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Дисертації з теми "Tripanosoma cruzi"
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Sulca, Cachay Lourdes Elizabeth. "Trypanosoma cruzi en triatominos del distrito de Cajaruro, Utcubamba - Amazonas, Perú 2001." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2004. https://hdl.handle.net/20.500.12672/1429.
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La Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana constituye uno de los problemas de salud más importante de Latinoamérica.
El presente trabajo tuvo corno objetivos: Tipificar la especie de Trvpanosoma en las localidades de Hebron y Morochal, Distrito d e Cajaruro, Provincia de Utcubamba, Departamento de Amazonas; determinar la especie de triatomino presente en la zona de estudio, su distribución en las diferentes áreas de las viviendas; y determinar el índice tripano triatomínico.
Se realizó el estudio morfométrico de Trypanosoma presente en las heces de Panstrongylus herreri, en sangre de Mus musculus infectados experimentalmente y en medio de cultivo, en este último se observó el Comportamiento. Se hicieron coloraciones de los frotices de heces, sangre y medio de cultivo con Giemsa y de los cortes histológicos de cerebro y corazón de Mus musculus con H E.
Para la identificación de la especie de triatomino se usó la clave de Elliot el aL (1989) y para los estadios evolutivos la de Guillen el aL (1991). Para determinar el índice tripano tríatomínico se aplicó las fórmulas de Silveira (1993).
De acuerdo a la morfología externa (antenas, tibia, conexivo) se determinó que la especie de triatomino presente en ambas zonas es Panstrongylus herreri.
En Hebron se muestrearon 9 viviendas de los cuales 8 (88,89%) estaban infestadas, se capturó 140 triatomínos de ellos 39 (27,86%) se encontraron infectados con Trypanosoma cruzi.
En Morochal se muestrearon 12 resultando 8 (66,67%) infestadas, se capturó 35 triatominos de ellos 5 (14,29%) se encontraron infectados con T cruzi.
En Hebron, P. herreri se encontró distribuido en todas las áreas (dormitorio, cocina cuyero, cocina, cuyero, sala y peridomicilio) siendo el dormitorio el mas infestado con 56 (40%) triatominos encontrándose mayor porcentaje de positivos en la cocina cuyero, mientras que, en Morochal sólo se encontró en el dormitorio y cuyero; el lugar mas infestado con 30 (85,71%).--- Chagas' discase or Arnerican Tripanosomiosis is one of the most .important health problems in Latin America. The present work had the following objectives: Typify the specie of rypanosoma m the localities of Hebrán and Morochal, District of Cajaruro, Province Uctubamba, Department of Amazonas; determine the specie of triatornine present the field of study; its distribution in the different places of the houses, and ,termine the tripanotriatomínico index. it was carríed out the morphometric study of Trypanosoma found in faeces f PanstrongyIus herreri, in blood of Mus musculus infected experimentally and in Ature media, in this latter, we studied the behavior. We stained the facces, b1ood and Ature media with Giemsa and the histological cuts from brain and heart of fus musculus with H E. To identify the specie of triatomine was used Elliot et al. (1989) key d for the evaluative stages Guillén et al. (199 1) key. To determine the index ípanotriatomínico was used Silvíera's fórmula (1993). Taking into consideration the external morphology (antenna, shinbone, conexive) we determined that the triatomine specie found in both zones is `anstrongy1us herreri. In Hebron was sarnpled 9 houses frown which 8 (88,890/0) were infested, it was aptured 140 triatomínes from which 39 (27,861%) were found infected with 'rypanosoma cruzi. In Morochal was sampled 12 bouses being infested 8 (66,67 O/o), lt was aptured 35 triatomines from which 5 (14,29%) were found infectedwith T cruzi. In Hebron, P. herreri was found distributed in all areas of the houses bedroom, kitchen guinea píg house, kitchen, guinea pig house, living room and endomestie) bem9 the bedroom the most infested with 56 (40%) triatornines, being und the major percentage of positive inseas in the kitchen guinea pig house while n Morochal only was found in the bedroom and guinea pig house. The place most
Tesis
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Lourenço, João Lucas Magner. "Ocorrência de tripanossomatídeos em morcegos (Mammalia : Chiroptera) no Distrito Federal, Brasil." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2016. http://repositorio.unb.br/handle/10482/20618.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia, 2016.Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-30T18:58:01Z No. of bitstreams: 1 2016_JoãoLucasMagnerLourenço.pdf: 3585363 bytes, checksum: f2cf99713698569999457020457c75ee (MD5)
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Morcegos são hospedeiros de várias espécies de tripanossomatídeos, inclusive daquelas de interesse médico como Trypanosoma cruzie Leishmania spp. No entanto, pouco ainda se sabe sobre quais desses parasitos estão presentes nos morcegos do Distrito Federal (DF), Brasil, e qual o papel dos morcegos na manutenção dos tripanossomatídeos em ciclos silvestres. Assim, este trabalho teve como objetivo analisar a ocorrência de tripanossomatídeos em morcegos no DF. As capturas de morcegos foram realizadas com redes de neblina em seis áreas amostrais: Fazenda Água Limpa - FAL, Jardim Botânico de Brasília, FERCAL, REBIO Contagem, Campus da UnB em Brasília, e Fazenda Sarah em Brazlândia. Foram feitas coletas de fragmentos de asa, swab bucal e sangue que foi inserido em hemocultura, impregnado em papel de filtro e utilizado para realização de esfregaços sanguíneos. Para a análise molecular dos parasitos, foi realizada uma Nested PCR SSU rRNA. Na primeira PCR, foram utilizados os primers S4 e S12 gerando um fragmento de 520 bp, o qual foi usado para a Nested PCR com os primers S17 e S18 gerando um fragmento de 480bp, cujos produtos foram sequenciados. Além da Nested PCR SSU rRNA, foi também realizada uma qPCRkDNA para identificar quais amostras estavam positivas para T. cruzie T. rangeli. Um total de 146 morcegos de 14 espécies foram capturados. Não foram identificados parasitos nos esfregaços sanguíneos. Contudo, foram identificadas hemoculturas positivas para Trypanosoma dionisii em Carolliaperspicillata e Diphyllaecaudata, sendo que T. dionisiié registrado pela primeira vez em D. ecaudata. O sangue impregnado em papel de filtro foi a amostra biológica com a maior positividade para tripanossomatídeos, seguido pelas amostras de swab e de asa. Foram identificados T. cruzi, T. rangeli, T. lewisie Leishmania spp. nos morcegos. Em todas as áreas foi detectada infecção por tripanossomatídeos, sendo que a FAL foi a área onde ocorreu a maior riqueza de espécies de tripanossomatídeos. Leishmania spp. foi encontrada parasitando 12 espécies de morcegos e estava presente em todas as áreas de estudo, evidenciando que este parasito está circulando no meio silvestre no DF. A PCR de amostras de swab bucal foi um método não invasivo e prático para identificação de Leishmania spp. Morcegos não devem ser excluídos como potenciais reservatórios para tripanossomatídeos de interesse médico, assim como na participação do ciclo enzoótico desses parasitos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Bats are hosts of various species of trypanosomatids, including those of medical interest such as Trypanosomacruzi and Leishmania spp. However, there isn’t enough infomation about which of these parasites are present in bats of the Distrito Federal (DF), Brazil, and also the role of bats in the maintenance of the trypanosomes in the wild cycles. Therefore, this work has aimed to analyze the occurrence of trypanosomatids in bats in Distrito Federal. The batswerecapturedwithmist nets in six sites: Fazenda Água Limpa - FAL, Jardim Botânico de Brasília, Fercal, REBIO Contagem, Campus da UnB in Brasília, and Fazenda Sarah in Brazlândia. Wing fragments, oral swabs and blood were collected. The blood collected was inserted into blood culture, impregnated in filter paper and used to perform blood smears. For the molecular analysis of the parasites, a SSU rRNA nested PCR was performed. In the first PCR, S4 and S12 primers were used, which generate a fragment of 520 bp. This fragment was used for the nested PCR with the primers S17 and S18 that generate a 480bp fragment, whose products were sequenced. Besides the nested PCR SSU rRNA, a kDNAqPCRwas also performed to identify which samples were positive for T. cruzi and T. rangeli. A total of 146 bats of 14 species were captured. No parasites were identified in the blood smears. However, positive blood cultures were identified for Trypanosomadionisii in Carolliaperspicillata and Diphyllaecaudata, also this is the first recorded of T. dionisii in D. ecaudata. The blood impregnated in filter paper was the biological sample with the largest postivity for trypanosomatis, followed by the swab samples and the wing samples. T. cruzi, T. rangeli, T. lewisiand Leishmania spp. were identified in bats. In all areas infection by trypanosomatid was detected, and FAL was the area where the greatest species richness of trypanosomatids was detected. Leishmania spp. was found parasitizing 12 species of bats and it was present in all the the study areas, showing that this parasite is circulating in wild areas in DF. The PCR of oral swabs was a non-invasive and practical method for identification of Leishmania spp. Bats should not be excluded as potential reservoirs for trypanosomatids of medical interest, as well as their participation in the enzootic cycle of these parasites.
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Mattos, Eliciane Cevolani. "Interação parasita-célula hospedeira: modificação de proteínas de Tripanosoma cruzi durante adesão à matriz extracelular." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-25032014-085400/.
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A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira.The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells
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Bezerra, Rafael Campos. "Estudos parasitemicos e citologicos em camundongos infectados com as cepas Y ou CL do Tripanosoma cruzi (chagas, 1909)." [s.n.], 1992. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/317082.
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Orientador: Marcos Garcia CostaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
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Resumo: O período pré-patente, a parasitemia, a mortalidade e alterações hematológicas, esplênicas e medulares, foram estudados em camundongos Swiss, não isogênicos e em camundongos isogênicos BALB/c, CBA, C57BL/l0 e em híbridos (C57BL/l0xBALB/c)Fl e (C57BL/l0xCBA)Fl, infectados com inóculos variando de 100 a 100.000 tripomastigotas sanguíneas do Trypanasoma cruzi das cepas Y ou CL.As diferenças no período pré-patente, mostraram-se como decorrência direta do inóculo e das cepas de Trypanosoma cruzi empregadas, independente da linhagem de camundongo utilizada ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital
Abstract: Not informed.
Mestrado
Imunologia
Mestre em Ciências Biológicas
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Rocha, Miqueles Cristián Mauricio. "Rendimiento del xenodiagnóstico y reacción de polimerasa en cadena en la detección de Tripanosoma cruzi en deyecciones de triatominos." Tesis, Universidad de Chile, 2005. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/132291.
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Memoria para optar al Título Profesional de Médico VeterinarioLa enfermedad de Chagas constituye un problema de salud pública en el continente americano. De acuerdo a la OMS existirían 18.000.000 personas con esta parasitosis. Brasil con 5.000.000 y Argentina con 2.200.000 infectados, son los países más afectados. En Chile se estiman que existen actualmente 200.000 chagásicos crónicos. Existen características clínicas regionales de la Enfermedad de Chagas, siendo la cardiopatía y las megaformaciones las principales manifestaciones en la etapa crónica. El diagnóstico es abordado desde el punto de vista clínico-epidemiológico y se orienta en función de la etapa de la infección. En los casos agudos, debido a la elevada parasitemia, los métodos de elección son parasitológicos y en la etapa crónica, por las fluctuantes y bajas parasitemias, la detección de T. cruzi es más compleja. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en sangre periférica de individuos chagásicos, ha permitido aumentar la sensibilidad diagnóstica. Recientemente, se ha aplicado PCR en deyecciones de triatominos alimentados mediante xenodiagnóstico (XD) en chagásicos crónicos sometidos a tratamiento quimioterapéutico. Con el fin de conocer la sensibilidad y precocidad de la detección de kDNA de T. cruzi en deyecciones de triatominos alimentados mediante XD en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, a 25 infectados con XD (+) (Grupo I) y 25 infectados con XD (-) (Grupo II), se aplicó PCR al pool de deyecciones de triatominos incubados durante 30, 60 y 90 días. En todos los casos con XD (+) se detectó la banda específica de 330 pb. Mientras a los 60 días el XD era positivo en el 84% de los casos, PCR tuvo un 100% de positividad. En el Grupo II, de chagásicos con XD (-) a los 30, 60 y 90 días, 9 casos (36%) tuvieron PCR positivo. Los resultados permiten concluir que PCR aplicado en deyecciones de triatominos es una herramienta más precoz para detectar T. cruzi que el XD, ya que a los 30 días, XD y PCR tienen un 44% y un 92% de positividad, respectivamente. El 100% de los casos es pesquisado mediante PCR a los 60 días, mientras que el XD necesita 90 días para obtener el mismo resultado. El XD actúa como un medio de cultivo biológico para amplificar T. cruzi, lo que permite aplicar PCR en las deyecciones, por esta razón, ambas técnicas son complementarias
Financiamiento: Proyectos DI SAL 03/06-2 y Fondecyt 1040731
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Panepucci, Ezequiel Horácio. "Modelagem molecular da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de T. cruzi e análise de potenciais inibidores específicos." Universidade de São Paulo, 1994. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-18112013-143204/.
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Foi construído o modelo tridimensional da enzima gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi, o causador da doença de Chagas, usando técnicas computacionais de modelagem por homologia. O modelo foi comparado a enzima muscular homóloga de humanos quanto as diferenças no sitio de ligação do cofator NAD+. Sobre o modelo da enzima de T.cruzi foram construidas moléculas anaJogas ao grupo adenosina do cofator NAD+ como tentativa de se obter um inibidor seletivo a enzima do parasita e não efetivo quanto à enzima de humanos. Alguns dos compostos haviam sido ensaiados quanto à afinidade pela enzima análoga de Trypanosoma brucei. Foi escrito um programa de visualização gráfica de modelos moleculares que permite a análise dos parâmetros esteroquímicos com rapidez e simplicidadeThe three-dimensional model of the glycossomal enzyme gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, was built using homology modeling computational techniques. The model was compared against the human muscle homologous enzyme with regard to the differences in the NAD+ binding site. Adenosine analogs were designed based on the model of the T.cruzi enzyme as an attempt to build selective inhibitors of the parasite enzyme with no activity against the human enzyme. Some of the compounds were previously tested for their affinity for the homologous enzyme from Trypanosoma brucei. A graphical program was written that allows the representation and analysis of stereo chemical parameters of molecular models with ease and speed
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Martins, Luciamáre Perinetti Alves. "Isolamento e caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi Chagas,1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) a partir de triatomíneos silvestres do Estado do Rio Grande do Sul /." Araraquara : [s.n.], 2005. http://hdl.handle.net/11449/104540.
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Resumo: Embora a incidência da doença de Chagas tenha diminuído, os estudos sobre o Trypanosoma cruzi devem continuar, dada a dificuldade para o efetivo controle dos seus vetores. Triatoma infestans o principal vetor da doença de Chagas está praticamente eliminado no Brasil, entretanto outras espécies de Triatominae estão em processo de domiciliação, como o Triatoma rubrovaria no Rio Grande do Sul, constituindo-se em um fator de risco para o recrudescimento da infecção chagásica. Com o intuito de caracterizar cepas de T. cruzi que circulam na área rural, foram feitas buscas ativas de triatomíneos para isolamento desse protozoário em bairros do município de Quaraí, RS. Para tanto as fezes dos triatomíneos coletados foram obtidas por compressão abdominal para pesquisa de tripomastigotas metacíclicos. As fezes que se encontraram positivas foram inoculadas em animais de experimentação e em meio de cultura (LIT). Foram isoladas cinco cepas de T. cruzi, assim denominadas: QB1, QJ1, QJ3, QM1 e QM2, que apresentaram as seguintes características: predominância de formas tripomastigotas intermediárias após mensuração no 15º dia pósinfecção, picos parasitêmicos ao redor do17º dia pós-infecção, miotropismo na fase aguda e miosite na fase crônica da infecção. A análise do DNA que codifica a fração 24Sa do rRNA mostrou fragmentos de 110 pb, agrupando-as em T. cruzi I. Os serviços de vigilância epidemiológica foram informados sobre os resultados obtidos.Abstract: Although the decrease in the incidence of Chagas' disease, the studies concerning T. cruzi shall continue, due to the difficulty in controlling its vector. Triatoma infestans the main vector of Chagas'disease is nearly eliminated in Brasil, nevertheless other Triatominae species are on domiciliate process, like Triatoma rubrovaria in Rio Grande do Sul State, representing a hazard factor for increasing Chagas infection. In order to characterize T. cruzi strains that naturally occur in the rural area, active searches were performed in order to isolated these strains in the district of Quarai, RS. Triatomine feces were collected by abdominal compression and the presence of metacyclic tripomastigotes was evaluated. The feces positive for metacyclic triatomines were inoculated in experimental animals and in the culture medium (LIT). Five T. cruzi strains were isolated: QB1, QJ1, QJ3, QM1 and QM2. The strains displayed a predominance of intermediate forms on 15th day post-infection. Parasitimia peak occurred on 17th day post-infection. Myotropism during acute phase and myositis in the chronic phase was oberved. The DNA analysis coding the 24 Sa r RNA fraction has displayed fragments of 110 pb, grouping them in T. cruzi I. The Epidemiologic Vigilance Services have been warmed about the achieved results.
Orientador: João Aristeu da Rosa
Coorientador: Márcia Aparecida Sperança
Banca: Mara Cristina Pinto
Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha
Banca: José Clóvis do Prado Júnior
Banca: Sérgio Albuquerque
Doutor
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Núñez, Zapata Susy Fanny. "Desarrollo de clones de Trypanosoma cruzi con expresión estable de lucíferas para screening de drogas tripanosomicidas." Master's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2010. https://hdl.handle.net/20.500.12672/11094.
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Menciona que la enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, es endémica de Latinoamérica y afecta entre 16 y 18 millones de personas. Su tratamiento requiere de drogas más efectivas y menos tóxicas. Con el propósito de contar con un método de screening de drogas más sensible y rápido que facilite la selección de compuestos tripanosomicidas candidatos, se planteó como objetivo desarrollar parásitos de T. cruzi que expresen el gen reportero de la luciferasa (luc) de la luciérnaga Photinus pyralis en forma estable. Para la obtención de parásitos luc- transfectantes se construyeron dos plásmidos conteniendo el ORF de luc: el pBS-Neo-Luc y el pR-Luc-Neo. Epimastigotes de la cepa boliviana DH29 fueron electroporados con el DNA circular de estos plásmidos. Los clones fueron obtenidos por diluciones limitantes de los parásitos transfectantes resistentes al antibiótico G418. La inserción del gen luc y su expresión fue
demostrada por PCR y western blot, respectivamente. La actividad de la luciferasa fue medida con un luminómetro manual. Los clones que expresaron la luciferasa, medida por su actividad, fueron estables por más de seis meses en ausencia del antibiótico de selección y en los tres estadios de T. cruzi. La correlación entre la actividad de la luciferasa y el número de parásitos fue muy alta (r2= 0,999). La prueba de detección de la luciferasa fue altamente sensible, detectándose desde 102 parásitos ml-1. Por tanto, los parásitos con expresión estable de luciferasa podrán ser usados para el screening de drogas tripanosomicidas.Tesis
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Paico, Montero Henry Alonso. "Identificación de apoptosis en células THP-1 Y LLC-MK2 inducida por antígenos de dos cepas de Trypanosoma cruzi." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2015. https://hdl.handle.net/20.500.12672/9339.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorEvalúa la calidad microbiológica de aguas subterráneas (pozos), utilizadas para el consumo humano ubicadas en el Centro Poblado de Santa María de Huachipa en el distrito de Lurigancho, Lima. Se recolectaron treinta y cuatro muestras de aguas subterráneas (pozos). Para la determinación de Coliformes Totales, Escherichia coli, y Enterococcus sp., el análisis es realizado con la técnica del Número Más Probable (NMP), para bacterias heterotróficas y Pseudomonas aeruginosa, se emplean los métodos de recuento en placa y filtración de membrana respectivamente. En los resultados se observan valores superiores a los límites establecidos por el MINAM-2008, DIGESA y Código Alimentario Argentino, encontrándose que el 74% (25) de las muestras de agua supera el parámetro de bacterias heterotróficas (máximo 500 UFC/mL), el 100% (34) de las muestras de agua no cumple con el parámetro para coliformes totales (< 1,8 NMP/100mL o ausencia), y el 53% (18) de las muestras de agua supera los límites establecidos para Escherichia coli (< 1,8 NMP/100mL o ausencia). En el caso de Enterococcus sp. (< 1,8 NMP/100mL o ausencia) el 85% (29) de las muestras de agua supera el límite permisible; y el 53% (18) de las muestras presentó Pseudomonas aeruginosa (< 1 UFC/100mL o ausencia). Se concluye que ninguna muestra de agua cumple con los requisitos microbiológicos para ser aceptable como aguas de consumo humano, constituyendo un riesgo potencial para la salud de los consumidores debido a los elevados niveles de contaminación microbiana.
Tesis
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Leme, Neto Leandro. "Caracterização de inibidores de complemento liberados pelas formas metacíclicas de Tripanosoma cruzi e sua função na evasão da imunidade inata." reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, 2013. https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/12862.
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Previous issue date: 2016-02-23Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
O Tripanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, constitui um grave problema de saúde pública que afeta 18 milhões de pessoas na América latina. Para produzir a infecção formas tripomastigotas metacíclica de T. cruzi , liberadas durante a picada do inseto vetor, precisam evadir o sistema imune inato do hospedeiro vertebrado para infectar as células. O sistema complemento, devido à sua capacidade para rapidamente reconhecer e eliminar microrganismos constitui a principal linha de defesa do sistema imune inato. O sistema do complemento é composto por várias proteínas, ativadas em cascata por serino proteases, que culmina com a formação do complexo de ataque a membrana e lise do patógeno. Todavia, muitos organismos patogênicos desenvolveram formas de escapar do ataque do sistema do complemento por meio de diversos mecanismos. Visando à melhor caracterização dos fatores de virulência do T. cruzi, o grupo foi verificar se os sobrenadantes de formas metacíclicas apresentam atividade inibitória de complemento. Devido às vias do complemento serem ativadas por serino proteases, foi realizada uma busca no banco genômico de T. cruzi atrás de motivos de SERPINAS (inibidores de serino protease) que o parasito poderia estar liberando no primeiro contato parasito-hospedeiro. Foram realizados experimentos de lise mediada pelo complemento com sobrenadantes das formas metacíclicas de T. cruzi. Observou-se, ainda, que os sobrenadantes das formas metacíclicas do T. cruzi são capazes de inibir a lise mediada pelo complemento de formas epimastigotas
The Try panosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, is a serious public health concernthat affects 18 million people in Latin America. To produce the infection, metacyclic trypomastigotes de T cruzi released during the bite of the insect vector must evade the innate immune system of the vertebrate host to infect cells. The complement system, due to its ability to rapidly recognize and eliminate microorganisms is the major line of innate immune system defense. The complement system is composed of various proteins, activated by serine proteases cascade that culminates in the formation of the membrane attack complex and lysis of the pathogen. However, many pathogens have developed ways to evade the attack of the complement system through several mechanisms. Aiming to better characterize the virulence factors of T. cruzi, the team was to verify whether the supernatants of metacyclic forms exhibit inhibitory activity of complement. Due to the complement pathways are activated by serine proteases, we seek in genomic library of T. cruzi motifs related t o serpin (serine protease inhibitors) , a protein that the parasite could be releasing at the first parasite - host contact . Experiments were carried out to complement - mediated lysis with supernatants of metacyclic forms of T. cruzi . F urthermore , i t was ob served, that the supernatants of metacyclic forms of T. cruzi are capable of inhibiting the complement mediated lysis of epimastigotes
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Martins, Luciamáre Perinetti Alves [UNESP]. "Isolamento e caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi Chagas,1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) a partir de triatomíneos silvestres do Estado do Rio Grande do Sul." Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2005. http://hdl.handle.net/11449/104540.
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martins_lpa__dr_arafcf.pdf: 1228013 bytes, checksum: 5934b003d49e4880c1d0e8c2f03123b7 (MD5)Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Embora a incidência da doença de Chagas tenha diminuído, os estudos sobre o Trypanosoma cruzi devem continuar, dada a dificuldade para o efetivo controle dos seus vetores. Triatoma infestans o principal vetor da doença de Chagas está praticamente eliminado no Brasil, entretanto outras espécies de Triatominae estão em processo de domiciliação, como o Triatoma rubrovaria no Rio Grande do Sul, constituindo-se em um fator de risco para o recrudescimento da infecção chagásica. Com o intuito de caracterizar cepas de T. cruzi que circulam na área rural, foram feitas buscas ativas de triatomíneos para isolamento desse protozoário em bairros do município de Quaraí, RS. Para tanto as fezes dos triatomíneos coletados foram obtidas por compressão abdominal para pesquisa de tripomastigotas metacíclicos. As fezes que se encontraram positivas foram inoculadas em animais de experimentação e em meio de cultura (LIT). Foram isoladas cinco cepas de T. cruzi, assim denominadas: QB1, QJ1, QJ3, QM1 e QM2, que apresentaram as seguintes características: predominância de formas tripomastigotas intermediárias após mensuração no 15º dia pósinfecção, picos parasitêmicos ao redor do17º dia pós-infecção, miotropismo na fase aguda e miosite na fase crônica da infecção. A análise do DNA que codifica a fração 24Sa do rRNA mostrou fragmentos de 110 pb, agrupando-as em T. cruzi I. Os serviços de vigilância epidemiológica foram informados sobre os resultados obtidos.
Although the decrease in the incidence of Chagas' disease, the studies concerning T. cruzi shall continue, due to the difficulty in controlling its vector. Triatoma infestans the main vector of Chagas'disease is nearly eliminated in Brasil, nevertheless other Triatominae species are on domiciliate process, like Triatoma rubrovaria in Rio Grande do Sul State, representing a hazard factor for increasing Chagas infection. In order to characterize T. cruzi strains that naturally occur in the rural area, active searches were performed in order to isolated these strains in the district of Quarai, RS. Triatomine feces were collected by abdominal compression and the presence of metacyclic tripomastigotes was evaluated. The feces positive for metacyclic triatomines were inoculated in experimental animals and in the culture medium (LIT). Five T. cruzi strains were isolated: QB1, QJ1, QJ3, QM1 and QM2. The strains displayed a predominance of intermediate forms on 15th day post-infection. Parasitimia peak occurred on 17th day post-infection. Myotropism during acute phase and myositis in the chronic phase was oberved. The DNA analysis coding the 24 Sa r RNA fraction has displayed fragments of 110 pb, grouping them in T. cruzi I. The Epidemiologic Vigilance Services have been warmed about the achieved results.
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Castillo, Paca Juan Paul. "Cuantificación de Tripanosoma cruzi en sangre periférica y deyecciones de Triatoma infestans alimentados mediante xenodiagnóstico en pacientes cardiópatas y no cardiópatas en enfermedad de Chagas crónica." Tesis, Universidad de Chile, 2016. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/144425.
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Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias AnimalesEn la actualidad, la enfermedad de Chagas (ECh), es considerada una de las “enfermedades desatendidas” más importantes del mundo y debido a sus implicancias médicas, sociales y económicas constituye uno de los principales problemas de salud pública de Latinoamérica. Se estima que 28 millones de personas de la región están expuestos a la infección y que la ECh es causa de muerte a 14.000 personas cada año, mucho más que otras parasitosis en la región, incluida malaria. La ECh causa discapacidad prematura, con un costo anual de 667.000 años de vida ajustados por discapacidad. Desde el punto de vista diagnóstico, la detección del parásito ha mejorado en forma considerable desde la aplicación de la Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR). No obstante, la modalidad convencional (PCR Tiempo final), sólo permite detectar la presencia de ADN de Trypanosoma cruzi circulante, mientras que la aplicación de PCR Tiempo Real (qPCR), modalidad cuantitativa de PCR, permite obtener información sobre la carga parasitaria de T. cruzi circulante. El objetivo de esta tesis fue cuantificar la carga de T. cruzi mediante qPCR en sangre (qPCR-S) y deyecciones de triatominos alimentados mediante XD (qPCR-XD) en 90 personas con ECh crónica, clasificados según presencia o ausencia de cardiopatía. Todos proceden de áreas endémicas de Chile y participaron en el estudio bajo Consentimiento Informado. La curva estándar de qPCR se elaboró a partir de una concentración conocida de ADN de T. cruzi, realizando diluciones seriadas (1/10) en sangre de paciente sin ECh con un rango dinámico entre 106 a 10-1 parásitos equivalentes/ml (par.eq/ml.) Todos los cálculos se estimaron considerando que cada célula de T. cruzi posee 200 fg de material genético. Se aplicó el sistema de detección TaqMan®, en un termociclador Mx3000P™ Stratagene (AgilentTecnologies, USA) con los primers satelitales cruzi 1 y cruzi 2. En los grupos de cardiópatas con XD (+) o XD (-) fue posible establecer mediante qPCR-S, que el 57.1% y el 39.5%, respectivamente, presenta cargas parasitarias entre 0.1-1 par. eq./ml. Al aplicar qPCR-XD en los mismos grupos, se observó que el 57.1% de los casos XD (+) tenía entre 1-10 par. eq./ml y el 34.21% de los casos XD (-) entre 0.01-0.1 par. eq./ml. La positividad de qPCR-S y qPCR-XD en el grupo XD (+) fue del 100%, con rangos de parasitemia diferentes, mientras que en el grupo XD (-), la positividad de qPCR-XD fue del 55.27%. En el grupo de no cardiópatas XD (+), fue posible determinar mediante qPCR-S que el 77.8% de los casos tuvieron una carga parasitaria entre 0.1-1 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-), el 52.8% tuvo cargas entre 0.01-0.1 par. eq./ml. En el 36.1% de los casos de este último grupo, qPCR-S no detectó T. cruzi. Al aplicar qPCR-XD en el grupo de no cardiópatas XD (+) se estableció que el 44.4% tuvo cargas parasitarias entre 10-100 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-) el 50% de los casos tenía entre 0.01-0.1 par.eq./ml. La positividad de qPCR-XD en XD (-) fue del 72.2%. La mediana de carga parasitaria de T. cruzi determinada mediante qPCR-S para el grupo cardiópata fue de 0.07 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.02 par.eq./ml. Por otra parte, la mediana de parasitemia de T. cruzi qPCR-XD para el grupo de cardiópatas fue de 0.017 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.055 par.eq./ml. La prueba de diferencias de Mann-Whitney para las medianas, no encontró diferencias entre las cargas parasitarias entre cardiópatas y no cardiópatas.
Financiamiento: proyecto Fondecyt 1120382-1161485.
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Uribe, Cordero José Luis. "Infección por Tripanosoma cruzi en grupos familiares y perros de viviendas positivas al vector Triatoma infestans: Calera de Tango y Til Til, Región Metropolitana." Tesis, Universidad de Chile, 2008. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/131263.
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Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico VeterinarioLa enfermedad de Chagas existe desde tiempos remotos en el continente americano y constituye un problema de salud pública en países latinoamericanos. En los últimos años, la emigración masiva de personas de América Latina a otras partes del mundo ha hecho que la enfermedad se convierta en un problema mundial. El protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, corresponde al agente etiológico de esta zoonosis, que desde el punto de vista médico veterinario, afecta a animales de hábitos intra y peridomiciliarios, los cuales son un factor de mantenimiento en la transmisión vectorial. En Chile, el área de endemia de la enfermedad se extiende desde el paralelo 18° LS por el norte, hasta el paralelo 34,5º LS por el sur. La Secretaría Regional Ministerial (SEREMI) de Salud de la Región Metropolitana aplica el Programa de Control del Triatoma infestans, vector intradomiciliario del parásito de mayor importancia epidemiológica en Chile; gracias a este programa se detectó en viviendas de comunas rurales de Calera de Tango y Til Til, la presencia reiterada de ejemplares adultos de este insecto. Por ello, esta investigación planteó como objetivo principal pesquisar infección chagásica en los integrantes de estos grupos familiares y sus perros mascota. De un total de 269 personas examinadas, (159 de la comuna de Calera de Tango y 110 de Til Til), fueron confirmados cuatro casos provenientes de Til Til serológicamente positivos a T. cruzi que correspondieron a personas adultas del género masculino, cuyas edades fluctuaron entre los 33 y los 73 años. Además, fue detectada infección por T. cruzi en dos perros provenientes de esta misma comuna. Sin embargo, no existió relación de positividad a T. cruzi entre integrantes de estos grupos familiares y los perros positivos detectados
Financiado por el Instituto de Salud Pública de Chile y la Secretaría Regional Ministerial de Salud Región Metropolitana
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Gordillo, Vílchez Sara Martha. "Evaluación in vitro de la actividad anti trypanosoma cruzi del hongo medicinal Auricularia delicata “Callampa”." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013. https://hdl.handle.net/20.500.12672/14515.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorEvalúa el efecto del hongo Auricularia delicata sobre el parásito Trypanosoma cruzi. A. delicata fue colectado en el Departamento de Huánuco-Tingo María en los meses de octubre a diciembre del 2010. En el laboratorio los basidiosomas se deshidrataron, dejaron en etanol al 96° por 15 días hasta obtener un residuo sólido, el cual se denominó extracto alcohólico de A. delicata. También se evaluó el efecto del extracto provenientes de cultivos líquidos de A. delicata (E0-E10) que fueron incubados a diferentes tiempos (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 y 60). La acción tripanocida se evaluó con el estadio de tripomastigote de T.cruzi. El extracto etanólico del basidiosoma presentó un efecto tóxico en una concentración de 3 mg/ml causando un 98.82% de mortalidad a las 48 horas. Con el extracto E6 y E7 del cultivo líquido se obtuvo una mortalidad del 100% y 99.64 %. Ambos extractos se encontraron en la fase estacionaria según la evaluación de la biomasa. El extracto del cultivo líquido (100 % con 3 mg/ml) mostró mayor mortalidad que el extracto del basidiosoma (98.82% en la misma concentración), lo cual sugiere que los compuestos activos de A. delicata están presentes tanto en el cultivo líquido como en el basidiosoma.
Tesis
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Aysanoa, Moore Esar Ezequiel. "Detección molecular de tripanosomátidos y Trypanosoma cruzi en sangre de primates no humanos mediante PCR anidada." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2015. https://hdl.handle.net/20.500.12672/8935.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorDetecta la presencia de tripanosomátidos y Trypanosoma cruzi en sangre de primates no humanos mantenidos en cautiverio, mediante PCR anidada. Para realizar la identificación por PCR de T. cruzi en primates no humanos, se optimiza un protocolo anidado usando dos pares de cebadores dirigidos al gen 24S alfa de la subunidad mayor de ribosoma. Se analizan muestras de sangre de mono colectadas en tubos con EDTA y tarjetas FTA provenientes de siete ciudades peruanas: Yurimaguas (n=69), Pucallpa (n=29), Puerto Maldonado (n=26), Iquitos (n=1), Moyobamba (n=17), Lima (n=34), y Cuzco (n=18). Las muestras son colectadas entre noviembre 2011 y mayo 2012 por la ONG Wildlife Conservation Society (WCS) mediante un muestreo no probabilístico por conveniencia. De cada muestra también se realizan frotis y gota gruesas para detección de hemoparásitos por microscopía. Los productos de amplificación de la primera reacción son de aproximadamente 240-280 pb y amplificaron secuencias conservadas en todos los tripanosomátidos, mientras que los de la segunda PCR son de 110-130 pb y amplifican una secuencia interna, exclusiva de T. cruzi. No se observa una reacción cruzada con ADN de mamífero (Aotus, humanos) ni con otros parásitos como Plasmodium spp. El límite de detección del protocolo es de 1,5 pg de ADN para tripanosomátidos y de 15 fg para T. cruzi; lo que equivale aproximadamente a 4,5 y 0,045 parásitos, respectivamente. Sin embargo, como la cantidad de ADN de T. cruzi varía entre cepas y clones, este rango podría ser más amplio y detectar solo 12,5 parásitos en la primera reacción y 0,12 en la segunda. Al comparar la PCR con el diagnóstico por microscopía, se determina que esta última es menos específica (97,96%) y sensible (82,86%). Finalmente, al emplear el protocolo de PCR en las muestras de primates no humanos, se encuentra que la prevalencia de tripanosomátidos es de 26,49% y la de T. cruzi 3,24%.
Tesis
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Jahuira, Arias Martha Helena. "Desarrollo de micropartículas modificadas de quitosano para el diagnóstico molecular de la enfermedad de Chagas." Doctoral thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2019. https://hdl.handle.net/20.500.12672/10677.
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Desarrolla micropartículas modificadas de quitosano con capacidad de adsorción de ácido desoxirribonucleico (ADN) para diagnóstico molecular de la enfermedad de Chagas. Se sintetizaron y caracterizaron diferentes micropartículas de quitosano, se optimizó la condiciones de adsorción de ADN in vitro evaluando parámetros (tipo, pH del medio, concentración, tiempo y el método de desorción). Se determinó, el límite de detección de ADN plasmídico y ADN de T.cruzi. Se evaluó la sensibilidad y especificidad en la detección de ADN del kinetoplasto (ADNk) - 71P y ADN satélite (ADNsat) - C3 en muestras de orina obtenidas a los 14 y 45 días postinfección (dpi) en animales experimentalmente. Los resultados mostraron que las micropartículas de quitosano entrecruzadas (QE) tienen mayor capacidad de adsorción de ADN. Se establecieron los siguientes parámetros óptimos; concentración de entrecruzante al 1%, el pH del medio a 6.9, tiempo de 60 minutos y el método de desorción EDTA-SDS. El límite de detección del ADN plasmídico fue de 101 copias/mL y del ADN de T. cruzi de 10-1 parásitos/mL. La sensibilidad fue mayor en la detección del ADNk con 71 %, con la región del ADNsat alcanzó 25%. La sensibilidad a los 14 dpi fue de 42 % en la detección de la región del ADNsat y 78% con la región del ADNk; a los 45 dpi fue de 7 %y 64% con la región de satélite del ADNsat y región del ADNk respectivamente. Se demostró la alta especificidad (100%) para ambas regiones. El método desarrollado es innovador, las micropartículas de QE tienen la capacidad de aislar y concentrar el ADN de T.cruzi en muestras de orina y podría usarse como biomarcador para el diagnóstico no invasivo de Chagas.Tesis
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Silva, Daniel Gedder. "Planejamento, síntese e avaliação de inibidores da enzima cruzaína e de agentes tripanossomicidas derivados de imidazopiridina." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-16012018-091612/.
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No capítulo 1, a modelagem HQSAR, a docagem e os estudos de ROCS foram construídos utilizando uma série de 57 inibidores de cruzaína. O melhor modelo HQSAR (q2 = 0,70, r2 = 0,95, r2test = 0,62, q2rand. = 0,09 and r2rand. = 0,26) foi utilizado para predizer a potência de 121 compostos extraídos da literatura (conjunto de dados V1), resultando em um valor de r2 satisfatório de 0,65 para essa validação externa. Uma validação externa adicional foi empregada utilizando uma série de 1223 compostos extraído dos bancos de dados ChEMBL e CDD (conjunto de dados V3); nessa validação externa o valor de AUC (área sob a curva) para a curva ROC foi de 0,70. Os mapas de contribuição, obtidos para o melhor modelo HQSAR 3.4, estão de acordo com as predições do modo de interação e com as bioatividades dos compostos estudados. Nos estudos de ROCS, a forma molecular utilizada como filtro, foi útil na rápida identificação de modificações moleculares promissoras para inibidores de cruzaína. O valor de AUC obtido com a curva ROC foi de 0,72, isso indica que o método foi muito eficiente na distinção entre inibidores ativos e inativos da enzima cruzaína. Em seguida, o melhor modelo HQSAR foi utilizado para predizer os valores de pIC50 para novos compostos. Alguns dos compostos identificados, utilizando esse método, demonstraram valores de potência calculada maior do que a série de treinamento em estudo. No capítulo 2, os efeitos sobre a potência na inibição da enzima cruzaína pela substituição de um grupo nitrila como warhead por outros grupos foi avaliada. Com a síntese de 20 compostos do tipo dipeptidil, avaliou-se a relação estrutura-atividade (SAR), baseado na troca do grupo warhead na porção P1\'. O grupo oxima foi mais potente que o grupo correspondente nitrila em 0,7 unidades logarítmicas. Os compostos do tipo dipeptidil aldeídos e azanitrila obtiveram potências mais elevadas do que o correspondente dipeptidil nitrila em duas de magnitude. Os compostos dipeptidil alfa-beta insaturados foram menos potentes do que o correspondente dipeptidil nitrila. No capítulo 3, estratégias de química medicinal foram empregadas nas sínteses de 23 novos análogos, contendo o esqueleto básico de imidazopiridina. Sete e doze compostos sintetizados exibiram EC50 <= 1µM in vitro contra os parasitos Tripanosoma cruzi (T. cruzi) e brucei (T. brucei), respectivamente. Com os resultados promissores de atividade biológica in vitro, citotoxicidade, estabilidade metabólica, ligação proteica e propriedades farmacocinéticas, o composto 41 foi selecionado como candidato para os estudos de eficácia in vivo. Esse composto foi submetido em um modelo agudo da infecção com T. cruzi em ratos (cepa Tulahuen). Depois de estabelecida a infecção, os ratos foram dosados duas vezes ao dia, durante 5 dias; e monitorados por 6 semanas usando um sistema de imagem in vivo IVIS (do inglês, \"In Vivo Imaging System\"). O composto 41 demonstrou inibição parasitária comparável com o grupo de treinamento dosado com benzonidazol. O composto 41 representa um potencial líder para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de tripanossomíases.In chapter 1, the HQSAR, molecular docking and ROCS were applied to a dataset of 57 cruzain inhibitors. The best HQSAR model (q2 = 0.70, r2 = 0.95, r2test = 0.62, q2rand. = 0.09 and r2rand. = 0.26) was then used to predict the potencies of 121 unknown compounds (the V1 database), giving rise to a satisfactory predictive r2 value of 0.65 (external validation). By employing an extra external dataset comprising 1223 compounds (the V3 database) either retrieved from the ChEMBL or CDD databases, an overall ROC AUC (area under the curve) score well over 0.70 was obtained. The contribution maps obtained with the best HQSAR model (model 3.4) are in agreement with the predicted binding mode and with the biological potencies of the studied compounds. We also screened these compounds using the ROCS method, a Gaussian-shape volume filter able to identify quickly the shapes that match a query molecule. The AUC obtained with the ROC curves (ROC AUC) was 0.72, indicating that the method was very efficient in distinguishing between active and inactive cruzain inhibitors. These set of information guided us to propose novel cruzain inhibitors to be synthesized. Then, the best HQSAR model obtained was used to predict the pIC50 values of these new compounds. Some compounds identified using this method has shown calculated potencies higher than those which have originated them. In chapter 2, the effects on potency of cruzain inhibition of replacing a nitrile group with alternative warheads were explored; with the syntheses of 20 dipeptidyl compounds, we explored the structure activity relationships (SAR) based on exchanging of the warhead portion (P1\'). The oxime was 0.7 units more potent than the corresponding nitrile. Dipeptide aldehydes and azadipeptide nitriles were found to be two orders of magnitude more potent than the corresponding dipeptide nitriles. The vinyl esters and amides were less potent than the corresponding nitrile by between one and two orders of magnitude. In chapter 3, we synthesized 23 new imidazopyridine analogues arising from medicinal chemistry optimization at different sites on the molecule. Seven and twelve compounds exhibited an in vitro EC50 <= 1µM against Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Trypanosoma brucei (T. brucei) parasites, respectively. Based on promising results of in vitro activity (EC50 < 100 nM), cytotoxicity, metabolic stability, protein binding and pharmacokinetics (PK) properties, compound 41 was selected as a candidate for in vivo efficacy studies. This compound was screened in an acute mouse model against T.cruzi (Tulahuen strain). After established infection, mice were dosed twice a day for 5 days, and then monitored for 6 weeks using an in vivo imaging system (IVIS). Compound 41 demonstrated parasite inhibition comparable to the benznidazole treatment group. Compound 41 represents a potential lead for the development of drugs to treat trypanosomiasis.
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Jaimes, Huamán Gustavo Adolfo. "Estudio comparativo de tres ensayos inmunoserológicos para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en donantes del servicio de banco de sangre del Hospital Edgardo Rebagliati, Lima, Perú - 2017." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2017. https://hdl.handle.net/20.500.12672/7342.
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Compara tres ensayos inmunoserológicos para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi, en donantes del Banco de sangre del Hospital Edgardo Rebagliati Martins. Se plantea un estudio descriptivo retrospectivo de corte transversal. Muestra. 63 plasmas con resultado reactivo por el método de ELISA indirecto, evaluados por quimioluminiscencia (CLIA), western blot (WB) e inmunofluorescencia (IFI). Se realiza un análisis descriptivo a través del cálculo de frecuencias, sensibilidad y especificidad, índice kappa (k) y chi-cuadrado. Del total de muestras estudiadas, 7.94% (5/63) son reactivos por CLIA, 6.35% (4/63) positivos por WB y 7.94% (5/63) por IFI. La concordancia entre la prueba de CLIA e IFI obtiene un k = 0.78, WB e IFI un k = 0.88 y CLIA y WB un k = 0.88. Considerando al IFI como prueba de referencia, la prueba de CLIA da una sensibilidad y especificidad de 80 y 98% respectivamente, mientras el Western Blot da una sensibilidad y especificidad de 80 y 100%.Tesis
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Ynocente, La Valle Raúl Jesús. "Determinación de la infección por una cepa de Trypanosoma cruzi proveniente de Arequipa en modelo murino." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2018. https://hdl.handle.net/20.500.12672/7621.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorEvalúa el daño tisular ocasionado por la infección de la cepa Arequipa de T. cruzi en modelo murino y compararla con la infección ocasionada por dos cepas ya conocidas de T. cruzi. Se utilizaron 20 ratones de la cepa C57BL/6, los cuales fueron divididos en 4 grupos, 3 de los cuales fueron infectados con 10000 tripomastigotes sanguíneos de las cepas Arequipa, Colombia y CL Brener, mientras el cuarto se empleó como control. Se evaluó la parasitemia en sangre de cada ratón, se realizaron análisis morfométricos de cada cepa durante su pico máximo de parasitemia y se evaluó histopatológicamente los corazones, cerebros, músculos, colon y esófagos de cada ratón a los 5, 15, 30, 60 y 120 días post infección. El periodo prepatente de las cepas Arequipa y Colombia fue de 11 días, mientras la cepa CL Brener fue de 9 días post infección. Las cepas Arequipa y CL Brener presentaron dos formas morfométricas: tripomastigotes de formas delgadas y gruesas, encontrando la mayor concentración de formas delgadas en la cepa CL Brener. Todas las cepas parasitaron al corazón comprobándose así su tropismo y siendo este el órgano más afectado durante la infección, presentando infiltración celular, fibrosis y nidos de amastigotes. La cepa Arequipa fue la primera en presentar nidos a los 5 días post infección, pero no generó muertes en los ratones, en comparación de la cepa CL Brener que ocasionó la muerte del 20% de ratones a los 27 días. Se presentan estos datos como valores importantes para comprender el comportamiento de la cepa Arequipa de T. cruzi y como esta varía en comparación con otras cepas del mismo parásito.
Tesis
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Recuenco, Rojas Fernando Miguel. "El cerdo (Sus scrofa domesticus) como modelo experimental para la infección de Trypanosoma cruzi (mal de chagas)." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2011. https://hdl.handle.net/20.500.12672/12519.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorEvalúa al cerdo doméstico como modelo experimental para la inoculación de Trypanosoma cruzi, en la búsqueda de una especie doméstica que signifique una alternativa más de modelo animal para diversos ensayos en esta enfermedad. Para este fin se inocularon a cuatro gorrinas de tres meses de edad, con una cepa de T. cruzi obtenida de cultivo celular, realizado en las instalaciones del Laboratorio de Investigación y Desarrollo. Utilizando las vías de inoculación sanguínea e intradérmica y utilizando dos diferentes dosis de inóculo: 1x10 6 y 5x10 6 tripomastigotes por animal, suspendidos en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium). Se colectaron muestras sanguíneas semanales para hacer pruebas directas (Microconcentración) e indirectas (EAE-ELISA y TESA Blot), por un periodo de cinco meses. Evaluándose a través de la prueba de microconcentración se obtuvo el 100% de animales positivos (4/4) desde el día 15 post-inoculación. Además se realizaron pruebas serológicas de TESA Blot (Blot con Antígeno excretorio-secretorio de tripomastigote), detectando IgG desde el día 20 post inoculación, resultando positivos el 100% de los animales (4/4). Para la prueba EAE- ELISA (ELISA con antígeno de extracto alcalino de epimastigote) se detectaron IgM desde el día 11 post-inoculación y detectando IgG desde el día 20 post-inoculación resultando positivos el 100% de los animales (4/4). Este estudio demostró la infección experimental en el cerdo, utilizando parásitos obtenidos por cultivo celular, a través de los métodos mencionados. La vía de inoculación intradérmica logró la infección al igual que la vía sanguínea. No se observaron signos clínicos de enfermedad.
Tesis
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Rojas, Rojas Teresa Milagros. "Estandarización y evaluación de una prueba de inmunohistoquímica para la detección de Trypanosoma cruzi en tejidos de Cavia porcellus experimentalmente infectados." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013. https://hdl.handle.net/20.500.12672/12367.
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Evalúa y estandariza la prueba de inmunohistoquímica (IHC) en tejido cardiaco de cobayos experimentalmente infectados. Para ello, se estudiaron 48 cobayos infectados con la cepa Y de T. cruzi y 12 cobayos no infectados, los cuales sirvieron como grupo control. La infección en cada animal fue verificada mediante un frotis de sangre. Para encontrar el tiempo mínimo de post-infección en que la prueba de IHC puede detectar al parásito, se sacrificaron los cobayos pertenecientes a los grupos de 5, 13, 27, 56, 117 y 167 días post-infección, para coincidir con los días de infección aguda y crónica. Al mismo tiempo, la prueba de IHC fue comparada con la tinción de Hematoxilina Eosina (H&E). Para el desarrollo de la prueba de IHC, fue necesario la producción de anticuerpos polivalentes utilizando antígenos de excreción-secreción de formas tripomastigotes del parásito (TESA). Se escogió el conejo, ya que la cantidad que se requería de anticuerpo policlonal es poca y es factible la manipulación de estos animales en el laboratorio. La prueba de IHC presentó una sensibilidad del 58%, mientras que la tinción de H&E presentó una sensibilidad del 44%. La especificidad de ambas pruebas fue del 100%. El tiempo mínimo de detección del parásito T. cruzi en tejido cardiaco fue de 13 días post-infección, empleando la prueba de Inmunohistoquímica. De acuerdo a los datos obtenidos, se puede concluir que la prueba de IHC resulta ser más sensible que la tinción de H&E, al detectar mayor cantidad de nidos de amastigotes en tejido cardiaco y en un menor tiempo.Tesis
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Tarqui, Terrones Kathia Mariela. "Determinación de indicadores entomológicos y fuentes de alimentación de triatómicos en el Centro Poblado El Ron, distrito de Cajaruro, provincia de Utcubamba, Amazonas - Perú." Master's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2014. https://hdl.handle.net/20.500.12672/11001.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorDetermina la presencia de triatómicos, sus indicadores entomológicos y fuentes de alimentación en el centro poblado el Ron, distrito de Cajaruro, provincia de Utcubamba, Amazonas. El diseño del estudio fue descriptivo, de corte transversal. Se realiza un muestreo al 33% del centro poblado El Ron, siendo investigadas las localidades de: Las Tres Marías, El Ron y San Antonio. Se capturaron 139 especímenes de Panstrongylus herreri, distribuidos en 73 adultos y 66 ninfas de diferentes estadios; 15 ejemplares presentaron infección natural con Trypanosoma cruzi. Los principales indicadores entomológicos analizados fueron: Índice de Infestación domiciliaria: 44.0%, Índice tripano triatómico 10.8% e Índice de colonización 54.4%. Los datos obtenidos sugieren que la proporción de infestación domiciliaria y colonización de P. herreri están cerca del 50%. Asimismo se confirmó que el 10.8% de los triatominos presentaban infección con T. cruzi. La principal fuente de alimentación encontrada fue el cobayo, 64.6%, seguida de la fuente de alimentación múltiple humano/cobayo con 62.5%. Basados en estos hallazgos, es que concluimos que los habitantes de este centro poblado presentan un alto riesgo de infección para la enfermedad de Chagas.
Tesis
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Ferrer, Cruz Alejandro Pedro. "Alteración de la estructura del tejido cardiaco de ratones a partir de heces infectadas por Tripanosoma cruzi en T. infestans vector de la enfermedad de Chagas 2007." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2007. https://hdl.handle.net/20.500.12672/14051.
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El documento digital no refiere asesorDemostrar la presencia de amastigotes ( uno de los estadios del T. cruzi ) en el tejido cardiaco de los ratones. Plantea que la inoculación del parásito en estadio de Trypomastigotes que se encuentra en las heces del T. infestans, a ratones, producirá lesiones cardiacas, las cuales se evidencian con la presencia de nidos de amastigotes. El estudio realizado es pre experimental y fue llevado a cabo en el año 2002, en el Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrión de la UNMSM.
Trabajo académico
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Cano, Villar Kary Jenyffer. "Enfermedad de Chagas: endemia americana." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009. https://hdl.handle.net/20.500.12672/15331.
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La enfermedad de Chagas es una zoonosis muy compleja, también conocida como Tripanosomiasis Americana, causada por la infección del protozoo Trypanosoma cruzi (WHO, 2006). En el mes de abril de 1909, Carlos Chagas (1878-1934), investigador del Instituto Oswaldo Cruz (IOC), descubre al agente causal de esta enfermedad en el interior de Minas Gerais (Brasil), denominándolo Trypanosoma cruzi, en homenaje al maestro Oswaldo Cruz y al insecto que lo transmitía (triatomino conocido como “barbeiro”), que también había sido identificado por él a fines de 1908 (Kropf, 2006). La existencia de la enfermedad de Chagas humana es un hecho puramente accidental, en la medida en que el hombre fue entrando en contacto con los focos naturales, provocando desequilibrios ecológicos, forzando a los triatominos infectados a ocupar viviendas humanas. De esta manera, se produce el proceso de la domiciliación, en donde el insecto encuentra refugio y suficiente alimento en la sangre humana y la de los animales domésticos (WHO, 2006).Trabajo de suficiencia profesional
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Gomes, Taynara Cristina. "Situação atual de mães cronicamente infectadas pelo tripanosoma cruzi no estado de Goiás e triagem sorológica para infecção congênita em recém-nascidos pelo teste do pezinho na região metropolitana de Goiânia." Universidade Federal de Goiás, 2016. http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/6157.
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG
The congenital transmission is considered one of the main pathways of Trypanosoma cruzi infection. Retrospective studies of pregnant women population with Chagas disease (CD) allow the study of the epidemiological profile of this population which contributes to the knowledge of the congenital CD prevalence in Brazil. This study evaluated the triage of T. cruzi congenital infection in new-borns through the newborn screening aiming the precocious detection of congenital transmission as well as its retrospective analysis of the seroepidemiological profile of the infected pregnant women dwelling in Goias State in a period of three years (2013-2015). The retrospective study used the data base of the Association of Parents and Friends of Special Needs Individuals (APAE) of Goiania. The analysis showed that the prevalence of CD infected pregnant women from 0.24% to 0.17%, with a decrease throughout the years. Most of these pregnant women had ≥31 years old, which is in accordance with the success of Triatoma infestans vectorial transmission control and transfusional control programmes, improvement in dwellings and better efficacy in diagnostics and therapeutics. The prospective study used the IFI and ELISA techniques for serology and filter paper detection. A total of 967 samples of dry blood in filter paper were collected in three public health units in Goiania and Aparecida de Goiania. From these samples 19 (1.96%) which were collected in filter paper from newborns were from mothers who declared to have CD. Results showed that 8 (42%) from the 19 samples were reagent to IgG anti-T. cruzi in both technique used. Peripheral blood was collected in seven mothers and their respective children. The serum samples were analyzed and the results confirmed IgG positive serology anti-T. cruzi with rates and titulation similar between mother and their respective newborn. Also there was accordance between the serology and the filter paper results which validates this strategy in the newborn screening triage from children from chronically infected mother. This study highlights the importance of the prenatal and neonatal care that precociously identifies the T. cruzi infection and also of programmes of health education about CD to the pregnant women population.
A transmissão congênita é considerada uma das principais vias de infecção pelo Trypanosoma cruzi. Estudos retrospectivos da população de gestantes com doença de Chagas (DC) viabilizam o estudo do perfil epidemiológico desta população, contribuindo para conhecimento da prevalência da DC congênita no Brasil. Este estudo avaliou a triagem de infecção por T. cruzi em recém-nascidos através do teste do pezinho, visando o diagnóstico precoce da transmissão congênita, como também a análise restrospectiva do perfil soroepidemiológico de gestantes infectadas residentes no estado de Goiás em um período de três anos (2013-2015). Para o estudo retrospectivo foi utilizado a base de dados da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE) de Goiânia. As análises mostraram que a prevalência de gestantes com DC variou de 0,24% a 0,17%, apresentando um declínio com o decorrer dos anos. Foi também possível evidenciar que a maioria destas gestantes possuía idade ≥31 anos, dados que corroboram com o sucesso de programas de controle da transmissão vetorial pelo Triatoma infestans e transfusional, melhoria habitacional e melhor eficiência do diagnóstico e da terapêutica. Para o estudo prospectivo foram utilizados os métodos de IFI e ELISA para a sorologia tanto em papel filtro (PF) e soro. Um total de 967 amostras de sangue seco em papel filtro (PF) foi coletado em três unidades de saúde pública em Goiânia e Aparecida de Goiânia, destes, 19 (1,96%), amostras de sangue em PF de RN foram de mães que se autodeclararam com a doença de Chagas. Os resultados mostraram que oito (42%) destas 19 amostras foram reagentes para IgG anti-T. cruzi em ambas as técnicas. Foi coletado sangue periférico em sete mães com seus respectivos filhos. As amostras de soro foram analisadas e os resultados confirmaram sorologia IgG anti-T. cruzi com índices e titulações semelhantes entre mães e seus respectivos RN, havendo concordância entre os resultados obtidos pela sorologia e o PF, validando esta estratégia na triagem dos RN de mães cronicamente infectadas. Este estudo salienta a importância de um acompanhamento pré-natal e neonatal que identifique precocemente a infecção por T. cruzi e também programas de conscientização sobre a DC na população de gestantes.
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Pereira, Alagón Miguel Angel. "Comparación de los métodos de ELISA e IFI para la detección de la enfermedad de chagas en muestras seropositivas del banco de sangre del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen en el 2010." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013. https://hdl.handle.net/20.500.12672/12381.
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Publicación a texto completo no autorizada por el autorCompara los métodos de ELISA e IFI para la detección de la Enfermedad de Chagas en muestras seropositivas del Banco de Sangre del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen en el 2010. Se realizó un estudio descriptivo retrospectivo en 22,589 donantes de Banco de Sangre del Hospital Guillermo Almenara Irigoyen durante el año 2010, para lo cual se realizó el test de ELISA (Chagas biokit). La muestra de estudio estuvo constituida por el total de donantes reactivos e indeterminados para el ELISA (N=183), a los cuales se les realizó un segundo ensayo, y para los casos no concordantes entre el 1er y 2do ELISA se le realizó un tercer ensayo y posteriormente se les realizó inmunofluoresecencia indirecta (IFI) para Chagas. Se recolectaron datos sociodemográficos de los donantes como edad, sexo y procedencia. Los datos fueron registrados en una base de datos y analizados con el programa excel para Macintosch. Se analizaron 183 casos, 134 eran de sexo masculino (73.2%). La proporción de donantes reactivos confirmados para enfermedad de Chagas fue de 2.2 por 10,000 en el Hospital Guillermo Almenara en el año 2010.La edad promedio de los donantes reactivos fue de 35.7 años. El antecedente de donación previa estuvo presente sólo en el 2.2%. La mayoría de los donantes era procedente de la provincia de Lima (157; 85.5%). El 87.4% (160) de los sueros fueron reactivos en el 1er ELISA, 54.6% (100) en el 2do ELISA, 57.4% en el resultado final ELISA y sólo el 2.7% en IFI y el goldstandard. La tasa de concordancia entre el ELISA e IFI fue del 31.1% (57). Todos los casos confirmados con la prueba goldstandard fueron del sexo masculino, y la edad promedio fue de 27.2 años. Sólo el 5% de los sueros reactivos para Chagas con la prueba de ELISA fueron realmente reactivos cuando se utilizó el goldstandard. La prueba de ELISA permite realizar un screening masivo con alta sensibilidad pero baja especificidad, en donantes de Banco de Sangre, y sus resultados deben ser confirmados por IFI y el gold standard (ELISA + IFI) pues sólo el 5% de los sueros reactivos con ELISA, serán realmente reactivos con el gold standard.
Trabajo académico
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FERRÃO, Ana Rita Filipe. "Estudo piloto sobre a prevalência da doença de Chagas em grávidas latino-americanas em Portugal." Master's thesis, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 2012. http://hdl.handle.net/10362/13986.
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A Doença de Chagas é causada pelo protozoário Tripanosoma cruzi e pode ser transmitida aos humanos através do insecto vector triatomíneo (apenas na América latina), de mãe para filho, por transfusão ou por transplante. Após uma fase aguda de algumas semanas de duração, a doença evolui durante décadas de forma assimptomática. Cerca de 40% dos indivíduos nesta fase progridem para a fase crónica, caracterizada por insuficiência cardíaca progressiva e/ou dilatações do trato digestivo.
O deslocamento de um número cada vez mais elevado de migrantes da América Latina para a Europa faz com que a Doença de Chagas seja actualmente um problema de saúde pública nesta região. Importa conhecer a sua epidemiologia através de inquéritos serológicos de forma a permitir uma adequada e atempada actuação das autoridades de saúde. Em Portugal o número de imigrantes latino-americanas tem aumentado ano após ano, destacando-se o Brasil como país de origem. No entanto, o número de migrantes infectados por T. cruzi no nosso país não é conhecido, apontando as estimativas para a existência de cerca de 500 a 1000 indivíduos chagásicos. Neste estudo multicêntrico foi avaliada a prevalência da infecção por T. cruzi em grávidas latino-americanas em três serviços hospitalares de Lisboa, onde a percentagem de imigrantes latino-americanos é a mais elevada do país. Mais de 95% da amostra estudada é originária do Brasil. Não foram encontrados neste estudo casos positivos para Doença da Chagas. No entanto, foi possível elucidar os profissionais de saúde sobre o impacto da Doença de Chagas, avaliando a necessidade de implementação de programas de rastreio continuado.
A comparação entre testes laboratoriais corresponde a um dos métodos utilizados na validação de técnicas, sendo que em Portugal esse tipo de estudo nunca antes havia sido efectuado para a Doença de Chagas. Foi realizada uma comparação entre dois testes serológicos de rastreio (ELISA) para Doença de Chagas das empresas REM e OrthoClinicalDiagnostics. Concluiu-se que as diferenças entre os sinais obtidos não diferem significativamente.Chagas Disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and can be transmitted to humans by the vector triatomin bug (only in Latin America), from mother to child, through transfusion or transplant. After an acute phase of a few weeks of duration, the disease evolves over decades in an assymptomatic form. About 40% of the subjects at this stage progress towards the chronic phase, characterized by progressive heart failure and/or dilations of the digestive tract. The displacement of a growing number of migrants from Latin America to Europe makes Chagas Disease currently a public health problem in this region. It is important to know its epidemiology through serological surveys in order to allow a proper and timely action by the health authorities. In Portugal, the number of Latin American immigrants has increased year after year, highlighting Brazil as the country of origin. However, the number of migrants infected with T. cruzi in our country is not known, pointing the estimates for the existence of about 500 to 1,000 individuals with Chagas Disease. In this multicenter study the prevalence of T. cruzi infection in Latin American pregnant women was evaluated in three hospitals of Lisbon, where the percentage of latin american immigrants is the highest in the country. More than 95% of the sample studied is from Brazil. No positive cases were found positive cases for Chagas Disease in this study. Nevertheless, it was possible to elucidate the health professionals about the impact of Chagas Disease, evaluating the need for the implementation of permanent screening programs. The comparison between laboratory tests is one of the methods used for the validation of techniques, and in Portugal this type of study had never been carried out before for Chagas Disease. A comparison was made between two serological tests (ELISA) for Chagas Disease from the manufacturers REM and OrthoClinicalDiagnostics. It was concluded that the differences between the signals obtained did not differ significantly.
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Ferreira, Renata Cristina Grangeiro. "Caracterização do complexo coesina de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2011. http://repositorio.unb.br/handle/10482/7981.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011.Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-05-23T14:35:35Z No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5)
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A segregação das cromátides irmãs para os pólos opostos da célula durante a divisão celular é um evento complexo durante o ciclo de vida de uma célula eucariótica. Tanto na mitose quanto na meiose a coesão entre as cromátides irmãs é essencial para que ocorra a correta segregação cromossomal, evento sob a responsabilidade do complexo protéico chamado Coesina. Este complexo é melhor conhecido em leveduras e mamíferos, sendo formado por duas proteínas SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). A coesina mantém as cromátides irmãs unidas a partir da fase S do ciclo celular e essa coesão é mantida até a transição entre a metáfase e a anáfase, quando as cromátides irmãs se separam para os pólos opostos da célula. Existem poucos estudos sobre a coesina em tripanossomatídeos e o projeto genoma mostrou a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Neste trabalho nós propusemos a análise da expressão e a imunocitolocalização das subunidades do complexo Coesina em T. cruzi. Anticorpo contra a subunidade TcSCC1 produzido em coelho foi utilizado em ensaios de western blot e imunofluorescência em microscopia confocal, para as formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi. Tais análises indicam uma maior detecção da proteína TcSCC1 na forma amastigotas de T. cruzi, apresentando variações no padrão da localização nuclear. Nas formas epimastigotas um sinal fraco foi detectado e nas formas tripomastigotas não houve sinalização. Estes resultados sugerem a presença da proteína TcSCC1 do complexo coesina principalmente no núcleo das formas amastigotas de T. cruzi. Os níveis de expressão dos genes para as quatro subunidades da coesina foram analisados por RT-PCR em tempo real nas três formas do T. cruzi e verificamos poucas diferenças entre estes níveis, o que sugere um controle pós-transcricional na expressão da SCC1 em T. cruzi. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT
The segregation of sister chromatids to opposite poles of the cell during division is the most complex and, at the same time, the most important event during the life cycle of a eukaryotic cell. Both in mitosis and meiosis cohesion between sister chromatids is essential for the occurrence of the correct chromosomal segregation. The protein complex responsible for cohesion between chromatids is called Cohesin. The Cohesin complex is well known in yeast and mammals, consisting of two SMC (structural maintenance of chromosomes) proteins, SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (sister chromatid cohesion) proteins, the SCC1 and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). The Cohesin keeps sister chromatids together from S phase until the transition between metaphase and anaphase in cell cycle, when sister chromatids separate to the opposite poles of the cell. In trypanosomatids, there are few studies about this complex and the genome project revealed the presence of all Cohesin complex genes in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In this work we proposed the analysis of the expression of the Cohesin subunits and its imunocytolocalization in T. cruzi cells. An antibody anti-TcSCC1 produced in rabbit, was used in western blots and immunofluorescence confocal microscopy analyses of amastigote, epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi. These analyses indicate that the TcSCC1 protein is detected mainly in the amastigote forms with distinct pattern of nucleus localization. Epimastigote form presented a weak signal for the anti-SCC1 antibody and trypomastigote form presented no signal. These results suggest that the SCC1 subunit of the Cohesin complex is present in T. cruzi and it is mainly evident in the nucleus of amastigote form of this parasite. The expression levels of each subunit of the Cohesin complex were analyzed by real time RT-PCR assays in the three forms of T. cruzi and it was found few differences between these levels, suggesting a post-transcriptional control in the SCC1 expression in T. cruzi.
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Sousa, Isabel Garcia. "Expressão heteróloga e citolocalização da y-Glutamilcisteína sintetase e Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2011. http://repositorio.unb.br/handle/10482/8636.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2011Submitted by alcianira lima persch (alcyrpl@yahoo.com.br) on 2011-06-22T22:29:43Z No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5)
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O sistema biológico depende de rígido controle do processo de oxidação proveniente do metabolismo. A oxidação pode resultar em danos irreparáveis em inúmeras moléculas importantes para a manutenção da fisiologia celular. Assim, há uma via metabólica voltada para manter esse sistema reduzido, que nos tripanosomatídeos parece ser única, e alguma interrupção causaria danos ao parasito. Nesse intuito, esse trabalho teve como objetivo estudar duas enzimas participantes da via de óxido-redução do Trypanosoma cruzi identificadas como -glutamilcisteína sintetase (GCS) e glutationa sintetase (GS). A sequência nucleotídica dos gene gcs e gs de T. cruzi codificam proteínas de 693 e 535 resíduos de aminoácidos de massa molecular 79,67 kDa e 58,63 kDa respectivamente. Essas proteínas já foram estudadas em muitos organismos, e apresentam sequências altamente conservadas entre os tripanosomatídeos patogênicos. O baixo grau de identidade com a enzima humana é bastante interessante, pois podem representar alvos específicos para o desenvolvimento de quimioterápicos seletivos. As proteínas recombinantes foram expressas em sistema heterólogo de E. coli, a partir do vetor de expressão gcs-pET28a e gs-pET28a. As proteínas foram purificadas sob condições desnaturantes, pois a rGCSTc só está presente na fração insolúvel do lisado bacteriano, e rGSTc da fração solúvel apresentou dificuldades em se ligar na coluna de afinidade. Os anticorpos policlonais produzidos pelos camundongos imunizados foram eficientes no reconhecimento das proteínas recombinantes e das proteínas nativas no extrato total de epimastigotas de T. cruzi. Análise da imunofluorescência revelou que as enzimas são expressas por todas as formas do T. cruzi e localizam-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Biological systems depend on the strict control of the oxidation process derived from the metabolism. Oxidation can result in irreparable damage to many molecules important to the maintenance of cellular physiology. Thus, there is a pathway to keep the system reduced, that in trypanosomatids appears to be unique, and any disruption would cause damage to the parasite. At this purpose, this work aimed to study two enzymes participating in the redox pathway of Trypanosoma cruzi, identified as _-glutamylcysteine synthetase (GCS) and glutathione synthetase (GS). The nucleotide sequence of the T. cruzi gcs and gs genes encode proteins of 693 and 535 amino acid residues with molecular masses 79.67 kDa and 58.63 kDa respectively. Their proteins have already been studied in many organisms and their sequences are highly conserved among pathogenic kinetoplastids. The low degree of identity with the human enzyme may represent specific targets for the development of selective chemotherapeutic agents. The recombinant proteins were expressed in E. coli using the expression vectors gcs-pET28a and gs-pET28a. The proteins were purified under denaturing conditions, because the rGCSTc is only present in the insoluble fraction of bacterial lysate and the soluble fraction of rGSTc does not bind to the affinity column under non-denaturating conditions. Polyclonal antibodies against the purified enzymes, raised in mice, were effective in the recognition of the recombinant proteins and their native forms in the total extract of epimastigotes of T.cruzi. Immunofluorescence analysis revealed that the enzymes are expressed in all forms of T. cruzi and located within vesicles in the cytoplasm of the parasite.
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Oliveira, Alessandra Rejane Ericsson de. "Identificação e caracterização de uma proteína com motivos ZINC FINGER de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2006. http://repositorio.unb.br/handle/10482/3320.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006.Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-14T12:47:05Z No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5)
Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5)
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Proteínas zinc finger são compostas por domínios compactados contendo α- hélices e folhas β unidos e estabilizados por um ou dois átomos de zinco. Arranjos repetidos de zinc fingers são comumente utilizados para reconhecimento de ácidos nucléicos. Dentre outras atividades, eles estão envolvidos em replicação, transcrição e reparo de DNA. No nucleocapsídeo do vírus HIV tipo 1 foi identificada uma proteína contendo o motivo zinc finger CX2CX4HX4C, estando esta proteína envolvida em várias etapas do ciclo de vida viral, incluindo a propriedade de encapsidação do RNA viral. Em tripanosomatídeos, somente poucas proteínas contendo o motivo zinc finger já foram identificadas até o presente momento. Em um fragmento genômico de 17 kb da banda XX de T. cruzi, nós identificamos três genes in tandem codificando para proteínas zinc finger do tipo CX2CX2HX4C. Nós também demonstramos que genes similares estão presentes em T. brucei e L. major como três definidos grupos monofiléticos entre esses tripanosomatídeos. Em T. cruzi, TcZFP8 corresponde a um novo gene codificando para uma proteína com oito motivos zinc finger. O homólogo de TcZFP8 em T. brucei é aparentemente ausente, enquanto um candidato foi identificado em L. major. A clonagem molecular e a expressão heteróloga de TcZFP8 foi realizada para produção de anticorpos e procedimentos como imunocitolocalização, SELEX e EMSA. Análise por Western blotting revelou a presença dessa proteína nas três formas do parasita. Análises usando extratos protéicos nucleares e citoplasmáticos de T.cruzi mostraram que essa proteína está presente na porção nuclear. Esse resultado foi confirmado através de análise de microscopia por imunofluorescência indireta. Experimento de SELEX demonstrou quatro diferentes populações com uma região interna rica em C e/ou G, porém sem seqüências consenso específicas. Análises preliminares de EMSA de uma das quatro populações selecionadas revelaram evidências de que TcZPP8 possa ter afinidade de ligação à fita simples de DNA. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Zinc fingers are compact protein domains composed of a α-helix and a β-sheet held together by a zinc ion. Tandem arrays of zinc fingers are commonly used to recognize nucleic acids. Among other activities, they are involved in the processes of replication, transcription, and DNA repair. The nucleocapsid protein of HIV-1 contains a zinc finger motif CX2CX4HX4C that contributes to multiple steps of the viral life cycle, including the proper encapsidation of HIV RNA. In trypanosomatids, only a few of the proteins that contain such fingers were identified. In a 17-kb genomic fragment of Trypanosoma cruzi chromosome XX we identified three tandemly linked genes coding for CX2CX4HX4C zinc finger proteins. We also showed that similar genes are present in Trypanosoma brucei and Leishmania major sharing three monophyletic groups among these trypanosomatids. In T. cruzi, TcZFP8 corresponds to a novel gene coding for a protein containing eight zinc finger motifs. Homologous of TcZFP8 in T. brucei is apparently absent, while one candidate in L. major was identified. Molecular cloning of gene TcZFP8 and heterologous expression were performed in Escherichia coli. The purified recombinant protein His6x-TcZFP8 was used to produce antibody in rabbits and GST-TcZFP8 in SELEX and EMSA procedures. Using Western blot analysis, we observed the presence of this protein in all three forms of the parasite: amastigote, trypomastigote and epimastigote. Analysis using cytoplasm and nuclear cell extracts showed that this protein is present in the nuclear extracts and indirect immunofluorescence microscopy analysis confirmed the nuclear localization of the TcZFP8. SELEX experiment showed four different populations rich in C and/or G nucleotides, but with none consensus sequence. Preliminary EMSA from one population gave evidence that TcZFP8 has affinity to bind to singlestranded DNA.
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Oliveira, Licia Silva. "Modelando a interação entre o sistema imunologico humano e o Tripanossoma cruzi." [s.n.], 2010. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/307206.
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Orientador: Hyun Mo YangDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica
Made available in DSpace on 2018-08-15T07:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_LiciaSilva_M.pdf: 2109455 bytes, checksum: 069de481ab0344fa7d803510e59bfd4a (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: A ação da resposta imunológica na infecção de Trypanosoma cruzi envolve dois mecanismos: um que resulta na produçao de anticorpos específicos contra antígenos do parasita e outro correponde a resposta imunológica celular com atividade citotoxica, que mata as celulas infectadas ou aqueles que expressam antígeno parasitario pela acao de linfócitos T citotóxicos. Com o objetivo de abordar o processo de infeccao por Trypanosoma cruzi e o mecanismo de delimitacao no organismo do hospedeiro promovida pelo sistema imunologico, dois modelos matematicos da interacao entre sistema imune e Trypanosoma cruzi são apresentadas. Apesar da simplicidade da dinamica das populacoes isoladas de organismos patogenicos e das celulas, a descriçao da interacao entre eles se torna altamente complexo. Assim, apresentamos o desenvolvimento de dois modelos simplificados pela necessidade de anaílise quantitativa das respostas humoral e celular
Abstract: The action of the immune response in the infection of Trypanosoma cruzi involves two mechanisms: one that results in the production of specific antibodies against antigens of the parasite and the cellular immune response with cytotoxic activity, which kills infected cells or those expressing antigen parasitic by the action of cytotoxic T lymphocytes. Aiming to address the process of infection by Trypanosoma cruzi and the mechanism of delimitation in the organism of the host promoted by immune system, two mathematical models of the interaction between system immune and Trypanosoma cruzi are presented. Despite of the simplicity of the dynamic of the isolated populations of pathogen and the cells, the description of the interaction of them becomes highly complex. Hence, we present the development of two simplified models by the necessity of quantitative analysis of humoral e cell responses
Mestrado
Biomatematica
Mestre em Matemática Aplicada
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Biondo, Cheysa Arielly. "Caracterização de miosinas órfãs de Trypanossoma cruzi (Chagas, 1909)." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2012. http://hdl.handle.net/1884/26847.
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Resumo: Miosinas são motores moleculares envolvidas com diferentes formas de movimentação celular, como fagocitose, citocinese, contração muscular, batimento de cílios e tráfego de organelas e partículas. Elas usam a energia derivada da hidrólise do ATP para realizar esses movimentos e possuem um domínio motor comum. A diversidade dos membros da família nos permite agrupá-las em classes. A miosina muscular foi definida como convencional (classe 2), enquanto outros tipos são referidos coletivamente como miosinas não-convencionais (agrupadas em várias classes). Miosinas que filogeneticamente não se agrupam com qualquer outra miosina são denominadas miosinas órfãs. T. cruzi possui, além dos genes que codificam para duas miosinas (uma presente em quase todos os organismos – classe 1 – e uma presente apenas em outros tripanosomatídeos – classe 13), outros sete genes identificados que codificam para miosinas órfãs, chamadas de MyoA, MyoB, MyoC, MyoD, MyoE , MyoF, MyoG, que são o foco deste trabalho. Para iniciar a caracterização destas miosinas, experimentos foram delineados visando elucidar a localização celular e as proteínas que interagem com as miosinas. Para alcançar estes objetivos foi necessária a expressão de proteínas recombinantes para a produção de anticorpos em camundongos que foram utilizados para ensaios de imunolocalização e imunoprecipitação. Em paralelo, a transfecção do parasita para a expressão da proteína fusionada ao GFP e identificação da sua localização foi realizada. Os resultados nos confirmam que cinco das sete miosinas identificadas in silico são encontradas nos extratos protéicos das formas epimastigotas do parasita, mas que essa expressão deva ocorrer em baixos níveis. A localização celular visualizada através da utilização de anticorpos foi realizada para a MyoC, MyoD e MyoE. As miosinas C e E se concentram na região anterior do parasita, compatível com a bolsa flagelar e base do flagelo respectivamente e a miosina D tem uma localização granular dispersa pelo citoplasma. As demais miosinas tiveram sua localização visualizada somente quando expressas fusionadas à etiqueta de GFP, através da captação da fluorescência da etiqueta. A maioria dessas localizações apresentaram um padrão disperso pelo corpo celular, com exceção da MyoF que apresentou uma localização filamentar concentrada da porção anterior do parasita. Estamos trabalhando para identificar as proteínas que possam estar interagindo com as miosinas órfãs de T. cruzi. O nocaute gênico foi realizado para MyoC e ocorreu morte da cultura celular após o provável silenciamento de um dos alelos desta proteína. Estamos investigando se o hemizigoto realmente não é viável ou se não houve a adequada recombinação do cassete de resistência nessa primeira tentativa de transfecção. O estudo das miosinas de T. cruzi, suas funções e suas interações dentro da célula irá contribuir para a avaliação do papel do citoesqueleto em Trypanosoma cruzi.
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Magalhães, Adriana Dias. "Subproteômica de Trypanosoma cruzi : proteínas básicas e fosfoproteoma." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2010. http://repositorio.unb.br/handle/10482/9065.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010.Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5)
Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5)
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O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto, envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas.
The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive. Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel. Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles. Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.
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Mandacaru, Samuel Coelho. "Análise de proteínas nucleares reguladas na amastigogênese e de complexos proteicos de Trypanosoma Cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2013. http://repositorio.unb.br/handle/10482/12949.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013.Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:47:13Z No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5)
Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5)
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Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT
A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).
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Wyllie, Melisa Patricia. "Caracterização dos mecanismos de resistência ao sistema complemento humano e microvesiculação em diferentes cepas de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2017. http://hdl.handle.net/1884/49075.
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Orientador : Prof. Dr. Marcel Iván Ramírez ArayaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 31/01/2017
Inclui referências : f. 78-87
Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas. Considerada como uma doença tropical negligenciada, esta doença acomete milhões de pessoas do mundo e atinge também mamíferos silvestres e domésticos. Para produzir uma infecção o parasito T. cruzi precisa evadir o sistema imune inato do hospedeiro. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra patógenos; e o sistema complemento representa o principal mecanismo da defesa inata. O sistema complemento é formado por um conjunto de proteínas que são ativadas em cascata e, que culmina na formação de um poro na membrana do patógeno, provocando a sua lise. Todavia, muitos organismos patogênicos como o T. cruzi têm desenvolvido vários mecanismos para escapar o ataque do sistema complemento afin de progredir no seu ciclo de vida, e portanto estabelecer a infecção. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo de evasão empregado por patógenos, que é a liberação de microvesículas. Microvesículas são estruturas bicamadas lipídicas complexas (0.1-1 ?m), oriundo da brotamento e fissão da membrana plasmática e que transportam várias moléculas derivadas das células de origem tais como proteínas e ácidos nucleicos. Nosso grupo de pesquisa recentemente descreveu alguns aspectos das características e papel das microvesículas nos mecanismos de evasão do sistema imune inata e durante os eventos de infecção, utilizando como modelo as microvesículas liberadas durante a interação de apenas uma cepa de T. cruzi com células hospedeiras. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo analisar microvesiculação em diferentes cepas de T. cruzi durante a interação com células hospedeiras e availar seu efeito. Apresentamos evidências de que a liberação de microvesículas é induzida durante a interação entre tripomastigotas metacíclicos de diferentes cepas de T. cruzi, G (TcI) e Y (TcII), e células sanguíneas (monócitos) e que existem diferenças na produção de microvesículas entre as diferentes cepas. Os nossos resultados também demostram o envolvimento das microvesículas isoladas nos mecanismos de resistência de T. cruzi à lise mediada pelo complemento e os mecanismos de invasão. A adição de microvesículas a 6,25% de soro humano normal aumentou a resistência dos parasitos da cepa Y à lise mediada por complemento de 50% para 80%; este fenômeno foi mais pronunciado em parasitos da cepa G, pois este aumento quase dobrou. Em termos do papel das microvesículas na infectividade de parasito, verificamos que as microvesículas induziram um aumento de invasão celular pelo parasito. Na presença de microvesículas, o número de parasitos da cepa Y invadindo células mamíferas aumentou por aproximadamente 50%, entretanto mais uma vez este fenômeno foi mais evidente para parasitos da cepa G, o número de parasitos que penetraram as células mamíferas duplicou. Curiosamente, foi observado que o papel das microvesículas na resistência à lise do complemento e na invasão é de classe específica, uma vez que as microvesículas de uma classe não tinha efeito sobre os parasitos de outra classe. Isto indica que as cepas têm mecanismos de inibição independentes e que os componentes de microvesículas poderiam ser diferentes. Finalmente foi comprovado que as microvesículas carreiam proteínas parasitárias envolvidas na interação parasitohospedeiro e que soro de pacientes chagásicos possuem anticorpos que reagem com componentes das microvesículas. Isto fornece evidências de que as microvesículas poderiam ser utilizadas por T. cruzi para transferir fatores de virulência a células hospedeiras e do potencial das mesmas como biomarcador para o diagnóstico da doença. Com esse trabalho foi possível demostrar novos aspectos da relevância de microvesículas durante a interação de diferentes cepas de T. cruzi com células hospedeiras. Palavras-chave: microvesículas. sistema complemento. invasão.
Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Considered a neglected tropical disease, this disease affects millions of people worldwide as well as wild and domestic mammals. In order to produce an infection, the T. cruzi parasite has to evade the host's innate immune system. The innate immune system is the first line of defense against pathogens; and the complement system represents the main mechanism of innate defense. The complement system is composed of a set of proteins that are activated in cascade, culminating in the formation of a pore in the membrane of the pathogen, resulting in its lysis. However, many pathogenic organisms such as T. cruzi have developed several mechanisms to escape the attack of the complement system, in order to progress in their life cycle, and thus establish an infection. Recently, a new evasion mechanism used by pathogens has been described, this is, the release of microvesicles. Microvesicles are complex lipid bilayer structures (0.1-1 ?m), originating from the outward blebbing and fission of plasma membrane, and which carries molecules derived from the parent cell such as proteins and nucleic acids. Our research group recently described some aspects of the characteristics and role of microvesicles as a mechanism of evasion of the innate immune system and during the infection process, using as model, the microvesicles released during the interaction of only one strain of T. cruzi with host cells. Accordingly, the objective of the present work was to analyse microvesiculation during interaction of different T. cruzi strains with host cells and to evaluate their effect. We present evidence that microvesicle release is induced during the interaction between metacyclic trypomastigotes from different T. cruzi strains, G (TcI) and Y (TcII), and blood cells (monocytes). Our results also demonstrate the involvement of microvesicles, isolated from T. cruzi and host cells interaction, in parasite resistance to complementmediated lysis and invasion mechanisms. Addition of microvesicles to 6,25% normal human serum increased parasite resistence to complement-mediated lysis from 50% to 80% in parasites of Y strain; this inhibition was more pronounced in G parasites since this increase was almost doubled. In terms of the role of microvesicles in parasite infectivity, we verified that the microvesicles induced an increase in cellular invasion by the parasite. In the presence of microvesicles, the number of parasites of the Y strain invading mammalian cells increased by approximately 50%, however once again this phenomenon was more evident for parasites of G strain, the number of parasites that penetrated the mammalian cells duplicated. Interestingly, it was observed that the role of microvesicles in resistance to complement lysis and invasion is class-specific, since microvesicles of one class had no effect on the parasites of the other class. This indicates that the strains have independent inhibition mechanisms and that the components of microvesicles could be different. Lastly, it was demonstrated that microvesicles carry parasite proteins involved in the parasite-host cell interaction and that sera from chagasic patients contain antibodies that react with microvesicular components. This provides evidence that microvesicles could be used by T. cruzi to transfer virulence factors to host cells and their potential application as a biomarker for the diagnosis of this disease. With this work, it was possible to demonstrate new aspects of the relevance of microvesicles released during the interaction of different T. cruzi strains with host cells. Key words: microvesicles. complement system. invasion.
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Dias, Greicy Brisa Malaquias. "Desenvolvimento de linhagens TcI e TcII de Trypanosoma cruzi expressando proteínas fluorescentes para estudo da interação parasito-hospedeiro." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2016. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/175842.
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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.Made available in DSpace on 2017-05-23T04:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345764.pdf: 1327591 bytes, checksum: 16526788a991cb47c5948515e0df47a4 (MD5) Previous issue date: 2016
Surtos de doença de Chagas aguda associados à transmissão pela via oral têm sido reportados no Brasil e em outros países da América do Sul. Contudo, estudos sobre a dinâmica da infecção por via oral ainda são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a interação in vitro e in vivo de linhagens transfectadas de T. cruzi TcI e TcII com plasmídeos pTREXRFP/GFPNeo e pROCKGFPNeo. Para tanto, foram geradas linhagens da cepa SC25 (TcI) e SC96 (TcII) expressando de maneira estável as proteínas fluorescentes RFPe GFP, respectivamente. A cepa Y expressando GFP foi utilizada em ensaios de interação parasito-hospedeiro. Estudos in vitro mostraram que a transfecção não alterou o crescimento e a capacidade de infecção das cepas. Ensaios de co-infecção em células THP-1 mostraram que misturas de parasitos TcI e TcII em diferentes proporções apresentaram níveis de infecção inferiores aos observados para as cepas em infecções isoladas eque uma mesma célula comporta a infecção pelas duas linhagens de parasitos. Triatomíneos infectados isoladamente com cada uma das cepas transfectadas apresentaram taxa de infecção semelhante. Contrariamente, infecções mistas nos insetos mostraram um predomínio de parasitos da linhagem TcII. Em camundongos a infecção pela via oral da cepa TcI não foi capaz de induzir parasitemia sanguínea detectável nos animais. Por outro lado, a cepa YGFP ocasionou parasitemia sanguínea patente e nas inoculações com misturas de TcI e TcII, apenas parasitos TcII foram detectados no sangue e tecidos de animais infectados. O tratamento de tripomastigotas da cepa SC25RFP com pepsina reduziu significativamente sua capacidade de infecção em células THP-1, sugerindo que a passagem pelo ambiente gástrico pode ter interferido negativamente na infecção de camundongos pela via oral. A avaliação histopatológica mostrou que o processo inflamatório na fase aguda foi mais intenso e com presença de parasitismo apenas no tecido cardíaco para a cepa YGFP. Na fase crônica a inflamação foi reduzida e não foram encontrados parasitos visíveis nos tecidos avaliados. Contudo, a PCR revelou a presença de DNA do parasito em todos os tecidos examinados. Os resultados do presente trabalho sugerem que a dinâmica da co-infecção está mais associada às características das cepas de T. cruzi do que a linhagem genética (DTU) à que elas pertencem. Parasitos transfectados expressando genes repórteres distintos pode ser uma ferramenta útil no estudo da dinâmica de infecção mista.
Abstract : Acute Chagas' disease outbreaks associated with oral transmission have been reported in Brazil and other South American countries. However, oral infection dynamics studies are still incipient. The present work aimed to evaluate the in vitro and in vivo interaction of T. cruzi TcI and TcII transfected strains with plasmids pTREXRFP / GFPNeo and pROCKGFPNeo. Transfected SC25 (TcI) and SC96 (TcII) strains were showed stable RFP and GFP fluorescent proteins expression, respectively. Y strain expressing GFP was used in parasite-host interaction assays. In vitro studies showed that transfection did not afected the strains growth. Co-infection assays in THP-1 cells showed that mixtures of TcI and TcII parasites in different proportions had lower levels of infection than those observed for the isolated strains and that the same cell carries infection by the two strains of parasites. Triatomines infected with each transfected strains showed a similar infection rate. In contrast, mixed infections showed a predominance of TcII lineage parasites in the insect gut. In mice, oral infection with TcI strainwas not able to induce detectable blood parasitemia in the animals. On the other hand, the YGFP strain caused patent blood parasitemia and in mixed infections only TcII parasites were detected in blood and tissues of infected mice. Treatment of trypomastigotes of the SC25RFP strain with pepsin significantly reduced their ability to infect THP-1 cells, suggesting that passage through the gastric environment may have interfered with the parasite capacity to infect mice by oral route. The histopathological evaluation showed that inflammatory process was more intense in the acute phase and YGFP parasites were detected only in heart. In the chronic phase inflammation was reduced and no visible parasites were found in the evaluatedt issues. However, PCR revealed parasite DNA in all examined tissues. The present work suggest that co-infection dynamics is more associated with the T. cruzi strain characteristics than the genetic lineage (DTU) to which they belong. Transfected parasites expressing different reporter genes may be a useful tool for the study of mixed infection dynamic.
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Llanos, Ricardo Pariona. "Caracterização de interações proteína-DNA em tripanossomas." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42135/tde-22092014-184950/.
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O T. cruzi, é o agente causador da doença de Chagas. O estado redox NAD+/NADH intracelular é fundamental na manutenção do metabolismo celular. A GAPDH apresenta a função de proteção do telômero em mamíferos contra degradação, isto por causa de ligar se ao telômero. Aqui, mostramos que a GAPDH recombinante de T. cruzi (rTcGAPDH) interage com o DNA telomérico. A rTcGAPDH liga ao DNA de simples fita. Mostramos que a GAPDH liga ao DNA telomérico in vivo em células epimastigotas, onde a [NADH] é maior que [NAD+], mas a adição de NAD+ exógeno bloqueia esta interação. Corroborando a hipótese de que o equilíbrio NAD+/NADH determina a interação GAPDH-telômero, vimos que o tripomastigota tem maior [NAD+] intracelular que a [NADH] e a GAPDH não é capaz de ligar se ao DNA telomérico. Além disso, o NADH exógeno resgata a interação GAPDH-telómero nesta fase. É importante o equilíbrio NAD+/NADH desta interação em tripanosomas, sugerindo que a proteção do telômero do parasita pode ser regulada pelo estado metabólico das células.The T. cruzi, is the causative agent of Chagas disease. The redox state of NAD+/NADH intracellular is critical in the maintenance of cellular metabolism. The GAPDH has the protection function of the telomere in mammals against degradation, because it is connecting to the telomere. Here we show the recombinant GAPDH of T. cruzi (rTcGAPDH) interacts with telomeric DNA. The rTcGAPDH binds to single-stranded DNA. We show GAPDH to bind to telomeric DNA in vivo epimastigotes cells, where [NADH] is greater than [NAD+], but the addition of exogenous NAD+ blocks this interaction. Corroborating the hypothesis that the NAD+/NADH balance determines the GAPDH-telomere interaction, we saw that the trypomastigote has higher [NAD+] that intracellular [NADH] and GAPDH is not able to connect to telomeric DNA. In addition, the exogenous NADH recovers the GAPDH-telomere interaction at this stage. It is important the NAD+/NADH balance this interaction in trypanosomes, suggesting that the protection of the telomere of the parasite can be regulated by the metabolic state of the cells.
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Souza, Flávia Sá Pereira de. "Caracterização da proteína TcKAP3 do cinetoplasto do Protozoário Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2009. http://hdl.handle.net/1884/20201.
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Francisco, Eduardo Lemons. "Análise do padrão de decaimento do Transcriptoma de Trypanosoma Cruzi." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2012. http://hdl.handle.net/1884/27156.
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Resumo: O protozoario Trypanosoma cruzi controla sua expressao genica principalmente por mecanismos pos-transcricionais como, por exemplo, a estabilidade de mRNAs. Em trabalho anterior, foram realizados experimentos de microarranjos, para avaliar o decaimento de mRNA de epimastigotas de T. cruzi Dm28c, tratados por 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 e 240 minutos com 10 ƒÊg/mL e 50 ƒÊg/mL de actinomicina D (pontos em replicata, totalizando 40 amostras). Comparando-se os pontos temporais extremos, observou-se de 2 a 3 mil genes diferencialmente expressos para estabilidade de mRNA. Devido as limitacoes inerentes a tecnica de microarranjos, e a possibilidade de se utilizar sequenciamento de DNA como abordagem, a qual possui diversas vantagens em relacao aos microarranjos, foi idealizado o presente trabalho, que foi replanejado de acordo com as informacoes colhidas no trabalho citado acima. Foram analisados pontos temporais de decaimento menores (0, 5, 10, 15, 20 e 25 minutos) com a tecnica de sequenciamento RNA-Seq WT. As vantagens em relacao aos microarranjos sao: medida absoluta (quantitativa), maiores alcance dinamico, resolucao e cobertura genomica, sem hibridizacao cruzada e com pouco ruido de fundo. A dose efetiva do inibidor actinomicina foi fixada em 10 ƒÊg / mL / 107 celulas e foi acrescido sinefungina a 1 ƒÊg / mL / 107 celulas para as analises de decaimento dos mRNAs de T. cruzi. Em conjunto, nossos dados mostram que uma pequena parte da regulacao da expressao genica desse parasito durante o seu ciclo de vida pode ser explicada pela estabilidade de suas moleculas de mRNA. Ja que, foi possivel relacionar a velocidade de decaimento dos transcritos maduros com grupos funcionais envolvidos com montagem e manutencao do citoesqueleto, de ribossomos e de utros tipos de complexos ribonucleoproteicos.
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Mansur, Fernanda Cristina Borini. "Caracterização funcional de proteínas Poli-Q em Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2013. http://hdl.handle.net/1884/29684.
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Resumo: Em tripanossomatídeos, a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. A associação entre mRNAs e determinadas proteínas determinam o destino de um mRNA, direcionando-o à tradução, repressão ou degradação. Para caracterizar complexos proteicos associados a mRNAs traduzidos ou não-traduzidos, um trabalho prévio isolou mRNPs de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional utilizando microesferas poli-(T) e os complexos proteicos ligados a mRNAs poli-(A+) foram analisados por espectrometria de massas. Dentre estas proteínas, uma proteína poli-Q com função desconhecida, ortóloga à TbGAP2 em T. brucei, foi identificada, presente nas frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. O objetivo deste estudo é caracterizar esta proteína e determinar se esta está envolvida com a regulação da expressão gênica. O gene codificador desta proteína foi clonado e expresso para produzir anti-soro policlonal. O anti-soro contra a proteína TcGAP2 mostrou especificidade e identificou uma proteína de tamanho esperado em extratos de T. cruzi. TcGAP2 está presente no cinetoplasto e no citoplasma. Além disso, análises por Western blotting mostraram que TcGAP2 está diminuída nas formas metacíclicas, corroborando a marcação de imunofluorescência mais fraca nestas formas. Quando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional foram aplicados em gradiente de sacarose 15-55% e as frações foram analisados por imunoblotting, a proteína foi detectada em polissomos apenas nas últimas formas. Marcação in situ de nicks e gaps nas redes de minicírculos com a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) e dUTP fluorescente seguida de imunofluorescência mostrou co-localização parcial indicando certo envolvimento com replicação de minicírculo. Para identificar mRNAs e proteínas associadas a complexos mRNPs contendo TcGAP2, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com o soro contra TcGAP2 usando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. Os RNAs alvo de TcGAP2 foram identificados por sequenciamento de RNA em larga escala e as proteínas, por espectrometria de massas. Os transcritos dos complexos contendo TcGAP2 mudam entre as duas formas, entretanto eles são funcionalmente relacionados, estando enriquecidos em ligação a ATP, fosforilação de proteínas, processo metabólico, dentre outros. Análises utilizando o algoritmo MEME foram realizadas para identificar motivos de sequência comuns dentre os alvos identificados. Nenhum motivo aparente foi encontrado nas regiões 3' não-traduzidas nem nas regiões codificadoras. Entretanto, dois motivos foram encontrados na região 5' nãotraduzida. Assim como os RNAs alvo mudam entre os dois estágios, as proteínas parceiras também. Algumas das proteínas identificadas em epimastigotas como parte dos complexos contendo TcGAP2 incluem proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e em epimastigotas sob estresse nutricional, várias proteínas hipotéticas. Já GAP1 foi identificada em ambas formas e, juntamente com GAP2, está envolvida com estabilização de gRNA em T. brucei. O duplo nocaute do gene de TcGAP2 não se mostrou viável sugerindo que este gene seja essencial. Estes dados sugerem que esta proteína pode ter diferentes funções dependendo de sua localização e que TcGAP2 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos no citoplasma que podem estar regulando o processamento de mRNAs específicos.
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Sousa, Alessandro Oliveira de. "Transferência de DNA de Trypanosoma cruzi para retrotransposons line-1 de camundongos chagásicos tratados com nitroderivado benzonidazol." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2012. http://repositorio.unb.br/handle/10482/11297.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012.Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-24T15:32:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5)
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As publicações de pesquisadores do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, na Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, sugerem que a patogênese da doença de Chagas pode ser explicada pela auto-imunidade de origem genética (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011). A hipótese que levou as investigações sobre transferência de DNA do Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro mamífero foi feita depois que se observou que coelhos tratados com a droga tripanocida benzonidazol desenvolveram lesões destrutivas no coração com intensidade semelhante àquela encontrada nos coelhos chagásicos que não tinham recebido a droga. Entretanto, pesquisadores de outros centros consideram que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado benzonidazol é eficaz nos casos agudos da doença. Ademais, há os que tratam chagásicos com a infecção crônica, na expectativa de aliviar sintomas e melhorar o prognóstico do caso. Não obstante, vários autores sugerem que o tratamento com o nitroderivado não elimina a infecção pelo T, cruzi e não melhora o quadro da doença clínica. Esta polêmica tem mais que importância semântica, pois, se a quimioterapia da doença de Chagas fosse satisfatória poderia esclarecer os papéis das infecções persistentes e da autoimunidade na patogênese da doença. Os estudos prévios de Nitz e cols., 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011, mostram que sequências de minicírculo de DNA mitocondrial de T. cruzi (kDNA) integram frequentemente em retrotransposons LINE-1 no genoma hospedeiro, e sugerem que clones de linfócitos geneticamente modificados atacam e destroem o coração chagásico. Este estudo foi iniciado com o propósito de tentar falsear a teoria da origem genética da autoimunidade na doença de Chagas. Para isto, empregaram-se vários esquemas terapêuticos pelos quais grupos de camundongos com as infecções recentes pelo T. cruzi eram tratados com o nitroderivado benzonidazol, em dose quatro vezes acima (43 mg/kg) daquela usada para tratar a doença em humanos, e que era utilizado, alternativamente, em combinação com zidovudina (AZT) e ciprofloxacino (CIPRO), respectivamente, inibidores da transcriptase reversa e da Topoisomerase II. Essas enzimas bloqueiam vias metabólicas essenciais na integração do kDNA do T. cruzi no genoma (Rosa, 2005). Os resultados da investigação mostraram que os grupos de animais chagásicos tratados apenas com benzonidazol, ou em combinação com os inibidores, tiveram diminuição da quantidade de tripomastigotas de T.cruzi no sangue. Entretanto, jamais se observou cura parasitológica e imunológica (ausência de anticorpos específicos) nos animais submetidos aos diferentes esquemas terapêuticos. Ademais, todos os animais nos grupos tratados obtiveram positividade nos exames PCR específicos para identificação de DNA nuclear (nDNA) e de (kDNA) do protozoário. Diante desses resultados, foram conduzidos experimentos para avaliar se os esquemas terapêuticos empregados tinham bloqueado a integração do kDNA no genoma dos camundongos, infectados e infectados-tratados. Os resultados desses experimentos mostraram integrações de kDNA em retrotransposons LINE-1 do genoma de animais chagásicos que foram submetidos aos vários esquemas de tratamento, com frequências similares aquelas documentadas nos genomas dos camundongos controle positivos, infectados com T. cruzi e deixados sem tratamento. As populações de linfócitos T citotóxicos CD8+, γδ, e β (Vβ e Vβ1) atacam e destroem o coração chagásico. O conjunto de resultados desses experimentos mostra que não foi possível refutar (negar) a teoria auto-imune da patogênese da doença de Chagas. Lamentavelmente, confirmou-se que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado é insatisfatório.
The investigations conducted at the Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory at the Faculty of Medicine of the University of Brasilia suggest that the origin of the pathogenesis of Chagas Disease may be explained by the genetically driven autoimmune rejection of the target host tissues. Early experiments had shown that chagasic rabbits treated with the anti-Trypanosoma cruzi nitroderivative benznidazole developed destructive lesions in the heart similar to those found in chagasic, but untreated animals. This observation led to the hypothesis that the parasite DNA retained in the body could call out autoimmune mechanisms in Chagas disease. This hypothesis spurted further investigations on the transfer of T. cruzi DNA to the host's genome. Inasmuch some researchers continue to believe that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benzonidazole cure the Chagas disease, and others argue that the treatment should benefit those with the acute T. cruzi infections; prescriptions of the nitroderivative to treat the chronic infections aim at the prevention of disease outcome, aleviation of symptoms, and improvement of prognostics are recommended. Nevertheless, experimental and clinical investigations have shown that the treatment with the nitroderivative does not eradicate the T. cruzi infections and, therefore, the prognosis of the disease remains unchanged. This study subject bears practical importance, because it can show whether or not the chemotherapy of Chagas disease is satisfactory. Furthermore, its investigation in a suitable animal model may demonstrate any role played by the parasite persistence in the pathogenesis of the disease. Previous studies (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011) showed that the mitochondrial DNA minicircle sequence of T. cruzi integrates frequently into LINE-1 of the host's genome, and they suggest that clones of cytotoxic T lymphocytes, undergoing genotype modifications, attack and destroy the chagasic heart. This study was undertaken with the aim of falsifying the theory of the genetically driven autoimmune rejection of the heart in Chagas disease. We used several groups of mice with the T. cruzi infections, which were treated with the nitroderivative benznidazole four fold (43 mg/kg) above the dose used to treat human Chagas disease. Also, groups of chagasic mice were treated with benznidazole (43mg/ml) combined with either zidovudine (AZT) or ciprofloxacino (CIPRO), or with both, inhibitors of reverse transcriptase and of topoisomerase II,respectively. These enzymes were used to halt metabolic pathways for the integration of kDNA minicircle sequences into the host cell genome (Rosa, 2005). The results of these investigations showed that animals treated with benznidazole alone, or in combination with AZT, CIPRO, or with both inhibitors, diminished the number of T.cruzi trypomastigotes in the blood. However, the parasitologic cure was never achieved, for specif anti-parasite antibodies remained in tissues,regardless of the therapeutic regime used. Moreover, treated mice yielded positive PCR exams that identify the T. cruzi nuclear DNA (nDNA) and kDNA. Accordingly, further experiments were carried on to finding out whether the therapeutic regimes used had prevented the kDNA integration into the chagasic mice genome. These results revealed that the kDNA minicircle sequences integrated into retrotransposons LINE-1 of mice, which had received the therapeutic regimes, in a frequence not different from that observed in the positive control group of T. cruzi-infected mice, which did not receive any therapeutic regime. It was further shown that subsets of cytotoxic T lymphocytes CD8+, γδ, and β (Vβ and Vβ1) attacked and destroyed the chagasic heart. The results of these experiments reveal that it was not possible to falsify (deny) the genetically driven auto-immune theory that explains the pathogenesis of Chagas disease. Unfortunately, it was confirmed that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benznidazole is unsatisfactory.
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Slompo, Eloise Pavão Guerra. "Análise filogenética e funcional das proteínas RBP7 e RBP40 em tripanossomatídeos." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2014. http://hdl.handle.net/1884/45420.
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Orientador : Prof. Dr. Bruno DallagiovannaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/07/2014
Inclui referências : f. 105-111
Resumo: Os organismos estão constantemente em modificação. Seja em resposta a pressões do ambiente, seja por eventos estocásticos, as modificações podem ser momentâneas ou hereditárias. Modificações momentâneas são desempenhadas pela regulação da expressão gênica, enquanto as hereditárias são os eventos evolutivos. A junção destas duas respostas biológicas, a evolução das redes regulatórias da expressão gênica, ainda é uma questão em aberto na biologia. O parasita unicelular Trypanosoma cruzi, além de sua importância médica, constitui um organismo modelo para o estudo da regulação pós-transcricional da expressão gênica. Devido à sua ramificação precoce na árvore filogenética dos seres vivos, é também um modelo no estudo da biologia evolutiva. Uma de suas RBPs (proteína de união ao RNA), a proteína regulatória TcRBP40, foi caracterizada em um estudo anterior. No atual trabalho foi determinada a sua localização celular: os reservossomos do parasita, estrutura anteriormente conhecida como de armazenamento nutricional. A presença desta proteína regulatória nesta organela, juntamente com outras proposições recentes, indica funções adicionais dos reservossomos para a biologia do parasita. Uma análise filogenética mostrou que o gene codificante da TcRBP40 originou-se junto com o gene da TcRBP7 a partir da duplicação de um gene ancestral, assim como seus homólogos em T. brucei (TbRBP7A e B). De acordo com a filogenia, os eventos de duplicação destes genes nestes organismos ocorreram de modo independente, após a divergência das duas espécies, e que estão acumulando mutações de modo assimétrico. As estruturas das proteínas foram preditas por modelagem por homologia e comparadas, sendo identificados os sítios divergentes. As proteínas TcRBP7 e TbRBP7A conservam maior semelhança, enquanto TcRBP40 é a mais divergente do grupo. Os alvos das proteínas TcRBP7 e TcRBP40 foram determinados por ribonômica in vivo e sequenciamento de nova geração, mostrando que menos de 10% são alvos em comum entre elas. Isso indica que estas RBPs de T. cruzi, apesar de conservarem 72% de identidade, regulam redes distintas de genes e portanto desempenham funções biológicas diferentes. Futuras análises poderão responder como as novas redes regulatórias surgem nos organismos, e como evoluem para desempenhar papéis distintos na biologia dos organismos.
Abstract: Organisms are constantly changing. In response to environmental pressures, or for stochastic reasons, those changes might be transient or inheritable. Transient changes are played by gene expression regulation, while inheritable ones consists on evolutionary events. The joining of both biological responses, which accounts for the gene expression regulatory networks evolution, is still an open question in biology. The unicellular parasite Trypanosoma cruzi, beyond its medical importance, is a model organism for posttranscriptional gene expression regulation studies. Due to its early-branching in the tree of life phylogeny, it is also a model for the study of evolution biology. One of its RBPs (RNA binding proteins), the regulatory protein TcRBP40, was characterized on a previous study. In this current work, its cellular location was determined: the parasite's reservosomes, previously known as a nutritional storage compartment. The presence of this regulatory protein inside this organelle, altogether with other recent propositions, indicates additional regulatory functions performed by reservosomes in the parasite's biology. A phylogenetic analysis revealed that TcRBP40 coding gene arose with TcRBP7 from the duplication of an ancestral gene, just as its T. brucei homologs (TbRBP7A and B). According to this phylogeny, the duplication events of these genes on those organisms occurred independently, after species divergency, and they are asymmetrically accumulating mutations. Protein structures were predicted by homology modeling and compared, identifying the divergent sites. The proteins TcRBP7 and TbRBP7A share the higher similarity, and TcRBP40 is the most divergent in this group. TcRBP7 and TcRBP40 targets were determined by in vivo ribonomics and next generation sequencing, showing less than 10% of overlap. This indicates that these T. cruzi RBPs, even though they conserve 72% identity, they regulate distinct gene networks and so play different biological roles. Other analysis may answer how the new regulatory gene networks arise in organisms, and how they evolve to play distinct roles in organisms' biology.
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Gastardelo, Thiago Santana. "Caracterização bioquímica de uma Leucil-aminopeptidase de Trypanosoma cruzi (LAPTc)." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2010. http://repositorio.unb.br/handle/10482/8943.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010.Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-30T18:43:41Z No. of bitstreams: 1 2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5)
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Os patógenos dependem de atividades de peptidases para desempenhar muitos processos fisiológicos, tão bem quanto interagir com seus hospedeiros, destacando peptidases de parasitos como fatores de virulência e, então, potenciais alvos de drogas. O sequenciamento do genoma do cinetoplastídeo Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, revelou 28 genes que codificam aminopeptidases putativas, dentre as quais estão três metionina-aminopeptidases, duas aspártico-aminopeptidases, duas aminopeptidases sensíveis a puromicina e três leucil-aminopeptidases da família M17. Neste estudo, uma atividade leucil-aminopeptidolítica principal foi identificada em T. cruzi usando Leu-AMC como substrato. Ela foi isolada de formas epimastigotas do parasito por um procedimento cromatográfico de dois passos e associou-se com uma única proteína hexamérica de 320 kDa como determinado por experimentos de velocidade de sedimentação e de dispersão de luz. Ligações dissulfeto intercadeias não participam da organização oligomérica da peptidase ativa. Espectrometria de massa por Peptide mass fingerprint revelou a identidade molecular da enzima como a aminopeptidase EAN97960 predita de T. cruzi, o produto do gene Tc00.1047053508799.240. Análises enzimáticas e moleculares indicaram que esta leucil-aminopeptidase de T. cruzi (LAPTc) pertence à família M17 de peptidases ou família da leucil-aminopeptidase. LAPTc tem uma forte dependência de pH neutro, é mesofílica e conserva sua forma oligomérica até 80 °C. Ao contrário, sua forma recombinante produzida em E. coli, assim como outras LAPs, é termofílica e requer pH alcalino. A atividade desta metalo-aminopeptidase é inibida por bestatina e quelantes de metais tais como 1,10-fenantrolina, é restabelecida por Zn2+, e potencializada por Mn2+ ou Ca2+. A enzima é expressa por todas as formas do T. cruzi e localiza-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. Uma vez que vias de aminoácidos essenciais, incluindo leucina, estão desprovidas em T. cruzi, a LAPTc poderia ter uma função no suprimento nutricional. Além disso, a atividade da peptidase também poderia ter uma função no processamento de peptídeos e proteínas. Nós postulamos que a LAPTc poderia ser um alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a infecção de T. cruzi.
Pathogens depend on peptidase activities to accomplish many physiological processes, as well as to interact with their hosts, highlighting parasitic peptidases as virulence factors and, thus, potential drug targets. The kinetoplastid Trypanosoma cruzi genome sequencing, the aetiological agent of Chagas disease, has revealed 28 genes encoding putative aminopeptidases, among which there are three methionine, two aspartic, two puramycin-sensitive and three leucyl aminopeptidases of the M17 family. In this study, a major leucyl aminopeptidolytic activity was identified in the T. cruzi by using leu-AMC as substrate. It was isolated from epimastigote forms of the parasite by a two-step chromatographic procedure and associated with a single 320-kDa homohexameric protein as determined by sedimentation velocity and light scattering experiments. Interchain disulfide bonds do not take part in the oligomeric assembly of the active peptidase. Peptide mass fingerprinting revealed the molecular identity of the enzyme as the predicted T. cruzi aminopeptidase EAN97960, the product of the Tc00.1047053508799.240 gene. Molecular and enzymatic analysis indicated that this leucyl aminopeptidase of T. cruzi (LAPTc) belongs to the peptidase family M17 or leucyl aminopeptidase family. LAPTc has a strong dependence on neutral pH, is mesophilic and retains its oligomeric form up to 80 °C. Conversely, its recombinant form produced in E. coli, like other LAPs, is thermophilic and requires alkaline pH. The activity of this metalloaminopeptidase is inhibited by bestatin and metal chelants such as 1,10-phenanthroline, is restored by Zn2+, and potentiated by Mn2+ or Ca2+. The enzyme is expressed by all T. cruzi forms and localizes within vesicles in the cytoplasm of the parasite. Since biosynthetic pathways for essential amino acids, including leucine, are lacking in T. cruzi, LAPTc could have a function in nutritional supply. Furthermore, the peptidase activity could also play a role in peptide and protein processing. We postulate that the LAPTc might be a potential target for the development of new drugs to treat T. cruzi infection.
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Queiroz, Rayner Myr Lauterjung. "Proteômica de Trypanosoma cruzi : variações em subproteomas durante a amastigogênese." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2013. http://repositorio.unb.br/handle/10482/14455.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas, 2013.Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-30T12:35:16Z No. of bitstreams: 1 2013_RaynerMyrLauterjungQueiroz.pdf: 2749536 bytes, checksum: 919b0cd19524ed0a125aae72c5a61ed3 (MD5)
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O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma enfermidade que afeta milhões de pessoas especialmente na América latina onde é endêmica. O parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro dos seus hospedeiros mamíferos e triatomíneos. A respeito especialmente do hospedeiro mamífero, os tripomastigotas, a forma sanguínea infectiva do T. cruzi, diferencia-se intracelularmente em amastigotas replicativos após um período de incubação dentro de fagolisossomos ácidos, em um processo denominado amastigogênese. Aqui buscamos encontrar novas informações concernentes a esse processo através da análise do subproteoma de superfície celular dos estágios de vida presentes no homem e do repertório protéico secretado/excretado por tripomastigotas em pH fisiológico e também nas primeiras 3 horas de amastigogênese axênica. Também realizamos uma análise quantitativa do proteoma total e do fosfoproteoma durante a amastigogênese. Todos os subproteomas foram aqui analisados por LC-MS/MS com um espectrômetro de massas Orbitrap Velos. Primeiro utilizamos epimastigotas, o estágio do parasito encontrado no inseto vetor, para padronizar e avaliar o enriquecimento de proteínas da superfície celular por duas técnicas distintas: uma baseada na tripsinização da superfície de células intactas e a outra baseada na biotinilação de proteínas expostas na superfície e seu enriquecimento por cromatografia de afinidade a estreptoavidina. Os resultados mostraram que essas abordagens ofereceram informações abrangentes e complementares sobre o subproteoma da membrana plasmática do parasito e, então, foram aplicadas na análise desse subproteoma nas formas amastigota e tripomastigota. A análise quantitativa do proteoma e fosfoproteoma usou parasitos diferenciados de forma axênica em quatro pontos do processo (0 min, 30 min, 2 h e 9 h) e os fosfopeptídeos foram enriquecidos com resina de TiO2. Finalmente, o secretoma de tripomastigotas foi obtido de uma maneira similar ao protocolo de aquisição de antígenos secretados/excretados, mas com cuidados adicionais para evitarmos lise mecânica das células. As análises renderam milhares de proteínas identificadas que eram comprovadamente ou preditas como associadas à membrana plasmática ou secretadas e são envolvidas na interação parasito-hospedeiro. Da mesma forma, várias proteínas e fosfopeptídeos relevantes possuíram expressão regulada durante a amastigogênese.
Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas' disease, a neglected infectious illness that affects millions of people, mostly in the Latin America. The parasite undergoes several differentiation processes in order to adapt to different conditions inside both mammalian and triatomine hosts. Specially regarding mammalian hosts, the trypomastigote, an infective bloodstream life-form of the T. cruzi, differentiates intracellularly to the replicative amastigote stage after a period of incubation inside acidic phagolisossomes, in a process called amastigogenesis. Here we aim to bring further light to this process by analysing the cell surface subproteome of the mammalian hosted life-forms of the parasite and the secreted/excreted protein repertoire from trypomastigotes in physiological pH and also at the first 3 hours of the acidic pH induced amastigogenesis. Finally, we performed the quantitative proteome and phosphoproteome analysis of the amastigogenesis by iTRAQ labeling. All T. cruzi subproteomes were analysed by LC-MS/MS with Orbitrap Velos mass spectrometer. First we used T. cruzi epimastigotes, the insect hosted life-form, in order to prepare samples enriched in cell surface proteins by two distinct methodologies, which were optimized and evaluated. The first methodology was based on cell surface trypsinization (Shave) of intact living cells while the second approach used biotinylation of cell surface proteins followed by streptavidin affinity chromatography isolation of the labeled proteins. The results showed that the methodologies offered comprehensive and complementary information about the parasite's plasma membrane subproteome, which were applied afterwards in the trypomastigote and amastigote cells. The quantitative proteome and phosphoproteome analysis used the axenicaly differentiated parasites in four time points (0 min, 30 min, 2 h and 9 h) and the phosphopeptides were enriched using TiO2 beads. Finally, the trypomastigote secretome were obtained in a similar way to the protocols of acquisition of secreted/excreted antigens, but with further care to avoid mechanical lysis. The results yielded thousands of protein identifications which were either proved or expected to be associated to the plasma membrane or secreted and are involved in host-parasite interection and, in the same way, we found several proteins and phosphopeptides that have regulated expression during amastigogenesis.
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Maçaneiro, Liliam de Oliveira Faria. "Expressão de imunoproteassoma em células infectadas com Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2008. http://repositorio.unb.br/handle/10482/3802.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008.Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2010-02-27T13:10:04Z No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5)
Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-03-02T00:08:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5)
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Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, pode persistir por muitos anos no hospedeiro mamífero, sugerindo que este parasita escapa do sistema imunológico através da regulação negativa nas vias de processamento de antígenos. Dentro da via de apresentação de antígenos intracelulares MHC classe I, a grande maioria de peptídeos antigênicos é gerada pelo proteassoma, um complexo multicatalítico responsável pela degradação intracelular de proteínas. Em vertebrados, três subunidades catalíticas b1i, b2i e b5i, cuja expressão é induzida pela citocina interferon-g (IFN-g), substituem três subunidades catalíticas constitutivas b1, b2 e b5 na partícula 20S do proteassoma, formando o imunoproteassoma. Neste trabalho, nós analisamos se a composição ou a expressão de proteassomas 20S e imunoproteassomas foi alterada em células HeLa e L6 infectadas pelo T. cruzi. Experimentos de RT-PCR e de eletroforese bidimensional comparando células controle e infectadas, com e sem tratamento com IFN-g não apresentaram diferença na composição do imunoproteassoma ou na expressão de suas subunidades em ambos os tipos celulares. No entanto, as atividades símile tripsina e símile quimotripsina do proteassoma foram 2,5 e 3,6 vezes maiores nas células infectadas com T. cruzi, do que nas células não infectadas. Entretanto, o nível de expressão protéica das subunidades b1i e b2i do imunoproteassoma foi reduzido quase pela metade em células HeLa infectadas com T. cruzi e tratadas posteriormente com IFN-g por 24 h. Este resultado sugere que a formação do imunoproteassoma é inibida em células infectadas pelo T. cruzi com posterior tratamento com IFN-g, por um mecanismo de regulação traducional das subnidades induzidas.
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, may persist for many years in its mammalian host, suggesting that this parasite escape from the immune surveillance by down regulating antigen processing pathway. In the MHC class I pathway, the vast majority of antigenic peptides are generated by the proteasome, a multicatalytic complex responsible for the degradation of intracellular proteins. In vertebrates, three catalytic subunits b1i, b2i and b5i, whose expression is induced by the cytokine gamma interferon (IFN-g), replace the three constitutive catalytic subunits b1, b2 and b5 in the core 20S proteasome, generating the immunoproteasome. Here, we analysed whether proteasome subunit composition or expression of the proteasome 20S and immunoproteasome were altered upon infection of HeLa and L6 cells by T. cruzi. RT-PCR and two-dimensional gel electrophoresis experiments comparing non-infected or infected cells, untreated or treated cells with IFN-g did not show differences between the immunoproteasome and expression of its mRNA subunits. However, the proteasome’s trypsin-like and chymotrypsin-like activities were 2.5 and 3.6 times higher in infected cells than in non-infected cells. On the other hand, in infected HeLa cells followed by treatment with IFN-g for 24 h, expression of the immunoproteasome b1i and b2i subunits was reduced. This result indicates that the generation of immunoproteasomes is inhibited in T. cruzi-infected cells followed treating with IFN-g by a posttranslational mechanism of the inducible subunits.
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Rocha, Juliane Lopes da. "Caracterização funcional das miosinas de classes I e XIII de Trypanossoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2012. http://hdl.handle.net/1884/26848.
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Resumo: O citoesqueleto dos organismos da família Trypanosomatidae é muito pouco estudado. Esta família inclui organismos que causam doenças em humanos, como doença de Chagas e doença do sono – Trypanosoma cruzi e T.brucei, respectivamente – e leishmaniose – causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Microtúbulos são os principais filamentos dos tripanossomatídeos e ainda não foi detectada a presença dos filamentos de actina, embora já tenha sido mostrada a presença desta proteína por imunoensaios. Microtúbulos e filamentos de actina podem funcionar como trilhos para motores moleculares, responsáveis pelo transporte de carga. As miosinas são as proteínas motoras que se movem ao longo dos filamentos de actina e são classificadas de acordo com suas similaridades. Os tripanossomatídeos possuem a miosina de classe I, presente em quase todos os organismos eucarióticos, e uma miosina exclusiva da família, a de classe XIII. A presença desta miosina de tripanossomatídeos é bastante intrigante, principalmente porque pouco se sabe sobre o citoesqueleto de actina destes organismos. Este trabalho visa à caracterização funcional das duas miosinas de T.cruzi comuns aos tripanossomatídeos – myo1 e myo13 – e tem como propostas: verificação da expressão destas proteínas pelo parasita, localização celular e identificação de complexos proteicos ligados às miosinas obtidos por imunoprecipitação, utilizando anticorpos produzidos em camundongos; localização através da expressão da miosina inteira e cauda fusionadas à GFP em T.cruzi; remoção ou inibição da atividade funcional da proteína através de nocaute e ensaio dominante-negativo. Anticorpos foram produzidos em camundongos inoculados com os fragmentos cabeça e cauda das miosinas expressas em E.coli. Os soros produzidos se mostraram específicos para proteínas de tamanho esperado, porém os produzidos contra myo1 reagiram também contra outras bandas. Estes resultados de ligação cruzada podem ser explicados devido à baixa expressão desta proteína pelo parasita, como mostrado em estudos de proteômica e transcriptômica. Resultados de imunofluorescência da myo1 mostraram uma concentração da proteína próxima ao cinetoplasto, podendo ser a bolsa flagelar. Esta localização é semelhante à myo1 de T.brucei, que está envolvida com a endocitose. A imunolocalização realizada com o soro contra a myo13 marcou uma região na base do flagelo, a mesma região da myo13 de L.donovani, que está envolvida na montagem do flagelo. A cauda da myo1-GFP se localizou na mesma região da imunofluorescência, compatível com a bolsa flagelar, indicado que a carga pode ser a responsável pela localização desta miosina. Experimentos estão em andamento para a identificação dos complexos proteicos nos quais as miosinas estão interagindo. A superexpressão da cauda para promoção de um fenótipo dominante negativo não teve efeito morfológico visível a microscópio óptico ou na taxa de replicação de epimastigotas. Estamos trabalhando para a geração de parasitas nocaute. Baseando-se nas localizações e nos trabalhos publicados com T.brucei e L.donovani, sugerimos que a myo1 esteja envolvida com endocitose e tráfego de vesículas, e que a myo13 esteja envolvida com a montagem do flagelo. Assim, com este trabalho, iniciamos a caracterização das miosinas de T.cruzi, o que pode contribuir para um maior conhecimento do processo de transporte intracelular destes parasitas.
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Farnese, Maurício. "Identificação das proteínas ligantes de Ca2+/calmodulina de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2013. http://repositorio.unb.br/handle/10482/15208.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013.Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-02-18T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5)
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A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi atinge milhões de pessoas em todo mundo, especialmente na América Latina, onde é endêmica. Em seu ciclo de vida, o parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro do hospedeiro mamífero e do inseto triatomíneo. Componentes localizados na superfície do parasito e da célula hospedeira desempenham papéis importantes na invasão, entretanto os mecanismos envolvidos são muito discutidos. Sabe-se que a sinalização mediada por Ca2+ é um aspecto importante na invasão celular e na diferenciação do parasito. A calmodulina (CaM) é uma proteína citoplasmática Ca2+-dependente em eucariotos que regula várias proteínas. A ligação da CaM ao Ca2+ induz uma mudança conformacional que promove a interação desta com diversas proteínas com importantes funções biológicas. A CaM de T.cruzi (TcCaM) tem sido associada à várias funções diferentes como regulação do crescimento, estimulação enzimática, transdução de sinais, além de modular os efeitos do Ca2+. Desta forma, a fim de melhor entender o envolvimento das proteínas ligantes de CaM (CaM-BPs) nos processos de invasão e diferenciação de T. cruzi, foram adotadas nesse trabalho duas abordagens de identificação de proteínas ligantes de Ca2+ e/ou CaM. Primeiramente pela análise bioinformática de proteínas diferencialmente expressas durante a amastigogênese e proteínas presentes na superfície do parasito. Foram preditas 17 proteínas ligantes de Ca2+ dentre as identificadas com expressão regulada durante a amastigogênese e 36 proteínas na superfície de tripomastigota e amastigota. Estas possuem funções enzimática, de armazenamento, transporte dentre outras. A segunda foi uma abordagem experimental onde identificamos 6 proteínas, as quais desempenham funções estruturais, motilidade, adesão ou enzimática. Esta segunda vertente foi realizada experimentalmente por uma abordagem proteômica. As CaM-BPs extraídas da forma epimastigota foram enriquecidas por cromatografia de afinidade e separadas em géis eletroforéticos (1D-PAGE e 2D-PAGE). A identificação por espectrometria de massas foi iniciada e já foram identificados componentes da estrutura celular como α- e β-tubulinas, proteína paraflagellar rod putativa e uma proteína de transdução de sinal intracellular, a HSP70. Esses dados auxiliam no entendimento sobre como o Ca2+, a TcCaM e seus ligantes participam em processos celulares como invasão e diferenciação do T. cruzi.
Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, afflicts millions worldwide especially in Latin America where it is endemic. During its life-cycle, the parasite undergoes several differentiation events in order to adapt to a variety of conditions inside both mammalian host and triatomine vector. Components from both parasite and host-cell surfaces play major roles in invasion, however the mechanisms involved are still much discussed. It is known that Ca2+ mediated signaling is an important aspect of host-cell invasion and parasite differentiation. Calmodulin (CaM) is a citoplasmic Ca2+-dependent protein that regulates several proteins in eukaryotes and the binding of Ca2+ to CaM induces conformational changes, which promotes the interaction to a variety of other proteins with important biological functions. T. cruzi CaM (TcCaM) has been linked to several functions such as growth regulation, enzyme stimulation, and signal transduction, besides modulating the effects of Ca2+ concentration. Thus, in order to better understand the involvement of CaM binding proteins (CaM-BPs) in the invasion process and T. cruzi differentiation, was adopted here two approaches to identify Ca2+- and/or CaM- binding proteins. First though bioinformatic prediction of such proteins among those identified as differentially expressed during amastigogenesis and those presented in the parasite cell surface. It was predicted 18 Ca2+-binding proteins with regulated expression level during differentiation and 36 in the surface of trypomastigotes and/or amastigotes. These have enzymatic, storage, transportation and others functions. The second was an experimental approach where we identified 6 proteins, which play structural, motility, adhesion or enzymatic functions. This second part was an experimental proteomic approach, where CaM-BPs from epimastigotes were enriched by affinity chromatography and separated by gel electrophoresis (1D-PAGE and 2D-PAGE). Mass spectrometric identifications were initiated and it already has been identified cell structure components such as α-and β-tubulins, putative paraflagellar rod proteins and a signal transduction protein, the HSP70. This data contribute to the understanding of the involvement of Ca2+, TcCaM and their ligands in the invasion and differentiation processes.
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Almeida, Keyla Caroline de. "Clonagem e expressão da Oligopeptidase Bsímile, da X-Prolil dipeptidil aminopeptidase e da Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2009. http://repositorio.unb.br/handle/10482/4485.
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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009.Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-04-01T20:30:22Z No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5)
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Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização.
After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.
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Motta, Flávia da Silva Nader. "Prolil oligopeptidases de tripanossomos : aspectos estruturais e funcionais." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2010. http://repositorio.unb.br/handle/10482/9262.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010.Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-21T14:21:33Z No. of bitstreams: 1 2010_FlaviadaSilvaNaderMotta.pdf: 3843006 bytes, checksum: be72ce6d2ae5ec4a5cde40aa3a698258 (MD5)
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A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização de alvos potenciais para a quimioterapia da doença de Chagas tendo as proteases como principal enfoque, uma vez que estão envolvidas em processos biológicos fundamentais para a viabilidade e virulência de patógenos. Neste contexto, essa tese aborda alguns aspectos estruturais e funcionais de serino-proteases pertencente à família Prolil Oligopeptidase: a oligopeptidase B (OPBTc) e prolil oligopeptidase (POPTc 80) de Trypanosoma cruzi e a prolil oligopeptidase (POP Tb) de Trypanosoma brucei. A OPBTc participa da invasão celular por meio do recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira até o local de ligação do parasito por uma via dependente de Ca2+. Por meio deste trabalho, a OPBTc tornou-se a primeira oligopeptidase B a ter sua estrutura dimérica confirmada por ultracentrifugação analítica. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que em altas temperaturas, a enzima conserva sua estrutura secundária, mas não a terciária. A perda da estrutura terciária por tratamento térmico acompanha a diminuição da atividade da enzima e a perda da dimerização, que ocorrem a partir de 50 °C. No entanto, a associação do dímero é resistente a altas concentrações de sal e a tratamento com reagentes redutores, indicando que esta interação não ocorre devido a pontes dissulfeto intermoleculares. Este trabalho também mostra a caracterização funcional da POP de T. brucei, protozoário causador da doença do sono. Esta protease foi capaz de hidrolisar colágeno tipo I semi-purificado in vitro e colágeno nativo em mesentério de rato, além de peptídeos hormonais. Foi observado ainda, que POP Tb é liberada na corrente sanguínea de camundongos infectados pelo T. brucei, onde permanece ativa, sugerindo sua contribuição para a patogênese da doença do sono. Como já proposto em estudos prévios, a POP Tc80 está envolvida na entrada do T. cruzi em célula hospedeiras não fagocíticas e alguns de seus substratos naturais foram caracterizados mostrando que a mesmo hidrolisa colágenos do tipo I e IV e fibronectina. O mecanismo desta catálise não é completamente entendido, porém cálculos de interação entre o modelo estrutural teórico da POP Tc80 com o colágeno mostraram que ocorre uma abertura dos domínios da enzima para entrada do substrato. Para verificar essa hipótese, mutações sítios dirigidas na POP Tc80 acarretaram na perda da sua atividade devido à rigidez da enzima, impedindo o acesso do substrato à fenda catalítica. Finalmente, ainda na tentativa de esclarecer o papel da POP Tc80 na infecção do T. cruzi, foi montada uma estratégia para silenciar seu gene. Os resultados preliminares indicam que um alelo do gene poptc80 sofreu recombinação homóloga sendo trocado pelo marcador de seleção, o gene de resistência a neomicina.
The research activities of our group aim the identication and characterization of potential targets for chemotherapy oT Chagas:s disease, and proteases are the main focus since they are involved in biological processes essential for the viability and virulence of pathogens. In this context, this thesis addresses some structural and functional features of seine-proteases that belong to the Prolil Oligopeptidase family: the oligopeptidase B (OPBTc) and prolyl oligopeptidase (POP Tc80) of Trypanosoma cruzi and the prolyl oligopeptidase (POPTb) of Trypanosoma brucei. The OPBTc participates in cell invasion through the recruitment and fusion of the host cell lysosomes to the binding site of the parasite by a Ca2+ dependent pathway. In this work, the OPBTc had a structural approach, being the first oligopeptidase B to have its dimeric structure confirmed by analytical ultracentrifugation. Circular dichroism experiments showed that at high temperatures, the enzyme retains its secondary structure but not the tertiary. The loss of tertiary structure by heat treatment follows the decline of enzyme catalytic ability, which occurs from 50 "C. However, the association of the dimer is resistant to salt high concentration and treatment with reducing reagents, indicating that this interaction is not dueto intermolecular disulfide bonds. This work also shows the functional characterization of the enzyme POP of T. brucei {protozoan that causes sleeping sickness), the POPTb. This protease was able to hydrolyze native and semi-purified collagen type I and peptide hormones. In addition, POPTb is released into the bloodstream of T. brucei infected mice, where it remains active, suggesting their contribution to the pathogenesis of sleeping sickness. As shown in previous studies, the POP Tc80 is involved in the entry of the parasite in the non-phagocytic host cell and some of its natural substrates were characterized showing that the enzyme hydrolyzes collagen type I and IV and fibronectin. The mechanism of this catalysis is not completely understood, but docking analysis of the theoretical structural model of POP Tc80 with collagen, showed that the enzyme domains open to substrate entry. To investigate this hypothesis, site directed mutations in POP Tc80 resulted in loss of its activity due to the rigidity of the enzyme, preventing the substrate access to the catalytic pocket. In a attempt to clarify the role of POP Tc80 in T. cruzi infection, it was set up a strategy to silence its gene. Preliminary results indicate that one allele of the poptc80 gene has been replaced by the selection marquee, the gene for resistance to neomycin, through homologous recombination.
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Maranhão, Ana Carolina Bussacos. "Proteoma e transcriptoma comparativo das glândulas salivares de barbeiros das espécies de Rhodnius brethesi, Rhodnius robustus e Panstrongylus megistus." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2008. http://repositorio.unb.br/handle/10482/1331.
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008.Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-29T14:38:15Z No. of bitstreams: 1 2008_AnaCarolinaBMaranhao.pdf: 1723120 bytes, checksum: b2328a02886ae7db1a1e77f4da928e01 (MD5)
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A doença de Chagas causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é transmitida pelo triatomíneo hematófago e provoca mais de 17 milhões de infecções em toda America Latina. Mais de 140 espécies de triatomíneos foram descritas. O gênero Rhodnius compreende mais da metade dos triatomíneos encontrados na Amazônia, como o Rhodnius brethesi e Rhodnius robustus. Normalmente esses insetos não estão em contato com os humanos, porém o desflorestamento e as migrações aproximam o contato entre o inseto infectado e o humano. Diferentemente, o Panstrongylus megistus é amplamente distribuído do México até a Argentina e coloniza diferentes ambientes silvestres como ninhos, tocas, arvores e até domicílios humanos. Nesse estudo nos descrevemos o transcriptoma das glândulas salivares de R. brethesi e R. robustus com 56 e 122 clusters respectivamente. Mais de 30% desses clusters nunca tinham sido descritos antes. Nos seqüenciamos também pela primeira vez 45 transcritos de glândulas salivares de P. megistus. Além disso, foi realizada uma análise proteômica por espectrometria de massa do conteúdo das glândulas salivares desses insetos. Encontramos 123, 111 e 159 proteinas nos proteomas de R. brethesi, R. robustus e P. megistus respectivamente. Além da grande prevalência de proteínas de manutenção, nos encontramos lipoclinas, inositol polifosfate 5-fosfatase e proteínas com domínio kazal, essenciais para um repasto sanguíneo com sucesso. Foram encontradas também outras proteínas relacionadas com resistência a inseticidas e defesa como a glutationa S transferase e proteína antigeno-5 respectivamente. Rhodnius findings showed their genetic distance with Triatoma, in the opposite, data confirmed the closeness between Triatoma and P. megistus.
Chagas disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi is mostly transmitted by the triatomine bug and causes over 17 million infections in Latin America. More than 140 species of triatomines were described. The Rhodnius gender comprises almost half of the triatomines found in the Amazon Basin, as Rhodnius brethesi and Rhodnius robustus, normally these insects aren’t in contact with humans, but deforestation and migration are approaching the infected bugs to human habitats and working areas. Differently, Panstrongylus megistus is widely distributed from Mexico to Argentina and are known to colonize different wild life dwellings, such as ground burrows, birds nest, crevices on tree barks and human domiciles. In this study we described the transcriptome of the salivary glands of R. brethesi and R. robustus, respectively comprising 56 and 122 clusters. Over 30% of these clusters had never been described before. We also sequenced for the first time 45 transcripts from the P. megistus salivary gland. Furthermore, we performed a proteomic analysis using LC-MS/MS technology and found 123, 111, 159 proteins in R. brethesi, R. robustus and P. megistus proteome, respectively. Besides the highly redundant housekeeping proteins we also could found lipocalins (biogenic amino binding proteins and salivary platelet aggregation inhibitor), inositol polyphosphate 5-phosphatase, and kazal domain proteins, essential proteins used for the successful blood-feeding habits, and glutathione S transferase, and antigen-5 protein, respectively, involved with resistance to insecticide and defense. Rhodnius findings showed their genetic distance with Triatoma, in the opposite, data confirmed the closeness between Triatoma and P. megistus.