Academic literature on the topic 'Ácidos nucleicos'

LAS POLIMERASAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS LLEVAN A CABO REACCIONES clave como la replicación y transcripción del material genético con gran exactitud. En esta revisión se explican en términos estructurales, los fundamentos de la elevada fidelidad de las polimerasas de ácidos nucleicos y se da énfasis a la excepción a la regla, la incorporación de nucleótidos usando como substrato la lesión 8- oxoguanosina (8oG). T7 ADN polimerasa es una enzima modular, que consiste en un dominio con actividad de exonucleasa o de edición y un dominio de polimerización. La fidelidad durante la inserción de nucleótidos ocurre por un mecanismo de enlace inducido y la rigidez del dominio de polimerización. Esta fidelidad puede ser mayor debido a la actividad de edición, por la cual, una base erróneamente incorporada, se traslada del dominio de polimerización al de edición para ser removida. Así, T7 ADN polimerasa comente en promedio solamente un error por cada millón de bases replicadas. Sin embargo esta polimerasa se “equivoca” en uno de cada cuatro intentos (incorporación de dATP en lugar de dCTP) cuando replica la lesión 8oG. La inserción, fiel o infiel, teniendo como substrato 8oG, se relaciona con la rigidez del sitio activo de la enzima y modificaciones pequeñas en el sitio activo alteran su grado de fidelidad. Un evento de inserción mutagénico 8oG·dATP, “engaña” el sistema de edición al formar un par que asemeja el par normal Thy·dATP. Entender el fenómeno de la fidelidad en polimerasas replicativas esta directamente asociado a poder combatir enfermedades como el cáncer.

La baja eficiencia de algunos protocolos de extracción de ácidos nucleicos y el alto costo de los productos comerciales, deriva en la comparación entre métodos. En el presente trabajo se compararon tres métodos de extracción de DNA a partir de semilla de soya, para obtener ácidos nucleicos de concentración y calidad adecuadas para amplificación por PCR. Los protocolos estudiados incluyeron los métodos con soluciones de CTAB al 1% y al 3%, con sarcosina al 1% y con fenol/cloroformo. Los experimentos se realizaron en el laboratorio de ADN y Genómicas del Centro Nacional de Recursos Genéticos-INIFAP. Se evaluaron el rendimiento, pureza, integridad y funcionalidad de los ácidos nucleicos obtenidos. En todos los métodos se consiguió rendimiento adecuado de DNA, sin embargo, la pureza requerida del material solo se obtuvo con la solución de fenol/cloroformo. Con los métodos de CTAB al 1% y 3% y sarcosina se observaron sustancias contaminantes inhibidoras de PCR, mientras que, con fenol/cloroformo los valores de la relación A260/280 estuvieron en un rango de 1.96 a 2.00 y la relación A260/230 en un rango de 1.75 a 2.44, con diferencias significativas (p< 0.0001) con el resto de los métodos, además, el DNA fue de alto peso molecular y se obtuvo amplificado del gen rbcL por PCR en todas las muestras. El uso del protocolo de fenol/cloroformo permitió obtener de semilla de soya, ácidos nucleicos de concentración y calidad adecuadas para amplificación por PCR.

Técnicas moleculares requieren extracciones de ácidos nucleicos en cantidad y pureza adecuadas. Este trabajo describe un modelo lineal generalizado (GLM) de un factor ajustado con efectos fijos sobre el rendimiento de ácido nucleico (ng/μl) y la pureza (A260/A280 y A260/A230), para cinco métodos de extracción de ADN utilizando tarjetas FTA con sangre de cabra (Capra aegagrus hircus). Se ensayaron dos métodos comerciales basados en columnas de sílice (Invitrogen y Macherey Nagel; MN), método resina quelante (Chelex), método CTAB y el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI). Adicionalmente, para MN, se evaluó una etapa de incubación con tampón PBS (Phosphate Buffered Saline) en alta temperatura previa a la lisis y una etapa de purificación posterior a la extracción utilizando un modelo de efecto fijo de dos factores con interacción. Las concentraciones de ADN y las proporciones de pureza fueron variables; la concentración más alta se obtuvo con el kit MN (170.45 ng/μl), pero con deficiencias en la pureza (0.32 de A260/A230, 0.34 de A260/A280). A pesar de esto, todos los métodos de extracción generaron productos PCR con cebadores específicos D-loop (ADNmt). El efecto combinado de las etapas de pre-incubación y post-purificación arrojó valores de pureza satisfactorios (1.89 para A260/A230 y 1.65 para A260/A280), así como relaciones de concentración (476.78 ng/μl) con baja variabilidad. En conclusión, la concentración y pureza del ADN de muestras de sangre mejora considerablemente cuando se usa un kit comercial en combinación con incubación previa a la lisis y purificación posterior a la extracción. Estos ácidos nucleicos se sugieren para uso en potenciales aplicaciones moleculares a posteriori.

A interação entre células e nanoestruturas poliméricas vem sendo considerado um importante tema para a biotecnologia. As fibras eletrofiadas apresentam estruturas porosas na ordem de submícrons com características que mimetizam os componentes fibrilares da matriz extracelular natural, favorecendo a atuação local efetiva de sistemas bioativos. A complexação de ácidos nucleicos com essas fibras e sua utilização em terapias de recuperação funcional e regeneração tecidual podem ser alternativas ao transplante celular e aos sistemas de entrega de proteínas indutivas. Na customização do perfil de interação entre essas matrizes e o material genético, é relevante manter a disponibilidade de seus tipos moleculares em concentrações efetivas no microambiente, com maior expressão gênica e maior tempo de ação terapêutica. Ao se buscar equilíbrio entre eficiência de transfecção e a viabilidade celular, diferentes estratégias são seguidas, como a incorporação de polinucleotídeos em soluções poliméricas ou em emulsões antes do processo de eletrofiação, ou mesmo a funcionalização de nanofibras pela modificação de sua superfície. Diante disso, esta revisão tem por finalidade apresentar os diferentes métodos de produção de nanofibras eletrofiadas funcionalizadas com ácidos nucleicos e suas aplicações na área da saúde.

El estudio de los complejos procesos ultracelulares de los ácidos nucleicos es un tema debatido como argumento científico a favor del Diseño Inteligente (DI). El objetivo de este trabajo fue analizar algunos procesos moleculares de los ácidos nucleicos que sugieren la confirmación de la teoría del DI, a través de la técnica de análisis documental de contenido. En primer lugar, la estructura química del ADN y la combinación de las bases nitrogenadas refleja que la información genética de cada ser creado es una mezcla original de las bases nitrogenadas que hace a cada individuo único en la historia del mundo. En segundo lugar, al estudiar los procesos de replicación y reparación del ADN se observa que cada enzima cumple su función de una forma coordinada y organizada, evitando la ocurrencia de errores; y en caso de que así ocurra, la célula ha dispuesto de mecanismos de reparación finísimos que corrigen de la mejor forma posible estas alteraciones. En tercer lugar, el proceso de fabricación de proteínas y su control altamente regulado, involucra la participación de enzimas y proteínas que trabajan organizadamente para lograr proteínas, algunas de ellas irrepetibles, que definen la identidad del ser vivo. Como última parte, se discute el mecanismo de empaquetamiento de los ácidos nucleicos. Esta combinación de procesos, organización y confección de maquinarias especiales y precisas definitivamente provienen de un diseño meditado de un ser superior. Finalmente, se redactó una sección donde se expone ideas sobre la defensa de la Teoría del Diseño Inteligente

El estudio de los complejos procesos ultracelulares de los ácidos nucleicos es un tema debatido como argumento científico a favor del Diseño Inteligente (DI). El objetivo de este trabajo fue analizar algunos procesos moleculares de los ácidos nucleicos que sugieren la confirmación de la teoría del DI, a través de la técnica de análisis documental de contenido. En primer lugar, la estructura química del ADN y la combinación de las bases nitrogenadas refleja que la información genética de cada ser creado es una mezcla original de las bases nitrogenadas que hace a cada individuo único en la historia del mundo. En segundo lugar, al estudiar los procesos de replicación y reparación del ADN se observa que cada enzima cumple su función de una forma coordinada y organizada, evitando la ocurrencia de errores; y en caso de que así ocurra, la célula ha dispuesto de mecanismos de reparación finísimos que corrigen de la mejor forma posible estas alteraciones. En tercer lugar, el proceso de fabricación de proteínas y su control altamente regulado, involucra la participación de enzimas y proteínas que trabajan organizadamente para lograr proteínas, algunas de ellas irrepetibles, que definen la identidad del ser vivo. Como última parte, se discute el mecanismo de empaquetamiento de los ácidos nucleicos. Esta combinación de procesos, organización y confección de maquinarias especiales y precisas definitivamente provienen de un diseño meditado de un ser superior. Finalmente, se redactó una sección donde se expone ideas sobre la defensa de la Teoría del Diseño Inteligente

La Biología Molecular se dedica al estudio de la estructura y la función de dos importantes biomoléculas –proteínas y ácidos nucleicos- y de las interacciones que se establecen entre ellas. En el primer artículo de esta serie presentamos algunas de las técnicas “moleculares” y sus aplicaciones en el campo odontológico. En este segundo artículo presentamos los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos que han permitido conocer en profundidad los detalles acerca de la forma en que se almacena y se descodifica la información genética en los seres vivos. Las secuencias obtenidas a partir del estudio de genes y genomas son útiles, no solo para identificar y clasificar seres vivos (entre los cuales microorganismos causantes de enfermedades) sino para comprender las bases genéticas de muchas enfermedades. Presentamos igualmente las estrategias de secuenciación masiva en paralelo (también llamadas Tecnologías de Secuenciación de Próxima Generación, o NGS por sus siglas en inglés) que han permitido dilucidar la compleja estructura y composición de las comunidades de microorganismos que colonizan la cavidad oral.

La electroforésis es una técnica para separación de biomoléculas según su movilidad y naturaleza (generalmente ácidos nucleicos o proteínas) en un campo eléctrico sobre una matríz porosa, cuya composición depende de la biomolécula a analizar. Para la separación de ácidos nucléicos se utilizan matrices de agarosa y para la separación de proteínas se utilizan matrices de poliacrilamida. Esta técnica representa una herramienta fundamental de análisis cuantitativos en diversos campos de ciencias biológicas como biología molecular, bioquímica o proteómica. Entre las distintas plataformas de electroforésis, las más utilizadas en análisis de ácidos nucléicos son la electroforésis en gel de agarosa, la electroforésis de campo pulsado (PFGE) o la electroforésis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE), y las más utilizadas para análisis de proteínas son la electroforésis en gel de poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio (SDS) y la electroforésis bidimensional. Esta revisión discutirá las técnicas previamente mencionadas y sus recientes...

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química
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Complexos biomiméticos do sítio ativo das PAPs foram sintetizados com o objetivo de elucidar o papel das PAPs nos sistemas vivos e simultaneamente encontrar novas aplicações para estes complexos como nucleases sintéticas. Com este intuito, foi testada a atividade de uma série de complexos heterodinucleares Fe3+M2+, usando o ligante assimétrico H2BPBPMP. Os complexos são: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc. O DNA plasmidial foi utilizado como modelo para testar a clivagem da ligação fosfato pelos complexos. Foram testadas diferentes condições de pH e concentração dos complexos. As reações também foram realizadas na presença de captadores de radicais livres e na ausência de oxigênio. Para verificar a interação complexo/DNA foram realizados experimentos com Distamicina e titulação espectrofotométrica UV-Vis. Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar DNA por um mecanismo hidrolítico em baixas concentrações do complexo (2,5 µM) a 37 oC em pH próximo ao fisiológico (faixa de 6,0 a 7,0). O complexo FeNiOAc não cliva o DNA, mas pode se ligar ao DNA e alterar significativamente sua mobilidade. O complexo FeCuOAc é o mais ativo da série apresentando uma aceleração de 2,71 x 107 vezes quando comparado com o valor do DNA não catalisado, seguido por, FeMnOH, FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular
O aumento do número de microrganismos resistentes a antibióticos constitui uma das grandes problemáticas da atualidade, tornando-se pertinente encontrar terapias alternativas de tratamento de doenças infeciosas. A inativação fotodinâmica (PDI) tem sido proposta como alternativa para o controlo de infeções. A PDI consiste na destruição de microrganismos através da interação entre três componentes: luz, uma molécula de fotossensibilizador e oxigénio na forma molecular. Apesar de existirem numerosos estudos que demonstram a eficiência da PDI em diferentes tipos de microrganismos e com recurso a diferentes fotossensibilizadores, o mecanismo de PDI, ainda não se encontra completamente compreendido, principalmente no que diz respeito ao dano causado no DNA. De um modo geral, são considerados dois mecanismos principais, propostos para os efeitos letais causados nas bactérias pelo processo de PDI: este processo pode produzir alterações na parede celular ou provocar danos no DNA, sendo que os danos na parede celular são, de um modo geral, referidos como os principais responsáveis pela inativação celular. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito fotodinâmico nos ácidos nucleicos de E. coli usando como fotossensibilizadores duas porfirinas catiónicas, a tetra-iodeto de 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina (Tetra-Py+-Me) e a tri-iodeto de 5,10,15-(1-metilpiridinio-4-il)-20-(pentafluorofenil)porfirina (Tri-Py+-Me-PF). Neste sentido, recorreu-se a duas abordagens metodológicas diferentes. No primeiro caso, procedeu-se à fotoinativação das células de E. coli durante diferentes períodos de tempo e extraíram-se os ácidos nucleicos subsequentemente (efeito indireto). No segundo caso, os ácidos nucleicos foram extraídos de células de E. coli e irradiados posteriormente (efeito direto). Em ambas as abordagens metodológicas, os ácidos nucleicos foram analisados por eletroforese em gel de agarose e quantificados por fluorometria. Em geral, os perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli após PDI mostram uma diminuição na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, diretamente proporcional à inativação das células. Com a porfirina Tri-Py+-Me-PF, a diminuição de DNA genómico ocorreu mais rapidamente, comparativamente com a porfirina Tetra-Py+-Me. Relativamente aos perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli não irradiadas e posteriormente irradiados na presença do fotossensibilizador, observou-se que não ocorreu variação na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, contudo, observou-se uma diminuição na quantidade de rRNA ao longo do tempo. Embora não tenham sido observados danos no DNA, não se exclui a possibilidade de terem ocorrido danos não detetáveis com a metodologia utilizada neste estudo.
The increase of antibiotic resistance among pathogenic microorganisms is a major public health issue, making it relevant to find alternative therapies for the treatment of infectious diseases. Photodynamic inactivation (PDI) has been proposed as an alternative approach for the treatment of infections. PDI consists in destroying microorganisms through the interaction of three components: light, photosensitizer and molecular oxygen. Although there are numerous studies showing the efficiency of PDI in the inactivation of different types of microorganisms, by different photosensitizers, the mechanism of PDI is not yet fully understood. In general, two main mechanisms are proposed for the lethal effects of PDI on bacterial cells: the PDI process can produce cell membrane damages or cause DNA damage. The damages of the membrane are generally referred to as the main responsible for cell inactivation. The aim of this study was to analyze the photodynamic effect on E. coli nucleic acids, using two cationic porphyrins as photosensitizers (5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridini-um-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and 5,10,15-tris(1-methylpyridinium-4-yl)-20-(pentafluorophenyl)porphyrin tri-iodide (Tri-Py+-Me-PF). In this study, we used two different methodological approaches. In the first approach, the E. coli nucleic acids were extracted from photosensitized cells (indirect effect). In the second approach, the nucleic acids were extracted from non-irradiated E. coli cells and irradiated in the presence of the PS (direct effect). In both cases, nucleic acids were analyzed by agarose gel electrophoresis and quantified by fluorometry. In general, the electrophoretic profiles of nucleic acids extracted from E. coli cells after PDI reveal decreases in the amount of genomic DNA over time, which are directly proportional to the cell inactivation. The porphyrin Tri-Py+-Me-PF induced a faster decrease of the genomic DNA over time, in comparison with Tetra-Py+-Me porphyrin. The electrophoretic profiles of nucleic acids of E. coli irradiated in the presence of photosensitizer show no variation in the amount of genomic DNA over time. In this last case, there was a decrease in the amount of rRNA. Although no damage was observed in the DNA, we cannot exclude the possibility of the occurrence of damages which are not detectable by the methodology applied in this study.

1) Estudio teórico de nucleobases modificadas. Las modificaciones químicas de ácidos nucleicos tienen una amplia variedad de aplicaciones tanto en clínica, utilizadas como agentes antisentido, así como en el estudio de las estructuras de los propios ácidos nucleicos, las interacciones proteína DNA o en la catálisis de ácidos nucleicos por poner algunos ejemplos. Actualmente se sintetizan cientos de análogos de nucleósidos estándar en laboratorios farmacéuticos, algunos de ellos como, por ejemplo, los análogos de la arabinosa de adenosina y citosina, son útiles como fármacos antivirales o anticancerígenos. La mayoría de los fármacos anticancerígenos actúan inhibiendo la síntesis de DNA de alguna manera si bien es cierto que tienen bastantes efectos secundarios. Sin embargo, la combinación de varios de estos fármacos reduce la resistencia y minimizan la toxicidad. Ejemplos de este tipo de análogos son los antimetabolitos que al ser estructuralmente muy similares a los nucleósidos estándar son capaces de interferir en la producción de los ácidos nucleicos inhibiendo las rutas de síntesis de ácidos nucleicos o incorporándose dentro de la estructura del DNA y el RNA. Una vez que se incorporan al DNA, estos compuestos provocan la terminación de la cadena durante la replicación del DNA y en consecuencia la muerte celular. Existen modificaciones del esqueleto azúcar-fosfato de los oligonucleótidos que mejoran la eficacia en la síntesis de siRNAs controlando la expresión génica en unos casos al bloquear estéricamente la actividad enzimática de las nucleasas, en otros inhibiendo la hibridación del mRNA con la hebra antisentido o incluso favoreciendo la formación de triplexes con secuencias específicas de DNA. Un ejemplo de ello son los fosforotioatos que poseen un átomo de oxígeno no enlazante sustituido por azufre en el enlace fosfodiéster. Éste tipo de modificaciones han demostrado ser resistentes tanto para exo- como endonucleasas aumentando la resistencia en cultivos celulares y en suero. Estudio de las propiedades tautoméricas y reconocimiento de las tiocetotiminas. Las bases sintéticas, una vez introducidas en el DNA, son capaces de inducir cambios conformaciones y alterar la estabilidad induciendo incluso mutaciones o modificando los patrones de reconocimiento. La forma tautomérica que suele suponerse para an álogos de nucleobases estándar es la forma ceto/amino. Sin embargo, la influencia del entorno puede en algunos casos favorecer la existencia de formas teóricamente minoritarias. En este estudio se describen las propiedades tautoméricas de la timina, y la 2- y 4-tiocetotiminas mediante métodos ab initio y la combinación de simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre. Los patrones de reconocimiento así como las estabilidades relativas de los tautómeros mayoritarios en diversos entornos fueron identificados. Los resultados teóricos fueron apoyados por los resultados experimentales aportados por el laboratorio del Prof. Dr. Ramón Eritja, y permiten describir las características tautoméricas y de reconocimiento de las tiocetotiminas. 2) Estudio de la influencia de la 6-selenoguanina en diferentes estructuras de DNA. Los análogos de purinas 6-mercaptopurina y 6-tioguanina se utilizan como agentes inhibidores del metabolismo de los ácidos nucleicos en diversos tipos de leucemias. En este trabajo presentamos una caracterización exhaustiva de la estructura y propiedades de interacción de la 6-selenoguanina, un isóstero de la guanina que introducido en el DNA puede afectar diferencialmente en estructuras de mayor orden del DNA. Mediante cálculos exactos de mecánica cuántica y la combinación de simulaciones de dinámica molecular con métodos de energía libre, hemos evaluado la influencia de la sustitución de la guanina estándar por la 6-selenoguanina en sistemas de doble, triple hebra de DNA así como en la estabilidad de estructuras G-cuádruplex. Finalmente, se aborda el estudio de las propiedades electrónicas de la 6-selenoguanina ya que se ha observado que ciertas modificaciones introducidas en el DNA podrían aumentar la capacidad conductimétrica de estos sistemas. 3) Funcionalización de los extremos 3' de oligos de DNA y RNA con derivados modificados con puentes N-etil-N y uso como inhibidor de 3'-exonucleasas. Existen ciertas limitaciones en el desarrollo de ácidos nucleicos modificados con aplicaciones clínicas y es que, la vulnerabilidad a la acción de nucleasas, tanto exo- como endonucleasas, limita la vida media de estos oligos en suero. En la actualidad, los fosforotioatos son las modificaciones que generan mayor resistencia aunque presentan la limitación de que un elevado número de los fosfatos del oligo han de ser modificados. En este trabajo presentamos una nueva modificación en el extremo 3’ de los oligos, en la que dos nucleósidos se unen por el lado de la base en lugar de por enlace fosfodiéster que es eliminado en el diseño. Simulaciones de dinámica molecular del complejo molecular con el fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y el oligo modificado permiten demostrar la base del diseño racional del dímero modificado. Los estudios estructurales se complementaron con los experimentos realizados por la Dr. Montserrat Terrazas y Adele Alagia del grupo del Prof. Dr. Ramón Eritja. Éstos incluían estudios de digestión por 3’-exonucleasas (fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y la fosfodiesterasa de veneno de serpiente) así como experimentos celulares de RNA de interferencia. 4) Estudio de la flexibilidad de ácidos nucleicos de doble cadena. El estudio de la flexibilidad de los ácidos nucleicos ha sido y sigue siendo un campo actual en efervescencia gracias a la desarrollo de las técnicas de moléculas individuales y a los métodos computacionales como la dinámica molecular. En este estudio se aborda la influencia de la secuencia en la estructura, estabilidad y flexibilidad de moléculas de RNA de doble cadena mediante simulaciones de dinámica molecular. Otro de los objetivos del estudio era comparar los dos campos de fuerza que son mayoritariamente utilizados en el campo de los ácidos nucleicos, AMBER (parm99bsc0) y CHARMM (CHARMM27). Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad es dependiente de la secuencia pudiendo agrupar los diferentes dinucleótidos en su mayor o menor capacidad para ser deformados. Medidas experimentales como la longitud de la persistencia o la torsión de las dobles hélices de RNA son parámetros moleculares globales que definen la flexibilidad en una escala mayor. Mediante métodos de dinámica esencial, se calcularon los promedios de las entropías intramoleculares de las cuatro secuencias consideradas así como las estimaciones teóricas de la longitud de la persistencia, de la torsión helicoidal y del estiramiento molecular. Además, los resultados del estudio aportan más datos acerca de la diferente flexibilidad que existe entre el DNA y el RNA de doble cadena.
In this thesis quantum mechanics and classical mechanics techniques have been used to study the tautomeric properties of modified nucleobases with potential application to antisense and biotechnology fields. On the other hand, the study of the mechanical properties of double stranded DNA and RNA (dsDNA versus dsRNA) and their sequence dependency have been addressed. In practice, the work has been divided into the following sections: 1.- Theoretical study of sulfur modified thymines. The tautomeric properties of thymine and two thioketoderivatives, 2- and 4-thioketothymines, have been studied by means of accurate ab initio calculations and molecular dynamics simulations coupled with free energy calculations. Previous results suggested that these modifications could stabilize DNA structure at least as good as the natural thymine leading to the fidelity consequences during the replication. Indeed, those results suggested that some minor tautomeric forms could be present in the DNA double stranded environment which would explain the higher stability of certain mismatches. In the light of these results, we explored the impact of thioketothymines by means of both theoretical and experimental studies. 2.- Theoretical study of seleno modified guanine. We explore the chemical properties of 6-selenoguanine (6SeG) and the influence in duplex, triplex and G-quadruplex structures by means of high-level quantum mechanics calculations and free energy calculations combined with molecular dynamics simulations. 6-Selenoguanine, like other related antimetabolites like thiopurines, has been longtime used against several cancers like lymphomas or hepatomas. Moreover, their applications have been extended to solving X-ray nucleic acids structures (6SeG can be incorporated to these molecules and display anomalous dispersion) and, from the present work we suggest that 6SeG can also exhibit remarkable conductor properties in DNA structures. 3.- Inhibition of 3’-exonucleases with dimeric N-ethyl-N modified nucleosides. Development of synthetic oligonucleotides (ONs) has received much attention in the past years due to their ability to silence the expression of undesired overexpressed genes. Among established therapies, siRNAs have been widely studied due to their high potency and sequence-specificity. However, the application of oligonucleotides in vivo faces important limitations. For example, their high vulnerability to degradation by serum nucleases. Much effort has been made to overcome these limitations but, in many cases, modifications that increase nuclease stability, cause negative effects on RNAi activity. We are interested in creating chemical modifications able to increase nuclease stability without disrupting RNAi activity. In particular, in this work, we explored 3’-terminal modifications by replacing standard nucleobases by N-ethyl-N-coupled nucleosides. We focused special attention on 3’-exonucleases because they are the predominant nuclease activity present in serum. By means of molecular dynamics simulations and in vitro experiments, modified siRNAs resistant to nuclease digestion were evaluated against Bcl-2 in vitro, an antiapoptotic gene which is overexpressed in several cancer processes. 4.- Flexibility study of dsRNA molecules. Despite their chemical similarity, DNA and RNA duplex structures play very different biological roles. While double stranded DNA can display a large variety of structures close to the B-form with very dynamic sugar-phosphate conformations, RNA double stranded has been traditionally considered rigid. However, presented results from CHARMM27 MD simulations that pointed in the opposing direction, stating that RNA2 is more flexible than DNA2. To shed some light on this topic, we study the flexibility of double stranded RNA molecules by means of molecular dynamics simulations on four different 18-mer sequences. AMBER and CHARMM nucleic acid force fields were used to analyze the sequence dependent elastic properties and the results were ultimately compared with the obtained for DNA duplex, were both force fields produced comparable results.

Esta tesis recoge el estudio teórico de algunos de los más importantes tipos de interacciones débiles no covalentes en el ADN. Los sistemas de estudio van desde bases nitrogenadas y nucleósidos en fase gas hasta los ácidos nucleicos en solución.

Concretamente se trataran las interacciones débiles pi-catión y los contactos entre bases con el objetivo de profundizar en su naturaleza. Dentro de las interacciones entre bases podemos diferenciar entre: (i) las interacciones de puente de hidrógeno impropio, (ii) las interacciones con bases modificadas, como la 8-aminoinosina y el difluorotolueno, y finalmente (iii) las interacciones no canónicas: Hoogsteen y Watson-Crick reverso, que pueden dar lugar a nuevas estructuras secundarias del ADN.

Se utilizan todo un conjunto de técnicas teóricas que van desde la mecánica clásica hasta los más elevados niveles de mecánica cuántica, con la finalidad de aportar la máxima información estructural, reactividad y dinámica que complemente así los datos experimentales disponibles sobre las nucleobases y los ácidos nucleicos.

En la primera parte de la presente tesis se describirán los métodos teóricos empleados para caracterizar las interacciones no covalentes. En la segunda parte se detallarán brevemente la estructura y las propiedades de los ácidos nucleicos. A continuación, se presentarán los resultados de las interacciones estudiadas. Y finalmente, se procederá a la discusión de los resultados obtenidos y a las conclusiones.

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CAPES CNPq INAMI
O nanoporo formado pela incorporação da α-hemolisina em bicamadas lipídicas planas é considerado modelo de nanoporo proteico para elucidação do mecanismo de transporte de moléculas e no desenvolvimento de dispositivos analíticos - biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. O conhecimento da interação de nucleotídeos com o nanoporo da α-hemolisina é de especial interesse, pois, alguns estudos sugerem varias metodologias para a utilização deste nanoporo como sequenciador de DNA em tempo real. Apesar de todos os avanços, a principal dificuldade operacional para obtenção de um sequenciador baseado na tecnologia “nanopore sensing”, é a rapidez na translocação do DNA através do nanoporo; dificultando a discriminação adequada das bases. Neste contexto é imprescindível fazer adaptações moleculares no nanoporo visando o aumento do tempo de permanência do DNA e da energia de interação deste com o nanoporo. As principais estratégias disponíveis para produção de nanoporos adaptados são: mutações sítio dirigidas e funcionalização química. Ambas são de elevado custo e tempo de experimentação. Neste trabalho utilizamos técnicas de simulação computacional para obtenção, a nível atomístico, a interação do DNA com o nanoporo da α-hemolisina na sua forma nativa e adaptada em posições estratégicas previamente selecionadas por modelagem molecular. As técnicas utilizadas baseiam-se na dinâmica molecular fora do equilíbrio e na Relação de Jarzynski, na qual a média do trabalho realizado ao deslocar o DNA ao longo do nanoporo proteico é estatisticamente relacionada à energia livre do processo. As informações sobre as interações do DNA-nanoporo obtidas podem predizer, teoricamente, os nanoporos mais promissores para serem testados experimentalmente. Realizou-se a seleção das mutantes que foram usadas e foram obtidos dados importantes sobre a parametrização das dinâmicas usando a relação de Jarzynski, como velocidade e constante de força que devem ser aplicadas ao sistema. Além disso, foram obtidas informações sobre a trajetória e contato do DNA com o interior do poro mutado e na forma selvagem, o que mostra a efetividade do sistema.

O consumo de álcool vem sendo associado a um aumento do risco de câncer e a uma situação de estresse oxidativo. Os metabólitos responsáveis por tais processos permanecem em discussão. Neste trabalho, caracterizamos novos metabólitos radicalares do etanol e examinamos suas interações com ácidos nucléicos. Primeiramente, demonstramos que os radicais 1-hidroxietila e 2-hidroxietila produzidos durante a oxidação do etanol por sistemas Fenton alquilam DNA e RNA in vitro produzindo os adutos 8-(1-HE)Gua e 8-(2-HE)Gua, respectivamente. Esses adutos foram sintetizados e caracterizados quimicamente. Também, demonstramos que acetaldeído, o principal metabólito do etanol, é oxidado por sistemas Fenton, peroxinitrito, xantina oxidase, partículas submitocondriais e ratos a radicais acetila e metila. Esses radicais foram caracterizados e seus mecanismos de formação elucidados, pelo menos in vitro. A possibilidade do radical 1-hidroxietila alquilar ácidos nucléicos in vivo foi também examinada. Inesperadamente, o aduto 8-(1-HE)Gua foi detectado em RNA e DNA do fígado de ratos controle e seus níveis não foram significativamente alterados após administração aguda de etanol. Esses resultados sugerem que os radicais 1-hidroxietila, acetila e metila são importantes metabólitos do etanol in vivo mas atacam preferencialmente outras biomoléculas que não ácidos nucléicos.
Alcohol consumption has been associated with increased cancer risk and an oxidative stress condition. Ethanol metabolites responsible for these processes remain debatable. Here, we characterized novel radical metabolites of ethanol and examined their interactions with nucleic acids. First, we demonstrated that the 1-hydroxyethyl and 2-hydroxyethyl radical produced from ethanol oxidation by Fenton systems alkylated DNA and RNA in vitro to produce 8-(1HE)Gua and 8-(2-HE)Gua, respectively. Both adducts were synthesized and structurally characterized. Next, we demonstrated that acetaldehyde, the main ethanol metabolite, is oxidized by Fenton systems, peroxynitrite, xanthine oxidase, submitochondrial particles and whole rats to acetyl and methyl radicals. These radicals were characterized and their production mechanisms in vitro elucidated. The possibility of the 1-hydroxyethyl radical alkylating nucleic acids in vivo was also examined. Unexpectedly, the adduct 8-(1-HE)Gua was detected in RNA and DNA from liver of control rats and their levels were not increased by acute ethanol treatment. Overall, the results suggest that the radicals 1-hydroxyethyl, acetyl and methyl are important ethanol metabolites in vivo but they preferentially attack biomolecules other than nucleic acids.

1. The Force Field Accuracy Problem. The utility and applicability of MD simulations to model biomolecular systems goes only as far as its ability to sufficiently sample the conformational space and the correct description of the potential in terms of the force field functional form and parameter set. Clearly, the force field defines the shape of the conformational space for a given set of atomic positions and also the accessibility of energy minima. When simulating systems at equilibrium, especially quite stable systems such as DNA, the force fields strive to generate ensembles that reproduce well real systems and this does not have to come as a big trade-off with sampling power. In recent years it has become the business of computer engineers and software developers to address the issue of achieving long and biologically relevant time scales. Convergence and reproducibility of atomistic DNA simulations with state-of-the-art force fields such as our parmbsc1 has been convincingly demonstrated. It also seems that until a significant revolution, where milliseconds of simulation become routine, current sampling ranges completely cover the internal structures and dynamics of B-DNAs at this time scale. The growing confidence has allowed many researchers to use MD for very detailed studies on the sequence-dependent nature of DNA oligomers and on the complex arsenal of mechanisms that govern its behavior. In any such studies careful validation of results is necessary since it is not yet entirely clear how well and to what degree are sequence effects reproduced in MD. The fact that the latest-generation of force fields agree very well between themselves and that they fit with the sparse experimental data is surely very encouraging, but it will be some time until small differences in sequence geometries can be validated. Our own extensive validation of the parmbsc1 force field, as well as a large number of other works that have, since its publication, either specifically set out to assess its performance, or have just applied it with success, speak of a very stable parametrization able to deal with a wide range of DNAs. It is worth to mention that in special conditions small improvements might be necessary, which could be achieved with the inclusion of polarization terms. However, up to date, no force field has been able to model polarization without eventually destabilizing the system and this at a huge cost (a factor of 10) to calculation speed. To sum up, based on the remarkable performance of parmbsc1, we and other groups can employ it with confidence in the detailed study of DNA dynamics and we expect that the number of supporting results will only increase. 2. 2. Sequence-dependence and polymorphisms of B-DNA. So what is it that we actually learn from analyzing the conformation variability of DNA over its sequence space at the tetramer level? It is well established that different bps have different preferences regarding their internal geometries, and to some extent, Calladine’s set of heuristic rules is able to make sense of these differences. At the bps level, some sequences are extremely stable, such as ApT, and some sequences, such as CpG, have a bi-stable equilibrium and they convert between different arrangements of their internal geometries. There are cases where this frustration can be explained by their charge distribution, bulkiness or the strength of their stacking and h-bonding interactions, but in many cases in requires a more holistic view, taking higher-level sequence effects into account. In multi-microsecond MD simulations, intra-base-pair parameters are always unimodal since alternative states that might be accessed through base opening are not sampled in at this time scale. However, their ensemble averages show sizeable differences according to the change in sequence. Inter- base-pair parameters can be bimodal, but only in certain tetranulceotide combinations that make up about 5% of cases. This can be explained considering that the central bps of a particular combination of four nucleotides has a structural preference that is in conflict with those of its neighboring steps. In order to minimize the energy cost and satisfy as best as possible all conformational requirements, a more flexible bps will populate several states, usually a maximum of two. Optimization of geometries between several bps generally involve backbone rearrangements, with the sugar-phosphate acting as a hinge that allows consecutive bps to coordinate in a complex choreography often involving other factors, such as subtle changes in the solvent environment environment. In B-DNA the most important backbone transition is the BI/BII, which can be related to the base chemistry through the sequence-dependent relative strength of unconventional h-bonds that stabilize BII conformations. In a tetramer model of B-DNA, the backbone transitions of different tetramers are translated into motions along different internal degrees of freedom, depending on the sequence. Therefore, we are able now to build a picture of the interconnected conformational space of DNA as an overlap of tetranucleotide sequences with transferable structural descriptors. It is still a matter of speculation how these properties might be exploited by proteins and other binders for biological function. 3. Information transfer through the DNA. There are however a few special cases where the tetramer model does not seem to be sufficient. The CTAG is one such case that demonstrates that for a highly flexible and polymorphic tetramer, long-range sequence composition can have a notable effect on the structural properties of the central bps. Analyzing the mechanism behind this long-range communication through the DNA has meant more than anything else an opportunity to understand rare events of sequence modulation that might be a lot more general in cases of larger, induced distortions on the helix. In CTAG we could observe sequence influence not only from the hexamer level, but even from beyond, and the data points to a complex mechanism of information transfer across DNA through coordinated backbone movements. In performing biological function, DNA is often mistakenly viewed as an inert lattice onto which proteins assemble to replicate or transcribe genes. However, experiments demonstrate that information transfer in the DNA can happen even over long distances and can produce allosteric effects upon ligand binding. Without question, the binding of proteins or small molecules to the DNA can produce coupled conformational changes that may affect a neighboring binding site and increase its affinity for the secondary binding protein. Such changes need not alter ensemble averages and only potentiate modifications in the shape of the energy well at the secondary binding site. As seen from the dynamic information provided by an MD trajectory, maybe in more than one case of protein couples, DNA acts as a wire transmitting pulses of information originated at the primary binding site that travel to distant regions. We show that MD methods can provide reasonable explanations for cooperative binding phenomena on the DNA and open for the first time the possibility of the “allostery without conformational change” in the recruitment of proteins of the DNA scaffold. From a thermodynamic point of view, this type of cooperative binding seems to be entropy-driven. Thus, the first binding event freezes some of the degrees of freedom around it’s own binding region, but also reduces the entropy cost associated to the second binding.
1. Problema de exactitud del campo de fuerza La utilidad y aplicabilidad de las simulaciones de DM para modelar sistemas biomoleculares depende de su capacidad para muestrear suficientemente el espacio conformacional y la descripción correcta del potencial en términos de la forma funcional del campo de fuerza y el conjunto de parámetros. Claramente, el campo de fuerza define la forma del espacio conformacional para un conjunto dado de posiciones atómicas y también el acceso a los mínimos energéticos. Al simular sistemas en equilibrio, especialmente en sistemas bastante estables como el ADN, los campos de fuerza se esfuerzan por generar conjuntos que reproducen sistemas reales y no tiene por qué ser una gran desventaja con el poder de muestreo. En los últimos años, se ha convertido en tarea de los ingenieros informáticos y los desarrolladores de software abordar el problema de lograr escalas de tiempo largas y biológicamente relevantes. La convergencia y reproducibilidad de simulaciones de ADN atomístico con campos de fuerza de última generación, como nuestro parmbsc1, se ha demostrado de forma convincente. También parece que hasta llegar a una revolución significativa, donde los milisegundos de simulación se vuelven rutinarios, los rangos de muestreo actuales cubren por completo las estructuras internas y la dinámica de los ADN-B en esta escala de tiempo. La creciente confianza ha permitido a muchos investigadores utilizar DM para estudios muy detallados sobre la naturaleza dependiente de la secuencia de oligómeros de ADN y sobre el complejo arsenal de mecanismos que rigen su comportamiento. En cualquiera de estos estudios es necesaria una validación cuidadosa de los resultados ya que aún no está del todo claro qué tan bien y en qué grado se reproducen los efectos de secuencia en DM. El hecho de que la última generación de campos de fuerza coincida muy bien entre sí y que se ajusten a los escasos datos experimentales es seguramente muy alentador, pero pasará algún tiempo hasta que se puedan validar pequeñas diferencias en las geometrías de las secuencias. Nuestra propia validación extensiva del campo de fuerza parmbsc1, así como una gran cantidad de otros trabajos que, desde su publicación, se han establecido específicamente para evaluar su rendimiento, o simplemente lo han aplicado con éxito, hablan de una parametrización muy estable capaz de tratar con una amplia gama de ADN. Vale la pena mencionar que en condiciones especiales podrían ser necesarias pequeñas mejoras, lo que podría lograrse con la inclusión de términos de polarización. Sin embargo, hasta la fecha, ningún campo de fuerza ha sido capaz de modelar la polarización sin desestabilizar finalmente el sistema y esto a un costo enorme (un factor de 10) a la velocidad de cálculo. En resumen, con base en el notable desempeño de parmbsc1, nosotros y otros grupos podemos emplearlo con confianza en el estudio detallado de la dinámica del ADN y esperamos que el número de resultados de soporte solo aumente. 2. Dependencia de la secuencia y polimorfismos del ADN-B. Entonces, ¿qué es lo que realmente aprendemos al analizar la variabilidad de conformación del ADN sobre su espacio de secuencia a nivel de los tetrámeros? Está bien establecido que diferentes bps tienen diferentes preferencias con respecto a sus geometrías internas, y hasta cierto punto, el conjunto de reglas heurísticas de Calladine es capaz de dar sentido a estas diferencias. A nivel de bps, algunas secuencias son extremadamente estables, como ApT, y algunas secuencias, como CpG, tienen un equilibrio biestable y convierten entre diferentes disposiciones de sus geometrías internas. Hay casos en que esta frustración puede explicarse por la distribución de cargas, el volumen o la fuerza de sus interacciones de apilamiento y los puentes de hidrógeno, pero en muchos casos requiere una visión más integral, teniendo en cuenta los efectos de secuencia de más alto nivel. En simulaciones de DM de multi-microsegundos, los parámetros de pares intra-base son siempre unimodales ya que los estados alternativos a los que se puede acceder a través de la apertura de la base no se muestrean en esta escala de tiempo. Sin embargo, sus promedios de conjunto muestran diferencias considerables de acuerdo con el cambio en la secuencia. Los parámetros de pares de bases pueden ser bimodales, pero solo en ciertas combinaciones de tetranulceótidos que constituyen aproximadamente el 5% de los casos. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que el bps central de una combinación particular de cuatro nucleótidos tiene una preferencia estructural que está en conflicto con la de sus pasos vecinos. Con el fin de minimizar el costo de energía y satisfacer de la mejor manera posible todos los requisitos conformacionales, un bps más flexible poblará varios estados, generalmente un máximo de dos. La optimización de las geometrías entre varios bps generalmente implica reorganizaciones de la red troncal, con el azúcar fosfato actuando como una bisagra que permite la coordinación consecutiva de bps en una coreografía compleja que a menudo involucra otros factores, tales como cambios sutiles en el entorno del solvente. En los ADN-B, la transición principal más importante es BI/BII, que se puede relacionar con la química a través de la fuerza relativa dependiente de la secuencia de puentes de hidrógeno no convencionales que estabilizan las conformaciones BII. En un modelo de tetrámero de ADN-B, las transiciones de la cadena principal de diferentes tetrámeros se traducen en movimientos a lo largo de diferentes grados internos de libertad, dependiendo de la secuencia. Por lo tanto, ahora podemos construir una imagen del espacio conformacional interconectado del ADN como una superposición de secuencias de tetranucleótidos con descriptores estructurales transferibles. Todavía es una cuestión de especulación cómo estas propiedades podrían ser explotadas por proteínas y otras moléculas que se unen al ADN para diferentes funciones biológicas. 3. Transferencia de información a través del ADN. Sin embargo, hay algunos casos especiales en los que el modelo de tetrámero no parece ser suficiente. El CTAG es uno de esos casos que demuestra que, para un tetrámero altamente flexible y polimórfico, la composición de la secuencia de largo alcance puede tener un efecto notable sobre las propiedades estructurales del bps central. Analizar el mecanismo detrás de esta comunicación de largo alcance a través del ADN ha significado más que nada una oportunidad para comprender los raros eventos de modulación de secuencia que podrían ser mucho más generales en casos de distorsiones mayores e inducidas en la hélice. En CTAG pudimos observar la influencia de la secuencia no solo desde el nivel del hexámero, sino incluso más allá, y los datos apuntan a un complejo mecanismo de transferencia de información a través del ADN mediante movimientos coordinados de la cadena principal. En la realización de la función biológica, el ADN a menudo se considera erróneamente como un retículo inerte sobre el cual las proteínas se ensamblan para replicar o transcribir genes. Sin embargo, los experimentos demuestran que la transferencia de información en el ADN puede ocurrir incluso a largas distancias y puede producir efectos alostéricos sobre la unión al ligando. Sin lugar a duda, la unión de proteínas o moléculas pequeñas al ADN puede producir cambios conformacionales acoplados que pueden afectar a un sitio de unión vecino y aumentar su afinidad por la proteína de unión secundaria. Tales cambios no necesitan alterar los promedios del conjunto y solo potencian modificaciones en la forma del pozo de energía en el sitio de unión secundario. Como se ve a partir de la información dinámica proporcionada por una trayectoria de DM, tal vez en más de un caso de parejas de proteínas, el ADN actúa como un cable que transmite pulsos de información originados en el sitio primario de unión que viajan a regiones distantes. Mostramos que los métodos de DM pueden proporcionar explicaciones razonables para los fenómenos de unión cooperativa en el ADN y abren por primera vez la posibilidad de la "alostería sin cambio conformacional" en el reclutamiento de proteínas al ADN. Desde un punto de vista termodinámico, este tipo de enlace cooperativo parece estar impulsado por la entropía. Por lo tanto, el primer evento vinculante congela algunos de los grados de libertad alrededor de su propia región de unión, pero también reduce el costo de entropía asociado al segundo enlace.

The mitochondrial transcription factor A, TFAM, has a dual function in the organelle: it activates mitochondrial DNA transcription by binding to the HSP and LSP promoters, while in higher concentrations compacts the mtDNA. In this thesis the mechanism of complex formation between the mitochondrial transcription factor A (TFAM) and its cognate DNA binding sequences is analysed. TFAM is a DNA binding protein that belongs to the HMG- box family. Previous crystallographic works have shown that, by its two HMG-boxes and the intervening linker, TFAM binds to the DNA minor groove of mitochondrial DNA promoters imposing severe DNA distortions. These include two sharp 90-degree kinks that bend the cognate DNA into a U-turn. We here present the crystallographic structure of TFAM in complex with site Y, which together with site X are protein binding sites alternative to the promoter binding regions at the control region of mitochondrial DNA (mtDNA). The structure of the TFAM/site Y complex shows the two HMG-box domains (HMG-box1 and 2) organized in an “L”-shape fold that bends the contacted DNA by 90 degrees. Each HMG-box domain inserts a leucine, Leu 58 from HMG-box1 and Leu182 from HMG-box2, into a base-pair step from respective DNA contacted regions. The two DNA steps are separated by a DNA helix turn. Each insertion disrupts the DNA stacking and, together with additional interactions, facilitates the 90º DNA bending, the two bends resulting in the U-turn conformation. A structural comparison between available TFAM/DNA complexes shows that the linker between HMG-domains is instrumental for the protein to adapt to a conformation variability induced by the different DNA sequences. In addition, while all other crystal structures are unambiguous in the assigned DNA sequence, TFAM/site Y electron density maps indicated a surprising DNA disorder that suggested to trace the DNA in an alternative, not predicted, orientation. Thus in order to better characterize the binding mechanism of TFAM to the DNA and the role of the DNA properties in this process, we further studied the TFAM/site Y, TFAM/site X and TFAM/LSP complexes by molecular dynamics (MD) simulations, isothermal titration calorimetry (ITC) and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). All these techniques showed a recurrent result, which is that TFAM has a clear preference in binding and bending site Y over site X and LSP. The three DNAs present intrinsic distortions that facilitate binding, which occurs by a mechanism in all cases endothermic and spontaneous and TFAM presents similar affinities to all of them. However, site Y is intrinsically more rigid but easier to distort into the shape found in the crystal, it competes better for TFAM binding, and the enthalpy and entropy of binding are much higher than for the other two sequences. These results suggest a specific binding and bending mechanism significantly dependent on the DNA sequence. Finally, by multi-angle laser light scattering (MALLS) and analytical ultracentrifugation the multimerization ability of TFAM detected by EMSA and size exclusion chromatography was analysed. The results indicate multimerization of the protein either alone or on the DNA in a cooperative manner at increased complex concentrations, which is consistent with the alternative function of TFAM as an mtDNA packaging protein. Altogether, our results suggest that the DNA sequence properties mediate TFAM binding, involving either specific interactions at the mtDNA control region, or non-specific contacts during mtDNA compaction. For this latter, the regulation of TFAM binding exerted by the DNA sequence might be combined with regulation of protein multimerization processes, all together determining mtDNA compaction, which is essential for cell life.
Este trabajo de tesis doctoral está centrado en el análisis del mecanismo de unión del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) con sus secuencias de reconocimiento en la región control del ADN mitocondrial (mtADN). En la mitocondria TFAM está implicado en dos procesos fundamentales: la regulación de la trascripción del mtADN, cuando está unido a las secuencias promotoras del filamento ligero y pesado (HSP y LSP), y la compactación del mismo ADN cuando está presente en alta concentración. TFAM pertenece a la familia de los HMG-box y está constituida por dos dominios HMG conectados por un “linker” de 20 residuos. En este trabajo se presenta la estructura cristalográfica de TFAM en complejo con su sitio de reconocimiento alternativo a los promotores, site Y. Desde el análisis de la estructura se ha evidenciado que TFAM presenta el mismo plegamiento observado también cuando está en complejo con LSP, HSP, ADN no específico (nsADN) y su otro sitio de unión site X. Además en todos estos complejos el ADN resulta doblado 180° por medio de dos inserciones mediadas por LEU58 y 182, cada una responsable de un “kink” de 90°. La diferencia principal entre todas las estructuras se observa a nivel del linker que presenta una desviación en respuesta a las diferentes propiedades de los ADNs que contacta. Para caracterizar mejor el mecanismo de unión de TFAM con sus secuencias de reconocimiento en la región control del mtADN (LSP, site Y and site X), se realizaron diferentes análisis de tipo biofísico y bioquímico. La flexibilidad de estas secuencias se estudió primero por dinámica molecular. Estudios de “isothermal titration calorimetry” y “electrophoresis mobility shift assays” permitieron evidenciar que también si TFAM tiene el mismo mecanismo de unión y la misma afinidad por las tres secuencias, la cinética de formación de los complejos parece ser diferente. Para el análisis de la estequiometria de la unión de TFAM a los diferentes ADN fueron empleadas las técnicas de “multi angle laser light scattering” y “analytical ultracentrifugation”. Estos estudios evidenciaron la tendencia de TFAM de multimerizar, en presencia y ausencia de ADN, en respuesta a aumento de su concentración.

El objetivo general de esta tesis doctoral fue el desarrollo de biosensores basados en aptámeros para la detección de bacterias enteropatógenas. Para ello se estudiaron diferentes estrategias de detección gracias a las propiedades únicas de los aptámeros, tales como su capacidad de adoptar diferentes estructuras conformacionales tras el enlace con la molécula diana, su estabilidad y la facilidad con que se pueden modificar químicamente, introduciendo marcajes o ciertos grupos funcionales. Las bacterias utilizadas en todas las estrategias de detección fueron: Salmonella typhimurium (diana del aptámero seleccionado, específicamente las proteinas transportador ABC, OmpA y precursor OmpD), Eschericia coli O157 Shiga, Shigella sonnei, Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea. En la primera fase de la tesis se realizó la caracterización de la bacteria Salmonella typhimurium y de la afinidad del aptámero por este microorganismo. La afinidad del aptámero por la bacteria se comprobó utilizando las técnicas de impresión por microcontacto (μCP), la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la microscopía de fluorescencia. Posteriormente en la fase siguiente se desarrolló un sistema de detección basado en partículas magnéticas como plataforma de captura, preconcentración y detección basada en un ensayo competitivo indirecto. Se llevó a cabo la detección colorimétrica, por absorbancia, y electroquímica, por voltametría de pulso diferencial (DPV). En ambas alternativas de detección se observó reactividad cruzada de la bacteria Salmonella typhimurium con E. coli O157 Shiga y con Shigella sonnei, no presentándose dicha reactividad con las otras bacterias. El porcentaje de similitud de las proteinas diana análogas fue mayor en relación a las proteinas correspondientes a E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei, y menor respecto a las proteinas análogas de las otras bacterias. En la tercera fase de la tesis se desarrollaron dos biosensores electroquímicos. Uno basado en la detección directa del enlace con la bacteria por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). El otro biosensor se basó en la inhibición enzimática causada por el cambio conformacional del aptámero tras su enlace con la bacteria. En este caso se utilizó la técnica electroquímica DPV para medir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Con el primero se lograron los mejores resultados, por cuanto los parámetros de comportamientos fueron los mejores (menor LOD, mayor sensibilidad, menor tiempo de análisis), pero además es una estrategia en la cual la construcción del aptasensor es simple puesto que consta de un solo paso. Finalmente los ensayos de selectividad llevados a cabo en todas las estrategias de detección muestran que todos los sistemas de detección fueron capaces de discriminar el grupo de bacterias clasificadas como enteropatógenos (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga y Shigella sonnei) del resto de bacterias (Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea), demostrando que la afinidad del aptámero por Salmonella typhimurium no es específica para esta bacteria, sino que también existe una afinidad equivalente por E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei.
The overall objective of this Thesis was to develop different biosensors based on aptamers to detect enteropathogen bacteria. This objective was accomplished through the study of different detection strategies which were proposed based on the unique properties of aptamers such as the capacity to present different conformational structures after linking to the target molecule, stability and ease of chemical functionalization. The affinity of the aptamer against the Salmonella typhimurium was confirmed by Microcontact Printing (μCP), Atomic Force Microscopy (AFM) and Fluorescence Microscopy. Then, a magnetic particle detection system was developed as a capture, pre-concentration and detection platform based on an indirect competitive test. Colorimetric and electrochemical detection, using differential pulse voltammetry (DPV) were performed. In both detection alternatives, cross-reactivity of Salmonella typhimurium with Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei was observed, with no cross- reactivity with Proteus mirabilis, Bacillus cereus, Kocuria lutea and Escherichia coli k5. In the next phase of the thesis, two electrochemical biosensors were developed, one based on the direct detection of the binding to the bacterium by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and the other based on the enzymatic inhibition caused by the conformational change of the aptamer after binding with the bacterium. In the second case the DPV technique was used to measure the activity of alkaline phosphatase. The best results were obtained with the impedance biosensor because as it showed improved behavior parameters (lower LOD, higher sensitivity and shorter analysis time). In addition, the construction of the aptasensor is simple as it consists of a single step. Selectivity tests carried out on all detection strategies showed that the developed detection systems were able to discriminate the bacterial group classified as enteropathogens (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei) from other bacteria (Escherichia coli K5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus and Kocuria lutea). Hence, the affinity of the aptamer for Salmonella typhimurium is not specific for this bacterium and there is also an equivalent affinity for E. coli O157 Shiga and Shigella sonnei.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
O trabalho de investigação desenvolvido teve como objectivo o estudo das interacções não covalentes de um grupo de porfirinas catiónicas, quatro bases livres e uma metalada, com hélices duplas constituídas por sequências de desoxirribonucleotídeos, de 6 a 12 bases, auto-complementares e não auto-complementares, diferindo entre si no tipo de bases e na respectiva sequência, utilizando Espectrometria de Massa com Ionização por Electrospray. Os aductos oligonucleotídeo-porfirina foram formados por electrospray em condições optimizadas. A caracterização destes aductos foi efectuada através de experiências de Espectrometria de Massa Tandem com Ionização por Electrospray, tendo-se detectado para os aductos [ds + porfirina]n- com as porfirinas com o maior número de cargas, a formação de fragmentos resultantes de perdas de ambas as cadeias das dupla hélices Os resultados obtidos indicam que, nas condições experimentais usadas, a ligação dos aductos [ds + porfirina]n- é predominantemente electrostática, estando as porfirinas ligadas à superfície da cadeia dupla e não intercaladas. O número de cargas das porfirinas é um factor muito importante na estabilidade daqueles aductos, que aumenta com o aumento daquelas, não se tendo observado variações significativas do comportamento daqueles aductos para diferentes motivos (AT ou GC) das hélices duplas. Os resultados obtidos no estudo dos aductos [ds + 2 porfirina]nconfirmam a estabilização dos aductos com o aumento do número de carga das porfirinas e a importância das repulsões/atracções electrostáticas na formação de aductos não-covalentes. A investigação de outras estruturas secundárias como “hairpins”, triplexes e quadruplexes e dos seus aductos com as porfirinas, foi também efectuada. Os resultados obtidos indicam que, nas condições experimentais utilizadas, a formação de estruturas do tipo “hairpin”, é muito pouco provável. No caso dos triplexes, quadruplexes e dos aductos das porfirinas com os triplexes, os dados obtidos permitem propor mecanismos específicos para a sua formação, sendo a abundância de cada espécie formada resultante do balanço de vários processos competitivos de associação e dissociação. ABSTRACT: The main goal of the present work was to investigate the non covalent interactions of a group of cationic porphyrins, four free bases and one complex, with double-stranded oligonucleotides, from sixmers to twelvemers, both self and non-self complementary, with different types of bases and sequences, using Electrospray Mass Spectrometry. The oligonucleotide-porphyrin adducts were formed by elecrospray in optimized conditions. The characterization of these adducts was done by Electrospray Tandem Mass Spectrometry. For the [ds + porphyrin]nadducts, with the porphyrins with a higher number of charges, the formation of fragment ions by losses from both strands was a novel feature observed. The results show that, in the experimental conditions used, the binding of the [ds + porphyrin]n- adducts is predominantly of an electrostatic nature, and also that the porphyrins are bound to the surface and not intercalated. The number of the charges of the porphyrins is an important factor in the stability of these adducts and significant changes in their behaviour were not observed when the motifs (AT or GC) of the double strand were different. The study of the [ds + 2porphyrin]n- adducts confirmed the stabilization of these type of structures with the number of charges of the porphyirns and the importance of the electrostatic interactions in the formation of non covalent adducts. The study of other secondary structures such as hairpins, triplexes and quadruplexes and of their adducts with the cationic porphyrins, was also implemented. The results show that, in the experimental conditions used, the formation of structures involving hairpins is not very probable. In the case of triplexes, quadruplexes and porphyrin-triplex adducts, the data obtained allowed the proposal of specific mechanisms for their formation, the abundance of each species formed being the result of the balance of several association /dissociation processes

Se estima que unos 10 millones de personas contrajeron tuberculosis (TB) en el 2019 y que a unos 3 millones de ellas no se les diagnosticó ni se les notificó la enfermedad. Con el propósito de poner fin a la epidemia mundial de la tuberculosis para el 2030, sigue siendo necesario ampliar la capacidad para analizar un gran número de muestras. En el 2020, la OMS encargó una revisión sistemática de los datos publicados e inéditos sobre tres clases de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos que no había examinado hasta el momento. Del 7 al 18 de diciembre del 2020, la OMS reunió a un grupo de elaboración de directrices para abordar los resultados de la revisión sistemática y formular recomendaciones sobre esas tres clases de tecnologías. La presente comunicación rápida tiene por objeto informar a los programas nacionales contra la TB y a otros interesados directos acerca de los resultados y las consideraciones principales sobre el uso de algunos análisis moleculares como pruebas diagnósticas para detección de la TB y la TB farmacorresistente, después de evaluar la nueva evidencia. Las recomendaciones detalladas se presentarán en la actualización del 2021 de las directrices unificadas de la OMS sobre la tuberculosis, en su módulo 3.

El conocimiento de la organización de la materia es indispensable para comprender la estructura y función de los seres vivos. Justamente las interrelaciones entre los átomos y las moléculas, son las que permiten el desarrollo de todas las funciones vitales de los organismos animales. Estos están constituidos por miles de moléculas orgánicas diferentes, que se agrupan en cuatro categorías principales: carbohidratos, lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. La información genética que controla la vida de cada célula está contenida en sus cromosomas, más específicamente en su ADN, codificándose y transfiriéndose de generación en generación. A lo largo de miles de millones de años surgieron las especies a partir de otras preexistentes por un proceso llamado de "descendencia con modificación" o "evolución". Una de las características de la naturaleza es la gran diversidad de organismos que la componen. La taxonomía, es la ciencia que se encarga de la búsqueda del orden natural, mediante la que se obtienen las distintas clasificaciones animales.

La Bioinformática es un área interdisciplinaria que se ocupa del análisis computacional de los sistemas biológicos, siendo una de sus ramas la aplicación de este tipo de análisis a los sistemas moleculares. Si bien una parte de la Bioinformática se ocupa del desarrollo de nuevas metodologías, en la actualidad contamos con un gran conjunto de herramientas computacionales que permiten sistematizar, extraer y analizar la información biológica contenida en secuencias moleculares tanto de ácidos nucleicos como de proteínas. Estas herramientas permiten entre otras cosas, predecir la estructura de proteínas, diseñar ligandos específicos como inhibidores o antibióticos, diseñar racionalmente proteínas, identificar sitios funcionales y predecir la función biológica. Así, la Bioinformática es un campo estrechamente relacionado con la biotecnología, la bioquímica, la biología molecular, la farmacología, y consecuentemente tiene incidencia en distintas áreas como por ejemplo la salud y el agro, tanto en el ámbito académico como industrial. La incorporación de estas herramientas acompañada del marco conceptual adecuado para su utilización y su articulación con resultados experimentales, son los principales objetivos de la asignatura optativa -y de postgrado- Bioinformática, perteneciente a la Licenciatura en Biotecnología y Biología Molecular dictada por el Área Biotecnología y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. Los docentes a cargo de la materia son el Profesor Gustavo Parisi y los JTPs Mauricio Lozano y María Leticia Ferrelli. El programa de la materia incluye los siguientes temas orientados principalmente al estudio de proteínas: estructura de proteínas, evolución biológica, estudios de similitud secuencial, utilización de bases de datos biológicas, estimación de la estructura de proteínas, estudios basados similitud estructural, modelado molecular, inferencia filogenética, e integración estructura-evolución (predicción de la función biológica). En el contexto de esta asignatura, y con el objetivo de que los estudiantes adquirieran una mayor experiencia práctica en las diferentes temáticas estudiadas, se realizó un trabajo práctico integrador desarrollado a lo largo de 12 clases, durante las cuales se profundizó en la caracterización de una proteína que fue elegida por los estudiantes bajo la supervisión de la cátedra. Como resultado del análisis bioinformático realizado se exigió a los estudiantes la presentación de un trabajo escrito individual, con el objetivo de fijar los conocimientos adquiridos, e introducir a los estudiantes en la escritura científica.

TEMAS POLÊMICOS RELACIONADOS AO TESTE DE PATERNIDADE, EMPREGO DE CÉLULAS-TRONCO, PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ORGANISMOS TRANSGÊNICOS E ENTRE OUTROS PASSAM A SER DISCUTIDOS DENTRO E FORA DA ESCOLA. CONSTATA-SE QUE OS ALUNOS APRESENTAM DIFICULDADES EM ESTABELECER RELAÇÕES ENTRE CONCEITOS CIENTÍFICOS BÁSICOS COMO ÁCIDOS NUCLEICOS, CROMOSSOMOS, GENES, DIVISÃO CELULAR E HEREDITARIEDADE APLICADA AOS TESTES DE PATERNIDADE, OU SEJA, CONHECEM O PRODUTO, MAS NÃO COMPREENDEM O CONJUNTO DE CONCEITOS CIENTÍFICOS ATRELADOS AO PROCESSO. A PRESENTE PESQUISA OBJETIVOU CONTRIBUIR PARA A INSERÇÃO DESTA TEMÁTICA POR MEIO DA APLICAÇÃO DE UMA SITUAÇÃO-PROBLEMA, RELACIONADA À BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA APLICADA AO USO DO EXAME DE DNA EM TESTE DE IDENTIFICAÇÃO DA PATERNIDADE, AOS ALUNOS DO 3º ANO DO ENSINO MÉDIO DE UMA ESCOLA PÚBLICA DE CAMPINA GRANDE – PB. PARA A EXECUÇÃO DESSA ATIVIDADE FOI REALIZADO UM EXPERIMENTO COM CARÁTER INVESTIGATIVO, A ATIVIDADE PROPÔS A SIMULAÇÃO DE UM TESTE DE PATERNIDADE POR MEIO DA ANÁLISE DE FRAGMENTOS DE DNA DA CRIANÇA, DE SUA MÃE E DE DOIS HOMENS, UM DELES O PAI BIOLÓGICO DA CRIANÇA. OS INSTRUMENTOS AVALIATIVOS CONSISTIRAM EM: OBSERVAÇÃO; DEBATES, RELATÓRIO ESCRITO, QUESTÕES-PROBLEMA QUE FORAM EXECUTADOS AO LONGO DE CADA ETAPA DA SITUAÇÃO PROBLEMA. AO TERMINO DA ATIVIDADE OS ALUNOS FORAM CAPAZES DE RELACIONAR OS CONCEITOS CIENTÍFICOS APLICADO AOS TESTES DE PATERNIDADE E PARTICIPARAM DE FORMA SATISFATÓRIA NO PROCESSO DE RESOLUÇÃO DA SITUAÇÃO PROBLEMA. A APLICAÇÃO DESSA ESTRATÉGIA METODOLÓGICA CONTRIBUIU PARA O AUMENTO DA MOTIVAÇÃO DOS ESTUDANTES, ALÉM DO APORTE TEÓRICO E DA POSTURA DOCENTE, O QUAL FAVORECEU O PROCESSO ENSINO APRENDIZAGEM.

Introdução: Em 2019, surge em Wuhan a Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19), considerada, hoje, a causadora do surto mais grave de pneumonia do mundo.1 A doença tem como agente etiológico um vírus altamente transmissível – SARS-CoV-2 – e já atingiu mais de duzentos países, causando mais de meio milhão de mortes apenas no Brasil. À vista disso, assistiu-se, em tempo recorde, o desenvolvimento, testagem e aprovação de, pelo menos, cinco vacinas que utilizam tecnologias diferentes e que, hoje, estão sendo aplicadas globalmente.2 Objetivos: Descrever e diferenciar as cinco principais plataformas vacinais aprovadas pelos órgãos de saúde para uso mundial até o presente momento. Métodos: Foram selecionados artigos disponíveis na plataforma PubMed, obedecendo os seguintes critérios: redigidos em inglês, publicados entre 2020 e 2021 e com as seguintes palavras-chaves: vacinação; COVID-19; plataformas vacinais; e planos de vacinação. Resultados/Discussão: Dentre as plataformas vacinais empregadas, destacam-se as de vetor viral recombinante; subunidade; vírus inativado; e as baseadas em ácidos nucleicos. Obteve-se na pesquisa três vacinas de vetor viral – uma estratégia recente, onde os vírus têm virulência e potencial replicativo reduzido sem haver alteração na capacidade de infecção. São elas: AstraZeneca, cujo plano vacinal inclui duas doses com intervalo de doze semanas e que utiliza um adenovírus de chimpanzé (ChAdOX1) carreando DNA que expressará a proteína S do SARS-CoV- 2; Janssen, cujo vetor é um adenovírus (Ad26) que expressa a proteína S viral e é administrada em dose única; Sputnik V que utiliza dois adenovírus diferentes – Ad26, produtor de proteína S para primeira dose, e Ad5, replicante para segunda – e é aplicada em duas doses com intervalo de 21 a 90 dias. Já as vacinas de vírus inativado carregam o antígeno morto, garantindo maior espectro de segurança, ainda que possam apresentar falhas na indução de resposta imune, fato que é contornado pela utilização de adjuvantes – como a CoronaVac, cujo adjuvante é o alúmen. Seu plano de vacinação é completo em duas doses num intervalo de 14 a 28 dias. Ademais, temos as vacinas de ácidos nucleicos, cujo princípio propõe a disponibilização de ácidos nucleicos para expressão de antígenos – tal tecnologia se destaca pela rápida produção e alta eficácia. Nesse grupo, evidencia-se a vacina da Pfizer, que carreia plataformas de RNA mensageiro encapsuladas em nanopartículas lipídicas. Seu plano de vacinação inclui duas doses com três meses de intervalo.3,4 Conclusão: Observa-se, então, cinco plataformas vacinais eficazes e que utilizam tecnologias das mais clássicas (CoronaVac) às mais recentes (ácidos nucleicos).

Introdução: O ácido fosfórico e seus derivados – ésteres e anidridos – têm grande importância biológica e terapêutica. Devido às suas múltiplas funcionalidades, esses grupos funcionais podem reagir como intermediários em muitos processos bioquímicos. Apesar do reconhecido papel dos ésteres e anidridos fosfóricos nos sistemas biológicos, eles são abordados de forma sucinta nas aulas de ciências da Educação Básica. Objetivo: Fazer uma revisão sobre os ésteres e anidridos derivados do ácido fosfórico como grupos funcionais de importância vital aos organismos vivos. Material e métodos: Trata-se de abordagem qualitativa, de natureza básica e caráter descritivo. Palavras-chave, como “Ácido Fosfórico”, “Anidrido Fosfórico” e “Éster Fosfórico” foram usadas como estratégia de busca nas plataformas PubMed e Google Scholar após serem traduzidas para o inglês. Resultados: Os ésteres e anidridos fosfóricos participarem de vários processos vitais e são essenciais em uma vasta gama de biomoléculas. Por exemplo, a maioria das coenzimas é ésteres de ácido fosfórico/pirofosfórico. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são fosfodiésteres, forma na qual se ligam às histonas, proteínas nucleares. Além disso, esses grupos funcionais fazem parte do metabolismo de nucleotídeos, glicólise e vias das pentoses fosfato. Os principais reservatórios de energia bioquímica, como o trifosfato de adenosina (ATP), glicose-6-fosfato, fosfoenolpiruvato, frutose-1,6-difosfato, ribose-5-fosfato, são ésteres e anidridos fosfóricos. Na molécula do ATP, a contribuição dos ésteres e anidridos fosfóricos vai além do fornecimento energético. Por meio de interações não covalentes dos seus grupos carregados, eles reduzem a energia de ativação, contribuindo termodinamicamente para muitos processos enzimáticos. Conclusão: Devido à pouca discussão desses grupos funcionais na Educação Básica, este trabalho apresentou uma breve revisão acerca de ésteres e anidridos fosfóricos, mostrando sua importância para metabolismo das biomoléculas.

Introdução: A COVID-19 é uma doença causada pelo SARS-CoV-2, apresentando os primeiros casos em Dezembro de 2019 na China, disseminando-se por todo o mundo. O vírus pode ocasionar diversas síndromes, incluindo a síndrome respiratória aguda. Porém, a infecção não se restringe apenas aos órgãos do sistema respiratório, podendo acarretar consequências neurológicas por meio da via bulbo olfatória e neuronal, por exemplo, tendo em vista sua afinidade por células neuronais. Objetivos: Estabelecer uma relação entre os mecanismos de invasão pelo SARS-CoV-2 com o sistema nervoso e suas complicações. Metodologia: O presente estudo é uma pesquisa bibliográfica, realizada nas principais ferramentas online de busca de artigos científicos em português, como: Scientific Eletronic Library Online (Scielo) e PubMed, no intervalo de 2020 a 2021. Resultados: A infecção por SARS-CoV-2 via bulbo olfatória ocorre pela entrada na mucosa da cavidade nasal e chega até ao encéfalo, atravessando a barreira hematoencefálica. Esse microrganismo invade a célula por meio da sua afinidade com o receptor da enzima conversora de angiotensina II, expressa na superfície dos neurônios, acarretando no tropismo do vírus pelos neurônios, sendo isto demonstrado através do estudo de cadáveres que tem a presença do SARS-CoV-2 dentro das células neuronais. Outrossim, o neurônio quando afetado e misturado com os ácidos nucleicos da célula neuronal, ocasiona uma inflamação, na qual o sistema imune irá tentar combater, mas acaba combatendo o próprio neurônio, acarretando em uma doença autoimune. Conclusão: Considerando o baixo índice de estudos publicados, que associam a COVID-19 à consequências neurológicas, torna-se difícil afirmar com precisão os mecanismos exatos de comprometimento do tecido nervoso. No entanto, acredita-se que há a relação causal de comprometimento neuronal, e que o agente infeccioso, tem a capacidade de causar acometimentos a longo prazo por meio de lesão neuronal, que poderá ser melhor confirmada por meio de futuros estudos.

INTRODUÇÃO: O vírus SARS-COV2 é um coronavírus responsável pela atual pandemia de síndrome respiratória aguda COVID-19, uma doença que ainda necessita de estudos para responder às diversas dúvidas levantadas pelas ciências da saúde. Neste contexto, encontra-se a imunomodulação desempenhada pelos hormônios sexuais, os quais determinam o diferente grau de acometimento de indivíduos do sexo masculino e feminino. Objetivo: por meio de uma revisão integrativa da literatura, avaliar a imunomodulação realizada pelos hormônios sexuais masculinos e femininos, expondo as alterações principais no sistema imunológico e seus impactos no paciente acometido por COVID-19. MATERIAL E MÉTODOS: levantamento de artigos indexados nas bases de dados PubMed, LILACS, SciELO e BVS a partir de 2019, por meio dos seguintes descritores: “estrogen” AND “covid 19”. Primariamente, obtiveram-se 209 referências. Após a exclusão de 22 fontes duplicadas e 167 referências que não atendiam aos critérios de inclusão/exclusão, restaram 20 artigos analisados no presente estudo. RESULTADOS: A presença superior dos níveis de estrogênio, quando relacionada ao COVID-19, atua como fator protetor para o sexo feminino, visto que tal hormônio apresenta um papel de ativação do sistema imunológico e possui interação com sistemas que modulam a homeostase vasomotora. Sabe-se que o estrogênio inibe a resposta vasoconstritora a vários estímulos e induz a vasodilatação da vasculatura pulmonar sob estresse, desta forma, atenua-se o impacto das microtromboses pulmonares do COVID-19 ao manter o fluxo microvascular. Outro ponto importante para o sexo feminino é a presença dobrada do cromossomo X, que contém o maior número de genes relacionados ao sistema imune em todo o genoma humano e também codifica receptores Toll-like que trabalham na detecção de ácidos nucleicos da SARS-CoV-2, dando às mulheres vantagem na geração de resposta imunológica. Entretanto, a testosterona e a progesterona fornecem uma supressão imunológica das respostas inatas e interferem negativamente a ação de células T citotóxicas e Natural Killers. CONCLUSÃO: Conclui-se que a presença do estrogênio, junto ao fato das mulheres apresentarem 2 cromossomos X em seus genes, faz com que o sexo feminino possua uma resposta imunológica ao COVID-19 mais rápida e eficaz.

Introdução: Com a pandemia da COVID-19, doença causada pelo vírus SARS-CoV- 2¹, o desenvolvimento de uma vacina eficaz ocorreu em tempo recorde, exibindo bons resultados. As vacinas foram criadas com métodos variados, como: vetor viral recombinante, subunidade de proteína, vírus inativados e ácidos nucleicos. No Brasil, a vacinação foi iniciada em 17 de janeiro de 2021, com uso emergencial da CoronaVac e da AstraZeneca. Objetivos: Descrever o perfil da resposta imunológica, eficácia e efeitos colaterais das vacinas contra COVID-19 utilizadas no Brasil. Métodos: Foram selecionados artigos disponíveis na plataforma PubMed. Os critérios de inclusão foram artigos no idioma inglês, publicados nos anos de 2020-2021 com os seguintes descritores: Vacinação; COVID-19; Eficácia; Efeitos Colaterais; e Resposta Imunológica. Resultados/Discussão: A vacina de RNAm da Pfizer induziu elevados títulos de anticorpos neutralizantes para SARS-CoV-2 e resposta T CD4+/CD8+, com eficácia de 95% após a segunda dose, e os efeitos colaterais mais comuns foram fadiga e cefaléia². A AstraZeneca, vacina de adenovírus modificado, apresentou resposta imunológica humoral e celular, além de eficácia de 90% após a segunda dose, possuindo como efeitos adversos mais comuns mialgia, fadiga, cefaléia, dor no local da injeção e febre.³ A Janssen, vacina adenoviral (Ad26) de dose única, demonstrou produção de anticorpos neutralizantes, e resposta celular T CD4+/CD8+, apresentando eficácia variando de 67% a 85% de acordo com a gravidade do caso. Seus os principais efeitos adversos foram dor no local da injeção, cefaléia e fadiga.4 A Sputnik V, vacina adenoviral de imunização heteróloga (Ad26 primeira dose e Ad5 segunda dose), apresentou forte resposta humoral e de células T CD4+/CD8+, e eficácia de 91,4% após a segunda dose, sendo as principais reações adversas astenia, mialgia, artralgia, febre e cefaléia. A CoronaVac, vacina de vírus inteiro inativado, induziu a produção de anticorpos contra o SARS-CoV-2, além de uma resposta celular de linfócitos T produtores de IFN-γ, apresentou eficácia que variou entre 83,7% e 100% após a segunda dose, dependendo da gravidade, e a principal reação adversa foi a dor no local da aplicação.5 Conclusões: O perfil de resposta imunológica é, principalmente, produção de anticorpos neutralizantes e resposta T CD4+/CD8+. As eficácias das vacinas em uso no Brasil variam entre 66% - 91,4% após a imunização completa e o principal efeito colateral foi a cefaléia.

Introdução: O sistema CRISPR-Cas possui grande relevância na medida em que se considera sua especificidade de atuação genética como forma de manipular ou editar o genoma de organismos de interesse, inclusive para criar organismos resistentes à infecção por HIV. Objetivos: Analisar como o sistema CRISPR-Cas pode ser utilizado para gerar células resistentes à infecção pelo HIV. Material e métodos: Foi realizada uma revisão bibliográfica por meio da Biblioteca Virtual em Saúde utilizando os seguintes descritores: “edição de gene” e “hiv”. Os filtros aplicados como critério de inclusão foram estes: (i) bases de dados: MEDLINE, IBECS e LILACS; (ii) assuntos principais: infecções por HIV, edição de genes, sistemas CRISPR-Cas; (iii) tipos de estudos: estudo de prognóstico, estudo de prevalência, ensaio clínico controlado e relato de casos; (iv) idiomas: inglês. Resultados: O sistema CRISPR-Cas possui como destaque sua grande especificidade para selecionar com precisão a região do ácido nucleico da célula que deve sofrer a ação das endonucleases Cas9. Dessa maneira, esse sistema pode ser útil para gerar resistência contra a doença da imunodeficiência adquirida na medida em que se considera a edição do gene CCR5, o qual é responsável pela síntese do principal correceptor de membrana que o HIV utiliza para fundir seu envelope com a membrana do linfócito TD4 e, desse modo, introduzir seu capsídeo na célula. Assim, realizando uma deleção homozigótica de 32 pares de bases do gene CCR5 por intermédio do sistema CRISPR-Cas, é possível gerar, como resultado dessa mutação, o gene CCR5-delta 32, o qual impede que esse correceptor se fixe na membrana plasmática da célula e, consequentemente, impede que a célula seja infectada pelo vírus da Aids. Conclusão: O sistema CRISPR-Cas se demonstra como uma ferramenta biotecnológica que pode ser benéfica para a reprogramação genética, para a realização de pesquisas biológicas de forma mais precisa e eficiente e, além de todo seu potencial de uso em organismos vegetais e animais, também possui grande destaque na área da saúde com seu provável potencial farmacológica.

Introdução: Na última década, a epidemia de HIV/aids no norte do Brasil, em especial no estado do Amazonas é crescente, e caracteriza-se por um aumento acentuado dos casos de incidência do HIV/aids. Doadores de sangue infectados pelo HIV são considerados uma importante população sentinela para a vigilância epidemiológica, no entanto, dados sobre a epidemiologia dessa infecção em doadores de sangue ainda são escassos. Objetivo: Identificar o perfil epidemiológico dos doadores de sangue e a prevalência de coinfecção do HIV/vírus das hepatites B, HIV/vírus da Hepatite C, HIV/vírus linfotrópico das células T humanas HTLV-1/2, HIV/Sífilis e HIV/Doença de Chagas da Fundação HEMOAM no período de 2017 a 2019. Metodologia: Trata-se de um estudo transversal e retrospectivo. Na triagem dos doadores de sangue para o HIV foi utilizado o método de Quimiluminescência (CMIA) e teste de ácido nucleico (NAT). As análises descritivas foram realizadas a partir de informações cadastradas no banco de dados do programa HEMOSYS da Fundação HEMOAM. Resultados: No período do estudo, um total de 172.867 candidatos a doação de sangue compareceram na Fundação HEMOAM. Destes, 0,8% (N=146) testaram positivo para o HIV. Entre estes, houve o predomínio de homens 77,4% (N=113), jovens entre 18 a 27 anos 39% (N=57), solteiros 52,1% (N=76), de raça parda 60,3% (N=88), com escolaridade ensino médio 40,4% (N=59). Em relação a coinfecção, verificou-se alta prevalência de HIV/sífilis com 26% (N=38) entre doadores de sangue, seguido pelo HIV/Hepatite C (HCV), sendo 3,4% (N=05). Não foram encontrados nenhuma coinfecção do HIV com o vírus da hepatite B, vírus linfotrópico de células T humanas HTLV, e Doença de chagas. Conclusão: Os resultados apresentados nesse estudo mostraram que os doadores de sangue infectados pelo HIV, eram adultos jovens, solteiros, do sexo masculino, pardos, com escolaridade ensino médio. Evidenciando que, este grupo necessita de mais políticas de educação e prevenção, ampliando a oferta de testes sorológicos para o HIV-1 nesta população. Os dados destacam a relevância da detecção da prevalência de coinfecções com o HIV em doadores de sangue, que podem subsidiar medidas de prevenção e de disseminação de infecção.

Introdução: A detecção de HIV na triagem em doadores de sangue da Fundação HEMOPA é realizada simultaneamente por um teste sorológico e um molecular. No caso de discordância entre estes, é realizado um teste confirmatório. Objetivo: Determinar a frequência de resultado de Imunocromatografia GEENIUS HIV 1/2 CONFIRMATORY ASSAY (Bio-Rad), em amostras Eclesys HIV Duo (ROCHE) reagentes (positivos e inconclusivos) e teste de ácido nucleico (NAT) para HIV indetectáveis. Materiais e Métodos: Foram avaliadas 97 amostras entre o período de outubro 2020 á fevereiro 2022. Para este estudo todas as amostras selecionadas tinham sorologia Anti-HIV reagente (valor de leitura da amostra/ valor do “cut off” (S/CO) >1,2) e NAT indetectável. Foram utilizados para a detecção de anticorpos anti-HIV, o ensaio Eclesys HIV Duo com metodologia de eletroquimioluminescência e, para a detecção de RNA de HIV, o Kit NAT HIV/HCV Bio-Manguinhos com metodologia de PCR em tempo real. O GEENIUS HIV 1/2 CONFIRMATORY ASSAY é usado como teste confirmatório suplementar para análise da presença de anticorpos específicos para HIV, contra os antígenos do HIV-1 (p24, p31, gp41,gp160) e HIV-2 (gp36 e gp140). A avaliação do teste é feita de acordo com a metodologia de imunocromatografia de acordo com o fabricante Bio-Rad. Resultados: O teste sorológico para Anti-HIV de 97 amostras revelou que 43% (42/97) tiveram resultados inconclusivos (valor S/CO entre 0,8 a 1,2) e 57% (55/97) tiveram resultados positivos (valor S/CO >1,2). Das amostras que tiveram sorologias inconclusivas, 97% (41/42) tiveram resultados de Imunocromatografia negativos, 3,0% (1/42) tiveram resultados de Imunocromatografia indeterminados e não houve resultados positivos. Das amostras com sorologia positiva, 91% (50/55) tiveram resultados de Imunocromatografia negativo, 3,6% (2/55) tiveram resultado de Imunocromatografia indeterminada e 5,4% (3/55) tiveram resultado de Imunocromatografia positiva. Conclusão: A imunocromatografia mostrou-se uma ferramenta efetiva para confirmar a não exposição ao HIV em 94% (91/97) dos doadores de sangue com resultados discordantes do teste de triagem sorológico-molecular para o HIV permitindo que esses doadores recebessem a correta orientação.

Introdução: A miocardite é uma doença inflamatória cardíaca desencadeada por infecções virais. Hodiernamente, tem-se percebido um aumento da incidência de casos de miocardite após a vacinação contra o COVID-19 (10 a cada 100000 pessoas). No entanto, esse aumento foi mais relatado em vacinas que utilizaram como base tecnológica o mRNA, como Pfizer/BioNTech e Moderna. Objetivos: Descrever mecanismos imunológicos envolvidos nos desfechos de miocardite após a vacinação contra o COVID-19. Material e Métodos:: Trata-se de uma revisão sistemática, na qual foram selecionados artigos científicos publicados na Biblioteca Virtual de Saúde (BVS), entre os anos de 2020 a 2022, a partir das palavras chaves “vacina”, “covid-19”, “miocardite” e “pericardite”, unidas pelo operador boleano \"AND\". Posteriormente, selecionou-se os artigos que respondessem a seguinte pergunta norteadora “qual a relação imunológica da vacina contra o covid-19 com desfechos de miocardite?”, totalizando 9 artigos. Resultados: A sequência de mRNA inoculada pela vacina promove a formação de proteínas spike do coronavírus nas células hospedeiras. Esses peptídeos são apresentados por células apresentadoras de antígeno, que ativam a imunidade adaptativa: resposta celular (ativação dos linfócitos T CD4+ e CD8+) e humoral (ativação de linfócitos B e produção de anticorpos anti-SARS-CoV-2). Contudo, a imunidade inata também é ativada de forma anormal devido a exposição à proteína spike secretada pela célula hospedeira ou pela exposição ao ácido nucleico viral, provocando uma resposta hiperimune que inclui ativação de linfócitos natural killer (NK) e macrófagos, bem como liberação exacerbada de citocinas. Sugere-se que essa alteração esteja correlacionada ao comprometimento miocárdico. Além disso, uma resposta imune contra autoantígenos em cardiomiócitos é outro possível mecanismo, visto que a presença de mimetismo entre a proteína spike e os autoantígenos cardíacos podem gerar anticorpos anti-SARS-Cov-2 contra proteínas cardíacas. Conclusão Portanto, os mecanismos imunológicos da vacina sobre a incidência de miocardite podem estar relacionados com a tempestade de citocinas e mimetismo da spike com autoantígenos cardíacos. Apesar dessa relação, os benefícios da vacinação contra COVID-19 ultrapassam o raro risco de miocardite para todas as faixas etárias, entretanto, são necessárias mais investigações sobre os mecanismos imunológicos desse quadro.