fully understood. Our aim was to study the role of these gene products in subcellular Ca2+ homeostasis, with major focus on mitochondria. Mitochondria play a central role in cell biology not only as producers of ATP, but also in the sequestration of Ca2+. Since they are the major site of free radical production in cells, they are also a primary target for oxidative damage and subsequent dysfunction. Mitochondria are also repositories of several proteins which regulates apoptosis. Perturbations in the normal functions of mitochondria will inevitably disturb cell function, may sensitise cells to neurotoxic insults and may initiate cell death. Alterations in mitochondrial Ca2+ signalling could synergize with mitochondrial dysfunction in causing deleterious functional alterations and committing the cell to death. In addition to the analysis of Ca2+ homeostasis, we have analysed other aspects of mitochondrial physiology including the energetic metabolism and the relationship between mitochondria and ER. Common interesting aspects are emerging from the data presented in this thesis, which have considered both the overexpression and the silencing of alpha-synuclein, parkin, DJ-1 and PINK1 proteins: all of them are able to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis. In particular alpha-synuclein, parkin, DJ-1 operate through the same mechanism by enhancing the ER-mitochondria contact sites of about 10%, thus enhancing the Ca2+ transfer between the two organelles. When this action is missing, as we have documented in the case of alpha-synuclein, the autophagic process can be activated. As for PINK1 we have identified an interesting biphasic effect. We have now to clarify whether this action could be related to distinct PINK1 distribution on mitochondrial membranes in respect to its expression levels and whether it may act by regulating the activity of the mitochondrial Ca2+ toolkit proteins. Experiments performed in permeabilized cells exposed to fixed 1 microM Ca2+ concentration account for this possibility.
Le malattie neurodegenerative, tra le quali il morbo di Parkinson (PD) sono associate a disfunzioni mitocondriali e a stress ossidativo. Inoltre, è stato suggerito che profonde alterazioni della struttura e delle funzioni del reticolo endoplasmatico (RE), una condizione nota come “ER stress”, e disfunzioni del sistema proteosoma-ubiquitina (UPS) siano alcuni dei processi cellulari coinvolti nell’insorgenza di queste malattie. I meccanismi attraverso i quali queste disfunzioni alterano la funzione cellulare sono complessi e solo parzialmente chiariti. Tra questi, gli effetti sulla distribuzione spazio-temporale di un secondo messaggero fondamentale per la corretta comunicazione cellulare, quale lo ione Ca2+, è sicuramente importante. Il programma del mio Dottorato di Ricerca prevedeva di chiarire alcuni di questi aspetti utilizzando modelli cellulari semplici. Infatti, anche se la maggior parte delle forme di PD sono sporadiche e multifattoriali, un numero crescente di mutazioni in geni specifici sono state individuate in alcune forme di malattia familiare. Lo studio delle funzioni delle proteine codificate da questi geni rappresenta quindi uno strumento molto importante per la comprensione degli aspetti molecolari alla base del processo neurodegenerativo. L’aspetto interessante è rappresentato dal fatto che le alterazioni cellulari alla base dei difetti genetici sono le stesse identificate nei casi sporadici. La delucidazione dei meccanismi patogenici delle forme genetiche, oltre a contribuire alla comprensione delle forme più diffuse, potrebbe quindi fornire anche nuove informazioni sui meccanismi cellulari alla base della insorgenza dei processi neurodegenerativi. In particolare, mutazioni in geni diversi (che codificano le proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1 (UCHL-1), LRRK2/dardarina e Omi/HTRA2) sono state individuate in pazienti affetti da forme familiari di PD. In tutti i casi l’esatta funzione dei prodotti genici non è ancora completamente chiarita. Il programma di ricerca prevedeva di studiare il loro ruolo nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+, con particolare attenzione alla funzione mitocondriale. Uno degli elementi comuni di molte malattie neurodegenerative è infatti rappresentato da disfunzioni del metabolismo mitocondriale del Ca2+. I mitocondri hanno un ruolo centrale nella biologia cellulare, non solo in quanto sono la sede principale di produzione di ATP, ma anche perché svolgono un ruolo importante nel sequestro del Ca2+ intracellulare e nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e di radicali liberi. Essi sono il primo bersaglio del danno ossidativo e delle disfunzioni che ne derivano, inoltre contengono numerose proteine che regolano il fenomeno della morte cellulare per apoptosi. Perturbazioni della funzionalità mitocondriale portano quindi inevitabilmente a disturbi del funzionamento cellulare e possono dare origine al processo di morte cellulare rendendo le cellule più suscettibili agli insulti neurotossici. Oltre all’omeostasi mitocondriale del Ca2+ sono stati analizzati anche altri aspetti legati alla fisiologia mitocondriale, in particolare il metabolismo energetico e i rapporti tra mitocondri e RE. Dagli esperimenti presentati in questa tesi, che hanno analizzato sia gli effetti della sovraespressione che del silenziamento delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, emergono alcuni aspetti comuni molto interessanti: tutte queste proteine sono in grado di modulare l’omeostasi del Ca2+ mitocondriale. Per quanto riguarda alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 abbiamo osservato che esse condividono anche il meccanismo con il quale operano questa modulazione: in tutti e tre i casi la loro sovraespressione provoca un aumento di circa il 10% dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri e quindi potenzia il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Se questa funzione viene a mancare, come abbiamo dimostrato nel caso di alfa-sinucleina, viene attivata la risposta autofagica. Per quanto riguarda PINK1 abbiamo evidenziato la possibilità che possa regolare l’omeostasi mitocondriale del Ca2+ attraverso un’azione bifasica, resta da chiarire se ciò dipenda dalla sua distribuzione nelle membrane mitocondriali e dalla sua attività sulle proteine che regolano il trasporto del Ca2+ mitocondriale. Gli esperimenti condotti in cellule permeabilizzate, ed esposte ad una concentrazione di Ca2+ pari a 1 microM, sembrano suggerire questa possibilità.

2012/2013
My PhD project concerns neurodegenerative processes in the mouse spinal cord, with a particular attention to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). During my PhD I have used as a model the organotypic spinal slice cultures and I have focused my studies on: early changes in spinal tissue excitability in an ALS genetic model; spinal network activity changes induced by oxidative stress in wild type (WT) and synaptic activity in premotor circuits when challenged by neuroinflammation in WT. The principal aim of my work was to understand the dialogue between a general stress condition and the spinal premotor network. To this aim, I combined electrophysiological techniques and immunofluorescence analysis to characterized the ventral interneurones located in spinal microcircuits. For that purpose I exploited the organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord that are generally accepted as a good model to study the neuronal premotor activity and provide high experimental access to interneurones (Avossa et al., 2003). In the first part of my research I compared WT cultures with SOD1G93A transgenic cultures, one of the more investigated ALS model. In cultured spinal networks, as described in acute preparation collected at different stages of development, there is a progressive fastening of glycinergic currents, represented by the reduction of the decay time constant (tau value) of synaptic currents along with the slices growth. WT and SOD1G93A cultures display a different maturation profile since in transgenic slices this developmental process is significantly steeper not only in glycinergic post synaptic currents (PSCs) but also in miniature PSCs (mPSCs). This difference in the glycinergic PSCs kinetic properties can be strongly reduced by the presence of TBOA that lowers the GABA synthesis. These results support the hypothesis that in SOD1G93A cultures there is an increase amount of glycine and GABA co-release leading to the conclusion that the synaptic release is conditioned by the presence of the mutation at an early stage of development, before any evident neuronal degeneration. Moreover, I supported this data also with preliminary results regarding the co-staining of GlyT2 and GAD65 (markers for presynaptic glycine and GABA, respectively). In fact, SOD1G93A spinal organotypic slices seem to display an higher amount of mixed synapses. Next, I tested other stress processes of the tissue that could potentially affect synaptic activity and, ultimately, alter network activity. I tested chronic incubations of the spinal slices, since they are long-term preparations, with stress key players: hydrogen peroxide (H2O2) to create an oxidative stress and lipopolysaccharide (LPS) or a mixture of cytokines (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) to mimic neuroinflammation. For these sets of experiments I have used another strain of mice with no genetic manipulation. All these chronic treatments increase the AMPA receptor mediated PSCs frequency; moreover, a neuroinflammation state is able to enhance the overall network activity; LPS treatment increases also the amplitude of AMPA-mediated synaptic currents in both spontaneous and miniature events, while CKs accelerate the disinhibited burst rhythm induced by the pharmacological removal of the synaptic inhibition that switch on the rhythmogenic centre contained in the spinal network. Summarizing, I detected that the treatments with these environmental cues affected the synaptic component, in this case the excitatory one, of the premotor network. Altogether, my work highlighted that a genetic predisposition (in the case of familial ALS) and environmental factors of different kind (oxidative and inflammatory factors or an alterate SOD1) trigger changes in synaptic transmission and we may speculate that these alterations in the premotor circuit could cooperate in synergy leading to the development of misconnected networks that contribute to induce motoneuronal neurodegeneration. Riassunto Il mio progetto di dottorato riguarda processi neurodegenerativi del midollo spinale, con una particolare attenzione verso la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Durante il mio dottorato ho usato come modello le fettine organotipiche di midollo spinale e ho concentrato i miei studi su: cambiamenti precoci nell’eccitabilità del tessuto spinale in un modello genetico di SLA; cambiamenti nell’attività del network spinale indotti da stress ossidativo in wild type (WT) e cambiamenti nell’attività sinaptica dei circuiti premotori sottoposti ad uno stress infiammatorio in WT. Il fine principale del mio lavoro era quello di capire il dialogo tra una condizione di stress generale ad il network spinale premotorio. A questo scopo, ho unito tecniche elettrofisiologiche e analisi di immunofluorescenza per caratterizzare gli interneuroni ventrali localizzati nel microcircuito spinale. Per raggiungere questo obiettivo ho sfruttato le colture organotipiche derivate dal midollo spinale di embrioni di topo che sono generalmente accettate come un buon modello per studiare l’attività premotoria neuronale e garantiscono un facile accesso sperimentale agli interneuroni (Avossa et al., 2003). Nella prima parte della mia ricerca ho confrontato colture WT con colture transgeniche SOD1G93A, uno dei modelli di SLA maggiormente studiati. Nei network spinali in coltura, come già descritto in preparazioni acute ottenute a diversi stadi di sviluppo, c’è una progressiva velocizzazione delle correnti glicinergiche, rappresentata dalla riduzione del decay time constant (valore di tau) delle correnti sinaptiche durante la crescita delle fettine. Le colture WT e SOD1G93A presentano un diverso profilo di maturazione dato che nelle colture transgeniche questo processo di sviluppo è significativamente più marcato non solo nelle correnti postsinaptiche (PSCs) ma anche negli eventi in miniatura (mPSCs). Questa differenza nelle proprietà cinetiche delle correnti glicinergiche può essere fortemente ridotta dalla presenza di TBOA che diminuisce la sintesi del GABA. Questi risultati supportano l’ipotesi che nelle colture SOD1G93A ci sia un aumento del co-rilascio GABA/glicina portando alla conclusione che il rilascio sinaptico sia condizionato dalla presenza della mutazione ad uno stadio precoce dello sviluppo, prima di qualsiasi degenerazione neuronale evidente. Inoltre, ho supportato questo dato anche con risultati preliminari riguardanti la marcatura di GlyT2 e GAD65 (due marker per la glicina ed il GABA presinaptici rispettivamente). Infatti, le fettine spinali organotipiche SOD1G93A sembrano caratterizzate da un aumento delle sinapsi miste. Successivamente, ho testato altri processi di stress del tessuto che potrebbero interferire con l’attività sinaptica e, conseguentemente, alterare l’attività del network. Dato che le fettine spinali sono preparazioni a lungo termine, ho testato incubazioni croniche con molecole chiave nei processi di stress: perossido di idrogeno (H2O2) per creare uno stress ossidativo e lipopolisaccaride (LPS) o una miscela di citochine (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) per mimare uno stato infiammatorio. Per questo set di esperimenti ho usato un altro ceppo di topi privo di manipolazione genetica. Tutti questi trattamenti cronici aumentano la frequenza delle correnti mediate dai recettori AMPA; inoltre, uno stato infiammatorio è in grado di incrementare l’attività globale del network; il trattamento con LPS aumenta anche l’ampiezza delle correnti sinaptiche AMPA-mediate, sia spontanee che in miniatura, mentre le CKs accelerano il ritmo dei burst indotto dall’eliminazione farmacologica dell’inibizione sinaptica che accende il centro ritmogenico presente nel network spinale. Riassumendo, ho dimostrato che i trattamenti con questi fattori ambientali alterano la componente sinaptica, in questo caso eccitatoria, del network premotorio. Nel complesso il mio lavoro ha evidenziato che una predisposizione genetica (nel caso della SLA familiare) e fattori ambientali di varia natura (ossidativi, infiammatori o di alterata SOD1) inducono cambiamenti nella trasmissione sinaptica e possiamo speculare sul fatto che queste alterazioni nel circuito premotorio possono cooperare in sinergia causando lo sviluppo di network inefficienti che concorrono a determinare la neurodegenerazione motoneuronale.
XXVI Ciclo
1985

Hearing loss represents the fourth cause of disability in the world according to the Global Burden of Disease Study, and the number of affected patients is expected to increase in the next years. The absence of effective therapies for the treatment of sensorineural hearing loss leads to irreversible deafness and calls for an urgent need of new therapeutic approaches. To make improvements in the field, in this dissertation, we investigated the effects of recombinant human nerve growth factor (rhNGF) and recombinant human brain derived neurotrophic factor (rhBDNF) on sensory and non-sensory cells of the organ of Corti. To this purpose, the experiments have been conducted by three partners in the framework of the “PON ricerca e innovazione”: the University of L’Aquila (L’Aquila, Italy), Dompé Farmaceutici S.p.A (Naples, Italy), and University Medical Center (UMC) Utrecht (Utrecht, The Netherlands). The first objective of the project was the investigation of the miRNAs profiles induced by rhNGF and rhBDNF in vitro on murine cochlear cells derived from the organ of Corti. The subsequent in silico analysis allowed us to identify a wide spectrum of target genes and signalings by the modulated miRNAs. Importantly, many of the target pathways by both neurotrophins involved cell survival, proliferation, neuronal differentiation and metabolic pathways. As a second step, we investigated the effects of rhNGF and rhBDNF on the survival of sensory and non-sensory cells of the organ of Corti of ototoxically deafened guinea pigs, and found limited effects in terms of cell number by both the treatments. At this level, we did not take into account any other aspects, such as the molecular events underlying the activity of those cells, that could affect their function. We therefore moved to molecular investigations in the organ of Corti of deafened guinea pigs. We selected the mTOR signaling from the in vitro and in silico analysis. Since the mTOR signaling was predominantly modulated by rhBDNF, we limited our investigations to this neurotrophin. We found that the BDNF-treated organs of Corti from deafened guinea pigs presented increased levels of pmTOR compared to normal hearing ears, and increased levels of mTOR compared to both untreated and normal hearing cochleas. On this basis, it is possible that rhBDNF may exert a protective effect on the organ of Corti that is mainly associated with the molecular function of those cells and not appreciable in terms of cell number. In conclusion, this dissertation provides a comprehensive overview over the effects of rhNGF and rhBDNF in the organ of Corti, and lays the foundation for the identification of new therapeutic targets.

In the present study metal ions role in neurodegenerative processes has been investigated. Two major pathways have been developed: 1) metal ions role in β-amyloid (Aβ folding and deposition from in vitro to in vivo; 2) calcium dyshomeostasis in an in vitro model of neurodegeneration. Firstly, metal ions role (aluminum, copper, iron, zinc) in Aβ folding and deposition was assessed. Aβ misfolding is, in fact, believed to play a critical role in Alzheimer’s disease pathogenesis. Our data confirm that Aβ folding is closely related to the conjugated metal ion, thereby following peculiar metal ion-dependent conformational changes. Strikingly, we report that aluminum, a non physiological metal ion, is the most efficient in “freezing” Aβ in its oligomeric and most toxic state. Within this framework we investigated the mechanisms underlying Aβ and Aβ-metal conjugates toxicity. To that aim we employed two natural compounds (resveratrol and cholesterol) acting on two different Aβ mechanisms of toxicity: oxidative stress and membrane damage, respectively. In both cases, in vitro analysis revealed that resveratrol and cholesterol do not influence Aβ and Aβ-metal conjugates folding processes, but are still effective in protecting a neuronal-like cell line against Aβ toxicity. We reported that resveratrol was able to significantly reduce the Aβ-triggered generation of reactive oxygen species, meanwhile physiological concentrations of cholesterol were effective in protecting cellular membrane structure against Aβ (especially Aβ-Al) lipid disrupting activity. To further assess that differently shaped Aβ-metal conjugates result in different biological responses, we investigated Aβ-Cu and Aβ-Zn role in influencing/altering gene expression profile in a neuronal-like cell line. We found that these two conjugates are effective in modulating expression of transcripts involved in inflammatory processes, oxidative stress, and in apoptotic cell death. Following these in vitro studies we decided to investigate whether expression of transcripts involved in metal ions homeostasis resulted affected in an in vivo model of the disease, represented by the 3xTg-AD mice. Our data highlight a significant overlapping between the expression profiles of young 3xTg-AD mice compared with aged wild type mice; this finding support the notion that Alzheimer’s disease can be interpreted as a boosted variant of otherwise naturally occurring age-driven changes. In our dataset we found several differentially expressed transcripts involved in calcium homeostasis, a key metal ion for the physiology of the cell. Secondly, calcium dyshomeostasis in striatal neurons following excitotoxic challenge was assessed. Striatal neurons degeneration is involved in several pathologies showing motor and behavioral sequelae, such as Huntington’s disease (HD). We tried to determine why a subpopulation of striatal neurons results spared in HD striata, showing a peculiar resistance towards excitotoxic challenges. Our data demonstrate that the striking resistance of these cells may be due to boosted scavenging capabilities embedded in such neuronal subpopulation, resulting in lack of ROS generation upon excitotoxic insults. Collectively, these findings highlight the pivotal role played by metal ions in the development of neurodegenerative disorders. Noteworthy, not only endogenous and biologically relevant metal ions (iron, copper, zinc and calcium) seem involved in the pathogenesis of neurodegenerative disorders, but also exogenous metals (i.e.: aluminum) could have a key and subtle, although less investigated, role in neuronal degeneration
Il presente lavoro di tesi si è suddiviso in due filoni principali che hanno come filo conduttore la disomeostasi di ioni metallici nei processi neurodegenerativi. La prima parte riporta lo studio sul ruolo di alcuni ioni metallici (alluminio, ferro, rame e zinco) nel processo di folding della proteina β-amiloide (Aβ), ritenuta uno dei fattori eziopatogenici del morbo di Alzheimer. I dati ottenuti dimostrano come i complessi Aβ-metallo-ione acquistino una peculiare conformazione dipendente dal metallo legato, conferendo così all’Aβ particolari proprietà citotossiche. Tale citotossicità risulta particolarmente evidente per il complesso Aβ-Al che è in grado di aumentare, in maniera significativa, la tossicità data dalla sola Aβ o dalla stessa Aβ coniugata con metalli diversi dall’Al. All’interno di questo quadro sperimentale si è poi cercato di indagare più nel dettaglio i meccanismi con i quali Aβ, e i suoi complessi metallici, esercitassero la loro citotossicità. A questo scopo sono stati impiegati due composti quali il resveratrolo e il colesterolo, che vanno ad agire su due meccanismi che stanno alla base della tossicità dell’Aβ, come lo stress ossidativo e l’alterata fluidità delle membrane cellulari. Nel primo caso, i dati in vitro hanno permesso di dimostrare come, agendo in maniera selettiva sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) Aβ-mediata, sia possibile ridurre la tossicità di Aβ e dei suoi complessi con metalli redox (rame e ferro) mediante un meccanismo di scavenging dei ROS ad opera del resveratrolo, dalle spiccate proprietà anti-ossidanti e neuro-protettive. A questo punto si è indagata la capacità dei vari complessi Aβ-metalloioni di alterare la struttura di membrane lipidiche attraverso l’uso di modelli di membrane cellulari. In precedenza si era dimostrato come il complesso Aβ-Al fosse l’unico complesso in grado di alterare significativamente la fluidità di layer lipidici. I dati ottenuti ci permettono di affermare che tale capacità è dovuta principalmente alla elevata idrofobicità superficiale del complesso Aβ-Al. Inoltre, agendo sulle membrane cellulari con concentrazioni fisiologiche di colesterolo è stato possibile ridurre l’”irrigidimento” delle membrane (lipidico) conseguente alla presenza di Aβ-Al, e ridurne la citotossicità. Si é quindi approfondito il ruolo geno-tossico dei succitati complessi Aβ-metalloioni andando ad indagare come questi siano in grado di modulare in maniera significativa (e metallo-dipendente) l’espressione genica di numerosi trascritti coinvolti nella patologia di Alzheimer. In particolare, il nostro interesse si è focalizzato sui complessi Aβ-Cu e Aβ-Zn, che si sono rivelati in grado di modulare selettivamente l’espressione di geni coinvolti in processi infiammatori, nello stress ossidativo e nella morte cellulare (apoptosi). Dopo questa serie di studi in vitro si è passati ad indagare l’espressione genica dell’intero genoma umano in un modello in vivo di patologia di Alzheimer. Lo scopo era quello di identificare il network o il pathway d’espressione coinvolti della disomeostasi cationica. I profili d’espressione del modello murino 3xTg-AD sono stati pertanto confrontati con quelli del controllo wild type. In questo contesto, si è scoperta una significativa sovrapposizione dei geni sovra- e sotto-espressi tra topi wild type anziani e topi 3xTg-AD giovani. Questo dato supporta l’idea che il substrato patologico dell’AD possa favorire un processo di invecchiamento precoce. All’interno del gruppo di geni trovati differenzialmente espressi, molti erano coinvolti nell’omeostasi del calcio, ione chiave per la fisiopatologia cellulare. Il secondo filone di ricerca ha riguardato lo studio del ruolo dello ione calcio nell’eccitotossicità dei neuroni dello striato. Tale fenomeno è particolarmente importante in alcune patologie neurodegenerative che hanno come segno caratteristico una progressiva e irreversibile perdita del controllo motorio, come ad esempio il morbo di Huntington. L’interesse si è focalizzato nel determinare il perchè una subpopolazione di neuroni striatali, caratterizzata dalla sovraespressione di nitrico-ossidosintasi, non vada incontro ad apoptosi in seguito a stress eccitotossico. I dati raccolti ci hanno permesso di stabilire che la resistenza di tale sottopopolazione al sovraccarico di calcio è dovuta principalmente ad una potenziata capacità di questi neuroni di detossificarsi rapidamente dalle specie ROS, di origine mitocondriale, specie che si generano durante fenomeni eccitotossici. Conclusione. Nel complesso i dati ottenuti sottolineano una volta di più un ruolo centrale degli ioni metallici nello sviluppo e/o nella progressione di alcune patologie a carattere neurodegenerativo. In particolare è importante notare come, a fianco di alcuni ioni metallici endogeni - che hanno un rilevante ruolo fisiologico (ferro, rame, zinco, calcio) -, anche altri ioni privi (apparentemente) di un ruolo biologico, ma coi quali ci interfacciamo quotidianamente, come ad esempio l’alluminio, sembrino svolgere un ruolo chiave in processi eziopatogenetici legati a fenomeni neurodegenerativi

E’ stato proposto che le alterazioni biochimiche (fosforilazione e/o proteolisi) delle proteine tau rappresentano uno tra i marcatori piu’ precoci del processo neurodegenerativo del morbo di Alzheimer (AD). Tali modificazioni inoltre, diversamente dalle placche di beta amiloide (Aβ), meglio correlano con il decorso clinico e il progressivo declino cognitivo associato a tale malattia dementigena. E’ stato recentemente riportato che un aumento dei livelli di espressione del frammento di tau NH2 26-230aa , ottenuto mediante infezione adenovirus-mediata di colture neuronali ippocampali e corticali, evoca un potente effetto neurotossico causato da un’ attivazione protratta e sostenuta dei recettori extrasinaptici del glutammato di tipo NMDA (Amadoro et al.,2004; Amadoro et al.,2006). La mia tesi di dottorato e’ stata pertanto finalizzata all’identificazione di tale frammento N-terminale di tau in diversi modelli cellulari ed animali di neurodegenerazione apoptotica di tipo AD, utilizzando un anticorpo diretto contro il neo-epitopo mappante nella sequenza NH2 della proteina tau umana e localizzato “a valle” del sito di taglio della(e) caspasi DRKD25-QGGYTMHQDQ. In questo lavoro sperimentale noi riportiamo dati morfologici e biochimichi evidenzianti che un frammento NH2-terminale di tau di 20-22 kDa, generato dopo taglio delle caspasi e consistente con le dimensioni del peptide neurotossico NH2-26-230aa, e’ prodotto in vitro sia (i) nella linea umana di neuroblastoma SH-SY5Y, differenziata ed indotta in apoptosi mediante privazione di BDNF o in seguito al trattamento farmacologico con staurosporina (STS) che (ii) nei neuroni ippocampali maturi di ratto esposti al peptide Aβ pre-fibrillare. Inoltre tale frammento di tau, la cui espressione correla con una significativa attivazione delle caspasi apptotiche, e’ rilevato anche in vivo, nell’ippocampo dei topi transgenici AD11, un noto modello animale in cui la progressiva neurodegenerazione di tipo AD e’ indotta mediante l’espressione di anticorpi intarcellulari anti-NGF. Infine, mediante saggi cell-free sui mitocondri neuronali intatti, noi dimostriamo che il peptide sintetico NH2 26-44, la minima regione del frammento N-terminale di tau che sostiene in vitro l’effetto neurotossico (Amadoro et al., 2006), significativamente diminuisce lo scambio ADP/ATP mediato dal traslocatore mitocondriale ANT. Al contrario il peptide non tossico NH2 1-25(Amadoro et al.,2006) non esibisce alcun effetto. Questi risultati (Corsetti et al., 2008; Atlante et al., 2008) supportano l’ipotesi che un aberrante attivazione delle caspasi, in seguito a stimoli apoptotici o ad insulti neurodegenerativi, possa produrre uno o piu’ frammenti tossici di tau derivati dal dominio N-terminale, i quali ulteriormente contribuiscono a propagare ed ad aumentare il danno cellulare durante la progressione dell’AD.
Biochemical modifications of tau proteins have been proposed to be among the earliest neurobiological changes in Alzheimer’s disease (AD) and correlate better with cognitive symptoms than do beta-amyloid plaques. We have recently reported that adenovirus-mediated overexpression of the NH2 26-230aa tau fragment evokes a potent NMDA-mediated neurotoxic effect in primary neuronal cultures. In order to assess whether such N-terminal tau fragment(s) are indeed produced during apoptosis or neurodegeneration in vivo, we attempted to ascertain their presence in cell and animal models using an anti-tau antibody directed against the N-terminal sequence of human protein located downstream of the caspase(s) cleavage site DRKD25-QGGYTMHQDQ. We provide biochemical evidence that a caspase(s)-cleaved NH2-terminal tau fragment of 20-22 kDa, consistent with the size of the NH2 26-230aa neurotoxic fragment of tau, is generated in vitro in differentiated human SH-SY5Y cells undergoing apoptosis by BDNF withdrawal or following treatment with staurosporine. In addition this NH2-terminally cleaved tau fragment, whose expression correlates with a significant up-regulation of caspase(s) activity, is also specifically detected in vivo in the hippocampus of 15 months old AD11 transgenic mice, a model in which a progressive AD-like neurodegeneration is induced by the expression of transgenic anti NGF antibodies. Having confirmed that adenovirus-mediated overexpression of NH2-tau fragment lacking the first 25 aminoacids evokes a potent neurotoxic effect, sustained by protracted stimulation of NMDA receptors, in primary neuronal cultures we investigated whether and how chemically synthesized NH2-derived tau peptides, i.e. NH2-26–44 and NH2-1–25 fragments, affect mitochondrial function. Oxidative phosphorylation is not affected by NH2-1–25 tau fragment, but dramatically impaired by NH2-26–44 tau fragment. Both cytochrome c oxidase and the adenine nucleotide translocator are targets of NH2-26–44 tau fragment, but adenine nucleotide translocator is the unique mitochondrial target responsible for impairment of oxidative phosphorylation by the NH2-26–44 tau fragment, which then exerts deleterious effects on cellular availability of ATP synthesized into mitochondria. The results (Corsetti et al., 2008; Atlante et al., 2000) support the idea that aberrant activation of caspase(s), following apoptotic stimuli or neurodegeneration insults, may produce one or more toxic NH2-tau fragments, that further contribute to propagate and increase cellular dysfunctions in AD.