Dissertations / Theses on the topic 'Acides biliaires – Métabolisme'

Ce travail analyse l'Influence de la flore microbienne du tractus digestif et de quelques glucides alimentaires sur les contenus intestinaux en acides biliaires, en comparant le rat axénique (sans germes) au rat holoxénique (conventionnel). Il décrit l'influence de ces deux facteurs sur trois mécanismes impliqués dans la circulation entérohépatique de ces molécules La présence de la flore microbienne dans le tractus digestif diminue de deux à trois fois les contenus en acides biliaires de l'intestin grêle et de l'ensemble caecum colon, augmente l'excrétion fécale de ces molécules et modifie leur structure chimique. Ces contenus sont modifiés par le saccharose, le lactose, les amidons de maïs, le son de blé et la pectine de pomme inclus dans l'aliment semi­synthétique. Les contenus de l'intestin grêle varient de 40 à 120 micromoles/100 g de poids corporel chez les rats axéniques et de 22 a 90 micromoles/100 g chez l'holoxénique. Des variations semblables sont observées dans le caecum et le colon. Celles-ci dépendent, de la composition des glucides, du mode de stérilisation et de présentation de l'aliment, de la présence de la flore où sont indépendantes de cette dernière. Pour expliquer ces résultats, l'influence des facteurs alimentaires et microbiens sur la biosynthèse hépatique, le transit et l'absorption des acides biliaires dans les intestins est recherchée. Aucune relation n'est trouvée entre le pool des acides biliaires et leur excrétion fécale (biosynthèse). Ceci suggère que la biosynthèse est peu impliquée dans ces variations. Le transit intestinal des acides biliaires, faiblement modifié par les aliments, est accéléré par la flore microbienne. Des relations entre les contenus intestinaux en acides biliaires et la durée du transit sont observées. Ceci signifie que le transit est un des mécanismes moteurs de ces variations. L'absorption intestinale des acides biliaires peu touchée par la flore microbienne, est augmentée par les glucides. Les relations observées entre les contenus et l'absorption des acides biliaires donnent à ce dernier processus un rôle éminent dans les variations enregistrées. La flore microbienne et les glucides alimentaires modifient fortement deux processus impliqués dans la biodynamique des acides biliaires : le transit et l'absorption dans l'intestin. Ils stimulent vraisemblablement davantage les mécanismes liés aux intestins que ceux liés au foie
This study was undertaken in germ-free and conventional rats which were fed semi­ synthetic diets to investigate the effects of intestinal microflora and those of dietary carbohydrate on bile acid intestinal contents. Relationships between these contents and the parameters derived from three processes involved in bile acids enterohepatic circulation (biosynthesis, intestinal transit and intestinal absorption) were established. The amount of bile acids in the small intestine and in the hindgut were generally two or three times lower in conventional than in germ-free rats. Fecal excretion of bile acids was increased in conventional compared to germ-free rats and bile acid composition was modified by microflora. Bile acid intestinal contents were strongly changed by sucrose, lactose, maize starches, wheat bran or apple pectin. Pools of the small intestine ranged from 40 to 120 micromoles/100 g of body weight in germ-free rats and from 22 to 90 micromoles/100 g in conventional rats. Similar variations were found in the hindgut. Pools were modified by the composition of carbohydrates, by the mode of sterilization and presentation of the diet, by the presence of microflora. To explain these results, the effects of intestinal microflora and carbohydrates on bile acid biosynthesis, intestinal transit and intestinal absorption were studied. No relationship was found between bile acid pool and fecal excretion of bile acid (biosynthesis). Lt is suggested that biosynthesis has little action on the variation of bile acid pool. Bile acid intestinal transit time, slightly modified by diets, was strongly decreased by the microflora. Relationships between bile acid pools and intestinal transit times were found. Lt is suggested that intestinal transit plays an important part on these variations. Bile acid intestinal absorption, slightly modified by microflora, was strongly increased by carbohydrates. Relationships between bile acid pools and absorption were found. Lt is suggested that intestinal absorption has an action on the variation of pools. Microflora and diets strongly modify two physiological processes involved in bile acid dynamic: bile acid intestinal absorption and intestinal transit. They probably modify intestinal before hepatic processes

Le syndrome de l'intestin irritable associe douleurs abdominales chroniques et troubles du transit. C'est une pathologie digestive fréquente, qui dans sa physiopathologie inclue le concept de dysbiose, i. E les perturbations du microbiote intestinal (l'ensemble des micro organismes contenus dans un intestin). La dysbiose sous entend des perturbations du dialogue hôte-microbiote conduisant à la maladie, concept essentiellement descriptif à ce jour. Les acides biliaires sont synthétisés par le foie, métabolisés par les bactéries puis réabsorbés par l'intestin - donc potentiellement acteurs de ce dialogue. D'autres axes physiopathologiques incluent motricité, perméabilité, et sécrétion intestinale, des fonctions également régulées par les acides biliaires, via le récepteur membranaire TGR5. Ce travail présente et discute, à travers deux publications scientifiques les liens entre syndrome de l'intestin irritable, dysbiose, et récepteur TGR5
The irritable bowel syndrome associates chronic abdominal pain and altered bowel transit. This is a common digestive disorder, which in its pathophysiology include the concept of dysbiosis, i. E disruption of the intestinal microbiota (overall micro organisms in a gut). Dysbiosis implies alterations of the host-microbiota dialogue leading to disease, a mainly descriptive concept to date. Bile acids are synthesized by the liver and metabolized by bacteria then reabsorbed from the intestine - so potentially involved in this dialogue. Other pathophysiological axes include motor, permeability, and intestinal secretion, and theses are functions also regulated by bile acids, through the membrane receptor TGR5. This work presents and discusses, through two scientific publications, the links between irritable bowel syndrome, dysbiosis, and TGR5 receptor

Les maladies métaboliques sont devenues un fléau ces dernières décennies préfigurant plusieurs maladies graves comme le diabète de type 2. Les disfonctionnements mitochondriaux sont caractéristiques des maladies métaboliques. Cependant, ils ne sont pas ciblés par les thérapies actuelles qui se concentrent plutôt sur les conséquences de ces maladies. Néanmoins, la capacité du récepteur couplé aux protéines G, TGR5 présent dans le tissu adipeux et musculaire à augmenter l’activité mitochondriale ouvre de nouvelles perspectives d’avenir pour prévenir les stades précoce des maladies métaboliques et pour traiter ces maladies. Pour explorer le potentiel de TGR5, notre principal défi était d’identifier des agonistes plus puissants et plus sélectifs que les acides biliaires. En effet, les acides biliaires seuls agonistes connus à ce jour sont aussi actifs sur d’autres récepteurs nucléaires. Dans ce but, nous avons criblé une collection de plantes antidiabétiques par bio-guidage sur TGR5, ce qui nous a permis d’isoler et d’identifier deux principes actifs de la famille des triterpènes, l’acide oléanolique et l’acide corosolique. In vivo, l’acide oléanolique possède une activité hypoglycémiante, améliore la tolérance au glucose et empêche la prise de poids. De plus, l’acide oléanolique augmente l’activité mitochondriale in vitro. Une étude de la relation structure à activité sur une collection plus large de triterpènes naturels nous a permis d’obtenir un chef de file, l’acide bétulinique dont l’hemi-synthèse d’analogues a fourni RG 239, un puissant agoniste TGR5 capable d’induire l’activité mitochondriale de façon TGR5-dépendante. Malgré cela, in vivo il n’a montré aucun effet probablement à cause d’une faible biodisponibilité. Bien que tous ces résultats confirment TGR5 comme une cible thérapeutique, nous nous sommes rendus à l’évidence que les triterpènes ne sont pas des molécules développables pour obtenir un médicament. En effet, leurs châssis hydrophobe et le faible degré de liberté qu’offre leurs fonctions chimiques pour des modifications structurales nous ont poussés à utiliser des outils chémoinformatiques pour découvrir une nouvelle famille d’agoniste TGR5. C’est pourquoi, le criblage des banques de données de produits commerciaux Zinc et Asinex a été réalisé par des recherches pharmacophoriques et topomériques dont les résultats sont en cours d’exploitation
Mitochondrial dysfunction, a hallmark feature in the early stage of metabolic diseases, is currently not targeted by the available therapies with preferentially focus on the consequence of the diseases. Nevertheless, an early discovered G coupled protein receptor named TGR5 was shown to lead to an increase in mitochondrial activity. This effect reveals TGR5 as an interesting target to prevent the early onset of metabolic diseases. To further explore TGR5 potential, our principal challenge was to identify more potent and more selective TGR5 agonists than the already known bile acids which act on other nuclear receptors. To this end we used a TGR5 activity assay to screen a plant library. Among the plant extracts tested, was have been able to isolated two active principles from the triterpene family, the oleanolic acid and the corosolic acid. In vivo, oleanolic acid showed antihyperglycemic activity, improved glucose tolerance and decrease weight gain. Furthermore, oleanolic acid enhanced mitochondrial activity in vitro. An SAR study based on natural triterpenes has led us to the discovery of betulinic acid used in hemi-synthesis and affords the synthesis of RG 239, a more potent TGR5 agonist which induce mitochondrial activity in a TGR5 dependant manner. Unfortunately, RG 239 was not active in vivo, probably because of poor bioavailability. Although, these results confirm TGR5 as therapeutical target, we have found that triterpenes were not drugable molecules. Indeed, triterpenes are hydrophobic molecules and the degree of liberty of their chemical function for structural modification is very low. That is the reason why we have decided to screen two databases of commercial products, Zinc and Asinex with a scaffold hoping method in order to find new TGR5 agonist family. The selected molecules by this approach are under investigation

L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires. La compréhension des mécanismes régissant l'homéostasie du cholestérol est cruciale puisqu'elle peut concourir au développement de nouvelles thérapies hypocholestérolémiantes. Les acides biliaires (AB) sont des dérivés terminaux du métabolisme du cholestérol. Ces molécules, produites dans le foie, jouent un rôle clef dans la digestion et l'absorption intestinale des lipides. Par ailleurs, elles représentent la principale voie d'élimination physiologique du cholestérol. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent qu'il existe une régulation coordonnée des gènes codant pour les transporteurs d'AB dans l'intestin, le foie et rein. Ce mécanisme assure une élimination efficace des AB par voie fécale et urinaire et contribue à expliquer la résistance de la souris à l'hypercholestérolémie induite par voie alimentaire. Les facteurs de transcription SREBP-2 et HNF-1, et le récepteur nucléaire PPAR, jouent un rôle clef dans ce mécanisme adaptatif puisqu'ils assurent la régulation cholestérol-dépendante de plusieurs transporteurs clefs d'AB, en particulier l'ASBT dans l'iléon et le rein, et la L-FABP dans le foie
Hypercholesterolemia is a major risk factor of cardiovascular diseases. Understanding of mechanisms ensuring the maintenance of body cholesterol homeostasis is crucial, since it can allow the development of new hypocholesterolemiant therapies. Bile Acids (BA) are end-products of cholesterol metabolism. These molecules, produced in the liver, participate to fat digestion and absorption in the intestine. Moreover, BA represent the main pathway of body cholesterol removal. The results presented in this thesis show that genes encoding intestinal, hepatic and renal BA transporters are coordinately regulated. This mechanism ensures efficient BA elimination through faecal and urinary route, and thus contributes to explain the resistance of mice to diet-induced hypercholesterolemia. The transcription factors SREBP-2 and HNF-1, and the nuclear receptor PPAR, play a key role in this adaptative process since they allow cholesterol-dependent regulation of several key BA transporters, particularly ASBT in the ileum and the kidney, and L-FABP in the liver

La biodisponibilité des nutriments lipidiques dépend d'un processus physico-chimique et enzymatique complexe : digestion par les lipases dans l'estomac puis l'intestin, absorption par les entérocytes et transport vers les cellules utilisatrices. L'altération physiologique (nouveau-né, personne âgée) ou pathologique (mucoviscidose, pancréatite) de ce processus réduit la biodisponibilité des acides gras essentiels, indispensables au développement et au fonctionnement des cellules de l'organisme. Ce mémoire présente des stratégies permettant d'améliorer la biodisponibilité des nutriments lipidiques chez l'insuffisant pancréatique, en utilisant les propriétés physico-chimiques des lipides. En effet, elles déterminent des caractéristiques primordiales de l'interface lipidique (superficie, composition), au niveau de laquelle se déroule l'hydrolyse enzymatique. Nos travaux montrent, in vitro dans des conditions proche de la physiologie, que le type de phospholipide entrant dans la composition d'une émulsion de trioléine, ou l'ajout d'un type donné d'acide gras libre dans le mélange lipidique avant l'émulsification, modifie la taille et le potentiel zêta des globules lipidiques, influence l'action des lipases gastrique, pancréatique et stimulée par les sels biliaires, et module l'absorption des acides gras par des cellules Caco-2. Un effet majeur est obtenu avec le lysophosphatidylinositol, rendant ce lipide potentiellement utilisable en nutrition clinique. Il présente un comportement interfacial étonnant (aire moléculaire, compressibilité) et son mécanisme d'action associe des effets indirects (modifications de l'interface lipidique) et directs (interactions avec les lipases).

Le but de notre étude a tout d’abord été d’évaluer le rôle in vivo du récepteur nucléaire Liver Receptor Homolog 1 (LRH-1) dans la régulation du transport inverse du cholestérol et du métabolisme des acides biliaires. Pour cela, nous avons généré des souris dont le gène LRH-1 est invalidé de manière spatio-temporelle. Ces souris présentent une réduction drastique de la synthèse de l’acide cholique engendrant une profonde modification qualitative du pool d’acides biliaires, ce qui modifie les caractéristiques physico-chimique de la bile et résulte en une malabsorption des lipides. Ainsi, cette étude démontre le rôle essentiel de LRH-1 dans le maintien de l’absorption intestinale des lipides. La seconde étape de ce travail a consister à étudier les conséquences de l’absence de LRH-1 sur le transcriptôme hépatique. Nos résultats suggèrent un rôle potentiel de LRH-1 dans la régulation du métabolisme des acides gras ainsi que dans la régulation de la cascade du complément
The goal of this work was to evaluate the in vivo role of the nuclear receptor Liver receptor homolog 1 (LRH-1) in the control of cholesterol and bile acid homeostasis. To this end, a mouse model in which the LRH-1 gene is specifically deleted in the hepatocytes was generated. These mice show a massive reduction of CYP8B1 and fail to produce cholic acid. In addition, we also show that the profound remodeling of the BA composition reduces significantly the efficacy of intestinal absorption of lipids and re-uptake of BAs and facilitates the removal of lipids from the body. Our studies hence unequivocally demonstrate a pivotal role for LRH-1 in determining the composition of BAs, which, in turn, has major consequences on the whole body lipid homeostasis. The second step of this work was to study the impact of the absence of LRH-1 on the hepatic transcriptome. The preliminary outcome of this study is suggestive for a predominant role of LRH-1 in both lipid metabolism and immune defense

Les effets de différents acides biliaires sur le ca² ⁺ cellulaire ont été examinés dans des suspensions d'hépatocytes isolés de rats. Les acides biliaires taurolithocholate et lithocholate qui inhibent la sécrétion biliaire in vivo augmentent le ca² ⁺ ionizé cytosolique de 150 à 700 nM en 20 secondes et stimulent l'efflux de ca² ⁺ cellulaire. Cet effet est dose-dépendant (EC50 de 16-18 micromoles/1). Il est indépendant du ca² ⁺ extracellulaire et résulte d'une mobilisation rapide de ca² ⁺ depuis un compartiment interne (0. 8 à 1 nmol/mg de protéines). Ce compartiment est le même que celui perméabilisé par la vasopressine, via la production d'inositol (1, 4, 5) tiphosphate (IP3). Cependant, au contraire de l’hormone, les deux acides biliaires ne stimulent pas la synthèse d’IP3. Dans les hépatocytes traités à la saponine, le taurolithocholate et le lithocholate provoquent une brusque libération de ca² ⁺ (en 20 sec, avec un EC50 à 16-18 µM) depuis un compartiment non mitochondrial, ATP-dépendant et sensible à l'IP3, c'est à dire depuis le reticulum endoplasmique. Cette action résulte d'une perméabilisation de la membrane et non d'une action sur la ca² ⁺_ Mg² ⁺ _ATPase ou sur les récepteurs à l'IP3. Il est spécifique du reticulum endoplasmique aucun effet de ces acides biliaires n'est observé sur la membrane plasmique cellulaire, mitochondriale ou sur les membranes artificielles de phosphatidylcholine. Au contraire, les acides biliaires trihydroxylés, taurocholate et chelate, qui stimulent la sécrétion biliaire, n'affectent pas le ca² ⁺cellulaire. Ces résultats suggèrent fortement que les acides biliaires taurolithocholate et lithocholate perméabilisent, de façon directe et spécifique, la membrane du réticulum endoplasmique pour le ca² ⁺. Cette perméabilisation pourrait être un signal clé dans le déclenchement de l'inhibition de la sécrétion biliaire
The effects of different bile acids on cell ca² ⁺ were examined in suspensions of isolated rat hepatocytes. The bile acids taurolithocholate and lithocholate, which markedly inhibit bile secretion, increase the concentration of cytosolic ca² ⁺ from 150 to 700 nM within 20 sec and stimulate the efflux of ca² ⁺ from the cells. The effect is dose-dependent (half-maximal effect at 16-18 ). It is independent of the extracellular ca² ⁺ and results from a rapid mobilization of ca² ⁺ from an intracellular store (0. 8 tc 1 nmol/mg proteins). This store is the same as that permeabilized by the Inositol-(1,4,5)-triphosphate dependent hormone, vasopressin. However, unlike the hormone, taureli thocholate and lithochelate do not stimulate Inositol-(1,4,5)-triphosphate CIP3l synthesis. In saponintreated hepatocytes, taurolithocholate and lithocholate induce a substantial release of ca2+ (within 20 sec with a half-maximal effect at 16-18 ),from an ATP-dependent, non mitochondrial pool, which is sensitive to IP3, likely the endoplasmic reticulum. This effect is not mediated by an action on the ca² ⁺-Mg² ⁺-ATPase or on the IP3 receptors and results from a permeabilization process. The action of the bile acids is specifie for the endoplasmic reticulum as demonstrated by the fact that the bile acids have no permeabilizing effects on mitochondria and cell plama membranes and on artificial phosphatidylcholine vesicles. In contrast, the trihydroxylated bile acids taurocholate and chelate, which stimulate bile secretion, do not alter cell ca² ⁺, These results suggest that taurolithocholate and lithocholate permeabilize directly and specifically the membrane of endoplasmic reticulum to ca² ⁺. This permeabilization might be a key signal in the inhibition of bile secretion

Les acides biliaires agissent comme des molécules anti-obésité, en augmentant la dépense énergétique via l’activation d’un récepteur membranaire pour les acides biliaires, le TGR5. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié extensivement différents agonistes pour le TGR5, ainsi que leurs propriétés pharmacologiques, en particulier pour leur utilisation potentielle dans le traitement des maladies métaboliques. Dans la première étude, nous avons établi les relations structure / activité sur le TGR5 pour plus de 80 acides biliaires (et dérivés) naturels. Ce travail a permis d’identifier les caractéristiques structurales que devaient présenter les acides biliaires pour activer le TGR5, et en outre a permis l’identification de plusieurs agonistes puissants pour le TGR5. Dans une deuxième étude, nous nous sommes intéressés à un phytostérol, la gugulstérone (GS), connue pour ses effets régulateurs sur le métabolisme. Nous avons montré que GS est également un puissant agoniste du TGR5. Biologiquement, GS active Dio2 et augmente la consommation d’oxygène chez l’animal et dans des modèles cellulaires. Dans la troisième étude, nous avons criblés des extraits de plantes afin d’identifier d’autres agonistes du TGR5. Ce criblage a permis d’identifier 21 plantes activant le TGR5 dont une pour laquelle une sélection bio-guidée nous a permis d'identifier une molécule originale agoniste du TGR5 dont la structure a été confirmé par RMN. Cette molécule a été testée chez l’animal et a révélé des propriétés anti-obésité. L’ensemble de ce travail a permis d‘identifier plusieurs agonistes puissants du TGR5, lesquels pourraient servir de base à un développement pharmaceutique dans le futur
Bile acids were shown to have antiobesity properties by increasing energy expenditure via activation of a membrane bile acid receptor, TGR5. In this thesis studies, potent TGR5 agonist was widely explored for pharmacological applications of the treatment of metabolic diseases. In the first study, the structure-activity relationship study was performed using 80 natural bile acids, bile acid derivatives. Not only structural feature of bile acid on TGR5 activation, but also several TGR5 agonists were identified as potent TGR5 selective agonists in this study. In the second study, the author paid an attention to a phytosterol, gugulsterone (GS) known as a metabolic modulator. Its effect was reported to be mediated by another bile acid receptor FXR but the author found that GS was a potent TGR5 ligand. Biological activity of GS on Dio2 activation and enhancement of oxygen consumption was observed in animal model and in cell model. This study showed diversity of drug development targeted to the two bille acid receptor, TGR5 and FXR. In the third study, the author attempted screening of TGR5 agonists using 29 plant extracts as a source of compound library. This assay revealed that 21 out of 29 crude extracts were positive. The author succeeded to purify and identify an active compound from one of the positive extract by means of flash chromatography and subsequently NMR analysis. The active compound showed antiobesity effects in an animal. Thus the author could identify the several compounds as potent TGR5 agonists, which could find the pharmacological applications in the future

Les virus des hépatites B et C (VHB et VHC) entretiennent des liens étroits avec le métabolisme lipidique des hépatocytes. Ainsi, la réplication du VHB est dépendante de certains récepteurs nucléaires hépatiques, tels que HNF4α et PPARα, impliqués dans ce métabolisme. L’assemblage des particules virales du VHC dépend lui de la voie de synthèse des lipoprotéines de très faible densité (VLDL) et le virus circule dans le sang sous forme de lipo-viro-particules associé notamment à l’apolipoprotéine B, un composant essentiel des VLDL. Dans ce travail, nous avons d’abord étudié le rôle de FXRα, le récepteur nucléaire des sels biliaires, sur la réplication du VHB. Nous avons montré, in vitro, que les sels biliaires, via FXRα, activaient le promoteur de Core du VHB qui contrôle le niveau de réplication virale. Puis dans l’étude des liens entre les lipoprotéines et le VHC, nous avons montré que l’apoB présente sur certaines particules virales jouaient un rôle important dans l’infectiosité du virus in vitro, et que la protéine Cideb, présente en surface des gouttelettes lipidiques et impliquée dans l’assemblage des VLDL, était impliquée dans l’association du VHC avec l’apoB et influençait l’infectiosité des virions sécrétés. De plus nous avons mis en évidence l’existence de particules sub-virales chez les patients infectés, de nature lipoprotéique mais ne portant que les protéines d’enveloppes du VHC. Tous ces résultats renforcent l’idée d’une adaptation du VHB et du VHC au métabolisme lipidique hépatique. Les bénéfices éventuels qu’en retirent ces deux virus, ainsi que l’existence de possibles thérapeutiques anti-virales ciblant le métabolisme lipidique, restent à explorer
Hepatitis B and C viruses (HBV and HCV) infections are tightly linked with hepatic lipid metabolism. HBV replication depends on specific nuclear receptors, such as HNF4α and PPARα, both implicated in this metabolism. HCV assembly depends on the synthesis of Very-Low-Density Lipoproteins (VLDL), and the virus circulates in the blood as lipo-viral-particles associated in particular with apoB, an essential component of VLDL. In this study, we first studied the influence of FXRα, the nuclear receptor for bile acids, on HBV replication. We showed that, in vitro, bile acids, via FXRα, were able to activate the HBV Core promoter which controls the level of viral replication. Then, in the study of the interactions between HCV and lipoproteins, we demonstrated that apoB, which is associated with a proportion of viral particles, played an important role in HCV infectivity in vitro, and that Cideb, a protein involved in VLDL assembly, was implicated in the association between HCV and apoB and influenced the infectivity of secreted viral particles. Finally, we showed that, besides HCV infectious particles, sub-particles bearing only viral envelope glycoproteins circulated in the blood of infected patients. Interactions of HBV with the metabolism of bile acids, and of HCV with the metabolism of lipoproteins, are two examples of adaptation of a parasite to its host. The potential benefits from these interactions are still to be determined, as well as the possibility to develop anti-viral strategies targeting lipid metabolism

Le récepteur CAR, Constitutive Androstane Receptor, appartient à la-famille NR1 des récepteurs nucléaires. Initialement décrit comme un récepteur orphelin, CAR est en fait activé par un grand nombre de molécules exogènes et une des fonctions principales de CAR est celle de xénosenseur. L'activation CAR par ses différents ligands stimule la transcription des enzymes de phase I, II et III nécessaires à la détoxification et à l'élimination des xénobiotiques. Parallèlement, CAR a fait l'objet de nombreux travaux indépendants qui ont démontré son implication dans le métabolisme de molécules endogènes comme les acides biliaires, la bilirubine et les hormones thyroïdiennes. Plus récemment un impact de CAR sur des voies métaboliques fondamentales comme la néoglucogenèse, la lipogenèse et le métabolisme des lipoprotéines a été mis en évidence faisant de CAR au même titre que les récepteurs du groupe NR1 (LXR et FXR) une cible potentielle pour l'étude et le traitement du syndrome métabolique et des maladies cardio-vasculaires. Dans le cadre de ce mémoire nous avons étudié l'impact d'une stimulation chronique de CAR par un agoniste spécifique le TCPOBOP sur le transport reverse du cholestérol, le métabolisme des lipoprotéines et la susceptibilité à l'athérosclérose dans un contexte de surcharge alimentaire en cholestérol. Chez les souris dyslipidémiques déficientes pour le gène du récepteur aux lipoprotéines de faible densité (Ldlr-/-) ou bien déficientes pour l'apoprotéine E l'activation spécifique de CAR par l'agoniste TCPOBOP (3,3',5,5'-Tétrachloro-1,4-bis (pyridyloxy )benzene), 1) diminue la lipogenèse via l'induction du facteur Insig1 et la répression du facteur de transcription Srebp1c et de ses gènes cibles. Cela se traduit par une diminution de la triglycéridémie plasmatique associée à une diminution du contenu hépatique en triglycérides et une diminution de la sécrétion de lipoprotéines riches en triglycérides, 2) stimule la conversion et l'élimination fécale du cholestérol sous forme d'acides biliaires ce qui se traduit par une élimination accrue du cholestérol dérivé des HDL dans les fèces, dernière étape du transport reverse du cholestérol, 3) diminue le taux de cholestérol associé aux LDL chez les souris Ldlr-/- probablement par stimulation de l'expression hépatique du récepteur aux lipoprotéines de très basse densité. La diminution de l'athérogénicité du profil lipoprotéique et la stimulation du transport reverse du cholestérol sont associées à une réduction des lésions athéromateuses au niveau des valves et de la crosse aortique chez les souris Ldlr-/-. Une diminution des lésions athéromateuses uniquement au niveau de la crosse aortique est également observée chez les souris ApoE-/- L'ensemble des travaux présentés et les récentes études publiées suggèrent que CAR peut être considéré comme un acteur central du métabolisme lipidique et font de ce récepteur nucléaire une nouvelle cible potentielle pour l'étude et le traitement des désordres métaboliques comme le diabète, l'obésité, la stéatose hépatique et l'athérosclérose

L’homéostasie énergétique ou ‘balance énergétique’ est l’équilibre qui s’établit chez l’Homme et l’animal adulte entre la prise quotidienne de nutriments sous la forme de glucides, de lipides ou de protéines et leur oxydation pour ne produire que la quantité énergétique strictement nécessaire. Pour maintenir cette balance l’organisme doit recueillir en permanence des signaux nerveux, métaboliques ou hormonaux de la part de cellules spécifiques. Ces senseurs des besoins énergétiques transmettent alors à des centres régulateurs leurs informations qui en retour, par voie hormonale ou nerveuse, informent les organes effecteurs des mesures à prendre pour stocker, produire ou consommer l’énergie. Les trois principaux centres de cette balance sont 1/ le cerveau, centre intégrateur de l’information ; 2/ un groupe d’organes effecteurs parmi lesquels le foie, le tissu adipeux, les muscles squelettiques, le pancréas et 3/ un centre senseur de la qualité et de la quantité des aliments, le tractus gastrointestinal (Migrenne 2006). En plus d’être la source d’énergie nécessaire à la vie des cellules, les nutriments tels que les acides gras, le cholestérol ou encore le glucose sont aussi des molécules de signalisation cellulaire à la fois par leur fixation à des récepteurs membranaires mais aussi via des récepteurs nucléaires. Un déséquilibre dans l’homéostasie énergétique dû à une alimentation déséquilibrée, à un manque d’exercice physique ou à des facteurs génétiques est une caractéristique de l’obésité et de complications telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires (Hill, 2006). Au cours de ma thèse je me suis intéressé à l’intestin pour son rôle de régulateur de l’homéostasie énergétique dans un contexte physiologique ou physiopathologique d’obésité via sa capacité à sécréter l’incrétine Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) en réponse au glucose et aux acides biliaires. J’ai étudié plus particulièrement le rôle du récepteur nucléaire en tant que senseurs moléculaires des acides biliaires FXR dans les cellules sécrétrices de cette incrétine car à l’heure actuelle rien n’était connu quant à son rôle ni même quant à son expression dans la cellule L. Pour cela, j’ai utilisé des lignées cellulaires murines et humaines où j’ai mis au point les conditions expérimentales pour répondre aux questions posées. Grâce à des ARN d’intestins issus de différents modèles de souris la relevance chez le rongeur a été testée. La relevance de ces résultats sur des biopsies intestinales humaine a également été testée. Grâce à ces outils, j'ai pu montré que FXR dans les cellules L était fonctionnel et que son activation interférait avec la voie de la glycolyse entrainant moins de synthèse et de sécrétion de GLP-1. Cela nous a permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire par lequel les séquestrants des acides biliaires exercent leur effets bénéfiques chez des patients atteints de diabète de type 2
Originally identified as dietary lipid detergents, bile acids (BA) are now recognized as signaling molecules which bind to the transmembrane receptor TGR5 and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X Receptor). Upon binding to TGR5 at the surface of enteroendocrine L cells, bile acids (BA) promote the secretion of the incretin GLP-1 which potentiates the glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells. More than 50% of the insulin secretion in response to glucose is mediated by GLP-1 and the other incretin Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP). Once secreted, GLP-1 is rapidly (2-3 minutes) degraded by the endothelial enzyme Dipeptydil Peptidase 4 (DPP4). GLP-1 analogues and DPP4 inhibitors are successfully used for the treatment of T2D. FXR is a ligand-activated nuclear receptor highly expressed in the liver and in the distal intestine. FXR controls BA, lipid and glucose metabolism. Whether FXR is expressed, functional in intestinal enteroendocrine L cells and in which extend its activation affects GLP-1 production are not yet reported. Encouraging data were obtained during my M2 training course. The aim of my thesis was thus to assess whether FXR in enteroendocrines cells could participate in the control of the deregulation of glucose homeostasis. Multiple in vitro, ex vivo and in vivo human and murine models allowed us to show that FXR is present and functional in L cells. FXR activation decreases GLP-1 production and secretion in L cells by inhibiting glycolysis pathway through an interference with the carbohydrate responsive transcription factor ChREBP. Finally, I identified an additional mechanism of action of the bile acid sequestrant Colesevelam, a molecule currently successfully used in USA for treating type 2 diabetic patients

La supplémentation des régimes alimentaires en stérols ou en acide biliaire provoque une augmentation du taux de cholestérol et de phospholipides dans les microsomes hépatiques et une diminution du taux de malandialdéhyde. L’administration de T3 provoque l'effet inverse

Le taux de HDL-Cholestérol (Lipoprotéine de Haute Densité, HDL-C) est inversement corrélé au risque cardiovasculaire. L'effet athéroprotecteur des HDL est principalement attribué à leur fonction métabolique dans le Transport Retour du Cholestérol (TRC), un processus par lequel le cholestérol excédentaire des cellules périphériques, et des macrophages spumeux en particulier, est pris en charge par les HDL pour être ramené vers le foie où il sera finalement éliminé via les secrétions biliaires. Notre équipe a décrit à la surface des hépatocytes humains une nouvelle voie de captation des HDL dans laquelle l'apoA-I, protéine majoritaire des HDL, se lie en surface des hépatocytes à un complexe enzymatique similaire à la F1-ATPase mitochondriale (appelé ecto-F1-ATPase) et active l'hydrolyse de l'ATP extracellulaire en ADP. L'ADP ainsi généré active spécifiquement le récepteur purinergique P2Y13 pour in fine stimuler l'endocytose des holoparticules HDL (protéines + lipides) via un récepteur de basse affinité, différent du récepteur SR-BI et dont l'identité reste à ce jour inconnu. Dans ce travail, nous avons étudié la fonction du récepteur P2Y13 dans le TRC et le développement de l'athérosclérose in vivo chez la souris. Dans une première partie, nous avons observé que des souris déficientes pour le récepteur P2Y13 (P2Y13 Knockout, KO) présentent une diminution de la captation hépatique en cholestérol et des secrétions de lipides biliaires. Ces changements sont accompagnés d'une forte diminution du TRC des macrophages vers les fèces et un régime riche en cholestérol (1. 25%, HCD) accentue ce phénotype. Inversement, l'injection en bolus d'un agoniste partiel du récepteur P2Y13, le cangrelor, stimule la captation hépatique et les secrétions en lipides biliaires (cholestérol, phospholipides et acides biliaires) chez des souris sauvages (WT) et des souris invalidées pour SR-BI hépatique (SR-BI KOliver) mais pas chez les souris P2Y13 KO. Sur le long terme, une infusion chronique de cangrelor pendant 3 jours sur des souris WT, diminue les concentrations plasmatiques en HDL-C en augmentant leur captation hépatique. Cet effet se retrouve corrélé à une augmentation des secrétions biliaires en acides biliaires. Dans une deuxième partie, nous avons démontré que l'invalidation de P2Y13 dans a modèle de souris d'athérosclérose, apoE KO, induit une augmentation de la plaque d'athérosclérose en corrélation avec une diminution des secrétions de lipides (cholestérol, phospholipides et acides biliaires) dans la bile et les fèces. Ainsi, l'ensemble de ces résultats montre que le récepteur P2Y13 pourrait constituer une nouvelle cible dans les thérapies HDL, visant à prévenir et/ou faire régresser le développement de la plaque d'athérosclérose
The level of High Density Lipoprotein-Cholesterol (HDL-C) is inversely correlated to the risk of atherosclerotic cardiovascular disease. The protective effect of HDL is mostly attributed to their metabolic functions in Reverse Cholesterol Transport (RCT), a process whereby excess cell cholesterol is taken up from peripheral cells and macrophages by the HDL particles, and is later delivered to the liver for elimination by bile excretion. We have previously identified a new pathway for hepatic HDL uptake, involved in RCT. In this pathway, apoA-I, the major protein of HDL, binds an ecto-F1-ATPase leading to ATP hydrolysis into ADP. Extracellular ADP activates the P2Y13 receptor which stimulates in fine HDL uptake through an unknown low affinity receptor, distinct from the classical HDL receptor, SR-BI. In this work, we have investigated on mouse models the physiological relevance of P2Y13 receptor in RCT and atherosclerosis development. In a first part, we have showed that P2Y13 deficient mice fed on chow diet displayed a decrease in hepatic HDL-C uptake and biliary lipids secretions. In these conditions, P2Y13 deficiency was also associated with a strong decrease in RCT, from macrophages to the faeces. Moreover, the same phenotype was found on P2Y13 deficient mice fed on a high cholesterol diet (1. 25%, HCD). Conversely, intravenous bolus injection of cangrelor, a partial agonist of P2Y13, stimulated hepatic HDL uptake and biliary lipids secretions (cholesterol, bile acids and phospholipids) in both wild-type and scavenger receptor class B type I liver deficient mice, with no effect in P2Y13 knockout mice. Furthermore, a long-term chronic treatment with cangrelor, by continuous infusion for 3 days, decreased plasma HDL-C levels as a consequence of increased hepatic HDL uptake. These effects were correlated with an increase in biliary bile acid secretion. In a second part, we have showed that deficiency of P2Y13 in a mice model for atherosclerosis, apoE knockout mice, induced an increase in atherosclerosis development. This result was correlated with a decrease in biliary lipids secretions and excretions into the faeces. Taken together our results suggest that P2Y13 receptor could be a target for therapeutic intervention on HDL ("HDL-Therapies"), aiming to prevent or reduce the development of atherosclerosis

Le foie est un organe clef dans la régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. La superfamille des récepteurs nucléaires y joue un rôle primordial de senseur de l’environnement métabolique. Parmi ces récepteurs nucléaires, le récepteur des acides biliaires FXR participe aux mécanismes de régulation de l’activité du foie à travers son action sur les métabolismes des acides biliaires, des glucides et des lipides. FXR est devenu ainsi une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de nombreuses maladies impliquant un désordre métabolique comme les cholestases, le diabète de type 2 ou la stéatohépatite non-alcoolique. Malgré des résultats prometteurs dans le traitement de la stéatohépatite non-alcoolique, le traitement de patients avec un agoniste de FXR, le INT747, semble augmenter la concentration plasmatique du LDL-Cholestérol et diminue la concentration du HDL-Cholestérol suggérant un risque accru de développement d’athérosclérose. Ces effets sur le profil lipidique sont le frein majeur du développement clinique de ses agonistes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation par FXR de nombreuses voies comme le métabolisme des lipides et du cholestérol sont peu explorés et peu compris. Compte-tenu de ces informations, il est d’autant plus intéressant d’approfondir les connaissances de ces mécanismes et d’identifier des facteurs ou de nouveaux partenaires capables de moduler l’activité transcriptionnelle de FXR plus spécifiquement dans le cadre du contrôle du métabolisme des lipides et du cholestérol. L’un des facteurs de transcription connu comme régulateur majeur de ces voies métaboliques dans le foie est le facteur de transcription de la famille forkhead FOXA2. Ce facteur de transcription, dont l’activité est dépendante des conditions physiologiques, est activé par le glucagon et inhibé par l’insuline. De plus, c’est également un régulateur du métabolisme des acides biliaires, du cholestérol et des lipides.L’objectif de cette thèse a été d’étudier l’interaction entre les voies de signalisation de FXR et de FOXA2 dans différentes lignées cellulaires d’hépatocytes humains ou murins et dans le foie. Nous avons établi que FOXA2 et FXR sont colocalisés sur la chromatine des cellules HepG2 et dans le foie de souris à proximité de gènes impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du cholestérol. Ces zones de cofixation de FXR et de FOXA2 présentent très peu de motifs de fixation de FOXA2 suggérant l’implication d’autres motifs de fixation non connus ou un mécanisme de type « tethering ». Nous avons montré que la fixation de FOXA2 à ces zones de cofixation avec FXR est augmentée par l’activation de FXR par son agoniste, le GW4064, évoquant une potentielle interaction entre ces deux facteurs. Nous avons démontré que ces deux facteurs interagissaient physiquement et que FOXA2 est un répresseur de l’activité transcriptionnelle de FXR à travers l’utilisation de différentes approches et modèles cellulaires. Finalement, dans les hépatocytes primaires de souris, FOXA2 est impliqué dans la répression de l’activité transcriptionnelle de FXR par le glucagon sur le gène Shp.L’ensemble de ce travail met en évidence pour la première fois la répression de l’activité de FXR par le facteur de transcription caractéristique du jeûne FOXA2 à travers un mécanisme moléculaire suggérant une transrépression de type «tethering». Ces résultats présentent un mécanisme inédit par lequel l’activité de FXR peut être modulée par le statut nutritionnel de façon gène-spécifique
The liver is a key regulator of whole-body energy metabolism. The nuclear receptor super-family plays a leading role in the metabolic sensing of the liver. Among the nuclear receptors, the bile acid nuclear receptor FXR contribute to the modulation of liver activity in particular through the regulation of bile acid, lipids and glucose homeostasis. Consequently, FXR became a potential therapeutic target for many diseases implicated metabolic disorder such as cholestasis, type 2 diabete or Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH). Despite promising results especially on NASH, patient treatment with FXR agonist the INT747 seems to increase LDL-Cholesterol plasma concentrations together with a decreased concentration of HDL-Cholesterol suggesting a higher risk to develop atherosclerosis. These effects on plasma lipid profile are the major break against the development of agonists in clinics. Giving the poor understanding and knowledge of the molecular mechanisms which govern FXR regulation of activity on various signaling pathways, it is of major interest to find new partners and regulators of FXR and especially on lipid and cholesterol homeostasis. One of the transcription factor known to be active in the control of these signaling pathways in the liver is the forkhead box transcription factor FOXA2. This transcription factor whose activity is dependent of physiological conditions is activated by glucagon and inhibited by insulin. In addition, this factor is known to regulate bile acid, cholesterol and lipid metabolism, functions very close from FXR activities in the liver.The objective of this PhD was to study the interaction between FXR and FOXA2 signaling pathways in different hepatic cells lines from human or mouse origin and in the liver. We established that FOXA2 and FXR are colocalised in HepG2 cells and liver chromatin near genes implicated in the lipid and cholesterol metabolism. These FXR/FOXA2 cobinding zones present few consensus FOXA2 response elements suggesting the implication of non consensus binding motifs or a “tethering” mechanism. We show that FOXA2 binding to FXR/FOXA2 cobinding zones is increased when FXR is activated and/or more present in the chromatin evoking a potential interaction between these two factors. We demonstrate that FXR and FOXA2 interact physically and that FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity using different approaches and cellular models. Finally, we show that FOXA2 is implicated in glucagon-induced repression of FXR transcriptional activity on Shp gene.To conclude, our results show for the first time that the fasting key regulator of lipid and cholesterol homeostasis FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity through a plausible mechanism involving “tethering” process. This work gives a novel mechanism by which FXR activity can be modified by nutritional status in a gene-specific manner

La dérégulation du métabolisme glucidique conduisant au développement d’une hyperglycémie est classiquement associée aux maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et l’obésité. Le foie est un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Ainsi, lors d’un état post-prandial (après un repas), il utilise le glucose pour produire de l’énergie par la voie de la glycolyse, mais surtout stocke l’excès de glucose sous forme de glycogène par la voie de synthèse du glycogène et l’excès d’énergie sous forme d’acides gras par la voie de la lipogenèse. Ces voies sont sous le contrôle des hormones insuline et glucagon qui, en fonction des changements nutritionnels, régulent respectivement l’utilisation (glycolyse) et la production (néoglucogenèse) de glucose en induisant l’expression des enzymes de ces voies métaboliques. Plus récemment, il a été montré que les voies de la glycolyse et de la lipogenèse sont également régulées par le glucose qui active le facteur de transcription ChREBP (Carbohydrate Response Element Binding Protein) et induit de ce fait l’expression des gènes de la glycolyse, tels que la LPK (Liver Pyruvate Kinase), et de la lipogenèse, tels que FAS (Fatty Acid Synthase) et ACC1 (Acetyl-CoenzymeA Carboxylase 1). Le récepteur nucléaire Farnesoid X Receptor (FXR), un facteur de transcription activé par des ligands, en plus de son rôle très important dans la régulation des acides biliaires et des lipides, contrôle aussi le métabolisme glucidique dans le foie. Ainsi, FXR inhibe l’expression des gènes des voies de la glycolyse et de la lipogenèse, probablement en interférant avec le facteur de transcription ChREBP, comme le propose une étude récente. Les objectifs de ma thèse ont été de caractériser deux lignées hépatocytaires humaines IHH (Immortalized Human Hepatocytes) et HepaRG d’un point de vue métabolique et d’étudier les mécanismes moléculaires d’interférence du récepteur nucléaire FXR avec l’activité du facteur ChREBP dans ces deux lignées
Glucose metabolism dysreglation leads to the developpment of hyperglaecemia and is classically associated with metabolic diseases such as Type II diabetes or obesity. The liver is a key organ in the control of glucose homeostasis. Indeed, at a post-prandial state (after a meal), it utilizes glucose to produce energy by the glycolysis pathway, but mostly stores the glucose excess as glycogen by the glycogenesis pathway and the energie excess as fatty acids by the lipogenesis pathway. These pathways are controlled by insulin and glucagon hormones which, in response ton nutritional changes, regulate respectively the utilization (glycolysis) and the production (gluconeogenesis) of glucose by inducing the expression of enzymes involved in these pathways. More recently, it has been shown that glycolyisis and lipogenesis are also regulated by glucose who activates the transcription factor ChREBP (Carbohydrate Response Element Binding Protein) and therefore induces the expression of glycolytic genes, such as LPK (Liver Pyruvate Kinase) and lipogenic genes, such as FAS (Fatty Acid Synthase) and ACC1 (Acetyl-CoenzymeA Carboxylase 1). Nuclear receptor Farnesoid X Receptor, a transcription factor activated by ligands, besides its role in the regulation of bile acids and lipids, also controls the glucose metabolism in liver. Thus, FXR inhibit the expression of genes involved in glycolysis and lipogenesis, probably by interfering with the transcription factor ChREBP, as it has been suggested by a recent study The objectifs of my thesis were to characterize two human hepatocyte cell lines IHH ( (Immortalized Human Hepatocytes) and HepaRG from a metabolic point of view and to study the molecular mecanisms involved in the interference of FXR with the activity of ChREBP in these two cell lines

Les acides biliaires (ABs) sont des molécules produites dans le foie, stockées dans la vésicule biliaire, sécrétées dans l’intestin et retournant au foie via le cycle entéro-hépatique. Une fraction des ABs échappe à la recaptation par le foie et passe dans la circulation systémique par laquelle ils atteignent les organes périphériques dont le pancréas. Outre leur fonction de faciliter l’absorption intestinale des lipides, les ABs sont des molécules de signalisation qui agissent via les récepteurs aux ABs, exprimés dans les tissu clés de la régulation du métabolisme, et dont la modulation par les ABs contribue à réguler l’homéostasie énergétique. Ainsi des variations dans la composition du pool d’ABs peuvent déterminer la modulation du métabolisme via leurs récepteurs.Le récepteur aux ABs Farnesoid-X-receptor (FXR) est impliqué dans la régulation du métabolisme glucidique, lipidique et des ABs par son action dans le foie, l’intestin, les tissus adipeux et le pancréas. La souris déficiente pour FXR dans le corps entier présente une intolérance au glucose et une insulino-résistance dans le foie et dans les tissus périphériques, alors que dans un contexte d’obésité la déficience de FXR améliore ces paramètres. De plus, FXR est exprimé dans la cellule bêta-pancréatique (bcell) où il régule la synthèse et la sécrétion d'insuline, mais les mécanismes moléculaires n’ont pas été complètement élucidés. Pour comprendre 1) la contribution de FXR bcell dans le phénotype métabolique de la souris FXRKO-total, et 2) les mécanismes moléculaires de la régulation de l’insuline par FXR dans la bcell, j’ai développé un modèle murin invalidé pour FXR spécifiquement dans la bcell par la stratégie Cre-LoxP. Le développement du modèle a mis en évidence des phénomènes de recombinaison non-spécifiques et j’ai mis au point une stratégie de génotypage permettant de pallier à cette problématique. J’ai testé différents contextes métaboliques permettant de mettre en évidence le phénotype de la souris FXRKObcell (régime standard et riche en graisses, conditions de jeûne et re-nourriture, variation circadienne). Par rapport au contrôle, la souris FXRKO-bcell développe une intolérance au glucose et présente des insulinémies plus basses, défauts majorés par un régime riche en graisses. L’analyse transcriptomique globale des îlots a permis d’identifier un ensemble de microRNA fortement dérégulés par l’invalidation de FXR bcell qui pourraient expliquer les dysfonctions de sécrétion d’insuline.Outre la modulation de l’activité des récepteurs, des effets métaboliques peuvent être obtenus en modulant la composition du pool de leurs ligands, les ABs. Ainsi, des perturbations métaboliques (comme l’insulino-résistance et le diabète de type 2, l’obésité) sont associées à des variations qualitative et/ou quantitative du pool d’ABs. De plus, des variations du pool d’ABs accompagnent les améliorations métaboliques qui suivent la pratique chirurgicale de Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB) avant la perte de poids, ce que suggère que les ABs puissent être parmi les acteurs des effets métaboliques bénéfiques indépendants de la perte de poids. Pour étudier cette hypothèse, des modèles précliniques de RYGB ont été développés. Au cours de ma thèse j’ai comparé le pool d’ABs pre et post RYGB entre trois espèces (rat, cochon et Homme ; coll. Pr. F. Pattou et Dr. E. Osto) avec l’objectif d’évaluer quel modèle préclinique est le plus approprié pour ces études en termes de caractéristiques du pool d’ABs. La deuxième étude concerne la recherche des causes et mécanismes sous-jacents à l’augmentation des concentrations en ABs circulants induits par le RYGB. Dans le modèle de minipig (coll. Pr. F. Pattou), l’analyse de la composition des pool d’ABs circulants et d’expression génique dans le foie avant et après RYGB, a permis de montrer que des changements de la fonction hépatique sont - au moins en partie - responsables de l’augmentation dans le pool d’AB qui suit le RYGB
Bile acids (BAs) are molecules produced in the liver, stored in the gallbladder, secreted into the intestine and returning to the liver via the enterohepatic circulation. A fraction of BAs escapes the reuptake by the liver and enters the systemic circulation, by which they reach the peripheral organs including the pancreas. Besides their function in facilitating the intestinal absorption of lipids, BAs are signaling molecules that act through receptors for BAs, which are expressed in the key tissues for metabolic regulation, and whose modulation by BAs contribute to regulate energy homeostasis. Thus, variations in the composition of the BAs pool determine the modulation of metabolism via their receptors. The BA-receptor Farnesoid-X receptor (FXR) is involved in the regulation of glucose, lipid and BA metabolism by its action in the liver, intestine, adipose tissue and pancreas. Whole body FXR deficient mice are glucose intolerant and insulin resistant in liver and peripheral tissues, whereas in a context of obesity, FXR deficiency rather improves these parameters. Furthermore, FXR is expressed in the pancreatic beta cell (bcell), where it regulates the synthesis and the secretion of insulin, but the molecular mechanisms have not been fully elucidated yet. To understand 1) the contribution of FXR bcell in the metabolic phenotype of the total FXRKO-mouse, and 2) the molecular mechanisms of the regulation of insulin production by FXR in the bcell, I developed a mouse model invalidated for FXR specifically in the bcell by the Cre-loxP strategy. The development of the model showed nonspecific recombination phenomena, and I developed a genotyping strategy to overcome this problem. To highlight the phenotype of the FXRKObcell mouse I tested various metabolic contexts (standard and high fat diet, fasting and refeeding conditions, circadian variations). Compared to control, FXRKO-bcell mice developed glucose intolerance and has lower insulinémia, defects increased by a high fat diet. The global transcriptomic analysis in the islets identified a set of microRNA strongly deregulated by invalidating FXR in the bcell, which could explain the dysfunctions in insulin secretion. Besides the modulation of the activity of the receptors, metabolic effects can be obtained by varying the composition of the pool of their ligands BAs. Thus, metabolic perturbations (such as insulin resistance and type 2 diabetes, obesity) are associated with qualitative and/or quantitative variations in the BA pool. In addition, variations of the BAs pool are associated to the metabolic improvement that precedes the weight loss after the surgical practice of Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB), which suggests that the BAs can be among the actors of the ‘weight loss-indipendent’ beneficial metabolic effects of RYGB. To investigate this hypothesis, some preclinical models of RYGB have been developed. During my thesis I compared the pool of BAs pre and post RYGB among three species (rat, pig and human; Coll. Prof. F. Pattou and Dr. E.Osto) with the aim of assessing which preclinical model is most suitable for these studies in terms of characteristics of the BAs pool. In a second study, I focused on the causes and mechanisms underlying the increased concentrations of circulating BAs induced by RYGB. In the model of minipig (coll. Pr. F. Pattou), the analysis of the plasma BA pool composition and the hepatic gene expression before and after RYGB, allowed to show that changes in the hepatic function are - at least in part - responsible for the increase of the BA pool following RYGB

L’obésité, le diabète de type 2 et l’athérosclérose sont les principaux problèmes de santé publique affectant les pays développés. Bien que de nombreux traitements soient disponibles contre ces maladies, de nombreux progrès sont encore nécessaire pour le développement de composés plus actif et plus sûr. Mon laboratoire a montré que l’activation du récepteur aux acides biliaires TGR5 par ses ligands entrainait une augmentation de la dépense énergétique et réduisait le niveau des cytokines chez la souris, ce qui pourrait être une nouvelle voie vers le traitement de ces désordres métaboliques. Nous décrivons ici le développement d’un nouvel agoniste synthétique, spécifique et puissant pour TGR5. A partir d’une librairie de 20.000 composés, les composés 50980906, 13008574 et 37525283 ont été caractérisés comme les plus puissants et stables. Le composé 13008574 a montré une réduction significative sur la prise de poids de souris C57BL/6J après un régime alimentaire riche en graisses. Suite à l’activation de TGR5, nous avons observés une augmentation du niveau d'expression des gènes Ucp-1, Dio-2 et Cpt-1 dans le tissu adipeux brun et une augmentation de la clairance du glucose suite à une augmentation de la sécrétion de GLP-1 chez les souris traitées par le composé 13008574. Nous avons également montrés que le composé 13008574 n’a pas d’effet sur les souris TGR5-/- témoignant de sa spécificité. Enfin nous avons par ailleurs confirmé l'effet du composé 13008574 comme agent anti-inflammatoire, avec un effet protecteur face au développement de l'athérosclérose. Notre travail montre ainsi que le développement d’agonistes pour TGR5, puissant et sûr, est possible pour traiter le syndrome métabolique
Obesity, type 2 diabetes and atherosclerosis, are amongst the main driving factors of a public health crisis that impacts developed countries. Although several drugs are available, there is still a large unmet medical need to find better and safer compounds to treat these diseases. In this context, my host laboratory discovered that activation of the membrane bile acid receptor TGR5 induces energy expenditure and reduces inflammation in mice, which would be beneficial to manage the above–mentioned disorders. INT-777, a semi-synthetic bile acid, is until now, one of the most specific TGR5 ligands. Here, we report the identification of a new synthetic, selective and potent TGR5 agonist. From a screen of 20,000 compounds as potential TGR5 activators, the compounds 50980906, 13008574 and 37525283 were the most potent and stable. In particular, 13008574 induced a significant reduction of body weight gain when C57BL/6J mice were exposed to a high fat diet, paralleled by an increase in the expression levels of Ucp-1, Dio-2 and Cpt-1 in brown adipose tissue. In addition, mice treated with 13008574 displayed improved glucose clearance, consequent to increased GLP-1 secretion. We showed furthermore that the effects of 13008574 were lost in TGR5-/- mice, testifying the specificity of the compound. In addition, 13008574 acts as an anti-inflammatory agent, with a protective effect on atherosclerosis development in LDLr-/- mice treated with a high cholesterol diet. Our work hence shows that potent, selective, and safe TGR5 agonists can be developed to cure the metabolic syndrome

Les acides biliaires sont des composants naturels du tractus gastro-intestinal. La hausse du taux d’acides biliaires dans l’intestin est associée à une carcinogenèse de l’appareil digestif. L’homéostasie des acides biliaires est maintenue par le contrôle de l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme tels que SHP, FGF19 et CYP-7A1 par le récepteur nucléaire FXRα. FXRα agit comme facteur de transcription en réponse à l’interaction directe des acides biliaires. Par contre, plusieurs évidences tendent à démontrer le rôle central de FXRα dans la carcinogenèse hépatique. Les récepteurs de la famille EGFR/ErbB sont des récepteurs tyrosine kinase également activés par les acides biliaires, dont la surexpression est associée au développement de plusieurs cancers. Ainsi, le projet vise à déterminer l’impact de la signalisation des récepteurs EGFR/ErbB sur la réponse transcriptionnelle de FXRα. Nous avons identifié un mécanisme d’inhibition de l’activité transcriptionnelle de FXRα et de l’expression de ses gènes cibles par l’activation des récepteurs EGFR/ErbB par leur ligands HRG et EGF et par l’expression du mutant constitutivement actif ErbB2-V659E dans les cellules hépatiques. Nous avons montré que ce processus dépend de la signalisation par la voie MAPK. On observe également que l’activation de FXRα diminue la prolifération des cellules cancéreuses du foie alors que celle du récepteur ErbB2 augmente cette prolifération. Ainsi, cette étude nous a permis d’établir un nouveau mécanisme de l’impact délétère de la suractivation des récepteurs EGFR/ErbB sur la prolifération des cellules cancéreuses du foie qui implique une inhibition du potentiel transcriptionnel du récepteur aux acides biliaires FXRα.
Bile acids are natural components of the gastrointestinal tract. An increase of bile acid levels in the intestine is associated with the carcinogenesis of the digestive system. Bile acid homeostasis is maintained by the nuclear receptor FXRα which regulates the expression of specific genes involved in metabolism such as SHP, FGF19 and CYP-7A1. In this way, FXRα acts as a transcription factor following bile acids binding, allowing its transcriptional activation. On the other hand, several studies established the central role of FXRα activation in liver carcinogenesis. EGFR/ErbB receptors are a family of tyrosine kinase receptors that can be regulated by bile acids. Overexpression of EGFR/ErbB receptors is associated with several cancers. Thus, the project aims to examine the impact of EGFR/ErbB receptors signaling on FXR transcriptional potential. We identify that EGFR/ErbB activation by their ligands HRG and EGF and by the expression of the constitutively active mutant ErbB2-V659E inhibits FXR transcriptional activity and expression of its target genes in liver cells. We demonstrate that this process is dependent on the MAPK signaling pathway. We also show that FXR activation decreases proliferation of liver cancer cells while activation of ErbB2 increases this cellular response. Thus, this study identifies a new mechanism of the deleterious impact of EGFR/ErbB receptors overactivation on liver cancer cells proliferation, involving the inhibition of the transcriptional potential of the bile acid receptor FXRα.

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.
Hepatic steatosis and plasma lipid profile deterioration are metabolic diseases favored by post-menopausal estrogen deficiency. However, mechanisms underlying these diseases have not been systematically adressed. The aim of this thesis was to investigate molecular mechanisms causing hypercholesterolemia and lipids (triglycerides: TG and cholesterol) accumulation in the liver using animal model of menopause, the ovariectomized (Ovx) Sprague Dawley rat. We also examined whether lifestyle modifications such as physical activity can prevent or correct changes induced by Ovx. Finally, rosuvastatin (statine) was used as a pharmacological therapy of hypercholesterolemia in order to understand its effect at the molecular level in Ovx rats. The first study was designed to determine how the Ovx may affect levels of TG and cholesterol in the liver of rats fed a high-fat diet (HF: 42% fat). Rats were submitted to a HF or a normal diet for 6 weeks prior to Ovx or being sham operated, and then kept on the same diets for another 6 weeks. The Ovx increased liver TG content, but not the HF diet alone. However, the combination of Ovx and HF diet resulted in a greater liver TG accumulation than that observed in Ovx submitted to normal diet. The mRNA levels of CPT-1, PGC1 and PPARα involved in liver lipid oxidation significantly increased in rats fed the HF diet (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectively); but this increase was substantially less if HF fed rats were Ovx (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectively), thus favouring TG accumulation in the liver. The combination of HF diet and Ovx also induced hypercholesterolemia and an increase in liver total cholesterol content, in spite of the reduction of liver HMGCoA-r gene expression, the key enzyme for cholesterol synthesis. This was also associated with a decrease of liver CYP7a1 gene expression, suggesting a reduction in bile acids synthesis. Having found in the first study that the Ovx increases liver and plasma cholesterol levels, we aimed in the second study at determining the effects of Ovx on gene expression of hepatic and intestinal transporters and enzymes involved in cholesterol and bile acids metabolism; and to verify whether treadmill exercise could prevent or correct changes induced by Ovx. The Ovx resulted in hypercholesterolemia associated with a reduction in gene expression of hepatic low-density lipoprotein receptor (LDL-R), lipoprotein remnants receptor (LRP1), SREBP-2 and PCSK9, suggesting a failure in the clearance of plasma lipoproteins particles. The Ovx also inhibited the expression of MTP and stimulated that of SR-B1 in the liver, but no change was observed with CYP7a1. These molecular changes might, therefore, favor cholesterol accumulation in the liver. Exercise training did not correct the deleterious effects caused by Ovx on gene expression of these molecular markers in the liver with the exception of SREBP-2. However, in the intestine (ileum) treadmill exercise reduced gene expression of molecular markers involved in the absorption of bile acids (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) and cholesterol (LXRα, NCP1L1) in Sham trained rats compared to sedentary rats. This could prevent the development of cholestasis and hypercholesterolemia protecting partially against the onset of atherosclerosis. In view of the deleterious effects (hypercholesterolemia and decreased in gene expression of LDL-R, PCSK9, LRP1, SREBP-2 and HMGCoA-r in the liver) caused by Ovx on cholesterol metabolism observed in the second study, the 3rd study was designed to test the effect of rosuvastatin (Ros) on gene expression of these molecular markers in Ovx sedentary rats or in Ovx rats submitted to voluntary training. Ros was injected to Ovx rats subcutaneously at dose of 5mg/kg/day during 21 days from the ninth week after ovariectomy. Ros failed to decrease plasma LDL-C and TC in Ovx rats. In contrast, Ros increased (P ˂ 0.05) PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r and ACAT2 but not significantly (P ˂ 0.3) LDL-R mRNA in the Ovx sedentary and trained rat liver. Ros failed to decrease plasma LDL-C in Ovx rats probably because of a stronger induction of PCSK9 than LDL-R gene expression. However by increasing LRP1 expression, Ros could decrease circulating lipoprotein remnants and, therefore, protects partially against the onset of cardiovascular diseases. In conclusion, the studies of this thesis indicate that the decrease of ovarian estrogen levels causes radical changes in hepatic TG and cholesterol metabolism caused by alterations in the expression of key genes associated with metabolic pathways.

Les estrogènes confèrent aux femmes une protection cardiovasculaire jusqu’à la ménopause. En effet, la perte des fonctions ovariennes engendre plusieurs désordres du profil lipidique qui s’accompagnent d’une accumulation de triglycérides au foie appelée stéatose hépatique. Le retrait des estrogènes perturbe de nombreuses voies de contrôle de la cholestérolémie, provoquant simultanément une hypercholestérolémie et une stéatose hépatiques. Toutefois, à ce jour, les mécanismes d’action du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol favorisant le stockage de triglycérides au foie demeurent imprécis. À cet égard, les travaux de cette thèse visaient à clarifier l’ensemble des effets du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol pouvant mener à la pathogenèse de la stéatose hépatique. Lors de la première étude, l’ovariectomie (Ovx) chez la rate, un modèle bien établi de la stéatose, avait permis d’identifier la voie d’assemblage des lipoprotéines à très faible densité (VLDL) comme élément contributif à la stéatose. La voie des VLDL reliant étant également une voie de transport du cholestérol, l’étude suivante a été réalisée afin de comprendre le rôle du cholestérol alimentaire sur les lipides hépatiques. Dans cette deuxième étude, le modèle de la diète riche en lipides et en cholestérol (HFHC), aussi reconnu pour induire une stéatose hépatique, a permis d’établir des liens étroits entre le métabolisme du cholestérol et celui des lipides hépatiques. Étonnamment, de manière similaire à l’Ovx, la diète HFHC perturbait la voie d’assemblage des VLDL. En outre, les données recueillies au cours de ces travaux indiquaient qu’une dysrégulation du métabolisme des acides biliaires avait contribué à la sévérité de la stéatose hépatique induite par cette diète HFHC. Dans la continuité de ces deux premiers projets, nous nous sommes intéressés aux effets concomitants du retrait des estrogènes et d’une diète HFHC sur la stéatose hépatique. De manière intéressante, lorsque combinés, l’Ovx et la diète HFHC potentialisaient non seulement l’accumulation de lipides hépatiques, mais également les perturbations moléculaires des voies sous-jacentes à la stéatose, dont l’assemblage des VLDL et de la sécrétion d’acides biliaires. Dans l’ensemble, les données présentées dans la revue de littérature et dans les trois études reliées à cette thèse indiquent qu’une dysrégulation du métabolisme du cholestérol en réponse au retrait des estrogènes entraîne des complications favorisant l’accumulation de lipides dans le foie.
Estrogens confer to women a cardiovascular protection until menopause. Indeed, the loss of ovarian functions leads to several lipid disorders along with hepatic triglycerides accumulation called hepatic steatosis. Estrogen withdrawal disrupts several cholesterol metabolism pathways that results in both hypercholesterolemia and hepatic steatosis. However, to date, the precise mechanisms by which estrogen withdrawal affect cholesterol metabolism pathways that favour lipid storage in the liver are unclear. In this regard, works in the present thesis aimed at elucidate the effects of estrogen withdrawal on cholesterol metabolism involved in hepatic steatosis pathogenesis. In the first study, estrogen withdrawal by ovariectomy (Ovx), a well established model for hepatic steatosis and hypercholesterolemia, had enabled the identification of very low density lipoprotein (VLDL) pathway as a contributory element for hepatic steatosis. Since the VLDL pathway relates lipids and cholesterol metabolism, we conducted the second study to explore the role of dietary cholesterol on hepatic lipids. In the second study, the high fat/high cholesterol (HFHC) diet, also recognized as a model for hepatic steatosis development, was used to explore links between cholesterol metabolism and hepatic fat accumulation. Surprisingly, HFHC diet also disrupted the VLDL pathway. Additionally, data provided in this study indicated that a dysregulation of bile acids metabolism might have contributed to the severity of hepatic steatosis induced by the HFHC diet. As a continuation of these projects, we were interested in the concomitant effects of estrogen withdrawal and HFHC diet on hepatic lipid accretion. Interestingly, when combined, Ovx and HFHC diet not only potentiated hepatic lipid accumulation but also molecular disruptions involved in underlying pathways for hepatic steatosis including the VLDL pathway and bile acid secretion. Overall, data presented in the review of litterature and provided by the three studies related to the present thesis indicate that cholesterol metabolism dysregulation following estrogen withdrawal result in complications that favour hepatic lipid accumulation.

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.
The farnesoid X receptor (FXR) is a ligand-activated transcription factor within the nuclear receptor superfamily. FXR is activated by bile acids and plays a crucial role in the regulation of glucose and lipid metabolism and in bile acid homeostasis. Our group has recently identified the contribution of the ghrelin receptor in the regulation of the nuclear receptor PPARγ. Indeed, ghrelin triggers transcriptional activation of PPARγ through a concerted signaling cascade involving Erk1/2 and Akt kinases. These results support the peripheral actions of ghrelin in diseases associated with the metabolic syndrome. It is recognized that there is interplay between PPARγ metabolic cascade and FXR. Here, we demonstrate that ghrelin promotes FXR transcriptional activity in a dose-dependent manner and also promotes its phosphorylation on serine residues. By using truncated ABC and CDEF constructs of FXR, we found that ghrelin induces FXR activity through the AF-1 and AF-2 activation domains. The ghrelin-induced FXR activity is additive to the induction by the selective agonist GW4064. Also, we demonstrate that FXR is the target of sumoylation, another post-translational modification. In particular, FXR is modified by SUMO-1 and SUMO-3 in a ligand-independent manner. SUMO-1 and SUMO-3 promote dose-dependent transcriptional activity of FXR. Our results show that lysine 122 is the prevalent site of sumoylation by SUMO-1, though a compensation mechanism seems to exist between the various sumoylation sites of FXR. With its emerging role in several metabolic cascades, identification of FXR modulators represents a promising approach for the treatment of the metabolic syndrome and type 2 diabetes.

Au cours des dernières années, une sélection génétique importante a été faite pour améliorer la production de lait des bovins, ceci au détriment des performances reproductives. Cette diminution de performance n’a cependant pas été rapportée chez la génisse présentant un même potentiel génétique. Cette immense production de lait et les changements métaboliques qui l’accompagnent ont donc un impact négatif sur l’efficacité reproductive des vaches laitières qui subissent un stress métabolique supérieur à celui des génisses. Le but de l’étude était d’acquérir une meilleure connaissance des différences moléculaires et métaboliques entre ces deux groupes d’animaux pour amener à une meilleure compréhension de la pathogenèse de l’infertilité chez la vache laitière. Pour ce faire, les vagues folliculaires de vaches en lactation (30-50 jours en lait; N = 12) et de génisses (N = 10) ont été synchronisées par ablation écho guidée des follicules et par traitement hormonal avec injection de prostaglandine et insertion d’un implant de progestérone. L’aspiration du liquide folliculaire et des cellules de la granulosa du follicule dominant a été faite au jour 6. Les paramètres métaboliques mesurés chez les animaux à partir de prises de sang, faites au jour 6, confirment un plus grand stress métabolique chez la vache, les niveaux de BHBA, acides biliaires et cholestérol étant plus élevés et le niveau de glucose plus bas chez celles-ci. Un total de six échantillons a été utilisé pour le séquençage d’ARN et des analyses bio-informatiques ont été effectuées. Plusieurs gènes et voies de signalisation ont présenté des différences entre les deux groupes d’animaux incluant le cycle cellulaire et la production d’hormones. Une confirmation des résultats par PCR en temps réel a été faite, mais la grande variation intragroupe a nui à l’obtention de résultats significatifs. Conjointement, une culture primaire de cellules de la granulosa a été réalisée pour évaluer l’effet des acides biliaires sur la stéroïdogenèse suite à la détection d’une plus grande quantité de ceux-ci chez la vache laitière. La présence d’acide biliaire dans la culture cellulaire cause une diminution de l’accumulation d’estradiol ainsi que de l’expression des gènes CYP19A1 et CYP11A1. Les résultats présentés dans ce mémoire indiquent une différence potentielle au niveau métabolique et moléculaire des follicules dominants entre la vache laitière et la génisse pouvant avoir une responsabilité dans la diminution de l’efficacité reproductive observée chez la vache laitière.
Over the last fifty or more years, genetic selection has been employed to improve milk production in dairy cattle. This selection was made at the expense of reproductive performance. The observed decrease in fertility does not occur in heifers with the same genetic merit. The enormous milk production and the metabolic challenge that accompany it have a negative impact on the reproductive efficiency due to the metabolic stress of lactation. The purpose of the study was to gain a better knowledge of the molecular and metabolic difference between the two groups of animals in order to better understand the pathogenesis of infertility in dairy cows. To do this, the follicular wave of twelve lactating cows (30-50 days in milk; N = 12) and ten heifers (N = 10) were synchronized by ultrasound guided follicle ablation and by hormonal treatment with injection of prostaglandin-F2α and insertion of a progesterone implant. Follicular fluid and granulosa cells of the dominant follicle were aspirated on day 6. The metabolic indicators BHBA, total bile acids, cholesterol and glucose, were measured in the animals from the blood samples also taken on day 6 confirming greater metabolic stress in the cows when compared to the heifers. A total of six samples were used for RNA sequencing and bioinformatics analyses were performed. Several genes and signaling and cellular function pathways were shown to differ between the two groups of animals, including the cell cycle signaling pathway and hormone production pathway. A confirmation of the results by real-time PCR was undertaken, but the great intragroup variation obviated significant results. In the second set of experiments, primary culture of granulosa cells was conducted to evaluate the effect of bile acids on steroidogenesis to further explore the larger amount of the bile acids in the dairy cows when compared to heifers. The results demonstrate a difference in the metabolic status of the animals; BHBA, total bile acids and cholesterol being higher and glucose being lower in the dairy cow relative to the heifer. Presence of bile acids in the granulosa cell culture caused a decrease in expression of CYP19A1, CYP11A1 and estradiol accumulation. The differences at the metabolic and molecular level of the dominant follicles between dairy cows and heifers may be implicated in the reduced reproductive efficiency of the dairy cows.