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La classe C des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) comprend plusieurs membres aux fonctions physiologiques importantes comme par exemple les récepteurs des principaux neurotransmetteurs excitateurs (glutamate) et inhibiteurs (GABA) du système nerveux, les récepteurs des goûts umami et sucré et les récepteurs sensibles au calcium. Ces récepteurs possèdent une architecture moléculaire particulière, caractérisée par la présence d’un large domaine extracellulaire (ECD) relié à un domaine membranaire composé de 7 hélices transmembranaires (7TM). De plus, ils forment tous des dimères obligatoires, la dimérisation étant fondamentale pour leur fonction. La fixation d’agoniste dans l’ECD induit l’activation du récepteur. L’activité des agonistes peut être modulée de manière allostérique par des modulateurs positifs (PAM) ou négatifs (NAM), se liant au domaine 7TM. Il est important de comprendre comment les changements de conformation induits par la liaison des agonistes au sein du domaine extracellulaire sont transmis au domaine transmembranaire mais aussi de comprendre les bases structurales et moléculaires de la régulation allostérique des récepteurs de la classe C. Les progrès récents de la microscopie électronique en conditions cryogéniques (cryoEM) ont permis des avancées sans précédent dans le décryptage des bases structurelles et moléculaires des mécanismes d’activation des RCPG de classe C, et notamment du récepteur métabotropique du glutamate de type 5 (mGlu5). Le glutamate entraîne une fermeture et un changement d’orientation des domaines extracellulaires qui induit un mouvement important entre les sous-unités, rapprochant les 7TM et stabilisant la conformation active du récepteur. La diversité de conformations inactives pour les récepteurs de la classe C était inattendue mais propice à une activation possible par des PAM. Ces derniers stabilisent une conformation active des 7TM, indépendante des changements conformationnels induits par les agonistes, représentant un mode alternatif d’activation des récepteurs mGlu. Nous présentons et discutons ici les caractérisations structurales récentes des récepteurs de classe C, en soulignant les résultats qui rendent cette famille de récepteurs unique. La compréhension de la base structurelle de la signalisation des dimères de mGlu représente une réalisation historique et ouvre la voie à l’analyse de la signalisation des dimères de RCPG en général. Ces analyses structurales devraient également ouvrir de nouvelles voies pour la conception de médicaments ciblant cette famille de récepteurs qui sont aussi des cibles thérapeutiques.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGlus) sont connus pour moduler la transmission excitatrice dans le système nerveux central. Parmi ces récepteurs, ceux localisés au niveau de la pré-synapse, exercent un rôle d’autorécepteur, entrainant une diminution de la libération de glutamate à la suite de leur activation. L’étude du rôle fonctionnel de tel ou tel sous-type de mGlus est complexe compte-tenu du manque d’outils pharmacologiques sélectifs permettant de cibler spécifiquement un sous-type mGlus donné. Dans un premier temps, nous avons, par des techniques d’électrophysiologie et de fluorométrie calcique, validé de nouveaux outils pharmacologiques spécifiques de mGlu2 (un « nanobody » modulateur allostérique positif, PAM) et mGlu4 (OptoGluNAM4.1, un modulateur allostérique négatif, NAM), respectivement sur tranches d’hippocampe et de cervelet de rongeur. Nous avons ensuite, au sein du cortex cérébelleux, utilisé l’OptoGluNAM4.1 pour démontrer pour la première fois, l’implication de mGlu4 dans un contexte physio-pathologique: l’ischémie cérébelleuse. A l’aide d’outils pharmacologiques plus classiques nous avons également pu mettre en évidence, au sein des synapses qu’établissent les fibres parallèles avec les cellules de Purkinje l’existence d’un “dialogue” entre les récepteurs mGlu4 et les récepteurs A1 (récepteurs à l’adénosine de type 1), conséquence d’intéractions fonctionnelles entres les voies de signalisation de ces récepteurs présynaptiques dimériques et/ou conséquence de l’association physique de ces récepteurs au sein d’hétérodimères, fonctionnels
Metabotropic glutamate receptors (mGlus) are known to modulate excitatory transmission in the Central Nervous System. Among them, those situated at the pre-synaptic level behave like autoreceptors, their activation leading to a decrease in glutamate release. Functional studies of the different mGlus have been hampered by the lack of selective pharmacological tools specifically targeting a given subgroup of these receptors. As a first step, using electrophysiological and calcium fluorometry techniques, we validated new specific pharmacological tools acting on mGlu2 (a nanobody, positive allosteric modulator, PAM) and mGlu4 (OptoGluNAM4.1, a negative allosteric modulator, NAM) on rodent hippocampal and cerebellar slices, respectively. We then used the OptoGluNAM4.1 in the cerebellar cortex to demonstrate, for the first time, the involvement of mGlu4 in a physiopathological condition: cerebellar ischemia. Using more conventional pharmacological tools, we were also able to show the existence of a dialog between mGlu4 and A1 (Adenosine type 1) receptors at the level of the synapse between parallel fibers and Purkinje cells. Whether this dialog results from functional interactions between the signaling pathways of these pre-synaptic dimeric receptors and/or is a consequence of their physical association in heterodimers is presently under study

La schizophrénie est un trouble mental débilitant multifactoriel affectant 1 % de la population mondiale qui est caractérisé par trois classes de symptômes : les symptômes positifs (hallucinations), les symptômes négatifs (isolement social) et les déficits cognitifs (altération de la mémoire de travail). Les antipsychotiques actuels tels que les antipsychotiques typiques et atypiques, ciblant respectivement le récepteur D2 de la dopamine et le récepteur 5-HT2A de la sérotonine, sont capables de traiter efficacement les symptômes positifs et peu efficaces contre les symptômes négatifs. Le récepteur métabotropique du glutamate mGlu2 (mGluR2) continue d'attirer une attention particulière compte tenu de son implication dans la schizophrénie. En effet, ce récepteur couplé aux protéines G (RCPG) est la cible principale d'une nouvelle génération d'antipsychotiques actuellement en essai clinique qui traite efficacement les trois classes de symptômes de la schizophrénie sans pour autant entraîner d’effets secondaires notables. Néanmoins, sa signalisation dans le cerveau et ses perturbations pathologiques restent mal caractérisées. En effet, la caractérisation spécifique de la signalisation native de mGluR2 est encore difficile en raison d'une forte homologie de séquences avec mGluR3, complexifiant la production de ligands ou d'anticorps spécifiques. Nous avons tiré parti d'un anticorps monocaténaire de lama (nanocorps) ciblant spécifiquement mGluR2 afin de purifier le récepteur endogène et ses interacteurs du cortex préfrontal de souris, une région cérébrale connue pour exprimer fortement mGluR2 mais également fortement perturbée dans la schizophrénie. Cet interactome a été caractérisé par spectrométrie de masse à haute résolution (AP-MS), et les annotations bioinformatiques des ontologies de gènes de ces partenaires protéiques ont révélé une grande pertinence pour les fonctions de mGluR2. L'un de ces interacteurs s'est révélé plus qu'attractif : le récepteur aux neurotrophines TrkB. Très significatif dans notre analyse AP-MS, il a été démontré que l'ARNm de TrkB est diminué dans le tissu cérébral des patients atteints de schizophrénie par rapport aux tissus témoins. Nous avons pu déterminer que : 1) mGluR2 et TrkB interagissent spécifiquement à une faible proximité, 2) cette interaction est modulée en fonction de leur état d'activation, 3) la stimulation de mGluR2 transactive TrkB dans les neurones corticaux dans le cortex préfrontal, 4) l'activation de TrkB conduit à la modulation de l'activité canonique de mGluR2 et 5) les effets antipsychotique des agonistes de mGluR2 dans un modèle préclinique de schizophrénie sont médiés par TrkB pour le sauvetage des déficits négatifs et cognitifs. En bref, cette transactivation réciproque de mGluR2 et TrkB est prometteuse puisque TrkB s’avère avoir un rôle central dans la médiation des effets antipsychotiques des ligands de mGluR2 dans les symptômes résistants jusqu'alors
Schizophrenia is a multifactorial debilitating mental disorder affecting 1 % of the world population characterized by three classes of symptoms: positive symptoms (e.g. hallucinations), negative symptoms (e.g. social isolation) and cognitive deficits (e.g. impaired working memory). Current antipsychotics such as typical and atypical antipsychotics, targeting dopamine D2 receptor and serotonin 5-HT2A receptor respectively, are able to treat efficiently the positive symptoms and partially the negative symptoms. However, antipsychotics treating efficiently the three classes of symptoms is still an unmet need. The metabotropic glutamate mGlu2 receptor (mGluR2) keeps on attracting particular attention given its implication in schizophrenia. This G protein-coupled receptor (GPCR) is the main target of a new generation of antipsychotics currently under clinical trial, treating efficiently the three class of symptoms without displaying any side effects. However, mGluR2 signaling in the brain and its pathological disturbances remain poorly characterized. Specific characterization of mGluR2 signaling in the brain was previously challenging due to a high homology of sequences with the structurally close metabotropic glutamate mGluR3 receptor, which complicated the production of specific ligands or antibodies. We have taken advantage of a single lama chain antibody (nanobody) specifically targeting mGluR2 in order to purify the endogenous receptor and its interacting proteins from mouse prefrontal cortex, a brain region known to strongly express mGluR2 but also highly disturbed in schizophrenia. This interactome was characterized by high resolution mass spectrometry and bioinformatics annotations of the gene ontologies of the candidate protein partners revealed high relevance to mGluR2 functions. One of these interactors revealed to be very attractive: the receptor tyrosine kinase TrkB. Highly significant in our AP-MS analysis, the mRNA of this rec eptor tyrosine kinase has been shown to be decreased in the brain tissue of patients with schizophrenia in comparison to control tissues. We were able to decipher that: 1) mGluR2 and TrkB interact specifically, 2) this interaction is modulated by the conformational state of both receptors, 3) mGluR2 stimulation by its agonist transactivates TrkB in cortical neurons in the prefrontal cortex, 4) the activation of TrkB leads to the modulation of the canonical activity of mGluR2 and 5) the antipsychotic-like effects of mGluR2 agonists in preclinical model of schizophrenia are mediated by TrkB for negative and cognitive deficits rescue. In summary, this reciprocal transactivation of mGluR2 and TrkB is highly promising and might have a pathophysiological influence in psychosis such as schizophrenia, but most importantly, TrkB has a pivotal role in mediating the antipsychotic-like effect of mGluR2 ligand for symptoms resisting so far to current antipsychotics

L'épilepsie affecte des millions de patients dans le monde. Les traitements disponibles sont symptomatiques, ils per récepteur mGlu7 du glutamate dans la modulation non seulement de l’excitabilité, mais également de l'hypersynchronisation des réseaux de neurones, deux facteurs cruciaux dans les crises d'épilepsie. J'ai parachevé ces découvertes qui ont été à l’origine d’une première publication (Tassin, Girard et al. 2016).A l’aide d’un nouvel agoniste du récepteur mGlu7, le LSP2-9166, lors de ma thèse j'ai ensuite étudié l’impact de ce récepteur dans différents modèles d’épilepsie chez la souris. Deux modèles complémentaires ont été utilisés : le kindling (embrasement), modèle chimique induit par le pentylènetétrazol (PTZ) qui sensibilise le cerveau jusqu’à générer des crises tonico-cloniques généralisées, et l’injection intra-hippocampique de kainate, mimant l’épilepsie mésiale du lobe temporal chez l'homme.Dans un premier temps j'ai observé une atténuation de la progression de la sévérité des crises dans le modèle de kindling au PTZ, sous l’activation du récepteur mGlu7. Cet effet a été corrélé à une inflammation, et une activation microgliale et astrocytaire plus faibles. Dans le modèle d’injection intra-hippocampique de KA, considéré comme pharmaco-résistant, l’activation du récepteur mGlu7 pendant la période d’épileptogenèse a augmenté la durée des périodes interictales et diminué la durée des crises ainsi que la réorganisation neuronale. Une fois les crises chroniques installées, l’activation aigu du récepteur mGlu7 a diminué le nombre de crises aussi fortement que le diazépam couramment utilisé dans le cadre clinique. Pour finir, des injections chroniques de LSP2-9166 chez des animaux naïfs (non épileptiques) n’engendrent pas de déficit cognitif ou comportemental détectables, ni de modification du niveau d’ARNm du récepteur mGlu7. L’activation du récepteur mGlu7 offre donc une cible stratégique dans nos deux modèles.Ces travaux permettent une meilleurmettent de traiter les crises sans pour autant éviter la progression de la maladie et présentent de lourds effets secondaires. La découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux composés reste primordiale pour dépasser les limites des stratégies thérapeutiques actuelles. Au début de ma thèse, des études précédentes avaient montré une implication due compréhension du rôle du récepteur mGlu7 dans l’épileptogenèse. Ils participent ainsi à la recherche de futurs traitements. antiépileptiques adéquats
Epilepsy affects millions of patients worldwide. The available treatments are symptomatic, they treat seizures without preventing the progression of the disease and have heavy side effects. The discovery of new therapeutic targets and new compounds is therefore essential to overcome the limitations of current therapeutic strategies. Previous studies have demonstrated substantial involvement of the mGlu7 receptor in modulating not only excitability but also hypersynchronization of neural networks, two crucial factors affecting epileptic seizures. These discoveries were at the origin of a first publication that I completed at the beginning of my thesis (Tassin, Girard et al., 2016).Using a new mGlu7 receptor agonist, LSP2-9166, in my thesis I then studied the impact of this receptor in different epilepsy models in mice. Two complementary models were used: kindling, a chemical model induced by pentylenetetrazol (PTZ) which sensitizes the brain to induce generalized tonic-clonic seizures, and intra-hippocampal injection of kainate, mimicking mesial temporal lobe epilepsy in humans.At first, I observed an attenuation of the progression of the seizures severity in the PTZ kindling model, under the activation of the mGlu7 receptor. This effect was correlated with weaker inflammation, and microglial and astrocytic activation. In the intra-hippocampal injection model of KA, considered as drug-resistant, activation of the mGlu7 receptor during the epileptogenesis period increased the duration of interictal periods and decreased the duration of seizures as well as neuronal reorganization. Once chronic seizures were established, acute activation of the mGlu7 receptor decreased the number of seizures as strongly as diazepam, commonly used in clinical settings. Finally, chronic injections of LSP2-9166 into naive (non epileptic) animals do not generate any detectable cognitive or behavioral deficits or changes in mGlu7 receptor mRNA level. The activation of the mGlu7 receptor thus presents a strategic target in our two models.This work provides a better understanding of the role of the mGlu7 receptor in epileptogenesis. It participates in the search for future more adequate treatments

Dans certaines aires cérébrales, l’action synergique du glutamate et de la dopamine est nécessaire pour induire et maintenir la plasticité synaptique. Un dialogue fonctionnel entre le récepteur métabotropique du glutamate mGlu5 et le récepteur de la dopamine D1 a été mise en évidence. Par ailleurs, de nombreuses études ont démontré que les récepteurs couplés aux protéines G ont la capacité de former des hétéromères créant ainsi de nouvelles entités fonctionnelles. En s’appuyant sur l’hypothèse d’une hétéromérisation des récepteurs, l’objectif de ce projet de thèse était d’étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent une synergie fonctionnelle entre les récepteurs mGlu5 et D1. Dans la première partie de ce travail, j’ai caractérisé les bénéfices de la Nanoluciférase, une luciférase très lumineuse, pour améliorer la technique de BRET en imagerie (Bioluminescence Resonance Energy Transfer imaging) qui permet d’étudier la dynamique des interactions entre protéines dans les cellules vivantes. Les bénéfices mis en évidence en termes de résolution spatio-temporelle, de stabilité et de sensibilité du signal ont été exploités pour la suite de ce projet. Dans la seconde partie de ce travail, les améliorations techniques mentionnées ci-dessus ont permis de mettre en évidence pour la première fois des hétéromères mGlu5/D1 dans des neurones en culture. En outre, nous avons montré que la co-expression des récepteurs mGlu5 et D1 en système hétérologue favorise la signalisation calcique, d’une part en augmentant l'activité constitutive de mGlu5 et, d’autre part, en créant une voie de libération du calcium intracellulaire atypique induite par l'agoniste D1.Ces résultats apportent de nouveaux éléments de compréhension des bases moléculaires du dialogue fonctionnel glutamate/dopamine dans le contrôle de la communication neuronale en conditions physiologiques et ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de moduler sélectivement la fonction des hétéromères
In some specific brain areas, synergism between glutamate and dopamine transmission is required to induce synaptic plasticity. Metabotropic glutamate receptor mGlu5 and dopamine receptor D1 are both known to control synaptic plasticity. Moreover, multiple lines of evidence converge toward the ability of G-protein coupled receptors to form dynamic heteromers thereby creating new entities with unique properties. Focusing on the hypothesis of receptor heteromerization, my PhD project aimed at investigating the molecular mechanisms underlying a functional interplay between mGlu5 and D1 receptors.To address this issue, a first part of this work consisted in improving single-cell Bioluminescent Resonance Energy Transfer (BRET) imaging, a technology enabling to study real time protein-protein interaction dynamics in living cells. Using the Nanoluciferase, an extremely bright luciferase, we characterized a faster and higher resolution single-cell BRET imaging technique with unprecedented performance in terms of temporal and spatial resolution, duration of signal stability and signal sensitivity. In the second part of this project, we showed that mGlu5 and D1 can form heteromers in heterologous expression system. The above-mentioned improvements of single-cell BRET imaging technique allowed to evidence the occurrence and the dynamics of mGlu5/D1 heteromers in cultured primary neurons. Furthermore, our results showed that the co-expression of mGlu5 and D1 receptors modifies single receptor properties to favor calcium signaling by increasing mGlu5 constitutive activity and creating a D1 agonist-induced activation of Ca2+ release from intracellular stores.These findings advance our knowledge about the molecular basis of the glutamate/dopamine functional dialogue to control neuronal communication in physiological conditions. Further investigation will help the dissection of the mGlu5/D1 heteromer specific signaling pathway with the hope of defining new therapeutics that may selectively modulate heteromer function and thus bypass undesirable side effects

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Il agit notamment sur huit récepteurs métabotropiques (mGluR) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) responsables de la modulation de la transmission synaptique. Les mGluR constituent des cibles de choix pour le traitement de maladies neurologiques, psychiatriques et neurodégénératives comme la schizophrénie, la dépression, ou la maladie de Parkinson. Aucun médicament agissant sur les mGluR n'existe à l'heure actuelle, mais plusieurs molécules sont en phase clinique pour différentes pathologies. L'objectif principal de mon travail de thèse a été d'étudier la dynamique structurale des mGluR, pour lesquels le mécanisme moléculaire d'activation reste mal connu. Ces récepteurs forment des homodimères constitutifs, dont chaque sous-unité possède un grand domaine extracellulaire qui lie le glutamate et un domaine transmembranaire responsable de l'activation des protéines G et où se fixent des modulateurs allostériques synthétiques. Une des étapes clé de l'activation serait la réorientation relative des deux domaines extracellulaires induite par le glutamate au sein du dimère. En développant tout d'abord une stratégie de marquage orthogonale des sous-unités de mGlu par fusion avec des enzymes suicide (SNAP-/CLIP-tag) combinée à une technique de transfert d'énergie par résonance de type Förster en temps résolu (TR-FRET), nous avons montré qu'en système hétérologue, les mGluR peuvent s'associer sous forme d'hétérodimères fonctionnels. De plus, nos expériences ont révélé une spécificité d'association au sein de la famille des mGluR : les sous-unités mGlu du group I, mGlu1 et mGlu5, peuvent former des hétérodimères entre elles, mais pas avec celles du groupe II et III, qui elles peuvent toutes s'associer entre elles. Puis nous avons fait évoluer la technologie précédente pour développer le premier biosenseur conformationnel de l'activation des mGluR. Nous avons ainsi identifié sur cellules vivantes les changements conformationnels nécessaires à l'activation du récepteur, et démontré que la variation de signal de FRET entre les deux sous-unités au sein du dimère correspondant au réarrangement relatif des domaines externes est corrélée avec l'état d'activation du récepteur. Nous avons ainsi confirmé le modèle d'activation des mGluR initialement proposé à partir des premières structures cristallines des domaines extracellulaires isolés. D'autre part, ce senseur permet de discriminer facilement les agonistes partiels des agonistes complets, et permet de mieux comprendre les mécanismes allostériques régulant l'activité au sein des mGluR (notamment le mode d'action des modulateurs allostériques positifs et négatifs qui se lient dans le domaine membranaire). Cette stratégie de senseurs conformationnels a également pu être appliquée à l'étude d'autres récepteurs membranaires (RCPG et récepteurs tyrosines kinases), et au développement de tests de criblage à haut débit. Enfin, nous nous sommes attachés à développer de nouveaux types de molécules ciblant les mGluR, en utilisant des anticorps simple domaine provenant de lamas. Ces ligands qui agissent sur de nouveaux sites d'activation à la surface des mGluR, représentent de nouvelles pistes pour développer de meilleures solutions thérapeutiques
Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in the central nervous system. It notably acts on eight metabotropic glutamate receptors (mGluR), which are G protein coupled receptor responsible for the modulation of synaptic transmission. mGluRs are promising pharmacological targets to treat neurological, psychiatric or neurodegenerative diseases such as depression, schizophrenia or Parkinson's disease. Unfortunately, so far, no drug acting at mGluR is accessible to patients, but several molecules are in clinical trials. The main objective of my thesis has been the study of the structural dynamics of mGluR, for which the molecular mechanism allowing activation are still poorly understood. These receptors are known to form constitutive dimers, with each subunit composed of a large extracellular domain which bind glutamate and a transmembrane domain responsible for G protein activation and where synthetic allosteric modulators bind. A key step in the activation process could be the relative reorientation of the two extracellular domains in the dimer upon glutamate binding. We first developed an orthogonal labeling method of each mGlu subunits by fusion with a suicide enzyme (SNAP-/CLIP-tag) that we combined with time-resolved Förster resonance energy transfer measurements to show that in a heterologous system, mGlu subunits can associate as strict and functional heterodimers. Our experiments also revealed a specific association pattern: mGlu subunits from group I, mGlu1 and mGlu5, can associate with each other, but not with those from group II and III, which can also associate with each other. Then we improved the technology to develop the first conformational sensor to monitor mGluR activation. We were able to monitor in real time in live cells the conformational changes occurring in the mGlu receptor upon activation, and we proved that the variation in FRET signal is correlated with the activation state of the receptor. This allowed us to confirm the activation model proposed based on the crystal structures of the isolated extracellular domains, which consist of a relative movement of the dimer extracellulair domains upon activation. Moreover, this sensor makes it possible to easily discriminate between full and partial agonists, and to better understand the allosteric mechanisms occurring in the mGluR (especially the action mode of positive and negative allosteric modulators binding in the transmembrane domain). This conformational sensor strategy was further applied to study the activation of other receptors (GPCR or tyrosine kinase receptors), and to develop screening assays compatible with high-throughput formats. Finally, we developed innovative ligands acting on mGluRs using single-domain antibodies from llamas. These activating ligands seem to bind to a new site on the surface of the receptor, offering new possibilities to develop better treatment acting at mGluRs

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui constituent près d'1% du génôme humain. Ils disposent de sept segments transmembranaires, mais définissent aussi une nouvelle famille de RCPG, la famille 3, distincte des familles 1 et 2 des récepteurs de la rhodopsine ou du glucagon. Les mGluR, qui sont au nombre de huit chez l' homme, présentent en effet quelques singularités. Ces protéines possèdent en particulier un large domaine extracellulaire dans lequel se fixe leur ligand, le glutamate. Grâce à de faibles homologies de séquences identifiées entre ce domaine et des protéines périplasmiques bactériennes, LIVBP, LBP (Leucine /Isoleucine /Valine Binding Protein et Leucine Binding Protein), un modèle de ce domaine a donc été construit par modélisation par homologie et une caractérisation plus précise des sites de liaison des mGluR a été réalisée. .
Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) belong to the G-Protein-Coupled-Receptors (GPCR) superfamily that constitute about 1% of human genome. They own seven transmembranar domains, but are distinct from GPCRs of family 1 (rhodopsin-like receptor family) or family 2 (glucagon-like receptor family). In fact, the eight human mGluRs form a new GPCR family , family 3 and display a few singularities. For example, these proteins possess a large extracellular domain, which binds the natural ligand glutamate. According to low sequence homologies detected between this domain and bacterial periplasmic proteins, LIVBP, LBP (Leucine/Isoleucine/Valine Binding Protein and Leucine Binding Protein), a structural model of this domain has been built by homology modeling and the glutamate binding site of mGluRs has been identified. Structurally, this domain folds into two lobes that open and close as a clamshell. Functionnally, this study led us to conclude that the the closure of the two lobes, which is stabilized by glutamate fixation, is necessary for mGluR activity. .

Ces cinquante dernières années ont été marquées par la percée des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. À ce jour, il existe uniquement des traitements symptomatiques. De plus, face à cette maladie multifactorielle, il apparaît donc nécessaire d’identifier et d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques. Parmi elles, le récepteur à l’adénosine A2A (A2AR) a fait l’objet de nombreuses études ces dernières années. En effet, ses antagonistes tels que la caféine ont montré de nombreux effets bénéfiques en permettant d’améliorer les performances cognitives par une diminution des dépôts amyloïdes et de la phosphorylation de la protéine Tau. Bien que plusieurs antagonistes d’A2AR aient atteint les phases cliniques, les efforts actuels sont maintenant dirigés vers le développement de nouveaux antagonistes avec de meilleures propriétés ADME. D’autre part, le récepteur métabotropique au glutamate 5 (mGluR5) et ses modulateurs allostériques négatifs jouent un rôle important dans les conditions physiopathologiques associées à la maladie d’Alzheimer. En effet, il a été montré que bloquer l’activité d’mGluR5 entraîne une diminution de la neurotoxicité et de la synaptoxicité du peptide amyloïde in vitro mais aussi in vivo. Basées sur des études de modélisation moléculaire, nous avons développé deux nouvelles familles d’antagonistes présentant un hétérocycle central quinazolinique et benzofuranique. Par la suite, nous avons mis en place une stratégie de ligands duaux ciblant de manière conjointe les récepteurs A2A et mGlu5. Les relations structure-affinité autour de ces deux hétérocycles nous ont permis d’identifier des composés d’affinité nanomolaire pour le récepteur A2A. Les travaux ont également conduit à l’obtention d’une nouvelle structure co-cristallisée. Parmi les composés développés, certains présentent une affinité micromolaire pour le récepteur mGlu5
The past fifty years have been marked by the breakthrough of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s. Unfortunately, only symptomatic treatments are available. Furthermore, facing this multifactorial disease, the search for new and innovative therapeutic targets becomes a major challenge. Among these targets, the adenosine A2A receptor (A2AR) has been the subject of much research in recent years. Indeed, it has been shown that A2AR antagonists such as caffeine improve memory performance as it reduces β-amyloid deposits and Tau-phosphorylation. Though several A2AR antagonists have reached clinical trials, current research efforts are focused on developing new antagonists with relevant ADME properties. On the other hand, negative allosteric modulators of the metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) also play an important role in the pathological conditions associated with Alzheimer’s disease. It has been found that blocking the activity of mGlu5 reduces the neurotoxicity and synaptoxicity of the amyloid peptide in vitro but also in vivo. Based on a molecular modeling-guided design, we developed new A2AR antagonists with quinazoline and benzofuran as central scaffold and a dual ligands strategy targeting both A2A and mGlu5 receptors. Hit-to-lead optimization has led to nanomolar affinity compounds for A2AR and a new co-crystallized structure. Among them, some hit compounds have been identified with micromolar affinities towards mGluR5

Les douleurs chroniques et notamment les douleurs neuropathiques sont particulièrement difficiles à traiter par les solutions thérapeutiques actuellement disponibles. Par conséquent, il existe un besoin crucial de découvrir et d'exploiter de nouveaux concepts d'antalgiques afin de traiter ce type de douleurs. Parmi les différentes pistes possibles, le système glutamatergique semble particulièrement intéressant puisque le glutamate est le principal neurotransmetteur propageant l'information douloureuse. Notre hypothèse est que l'activation du récepteur mGlu4 spinal inhiberait la neurotransmission glutamatergique et réduirait donc l'excès de douleur observé lors de douleurs chroniques. Grâce notamment au développement du premier agoniste orthostérique sélectif de mGlu4, nous avons mis en évidence que le récepteur mGlu4 n'altère pas la perception de la douleur aiguë mais qu'il influe, au contraire, sur l'aspect pathologique de la douleur en inhibant l'allodynie et l'hyperalgie mécanique ou thermique présentes lors de douleurs chroniques. Nous montrons que la modulation de l'hypersensibilité par mGlu4 semble provenir de sa capacité à inhiber la transmission glutamatergique via un couplage négatif avec les canaux calciques de type N au niveau de la couche II de la moelle épinière et plus particulièrement au niveau des fibres exprimant le transporteur vésiculaire VGLUT3. L'ensemble de nos résultats permettent de valider le récepteur mGlu4 spinal comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement des douleurs chroniques. En effet, les agonistes de mGlu4 pourraient être des antalgiques puissants et sélectifs des douleurs pathologiques
Chronic pain and in particular neuropathic pain are particularly difficult to treat by therapeutic options currently available. Therefore, it is a crucial to develop new concepts of analgesics to treat this type of pain. Among the various possibilities, targeting the glutamatergic system seems to be particularly interesting since glutamate is the main neurotransmitter propagating the pain information. Our hypothesis is that the activation of spinal mGlu4 receptor would inhibit the spinal glutamatergic neurotransmission and would thus reduce the excess of pain observed in chronic pain.Thanks to the development of the first orthosteric agonist selective for mGlu4 and the use of transgenic animals, we demonstrated that mGlu4 receptor does not alter the perception of acute pain but that it does affect the pathological aspect of pain by inhibiting the allodynia and the hyperalgesia (mechanical and thermal) usually observed in chronic pain. We show that the mGlu4 modulation of the hypersensitivity seems to result from the ability of the receptor to inhibit the glutamatergic transmission through a negative coupling with N-type calcium channels in the lamina II of the spinal cord and especially at the level of fibers expressing the vesicular transporter VGLUT3. Taken together, our results validate spinal mGlu4 as a potential therapeutic target for the treatment of chronic pain. Indeed, mGlu4 agonists could be potent and selective painkillers of pathological pain

Les récepteurs 5-HT2A de la sérotonine et mGlu2 du glutamate suscitent un grand intérêt vu la dérégulation des deux récepteurs observée dans la schizophrénie et leur statut de cibles des antipsychotiques dits atypiques et de nouvelle génération, respectivement. Même si les antipsychotiques atypiques ciblant le récepteur 5-HT2A ont montré une efficacité contre les symptômes positifs, leur effet reste très limité contre les symptômes négatifs et cognitifs, et leurs effets secondaires nombreux. Depuis les années 1990, une nouvelle classe d’antipsychotiques ciblant le système glutamatergique, en particulier le récepteur mGlu2, est en développement. Les tests cliniques n’ont montré leur efficacité que pour les patients n’ayant pas été traités auparavant par des antipsychotiques atypiques. Ceci suggère une interaction fonctionnelle forte entre les récepteurs 5-HT2A et mGlu2 dans le mode d’action de ces deux classes d’antipsychotiques. De plus, plusieurs études ont démontré l’existence d’un hétéromère des deux récepteurs dans le cortex préfrontal qui semble important pour la réponse aux hallucinogènes et aux antipsychotiques ciblant l’un ou l’autre récepteur. Ainsi, étant donné l’impact du profil de phosphorylation adopté par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sur leur fonction, j’ai caractérisé au cours de ma thèse l’impact de la co-expression du récepteur 5-HT2A sur le profil de phosphorylation du récepteur mGlu2 en réponse à différentes stimulations. Parmi les 5 sites de phosphorylation identifiés, la phosphorylation de la Ser843 est potentialisée en réponse à la stimulation par un agoniste du récepteur mGlu2 uniquement lorsque le récepteur 5-HT2A est co-exprimé. Ces résultats ont été validés grâce à la génération d’un nouvel anticorps dirigé spécifiquement contre la forme phosphorylée de la Ser843 sur culture cellulaire HEK-293 et in vivo dans le cortex préfrontal de souris, région où les deux récepteurs sont co-exprimés. Des études fonctionnelles ont démontré que la phosphorylation de la Ser843 est nécessaire à la potentialisation de l’activité Gi/o du récepteur mGlu2 en réponse à ses agonistes et constitue un cross-talk fonctionnel entre les deux récepteurs puisque les agonistes du récepteur 5-HT2A stimulent également la phosphorylation de la Ser843 du récepteur mGlu2. Ainsi, mes résultats de thèse ont permis d’identifier la phosphorylation du récepteur mGlu2 sur la Ser843 comme un événement moléculaire clé du cross-talk fonctionnel avec le récepteur 5-HT2A et apporte un élément important dans la compréhension du mode d’action des antipsychotiques atypiques et de nouvelle génération
The serotonin 5-HT2A and glutamate mGlu2 receptors keep on attracting particular attention given their implication in psychosis associated with schizophrenia and in the mechanism of action of atypical antipsychotics and of a new class of antipsychotics, respectively. Though atypical antipsychotics, targeting 5-HT2A receptor, are efficient against positive symptoms, these drugs do not act against negative, cognitive symptoms and display many side effects. Since the 90’s, new classes of antipsychotics triggering glutamatergic system, in particular mGlu2 receptor, have been developed. Their clinical trials have shown efficacy only in patients who have not been previously treated with atypical antipsychotics. This suggests a strong interaction between 5-HT2A and mGlu2 receptors in the mechanism of action of both classes of antipsychotics. Moreover, a large body of evidence indicates the presence, in prefontal cortex, of 5-HT2A/mGlu2 heteromer that is important for the response to hallucinogens and antipsychotics targeting one receptor or the other. Thus, in view of the importance of the phosphorylation profile adopted by G-protein coupled receptor (GPCR) on their activity, I characterized the impact of 5-HT2A receptor co-expression on the phosphorylation profile of mGlu2 receptor in response to various stimulations. Among the five identified phosphorylated residues, the phosphorylation of Ser843 increases upon mGlu2 receptor stimulation only when the 5-HT2A receptor is co-expressed. A new antibody against the phosphorylated form of Ser843 confirmed these results in HEK-293 cells and in mouse prefrontal cortex, area where both receptors are co-expressed. Functional studies demonstrated that Ser843 phosphorylation is necessary to enhance Gi/o signaling of mGlu2 receptor and constitutes a functional crosstalk between 5-HT2A and mGlu2 receptor since 5-HT2A receptor agonists also stimulate Ser843 phosphorylation. Collectively, my thesis findings identify mGlu2 receptor phosphorylation at Ser843 as a key molecular event of the functional crosstalk with 5-HT2A receptor that might be critical to understand the mechanism of action of atypical and potential future antipsychotics treatments