Добірка наукової літератури з теми "Spectroscopie de corrélation de fluorescence (SCF)"

Les techniques de fluorescence de molécule individuelle permettent de suivre la dynamique moléculaire et les interactions dans les processus biologiques. Maintenant, la dynamique moléculaire des protéines est principalement accompagnée du marquage fluorescent externe. Cependant, une molécule attachée peut perturber la dynamique de protéines. Heureusement, la majorité des protéines contiennent le tryptophane ou la tyrosine qui absorbent et émettent la lumière dans le domaine spectral d'UV entre 260 nm et 400 nm. Ces acides aminés ont de basses efficacités quantiques, photostabilisées dans l'UV et la section efficace d'absorption, qui gênent la détection des protéines individuelles. Afin d'atteindre la sensitivité de l'auto fluorescence UV des protéines individuelles, nous développons un microscope confocal UV à la résolution temporelle avec les lasers de 266 nm et 295 nm. Nous quantifions la sensitivité de détection et l'effet des techniques de photostabilisation sur l'autofluorescence des protéines. La spectroscopie de corrélation de fluorescence (SCF) et les mesures de time-correlated single photon counting (TCSPC) fournissent des informations quantitatives du volume de détection, de l'amélioration de fluorescence (AF), et de la photokinétique accélérée des molécules émettant à la présence et à l'absence des nanostructures d'aluminium (Al). En utilisant le p-terphenyl, nous optimisons les nanostructures plasmoniques d'Al afin d'améliorer la fluorescence. Sous certaines conditions, le confinement de la lumière et l'AF dans les structures d'Al permettent d'appliquer la plasmonique UV pour la détection des protéines individuelles de beta-galactosidase sans marquage
Single molecule fluorescence techniques enable to monitor the molecular dynamics and interactions in the biological processes. Nowadays, the molecular dynamics of proteins is principally accompanied by external fluorescent labeling. However, an attached molecule might perturb the protein dynamics. Fortunately, a vast majority of proteins contain tryptophan and tyrosine that absorb and emit light in the UV range of 260-400 nm. These intrinsically fluorescent amino acids yield limited absorption cross-section, quantum yield, and photostability in the UV range, which hampers single protein UV autofluorescence detection. In order to reach single molecule sensitivity of protein UV autofluorescence, we develop a time-resolved UV confocal microscope with 266 nm and 295 nm excitations and the detection optics in the near UV. Based on the total fluorescence time traces, we quantify the single molecule sensitivity, the effect of photostabilization techniques on the protein autofluorescence. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and time-correlated single photon counting (TCSPC) measurements provide quantitative information on the detection volume, the fluorescence enhancement factors, and the accelerated photokinetics of the UV emitting molecules in the presence and absence of the aluminum (Al) nanostructures. Using p-terphenyl as a bright UV emitting molecule, we optimize the Al plasmonic nanostructures to enhance the single molecule fluorescence. Under certain conditions, the light confinement and fluorescence enhancement in the aluminum nanostructures enable to apply the UV plasmonics for the single molecule detection of label-free beta-galactosidase protein

Le but initial de ce travail de thèse est de proposer une technique (basée sur la Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS) pour améliorer la sensibilité dans la discrimination de deux molécules ayant des constantes de diffusion proches. C'est dans ce contexte que nous avons étudié la FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy). A défaut d'améliorer la sensibilité de la Spectroscopie à Correlation de Fluorescence nous avons proposé trois géométries de FCCS pour élargir le champ d'application de la corrélation de fluorescence.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permet d’étudier la dynamique d’objets fluorescents. En particulier, elle est parfaitement adaptée à l’étude de la diffusion moléculaire. Ainsi, elle s’est avérée efficace pour étudier la diffusion de la Rhodamine-6G au voisinage d’une interface dont l’hydrophobicité est contrôlée. L’utilisation de surface possédant des degrés d’hydrophobicité croissants nous a permis de montrer que la rhodamine-6G est fortement attirée par les surfaces hydrophobes. Une étude de la fluidité de la membrane plasmique de cellules vivantes a également été menée. Elle a porté sur le phénomène de résistance multiple des traitements anticancéreux. La fluidité membranaire d’une lignée cellulaire résistante apparaît plus hétérogène que celle de la lignée sensible. L’effet d’un fluidifiant ainsi que de deux révertants nous ont permis de révéler l’existence de « domaine » membranaire corrélé à la présence d’une protéine à l’origine de la résistance. Enfin, un développement instrumental basé sur le FRET a été proposé afin de réduire fortement l’élongation axiale du volume d’observation. Grâce à une fonctionnalisation de la surface et un marquage membranaire spécifique, les points d’adhésion cellulaire ont été mis en évidence par imagerie, nous permettant de réaliser des premières mesures locales de FCS
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is used to probe the dynamic of molecular dyes. In particular, FCS is well adapted to investigate diffusion processes. Thus, such spectroscopic approach was suitable to study the diffusion of rhodamine-6G near a controlled interface in term of hydrophobicity degree. Finally, we have shown that rhodamin-6G is strongly attracted by hydrophobic surfaces. A study of membrane fluidity in living cells has also been conducted. It related to the multidrugs resistance (MDR) phenomena in cancer research. So, we clearly reveal the higher heterogeneity of plasma membrane in MDR cells in comparison with the sensitive ones. The effect of specific and non specific membrane agents allowed us to display the presence of distinct membrane “domain” linked to the resistance. Finally, an instrumental development based on FRET was proposed in order to strongly reduce the axial elongation of the confocal volume. Through a surface functionalization and an appropiate plasma membrane labelling, we have highlighted cell adhesion on surfaces, which enabled us to perform first local FCS measurements on cells

La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en œuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées cellulaires (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues. Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression de la P-glycoprotéine, protéine responsable d'un phénomène de résistance à la chimiothérapie. Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses, chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la Doxorubicine. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour l'utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l'imagerie de l'adhésion cellulaire
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed over-view of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug: the Doxorubicin. Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert. This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric scale. We demonstrate its potential through two applications: FCS in micromolar solutions and fluorescence imaging on cells adhesion areas

La détection de molécules individuelles fluorescentes est souvent limitée par deux problèmes : la collection des photons et la définition de la taille du volume d'observation. Dans le cadre de la Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS), nous montrons qu'un miroir, placé au niveau du point focal de l'objectif, permet : (i) une exaltation du nombre de photons collectés par molécule fluorescente et (ii) une restructuration du volume d'observation confocal par des franges d'interférences. D'abord validée à l'aide de nanosphères fluorescentes, cette méthode est mise en œuvre avec des molécules d'intérêt biologique en solution. Nous montrons numériquement, qu'au contraire de la FCS standard, cette nouvelle technique est adaptée à la mesure de coefficients de diffusion dans des structures confinées de taille similaire à la longueur d'onde d'excitation. Enfin, nous confirmons cela par l'étude de la diffusion de protéines fluorescentes, confinées dans le cytoplasme de bactéries
Single fluorescent molecule detection is often resrtricted by two problems : photon collection and size definition of the observation volume. In Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), we show that a mirror located at the objective focal point enables : (i) to enhance the collected photon number per fluorescent molecule, and (ii) to reshape the confocal volume with interference fringes. This new technique is firstly checked for fluorescent nanospheres, then for molecules of biological interest. We show numerically that this technique is well suitable for measuring diffusion coefficients in confined wavelength-sized structure. Finally, we confirm these results by studying fluorescent proteins diffusion in bacteria cytoplasm

Le noyau d'une cellule est hétérogène par sa structure et son activité et beaucoup de ses composants interagissent de façon dynamique. Lors de l'étude de processus cellulaires comme la réponse au stress thermique, des expériences classiques de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui sont habituellement limitées à un seul volume d'observation, n'apportent que des résultats partiels à cause des informations spatiales manquantes. Ce mémoire de thèse présente une nouvelle technique de FCS multi-confocale (mFCS) qui permet des mesures FCS simultanées à différents endroits d'une cellule. La technique est basée sur l'emploi d'un modulateur spatial de lumière pour la création de plusieurs volumes d'observations distincts et d'une caméra ''electron-multiplying'' CCD (EMCCD) pour la détection en parallèle. La résolution spatiale ainsi que la sensibilité du système mFCS sont proches de celles d'un système FCS classique et en utilisant un mode d'acquisition particulier une résolution temporelle de $14mu s$ a pu être atteinte. La technique mFCS est appliquée à l'étude de la réponse cellulaire au stress thermique en observant le facteur de transcription heat shock factor 1 (HSF1), qui est un régulateur clé de la réponse au stress thermique. Des mesures mFCS dans des cellules vivantes révèlent des changements dans la dynamique de HSF1 pendant le choc thermique. Ces changements concernent l'affinité ainsi que l'homogénéité spatiale des interactions avec l'ADN. En outre, nous avons également évalué les performances d'une caméra CMOS-SPAD et testé le dispositif en tant que capteur alternatif pour la mFCS en cellules vivantes.

Le noyau d'une cellule est hétérogène par sa structure et son activité et beaucoup de ses composants interagissent de façon dynamique. Lors de l'étude de processus cellulaires comme la réponse au stress thermique, des expériences classiques de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui sont habituellement limitées à un seul volume d'observation, n'apportent que des résultats partiels à cause des informations spatiales manquantes. Ce mémoire de thèse présente une nouvelle technique de FCS multi-confocale (mFCS) qui permet des mesures FCS simultanées à différents endroits d'une cellule. La technique est basée sur l'emploi d'un modulateur spatial de lumière pour la création de plusieurs volumes d'observations distincts et d'une caméra ``electron-multiplying'' CCD (EMCCD) pour la détection en parallèle. La résolution spatiale ainsi que la sensibilité du système mFCS sont proches de celles d'un système FCS classique et en utilisant un mode d'acquisition particulier une résolution temporelle de $14mu s$ a pu être atteinte. La technique mFCS est appliquée à l'étude de la réponse cellulaire au stress thermique en observant le facteur de transcription heat shock factor 1 (HSF1), qui est un régulateur clé de la réponse au stress thermique. Des mesures mFCS dans des cellules vivantes révèlent des changements dans la dynamique de HSF1 pendant le choc thermique. Ces changements concernent l'affinité ainsi que l'homogénéité spatiale des interactions avec l'ADN. En outre, nous avons également évalué les performances d'une caméra CMOS-SPAD et testé le dispositif en tant que capteur alternatif pour la mFCS en cellules vivantes
The cell nucleus is heterogeneous in its structure and activity and many of its components are in dynamic interactions with each other. When investigating the cellular response to an external signal, such as heat shock, standard fluorescence correlation spectroscopy (FCS) experiments, which are limited to one observation volume, do only give partial results because of the missing spatial information. This work introduces a novel multi-confocal FCS (mFCS) technique that allows simultaneous FCS measurements in different locations within a cell. It is based on the use of a spatial light modulator (SLM) to create several distinct observation volumes at a time and an electron-multiplying charge coupled device (EMCCD) camera to perform parallel detection. The spatial resolution as well as the sensibility of the mFCS system are close to that of a classical FCS setup and using a special readout mode, a temporal resolution of $14mu s$ is reached. The mFCS technique is applied to study the cellular response to thermal stress by monitoring the transcription factor heat shock factor 1 (HSF1), which is a key regulator of the heat shock response. mFCS experiments in living cells reveal changes in the dynamics of HSF1 upon heat shock. These changes concern the affinity as well as the spatial homogeneity of its interactions with DNA. Additionally, the performance of a CMOS-SPAD camera, consisting of an array of single photon avalanche diodes, is evaluated and the device is tested as an alternative detector for mFCS in living cells

Des études préliminaires ont été menées sur un modulateur plasmonique pour des applications télécoms et sur un réseau de nanopointes recouvertes d'or pour des applications biomédicales. Nous proposons d'utiliser des modulateurs plasmoniques tout optique basés sur des nanoparticules métalliques déposées sur des films métalliques minces afin d'assurer la conversion des signaux électriques en signaux optiques par variation de l'intensité de la lumière transmise. L'originalité de ce projet provient de l'utilisation simultanée de plasmons de surface localisés et propagatifs pour produire la fonction optique. Cette géométrie offre de nombreux avantages par rapport aux systèmes actuellement proposés : réalisation simple, capacité d'intégration haute densité et efficacité de modulation. Une partie de ce travail de thèse a consisté à étudier ce type de modulateur en microscopie à fuites radiatives. L'étude de la réponse optique de nanoparticules d'or déposées sur des films métalliques minces a permis d'obtenir des amplifications de la transmission de lumière à travers ces films. Nous avons également développé une nouvelle technique de fluorescence couplant la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) avec des substrats plasmoniques nanostructurés afin de pouvoir caractériser des biomolécules in vivo en réduisant le volume d'observation. Les substrats plasmoniques utilisés sont des réseaux de pointes nanométriques recouvertes d'or. Des mesures de FCS sur des fluorophores diffusant à proximité de ces substrats ont été effectuées. Les résultats obtenus n'ont malheureusement pas été concluants : en réflexion (laser d'excitation réfléchi sur les substrats plasmoniques), le signal émis par les fluorophores n'a pas pu être discriminé de celui émis par les substrats. Récemment, des résultats prometteurs ont cependant été obtenus dans une autre configuration (lumière injectée et collectée par les fibres optiques des substrats)
Preliminary studies were carried on a plasmonic modulator for telecomunication applications and on a gold nanotips array for biomedical applications