Добірка наукової літератури з теми "Protein-drug binding"

Background: Electrostatic interactions are one of the forces guiding the binding of molecules to proteins. The assessment of this interaction through computational approaches makes it possible to evaluate the energy of protein-drug complexes. Objective: Our purpose here is to review some the of methods used to calculate the electrostatic energy of protein-drug complexes and explore the capacity of these approaches for the generation of new computational tools for drug discovery using the abstraction of scoring function space. Method: Here we present an overview of AutoDock4 semi-empirical scoring function used to calculate binding affinity for protein-drug complexes. We focus our attention on electrostatic interactions and how to explore recently published results to increase the predictive performance of the computational models to estimate the energetics of protein-drug interactions. Public data available at Binding MOAD, BindingDB, and PDBbind were used to review the predictive performance of different approaches to predict binding affinity. Results: A comprehensive outline of the scoring function used to evaluate potential energy available in docking programs is presented. Recent developments of computational models to predict protein-drug energetics were able to create targeted-scoring functions to predict binding to these proteins. These targeted models outperform classical scoring functions and highlight the importance of electrostatic interactions in the definition of the binding. Conclusion: Here, we reviewed the development of scoring functions to predict binding affinity through the application of a semi-empirical free energy scoring function. Our studies show the superior predictive performance of machine learning models when compared with classical scoring functions and the importance of electrostatic interactions for binding affinity.

Comparison of the human plasma protein binding data for a variety of drug discovery compounds indicates that compounds tend to be slightly more bound to human plasma proteins, than compared to plasma proteins from rats, dogs or mice.

Drug repositioning applies existing drugs to new disease indications. A prerequisite for drug repurposing is drug promiscuity - a drug's ability to bind to several targets, possibly leading to side effects on the other hand. One reason for drug promiscuity is binding site similarity between (otherwise unrelated) proteins. In this thesis, a new algorithm for remote binding site similarity assessment and its application to the whole of the Protein Data Bank (PDB) is presented, forming the base for off-target identification and drug repositioning. The present thesis contributes to a long-standing debate on the reasons for drug promiscuity, being one of the pioneer studies investigating these from a protein structural point of view. Except for a small influence of flexibility, the analysis of all promiscuous drugs in the PDB revealed that drug properties are of minor importance. However, a strong correlation between promiscuity and binding site similarity of protein targets is found (r = 0.81), suggesting binding site similarity as the main reason for drug promiscuity. For 71 % of the promiscuous drugs at least one pair of their targets' binding sites is similar and for 18 % all are similar. In order to overcome issues in detection of remotely similar binding sites, a score for binding site similarity is developed: LigandRMSD measures the similarity of the aligned ligands and uncovers remote local similarities in proteins. It can be applied to arbitrary binding site alignments and also works on distinct ligands on a structural proteome scale. To answer the question on which other targets might be hit when targeting a particular protein, an all-to-all binding site alignment of 32,202 protein structures is analyzed. Of the hundreds of million possible protein pairs, 0.27 % were found to have similar binding sites. Extrapolating to the human proteome, for one human protein are 54 proteins with a similar binding site expected on average. Clearly, this is in contrast to the one drug-one target paradigm in drug development. Based on these data, disadvantageous off-targets can be uncovered and drug-repositioning candidates inferred. The enormous potential is demonstrated with the example of Viagra, proposing it for repositioning to Alzheimer's disease and prostate cancer. The findings in this thesis question the established single-target dogma in drug discovery. Drugs are triggered to modulate multiple targets simultaneously by the widespread binding site similarity. With the presented pipeline, drug targets can be reliably predicted: Starting from a target protein, additional targets are predicted based on binding site similarity and prioritized according to the resulting ligand structural overlap. Identifying drug targets helps to understand severe side effects and opens the door for drug repositioning.

Understanding how proteins fold and bind is interesting since these processes are central to most biological activity. Protein folding and protein-protein interaction are by themselves very complex but using a good and robust system to study them could ease some of the hurdles. In this thesis I have tried to answer some of the fundamental questions of protein folding and binding. I chose to work with PDZ domains, which are protein domains consisting of 90-100 amino acids. They are found in more than 400 human proteins and function mostly as protein-protein interaction units. These proteins are very stable, easy to express and purify and their folding reaction is reversible under most laboratory conditions. I have characterized the interaction of PSD-95 PDZ3 domain with its putative ligand under different experimental conditions and found out that its binding kinetics is sensitive to salt and pH.  I also demonstrated that the two conserved residues R318 and H372 in PDZ3 are responsible for the salt and pH effect, respectively, on the binding reaction. Moreover, I determined that for PSD 95 PDZ3 coupling of distal residues to peptide binding was better described by a distance relationship and there was a very weak evidence of an allosteric network. Further, I showed that another PDZ domain, SAP97 PDZ2 undergoes conformational change upon ligand binding. Also, I characterized the binding mechanism of a dimeirc ligand/PDZ1-2 tandem interaction and showed that despite its apparent complexity the binding reaction is best described by a square scheme. Additionally, I determined that for the SAP 97 PDZ/HPV E6 interaction that all three PDZ domains each bind one molecule of the E6 protein and that a set of residues in the PDZ2 of SAP 97 could operate in an unexpected long-range manner during E6 interaction. Finally, I showed that perhaps all members in the PDZ family could fold via a three state folding mechanism. I characterized the folding mechanism of five different PDZ domains having similar overall fold but different primary structure and the results indicate that all five fold via an intermediate with two transition states. Transition state one is rate limiting at low denaturant concentration and vice versa for transition state two. Comparing and characterizing the structures of the transition states of two PDZ domains using phi value analysis indicated that their early transition states are less similar as compared to their late transition states.

El trabajo presentado en esta tesis cubre varios campos de investigación relacionados con el desarrollo de moléculas bioactivas. Se compone de cinco partes distintas que se resumen aquí. Predicción de la utilidad farmacológica de dianas terapéuticas. El desarrollo de fármacos está generalmente dirigido a inhibir la función de una proteína específica. Pero para validar esta proteína como diana terapéutica, al principio de un proyecto de descubrimiento de fármacos se tiene que saber si una molécula de tipo fármaco puede unirse con suficiente afinidad a la proteína como para alterar su función. Existen métodos que predicen si una potencial diana terapéutica es tratable o no por vía farmacológica, lo que se ha dado en llamar ‘druggability’. El problema es que estos métodos no están accesibles libremente y su validación es discutible. En la primera parte de la tesis se ha compilado un conjunto extensivo de datos de cavidades en proteínas cuyo novel de ‘druggability’ es conocido, haciéndolo accesible en una plataforma web pública (http://fpocket.sourceforge.net/dcd). Estos datos pueden ser modificados por cualquier persona que quiera contribuir al desarrollo de este conjunto de datos, aumentando su volumen o mejorando su calidad. En estudios previos, los sitios druggable se han asociado a cavidades profundas e hidrofóbicas, ignorando la importancia que tiene los grupos polares en el sitio de unión y su posible relación con la ‘druggability’. Utilizando el set de datos compilado previamente, hemos encontrado que aunque las cavidades ‘druggables’ son mas hidrofóbicas, también tienen grupos polares más expuestos pero con poca superficie de interacción. Esta observación es objeto de posteriores investigaciones en la segunda parte de la tesis. Finalmente, se ha utilizado un algoritmo de búsqueda de sitios de unión, fpocket, que empecé a desarrollar como proyecto de master. Este programa se ha utilizado para extraer todas las características de las cavidades ‘druggables’ y no ‘druggables’ y estos parámetros se han utilizado para entrenar un modelo logístico capaz de predecir si un sitio es druggable o no. Demostramos que el algoritmo y la función de puntuación desarrollado durante esta primera parte predice la ‘druggability’ de manera fiable. Los resultados son de igual calidad a los obtenidos con el único otro programa accesible con funcionalidad parecida (SiteFinder, de Schrödinger), pero nuestro programa tiene las siguientes importantes ventajas: 1) es libre; 2) es mucho más eficiente computacionalmente; y 3) trabaja sobre cavidades detectadas automáticamente por el programa, lo que permite aplicaciones a gran escala. En otras partes de la tesis se verá como su aplicación al conjunto del PDB permite novedosas aplicaciones en el área del diseño de fármacos. Análisis de movilidad de cavidades de las proteínas Existen una gran variedad de algoritmos que permiten identificar posibles sitios de unión en las estructuras tridimensionales de las proteínas. El trabajo presentado en la sección anterior de esta tesis permitía extender uno de estos algoritmos para caracterizar la ‘druggability’ de las cavidades. Un problema de gran calado en el estado actual de la técnica, tanto de detección de sitios de unión como en diseño de fármacos en general,4 es que las proteínas se tratan como un cuerpo rígido a pesar de que en realidad gozan de una gran movilidad estructural. El objetivo de esta sección era otorgar todavía otra funcionalidad a fpocket, el programa de predicción de sitios de unión, para permitir también la detección y el análisis de cavidades de proteínas en movimiento. Habitualmente, los movimientos de las proteína se pueden simular usando la dinámica molecular (MD). Una herramienta capaz de analizar conjuntos de estructuras derivados de MD u otras fuentes puede ser, por tanto, extremadamente útil para observar la aparición de cavidades transitorias y su plasticidad. Como resultado final de este trabajo, se presenta un nuevo programa informático, llamado MDpocket y que se enmarca dentro del paquete fpocket. Para cada conformación de la proteína, se ejecuta un ciclo de detección de cavidades con fpocket. Los resultados de este proceso se plasman sobre una malla tridimensional superpuesta a la estructura de la proteína. La malla puede entonces ser visualizada o analizada en mayor detalle. Lo primero se puede llevar a cabo con programas de visualización molecular tales como PyMOL, VMD o Chimera. Otra funcionalidad dentro de MDpocket es la de seguir la evolución de las propiedades de una cavidad o zona de interés (definida por el usuario) a lo largo del tiempo. Cabe destacar que MDpocket es igualmente capaz de identificar sitios de unión de moléculas tipo fármaco como pequeños canales en la matriz proteica que pueden ser importantes para la migración de pequeños ligandos como gases o moléculas de agua. Las posibles aplicaciones de MDpocket se ejemplifican en tres casos distintos. El primero es la capacidad de identificar la apertura transitoria de cavidades en el sitio de unión de ATP en la proteína HSP90. En el segundo ejemplo, se muestra como MDpocket permite identificar un canal de migración de moléculas biatómicas en mioglobina, un sistema de referencia bien conocido. Aquí se demuestra que MDpocket puede, no tan solo identificar los sitios internos de unión a Xenón, sino también los canales que se abren de forma transitoria para permitir a los ligandos migrar de un sitio a otro. En el último ejemplo, las propiedades del sitio de unión a ATP de la proteína cinasa P38 se analizaron a lo largo de una trayectoria de MD, evaluando la capacidad de MDpocket para identificar aquellas conformaciones que pueden ser particularmente útiles para realizar docking molecular. Uno de los principales problemas en docking de proteína-ligando es que el receptor generalmente se considera rígido, mientras que si se utilizan múltiples conformaciones (cristalográficas o derivadas de MD) para representar al receptor es difícil decidir a priori cuales de ellas pueden dar mejores resultados. Aquí mostramos que MDpocket se puede utilizar para seleccionar conformaciones concretas de una trayectoria de MD para usarlas en procesos de docking. Concretamente, hemos observado que la densidad hidrofóbica promedio (previamente identificada como un descriptor importante para predecir ‘druggability’) correlaciona bien con la probabilidad de que el modo de unión de ligandos pueda ser predicho correctamente. Tal como en el trabajo anterior, MDpocket se incluye dentro del proyecto fpocket y se está accesible como una herramienta libre y de código abierto. Relaciones estructura-cinética de unión El control de los tiempos en interacciones moleculares es una propiedad esencial de los sistemas bioquímicos, pero poco se conoce sobre los factores estructurales que gobiernan la cinética de los procesos de reconocimiento molecular. Partiendo de una observación realizada durante el trabajo de predicción de ‘druggability’, aquí se ha investigado el papel que átomos con poca superficie expuesta a solvente pueden jugar en los sitios de unión de la proteína. En particular, encontramos que los átomos polares en los sitios druggable son minoritarios en comparación con los átomos apolares, pero si bien pueden tener poca superficie accesible, tienden a ser mas protuberantes, lo que los hace más accesibles para establecer interacciones. Hemos establecido que esta propiedad puede estar relacionada con la cinética de unión/disociación de un ligando a su cavidad en el receptor. En diseño de fármacos, la vida media del complejo formado entre el fármaco y su diana terapéutica determina en gran medida sus efectos biológicos, pero en ausencia de relaciones estructura cinética, se hace imposible optimizar esta propiedad de forma racional. Aquí se muestra que átomos polares prácticamente enterrados (ABPAs) – un elemento comúnmente encontrado en los sitios de unión de proteínas – tienden a formar puentes de hidrógeno que están protegidos de las moléculas de agua. La formación y ruptura de este tipo de puentes de hidrógeno implica un estado de transición penalizado energéticamente porque ocurre de modo asincrónico con el proceso de deshidratación/rehidratación. En consecuencia, los puentes de hidrógeno protegidos se intercambian a velocidades lentas. Estas conclusiones se basan en el estudio computacional del proceso de unión de un pequeño ligando a un sitio de unión modelo. El receptor modelo se construyó para permitir modular tanto el grado de exposición del átomo polar como la curvatura del entorno apolar. Mediante el uso de dinámicas moleculares con constricciones y la relación de Jarzinsky, se obtuvieron los perfiles de energía libre de unión para cada cavidad. La presencia de un estado de transición (y por tanto menor velocidad de asociación/disociación) puede anticiparse mediante un simple análisis estructural tal como la medición de la superficie accesible del átomo polar o su grado de protrusión. Esto constituye una nueva y valiosa clave para interpretar y predecir relaciones estructura-actividad, que se ha puesto a prueba investigando sistemas reales. En primer lugar, analizando tanto estructuras cristalográficas depositadas en el PDB como trayectorias de dinámica molecular, se ha demostrado que aquellas moléculas de agua que forman puentes de hidrógeno con ABPAs tienden a tener menor movilidad e intercambios más lentos. Posteriormente, la validez del principio se ha demostrado en dos pares de inhibidores de la proteína Hsp90, una diana terapéutica para cáncer, para los que se han obtenido datos estructurales, termodinámicos y cinéticos mediante distintas técnicas experimentales. El acuerdo entre observables macroscópicas y los resultados de simulaciones moleculares confirma la función de los puentes de hidrógeno protegidos de solvente como trampas cinéticas e ilustra como nuestro hallazgo puede ser usado para facilitar el proceso de diseño de fármacos basado en estructura. Base de datos de cavidades: hacia el ‘pocketoma’ El trabajo presentado en el principio de la tesis perseguía un objetivo muy especifico, que se enmarca en un proyecto mayor del grupo de investigación. La herramienta de predicción de ‘druggability’ se desarrolló con el fin de cribar grandes bases de datos estructurales, tales como el PDB, identificando complejos proteína-proteína no obligados (transitorios) que contengan en su interfase una cavidad potencialmente capaz de unir moléculas de tipo fármaco. Con ello se pretende estabilizar selectivamente dicha interacción y conseguir un efecto biológico que pueda ser terapéutico. Dado que la información sobre cavidades y su druggability asociada va a ser explotadas por otras personas en el grupo en este y otro tipo de proyectos encaminados a facilitar la explotación de nuevos mecanismos de acción, es necesario crear una base de datos que contenga esta información y sea fácilmente navegable. Para empezar, se ejecutó el programa para cada una de las estructuras depositadas en el PDB, identificando todas las cavidades y extrayendo sus descriptores, entre los que se incluye la función de puntuación de druggability. Esta información se guarda de forma organizada en una base de datos relacional (pocketDB), que se relaciona con otras bases de datos tales como Uniprot y Uniref, que contienen información sobre secuencias. Igualmente, se incluyeron información sobre la estructura cuaternaria y otros recursos tales como Kegg, haciendo de pocketDB un potente recurso para filtrar de modo eficiente millones de cavidades, identificando aquellas que tengan mayor interés para cada proyecto. De modo particular, cabe destacar la aplicación de pocketDB a la identificación de cavidades ‘druggable’ situadas en la interfase de complejos transitorios proteína-proteína, resultando en 39 complejos candidatos, entre los que se recobraron 3 casos conocidos previamente, lo que valida la metodología. Además otros tres sistemas identificados, después de una inspección minuciosa, han sido seleccionados en el grupo como candidatos para realizar la prueba de concepto que valide esta nueva estrategia farmacológica. Uno de ellos está actualmente en fase de validación experimental. El ‘pocketoma’ La última sección de mi tesis presenta un proyecto que hace un uso extensivo de la base de datos de cavidades (pocketDB) previamente presentada. Dos cuestiones importantes aún persisten hoy día en el proceso de descubrimiento de fármacos y, de algún modo, contribuyen a la alta tasa de fracasos en las fases tardías del desarrollo, que normalmente se explican por la baja eficacia o el exceso de efectos secundarios (normalmente tóxicos) para el organismo. Ambas situaciones pueden ser explicadas por un fenómeno común: la falta de selectividad. Las fármacos interaccionan en la célula con una diversa variedad de macromoléculas además de con la diana terapéutica, induciendo así efectos secundarios imprevistos. Asimismo, considerar solamente una diana para nuestro fármaco puede resultar menos efectivo de lo esperado, puesto que la pérdida de función de una sola proteína diana puede ser fácilmente reemplazada debido a los mecanismos homeostáticos controlados por robustas redes de interacciones, derivando en una pérdida de eficacia de nuestra molécula. Este trabajo pretende sentar las bases para poder establecer relaciones entre macromoléculas biológicas en base a su potencial para interaccionar con una misma entidad química (fármaco). El trabajo se basa en la asunción de que cavidades similares son capaces de unir ligandos similares. Existen varios métodos que calculan la similitud entre cavidades de unión, sin embargo, hasta la fecha no se ha realizado un análisis relacional profundo de todas las cavidades en el PDB que permita establecer relaciones entre ellos. Con el fin de cumplir con los requerimientos técnicos de unos objetivos tan ambiciosos, se ha desarrollado un novedoso método de comparación de cavidades. En este particular método se considera una representación muy abstracta de la cavidad. Dicha representación reúne información tanto sobre la forma de la cavidad cómo sobre la distribución por pares de los puntos de interacción en la superficie. No obstante, la información sobre la topología exacta de la cavidad es ignorada. Tal abstracción intenta relacionar cavidades que estructuralmente están alejadas, pero que se parecen entre ellas en términos de forma y propiedades fisicoquímicas globales. Usando varios ejemplos de validación en un conjunto de cavidades de referencia, el método resulta capaz de recuperar de un gran set de cavidades aquellas más similares y relacionadas entre sí. Del mismo modo, el método demuestra ser útil para encontrar relaciones entre cavidades previamente no relacionadas y que sin embargo unen los mismos ligandos o moléculas muy similares. Esta nueva implementación se ha utilizado en un experimento de exploración a gran escala para encontrar (i) las mismas cavidades en diferentes estructuras, (ii) cavidades relacionadas y (iii) cavidades con la misma estructura de ligando. Se obtuvieron excelentes resultados para estas tres categorías. Seguidamente, se compararon entre ellas todas las cavidades encontradas en el PDB. Se desarrolló una herramienta computacional novedosa para permitir la navegación en el 'pocketoma' resultante de las comparaciones, que será posible descargar gratuitamente. Los resultados presentados muestran por primera vez un espacio global interrelacionando cavidad-ligando para todas las cavidades del PDB. Finalmente, se señalan a continuación dos aplicaciones que ponen de manifiesto el posible impacto del ‘pocketoma’ y la herramienta de navegación. En el primer ejemplo, una cavidad no caracterizada encontrada en GSK3-β fue comparada contra todas las cavidades del PDB, permitiendo obtener una variedad de cavidades, y sistemas, supuestamente relacionadas. Entre los resultados se encontraban las subunidades de unión a ADP dhaL y dhaM de la PTS dependiente di-hidroacetona cinasa. Se encontró que el sitio de unión a ADP era muy similar a la cavidad investigada en GSK3-β con una sorprendente similitud estructural entre ambos. En el último ejemplo, se navegó por el ‘pocketoma’ utilizando la herramienta visual desarrollada para tal tarea. Durante la exploración se encontró una curiosa e importante relación entre el sitio de unión de la hormona del receptor de estrógenos y una cavidad no caracterizada en la proteína Caspasa-3. Seguidamente, se realizó un estudio de docking con ligandos similares a la hormona y se procedió a realizar una extensiva dinámica molecular con el ligando en la mejor posición para verificar la estabilidad del compuesto en la cavidad de Caspasa-3. El complejo proteína-ligando estudiado resultó ser muy estable. Actualmente, el compuesto identificado se encuentra bajo validación experimental por nuestros colaboradores.

To begin with, macromolecules consisting of poly(amido)amine dendrimers(PAMAM), polyglycidol, hyperbranched poly(amido)amine (HYPAM) were synthesized and characterized extensively. Porphyrins were also synthesized, characterized and modified in line with respective studies. Hereafter, surface modified TRIS PAMAM dendrimers and its analogs (hyperbranched polymers, hyperbranched PAMAMs) as potential drug delivery systems were studied with the use of model drugs (Ibuprofen and Porphyrin). Analogs of the model drugs were used to investigate the role of secondary interactions for high drug loading(s). UV-Vis Spectroscopy was utilized for studying and determining the maximum loading of the macromolecules under investigation. Further ahead, non-covalent approaches to improve dendrimer-protein binding were used by introducing amino acid chains as targeting groups on the dendrimer surface. Surface modified carboxylate PAMAM dendrimers were studied for their ability to bind with zinc metallated porphyrin. UV-Vis and Fluorescence Spectroscopy were used for protein binding studies. Lastly, Surface Crosslinked Micelles were synthesized and utilized as artificial blood mimics with an attempt to increase the half-life of encapsulated iron porphyrin acting as the heme mimic with the help of UV-Vis Spectroscopy.

Drug discovery is a protracted and demanding process, which can be expedited during its early stages through novel mathematical approaches and modern computing. To tackle this crucial issue, we are developing fresh mathematical solutions aimed at detecting and characterizing protein binding sites, pivotal for new drug discovery. This paper introduces algorithms founded on graph theory which we have devised to scrutinize target biological proteins. These algorithms yield vital data, facilitating the optimization of initial phases in novel drug development. A particular emphasis lies in the creation of pioneering protein binding site prediction algorithms (ProBiS) and innovative web tools for modeling pharmaceutically intriguing molecules—ProBiS tools. These tools have matured into comprehensive graphical resources for the study of proteins in the proteome. ProBiS stands apart from other structural algorithms due to its ability to align proteins with disparate folds, all without prior knowledge of the binding sites. This unique capability enables the identification of analogous binding sites and the prediction of molecular ligands of diverse pharmaceutical relevance. These ligands could potentially progress into drug candidates for treating diseases. Notably, this prediction is based on data sourced from the complete Protein Data Bank (PDB) and the AlphaFold database, encompassing proteins not yet cataloged in the PDB. All ProBiS tools are made available without charge to the academic community through http://insilab.org and https://probis.nih.gov.

The work for predicting drug and target affinity(DTA) is crucial for drug development and repurposing. In this work, we propose a novel method called GDGRU-DTA to predict the binding affinity between drugs and targets, which is based on GraphDTA, but we consider that protein sequences are long sequences, so simple CNN cannot capture the context dependencies in protein sequences well. Therefore, we improve it by interpreting the protein sequences as time series and extracting their features using Gate Recurrent Unit(GRU) and Bidirectional Gate Recurrent Unit(BiGRU). For the drug, our processing method is similar to that of GraphDTA, but uses two different graph convolution methods. Subsequently, the representation of drugs and proteins are concatenated for final prediction. We evaluate the proposed model on two benchmark datasets. Our model outperforms some state-of-the-art deep learning methods, and the results demonstrate the feasibility and excellent feature capture ability of our model.

Protein-protein interactions (PPI) are critical for cellular functions, host-pathogen dynamics and are crucial with drug design efforts. The interaction of proteins is dependent on the amino acid sequence of a protein as it determines its binding affinity to various molecules, including drugs, DNA, RNA, and proteins. Polymorphisms, natural DNA variations, affect PPIs by altering protein structure and stability. Computational chemistry is vital for the prediction of ligand-protein interactions through techniques such as docking and molecular dynamics and can elucidate the changes in energy associated with such mutations. We present a user-friendly protocol that uses the INTE command of CHARMM to predict the effects of mutations on PPIs. This command-line tool automates mutation analysis and interaction energy estimation, is applicable to different ligand types (protein, DNA, RNA, ion, small molecule) and provides various other features. The energy values yield absolute and normalized heat maps that allow rapid identification of stabilizing and destabilizing mutations. Our protocol forms the basis for automated programs that facilitate studies of binding-altering mutations in host-pathogen, protein-protein, and drug-target interactions.

The human serum albumin (HSA) is well known for its extraordinary binding capacity for both endogenous and exogenous compounds, including a wide range of drugs. The goal of our investigation was to evaluate the distribution process for 15 CNS active compounds. The drug-plasma protein interaction was evaluated under simulative physiological conditions on the HSA-based stationary phase by using the mixture of Sørensen phosphate buffer (pH 7.40) and acetonitrile modifier as a mobile phase (84:16 v/v). The retention parameters (k) were used to approximate the % of protein-binding by calculating the P(%) values. The results obtained through this study demonstrated that the constitutional properties (e.g. number of total bonds, atoms, carbon atoms) and lipophilicity have a strong positive impact on the HSA-binding affinity. The coefficient of diffusion has a negative impact, while the atoms and sites available for the CYP450 oxidation showed the most significant correlation (r = 0.92). This study provides a basis for further in vitro chromatographical investigations of drug-HSA interaction for CNS active compounds. The correlation between obtained retention data and the availability to enzymes oxidation indicates the application of the tested system in the assessment of the metabolic degradation profile of CNS related drugs.

Chemical signaling between beneficial or pathogenic bacteria and plants is a central factor in determining the outcome of plant-microbe interactions. Pectobacterium and Dickeya (soft rot Erwinias) are the major cause of soft rot, stem rot, and blackleg formed on potato and ornamentals, currently with no effective control. Our major aim was to establish and study specific bacterial genes/proteins as targets for anti-virulence compounds, by combining drug design tools and bioinformatics with experimental work. The approach allowed us to identify and test compounds (small molecules) that specifically interfere with the activities of these targets, by this impairing bacterial virulence. Two main targets were selected within the frame of the BARD project. The first is the ATP-binding cassette (ABC) transporters and methyl-accepting chemotaxis proteins (MCP) that have been characterized here for the first time in Pectobacteriaceae, and the second is the quorum sensing (QS) machinery of Pectobacterium with its major proteins and in particular, the AHL synthase ExpI that was identified as the preferred target for inhibition. Both systems are strongly associated with bacterial virulence and survival in planta. We found that Pectobacteriaceae, namely Dickeya and Pectobacterium, encode more ABC transporters and MCP in their genomes, compared to other bacteria in the order. For MCP, soft rot Pectobacteriaceae not only contain more than 30 MCP genes per strain, but also have more diverse ligand binding domains than other species in the Enterobacteriales. These findings suggest that both ABC transporters and MCP are important for soft rot Pectobacteriaceae pathogenicity. We now have a selection of mutants in these proteins that may be further explored to understand their direct involvement in virulence. In parallel, we studied the QS central proteins in pectobacteria, the signaling molecule N-acyl-homoserine lactone synthase, ExpI, and the response regulator ExpR, and established their phylogenetic relations within plant pathogenic Gram negative bacteria. Next, these proteins were used for virtual screening of millions of compounds in order to discover new compounds with potential to interfere with the QS machinery. Several natural compounds were tested for their interference with virulence related traits in Pectobacterium and their capability to minimize soft rot infections. Our findings using microcalorimetric binding studies have established for the first time direct interaction between the protein ExpI and two natural ligands, the plant hormone salicylic acid and the volatile compound carvacrol. These results supported a model by which plants interfere with bacterial communication through interkingdom signaling. The collaborative project yielded two research papers and a comprehensive review, which included new computational and bioinformatics data, in Annu. Rev. Phytopathol., the highest ranked journal in phytopathology. Additional two papers are in preparation. In order to transform the fundamental knowledge that have been gained during this collaborative BARD project into agricultural practice, to control soft rot bacteria, we have submitted a continual project.