Дисертації з теми "U2AF2"

L’exon en aval dans l’ARNm, dépendant du gène considéré et de la taille de la délétion dans le SP-MS. Nous montrons qu’un SP-MS raccourci présente moins d’affinité pour la protéine U2AF2 in vitro et que la mutation U2AF1-S34F ou le knock-down d’U2AF1 peuvent mimer l’effet de l’altération du PyT. Enfin, les transcrits matures dépourvus de l'exon cible peuvent être soit stables, soit dégradés par le système NMD de surveillance des codons non-sens prématurés, et ne sont donc pas dotés d'une capacité spécifique à éviter la dégradation. Nous supposons que les protéines aberrantes, qui peuvent être traduites à partir de ces ARNm alternatifs, pourraient participer à l’oncogenèse par la production de néo-antigènes associés aux tumeurs
Gastric and colorectal cancers are among the most common and deadly cancers. The MSI (Microsatellite Instability) subtype, which accounts for 15-20% of these cancers is deficient in the DNA mismatch repair system, thus leading to microsatellite instability. The polypyrimidine tract (SP-MS) that seats at the 3’ end of the intron, can be considered as a microsatellite-like structure that participates to the splicing of the downstream exon by interacting mainly with the U2AF2 protein and forms a heterodimer with the U2AF1 protein, which recognizes the AG dinucleotide 3’ acceptor splice site. Shortening of the PyT, in MSI cancers, can lead to splicing changes. We have identified a massive alteration of pre-messenger RNA splicing in digestive MSI cancers, in association with SP-MS shortening. These splicing defects are characterized by downstream exon skipping in mRNA, depending both on the gene considered and the size of the deletion in the SP-MS. We showed that a shortened SP-MS has less affinity for the U2AF2 protein in vitro and the mutation or knock-down of U2AF1 can mimic the effect of SP-MS alterations. Finally, mature transcripts devoid of the target exon can be either stable or degraded by the nonsense-mediated mRNA decay surveillance mechanism, and thus, are not endowed with a specific ability to avoid degradation. We surmise that the aberrant proteins that may be translated from these alternative mRNAs could participate in oncogenic mechanisms through the production of tumour-associated neo-antigens

Contribution de U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 dans le contrôle du maintien de la pluripotence et le devenir cellulaire.Les mécanismes de maturation du transcrit primaire peuvent profondément affecter la diversité et la fonction des protéines produites à partir d’un gène unique dans le but de mettre en place un programme complexe impliqué dans le maintien de pluripotence et/ou l’initiation de la différenciation des cellules souches humaines. Les réseaux transcriptionnels régulant la pluripotence et la différenciation ont été intensément étudiés contrairement au rôle de l’épissage alternatif dans ces mécanismes, rôle qui pour le moment reste mal compris et pour lequel il n’existe que très peux d’exemples de groupes de gènes subissant un changement général de variant d’épissage aboutissant à la modification du devenir cellulaire. Notre objectif est d’identifier les composés essentiels du spliceosome qui sont impliqués dans le maintien de la pluripotence et la différenciation précoce dans les trois feuillets embryonnaires et d’explorer leurs rôles dans ces processus. Via l’analyse de données de séquençage d’ARN nous avons identifié plusieurs facteurs d’épissage différentiellement exprimés entre les cellules souches et les trois feuillets embryonnaires. Parmi ces facteurs nous focaliserons notre étude sur les facteurs préférentiellement surexprimés dans les cellules souches, qui par conséquent devraient y jouer un rôle primordial. Les candidats sélectionnés, U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 ont été déplétés dans des cellules souches en utilisant un système shRNA inductible puis une analyse de séquençage ARN à haut débit a été effectuée pour comprendre les changements du transcriptome induits par ces déplétions. La déplétion d’U2AF1 entraine un changement majeur de l’expression de gènes impliqués dans le développement alors que la déplétion de NCBP1 et eIF4A3 entraine un changement d’expression de gènes impliqués dans le métabolisme, le remodelage de la chromatine et le développement. Des analyses complémentaires ont permis de mettre en lumière une régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle des gènes différentiellement exprimés dans les conditions étudiées. L’épissage alternatif a pour ça part été modifié par les trois déplétions de manière individuelle. Un programme d’épissage tissu spécifique a été associé à chaque candidat et les conséquences de chaque programme seront décrites au niveau du contrôle qualité de l’ARNm et de la synthèse protéique.Nos résultats construisent une nouvelle vision concernant le rôle des composés essentiels du spliceosome dans le contrôle du devenir cellulaire à travers la modulation de l’épissage alternatif. Cet apport ajoute une nouvelle variable au contrôle de l’expression des gènes et permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement précoce et de la diversité tissulaire
Contribution of U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 to the control of pluripotency maintenance and cell fate determination.Alternative pathways for processing the primary transcript can profoundly affect the diversity and function of the protein products that are generated from a single gene to set up complex programs involved in pluripotency and/or differentiation of human Embryonic Stem Cells (hESCs). While transcriptional networks regulating pluripotency and differentiation has been intensively studied, the role of Alternative Splicing (AS) in this process is not yet completely understood and clear examples of concerted switching of multiple genes from one isoform to another have not been demonstrated. Our goal is to identify Core Spliceosomal Factors (CSF), involved in the control of pluripotency maintenance, early differentiation into the three germ layers, and to explore their role in these processes. By RNA-Seq data analysis, we have identified several splicing factors that are differentially expressed between pluripotent stem cells and the three of the germ layers. Among these identified candidates, we focused on the factors that are more highly expressed in pluripotent stem cells, thereby they play a specific role in pluripotency maintenance. The selected candidates, U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 were depleted in pluripotent stem cells using inducible shRNA system and RNA-Seq analyzes have been performed to understand transcriptomic changes induced by these depletions. U2AF1 depletion causes a major switch of developmental genes expression, while NCBP1 and eIF4A3 depletions regulate the expression of genes involved in metabolism, chromatin remodeling and development. Further analysis highlighted a transcriptional and post-transcriptional regulation of differentially expressed genes. Alternative Splicing (AS) were shown to be affected by both depletions. A tissue specific AS program was associated to each of the candidates and the consequences of these changes on mRNA quality control and protein synthesis will be described.Our results build a new idea regarding the role of Core Spliceosomal Factors in cell fate control trough the modulation of AS. This knowledge adds a new layer of gene expression control and will allow a better understanding of early development mechanisms and tissue diversity

Les protéines U2AF65, CAPERα, PUF60 et SPF45 sont des facteurs d'épissage qui possèdent des domaines similaires appelés UHM et qui interagissent pendant les étapes précoces de l'épissage avec des protéines qui possèdent des domaines ULM, comme SF3b155. Par des approches biochimiques, nous avons mis en évidence la formation d'assemblages macromoléculaires par U2AF65 et CAPERα au contact du domaine multi-ULM de SF3b155. En diminuant les taux d'expression des facteurs d'épissage à domaines UHM avec des shRNA et en analysant par qPCR l'épissage de 65 exons cassette, nous avons identifié un rôle activateur de CAPERα, U2AF65 et PUF60 et un rôle répresseur de SPF45 dans l'épissage. Plus particulièrement, CAPERα et U2AF65 activent l'épissage des exons cassette présentant des séquences flanquantes en 5' riches en motifs polypyrimidine. De plus, ces séquences favorisent la formation des assemblages macromoléculaires de U2AF65 et CAPERα. Appuyés par ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel des interactions multivalentes conduisent à la formation d'assemblages macromoléculaires par CAPERα et U2AF65 ; ces complexes ont une affinité particulière d'une part pour les séquences introniques riches en motifs polypyrimidine et d'autre part avec le domaine multi-ULM de SF3b155. L'ensemble de ces interactions favorise la reconnaissance des sites 3' d'épissage
U2AF65, CAPERα, PUF60 and SPF45 are splicing factors that hold similar domains called UHM that interact during the early splicing steps with ULM domains proteins, such as SF3b155. Using biochemical approaches, we highlighted the formation of macromolecular assemblies by U2AF65 and CAPERα in contact with the multi-ULM domain of SF3b155. The inhibition of the expression of the UHM splicing factors by shRNA, followed by a qPCR analysis of 65 cassette exons led us to identify an activating role of CAPERα, U2AF65 and PUF60 and a repressing role of SPF45 in splicing. Particularly, CAPERα and U2AF65 activate splicing of cassette exons presenting long pyrimidine-rich 5' flanking regions. Moreover, these regions favor the formation of macromolecular assemblies of U2AF65 and CAPERα. On the basis of these results, we propose a model in which multivalent interactions lead to CAPERα and U2AF65 macromolecular assemblies; these assemblies present a particular affinity on one hand for long pyrimidine-rich introns and on the other one for the multi-ULM domain of SF3b155. All these interactions promote 3' splice sites recognition

Le syndrome de Down (SD) ou trisomie 21 (T21) est caractérisé par des anomalies morphologiques, des troubles cognitifs et moteurs associés à un retard mental. L’analyse génétique de cette pathologie nécessite le développement de modèles animaux. Afin de complémenter les modèles murins de T21 existant, notre laboratoire s’est attaché à créer de nouveaux modèles d’aneuploïdie des régions d’homologie au chromosome 21 humain. Mon travail de thèse à porté sur l’étude phénotypique de deux de ces modèles : les modèles Ms2Yah (monosomique) et Ts1Yah (trisomique) pour la région Abcg1-U2af1 (13 gènes), homologue à la partie télomérique du chromosome 21 humain. Des analyses préliminaires du transcriptome révèlent que les gènes de la région Abcg1-U2af1 sont globalement sous-exprimés d’un facteur de 0,5 dans le modèle monosomique et sur-exprimés de 1,5 dans le modèle de trisomie. Ces deux lignées se révèlent être de bons modèles d’étude de l’homocystéinurie, la concentration en homocystéine plasmatique chez ces souris étant liée au nombre de copies de la région d’aneuploïdie. Des analyses en cours suggèrent également une macrocytose chez les individus Ms2Yah. Une homocystéinurie et une macrocytose sont fréquentes chez les enfants et les adultes atteints du SD et seraient dues à une activité plus importante de la CBS dans ce syndrome. Enfin, un premier criblage comportemental révèle une force d’agrippement plus élevée et des troubles de l’habituation ou de la mémoire chez les individus de la lignée Ts1Yah. Ces deux modèles seront par la suite combinés avec les autres lignées aneuploïdes pour mieux comprendre les interactions génétiques en cause dans cette pathologie. Ces études devraient à terme conduire à l’identification des voies de signalisation perturbées chez les patients et permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Master of Science
Department of Entomology
Srinivas Kambhampati
Termites (Isoptera) are eusocial insects and exhibit highly complex eusocial behavior. Eusociality is characterized by the presence of castes (workers, soldiers, reproductives), polyphenisms (same genotype exhibiting multiple phenotypes), flexible developmental pathways, complex communication, cooperative brood care, construction and maintenance of complex nests, and division of labor. Previous studies on honey bees implicated several genes in caste-specific behavior; here, we investigate if orthologs of such genes are present in termites and if so, whether they are expressed differentially among the castes. A candidate gene approach using degenerate primers was used to amplify three candidate genes in the termite Reticulitermes flavipes. Quantitative real time PCR analysis revealed differential expression among termite workers, soldiers, and alates, with a general pattern of higher expression in alates. These results provide information on three novel genes in the termite R. flavipes.

Le syndrome de Down (SD), ou Trisomie 21, est l'aneuploïdie la plus fréquente chez l'humain. Le désordre génomique est tel qu'aucun traitement unique ne peut pallier à tous les symptômes (retard mental, troubles moteurs...). C'est pourquoi l'utilisation de modèles murins permet d'étudier l'impact de régions partielles du Hsa21 dans l'apparition des déficits. Mon projet de thèse s'est orienté sur un locus télomérique encadré par les gènes Abcg1 et U2af1. Mes recherches se sont focalisées sur deux modèles, Ts1Yah et Ms2Yah, dédiés à cette région. L'étude de ces lignées, combinées à d'autres modèles transgéniques, a montré la contribution de l'intervalle génique dans l'optimisation de l'apprentissage locomoteur. Dans un deuxième temps, le gène Cbs, candidat à la perte de fonction de mémoire, a permis de mettre en évidence un sauvetage fonctionnel dans une expérience à effets de doses. Cette découverte ouvre la voie à de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Plusieurs étapes successives sont essentielles àl'expression génique, parmi lesquelles l'élimination de séquencesinternes des transcrits primaires des gènes par lemécanisme d'épissage. Le complexe macromoléculaire quiréalise cette modification des ARN, le spliceosome, est assemblépar étapes par le biais d'interactions protéine-protéine,ARN-ARN et protéine-ARN. D'abord, la ribonucleoprotéineU1snRNP reconnaît le site d'épissage 5', SF1 (SplicingFactor 1) se lie au site de branchement et U2AF(U2snRNP auxilliary factor) au tract de polypyrimidine et ausite 3' (complexe E). U2AF favorise alors l'ancrage deU2snRNP au point de branchement, à la place de SF1, pourformer le complexe A. Ensuite, le recrutement du tri-snRNPU4/U6-U5 conduit au complexe B, et finalement, des réarrangementsstructuraux libèrent U1 et U4 snRNP conduisantau complexe catalytique C. U2AF est un hétérodimère,avec une sous-unité de 35 kDa (U2AF35) liée par son domaineUHM (U2AF Homology Motif) au domaine ULM(UHM Ligand Motif) de la sous-unité de 65 kDa (U2AF65).En outre, U2AF65 présente deux motifs de reconnaissancede l'ARN, un UHM C-terminal et un domaine N-terminal defaible complexité (LCD) riche en arginine-sérine (RS). Dansce modèle, le domaine RS de U2AF65 facilite l'hybridationde U2snRNA au point de branchement et son domaineUHM interagit successivement avec les domaines ULM deSF1 et d'une sous-unité de U2snRNP, SF3b155. In vitro, l'affinitéde U2AF65 pour SF1 est relativement plus élevée quepour SF3b155. Les domaines defaible complexité sont souvent impliqués dans la formationde condensats par séparation de phase liquide-liquide(LLPS), ce qui contribue en particulier à la compartimentalisationde complexes moléculaires dans des organites sansmembrane. Nous avions déjà montré que le domaine RS deU2AF65 favorise la formation de condensats via LLPS. Ici,nous avons recherché les déterminants de ce mécanismeet en particulier la force saline, la température, la longueurdu domaine RS et la composition en acides aminés. Laformation de condensats via LLPS est connue pour êtremodulée par des modifications post-traductionnelles.Nous avons montré que la phosphorylation du domaineRS module la formation de condensats. En utilisant desexpériences de pull-down et des immunoprécipitations,nous démontrons que la délétion du domaine RS empêchel'interaction de U2AF65 à la fois avec SF1 etSF3b155, ce qui indique fortement le rôle du domaine RSdans ces interactions in vivo.En parallèle, nous avons comparé, à l'aide de la spectroscopiepar résonance magnétique nucléaire (RMN), les interactionsdu domaine UHM avec les domaines ULM deSF1 et SF3b155. Les perturbations des spectres HSQC de15N-U2AF65-UHM indiquent que l'interaction de SF3b155avec U2AF65 implique au moins trois ULM distincts, enaccord avec la littérature. Inversement, un dosage de15N-SF3b155-ULM par U2AF65-UHM révèle des perturbationsdes déplacements chimiques d'au moins trois résidustryptophane de SF3b155. Ces spectres HSQC deSF3b155-ULM montrent que ce domaine reste désordonnéen présence de U2AF65, ce qui pourrait faciliter lareconnaissance de plusieurs ULMs et la formation decondensats de U2AF65 en présence de SF3b155.Finalement, nous avons entrepris une collaboration avecla société Synsight afin d'identifier, par criblage in silico,des molécules capables de perturber les interactionsUHM-ULM. Nous avons identifié une petite molécule(C13) interagissant avec le domaine UHM de U2AF65comme le montrent des analyses RMN. La combinaisonde données de RMN et des simulations de dynamiquemoléculaire (MD) a permis d’apporter des informationssur le mode de liaison du C13 dans la poche hydrophobedu UHM. Nous avons également montré que C13 peutmoduler la liaison de U2AF65 à SF3b155. Ces résultatsprometteurs suggèrent que les interactions UHM-ULMpourraient être ciblées pour lutter contre des maladiesspécifiques telles que les cancers
Gene expression requires many layers ofregulation among which splicing consists in the removalof sequences from primary transcripts. For thisprocess, a macromolecular machinery, the spliceosome,undergoes a dynamic assembly through protein-protein, RNA-RNA and protein-RNA interactionsin a stepwise manner. The simplified view of assemblyof the spliceosome is that first, the ribonucleoproteinU1 snRNP recognizes the 5’ splice site, Splicing Factor1 (SF1) binds the branchpoint sequence andU2snRNP auxiliary factor (U2AF) binds the polypyrimidinetract and 3' splice site (complex E). U2AF assiststhe recruitment of U2 snRNP to the branch point sequenceto form the A complex. Later, the recruitmentof U4/U6-U5 tri-snRNP forges the B complex, uponwhich, structural rearrangements release U1 and U4snRNPs leading to the catalytic C complex. U2AF is aheterodimer, with its 35kDa subunit (U2AF35) boundthrough its U2AF Homology Motif (UHM) domain tothe ULM (UHM Ligand Motif) of the 65kDa subunit(U2AF65). In addition, U2AF65 presents two RNArecognition motifs, a C-terminal UHM and a N-terminalarginine-serine (RS) rich low complexity domain(LCD). In this model, the RS domain of U2AF65 stabilizesthe U2snRNA-branchpoint sequence duplex andthe U2AF65-UHM domain recognizes successively theULM motif of SF1 and several ULMs in the U2snRNPsubunit SF3b155. In vitro, the affinity of U2AF65 forSF1 is relatively better than for SF3b155. LCD are often involved in the formation of condensatesthrough liquid-liquid phase separation (LLPS),which contribute for example to the compartmentalizationof biological molecules in membrane-less organelles.We have previously reported that U2AF65promotes the formation of such condensates viaLLPS. In line with this work, we have characterized theU2AF65 interactions supported by condensates formationrelatively to physicochemical parameters, includingsalt concentration and temperature, as wellas the length of the RS domain and its amino acidcomposition. Furthermore, LLPS can be modulatedby post-translational modifications. We havedemonstrated that the phosphorylation state of theRS domain modulates the formation of U2AF65condensates in vitro. Using pulldown experimentsand immunoprecipitations, we demonstrate thatthe deletion of the RS domain prevents the interactionof U2AF65 with both SF1 and SF3b155, whichstrongly indicates the actual contribution of the RSdomain in UHM-ULM interaction.In parallel, we compared, using nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy, the interactions ofthe hydrophobic core of the U2AF65-UHM domainwith the ULM domains of SF1 and SF3b155. Perturbationsof the 15N-U2AF65-UHM HSQC spectrumindicates that SF3b155 interaction with U2AF65-UHM is supported by at least three ULMs, which isconsistent with previous reports. In agreement, increasingthe stoichiometry of U2AF65-UHM against15N-SF3b155-ULM reveals stepwise changes inchemical shift perturbations of at least three tryptophanresidues, in the SF3b155-ULM spectrum. Interestingly,these HSQC spectra of SF3b155-ULMdid not reveal any structuration upon U2AF65-UHMbinding, suggesting a role of this dynamics to favourthe binding to several ULMs and the formationof U2AF65 condensates in the presence ofSF3b155.Lastly, we initiated a collaboration with the Synsightcompany in order to identify molecules ableto perturbate UHM-ULM interactions. Through insilico analyses, we obtained a small molecule (C13)displaying affinity for U2AF65-UHM as evidenced byNMR analyses. Through NMR and molecular dynamics(MD) simulations, we obtained insights intothe C13 binding mode in the U2AF65-UHM hydrophobicpocket. Using an in vitro binding assay, weshowed that C13 can modulate the binding ofU2AF65 to SF3b155. These promising results suggestthat UHM-ULM interactions could be targetedto fight specific diseases such as cancers

Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic stem cell disorders that often progress to chemotherapy-resistant secondary acute myeloid leukemia (sAML). We used whole-genome sequencing to perform an unbiased comprehensive screen to discover the somatic mutations in a sample from an individual with sAML and genotyped the loci containing these mutations in the matched MDS sample. Here we show that a missense mutation affecting the serine at codon 34 (Ser34) in U2AF1 was recurrently present in 13 out of 150 (8.7%) subjects with de novo MDS, and we found suggestive evidence of an increased risk of progression to sAML associated with this mutation. U2AF1 is a U2 auxiliary factor protein that recognizes the AG splice acceptor dinucleotide at the 3' end of introns, and the alterations in U2AF1 are located in highly conserved zinc fingers of this protein. Mutant U2AF1 promotes enhanced splicing and exon skipping in reporter assays in vitro. This previously unidentified, recurrent mutation in U2AF1 implicates altered pre-mRNA splicing as a potential mechanism for MDS pathogenesis.

Pre-mRNA splicing is a process in which introns are removed from eukaryotic transcripts and exons are ligated together. Splicing is catalyzed by spliceosome, a large ribonucleoprotein complex composed of five small nuclear RNAs and more than 100 additional proteins, which recognizes 5' splice site, branch point site and 3' splice site and performs two transesterification reactions to produce mRNA molecules. 5' splice site is recognized by U1 snRNP and U2 auxiliary factor (U2AF) is involved in branch point and 3' splice site recognition in the early splicing complex. There is some evidence of splice sites cooperation during intron recognition in vitro but little is known about the situation in vivo. Using Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and RNA immunoprecipitation (RIP) methods, we have investigated the early stages of spliceosome assembly. We have employed splicing reporters based on -globin gene and MS2 stem loops to detect interactions of proteins on RNA molecule directly in the cell nucleus. Results of FRET indicate that intact 5' splice site is required for U2AF35 interaction with 3' splice site and that U1C recruitment to 5' splice site is partially limited upon 3' splice site mutation. We have also confirmed by RIP that U2 snRNP association with pre-mRNA molecule requires presence of 5'...