Dissertations / Theses on the topic 'Ácidos nucleicos'

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química
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Complexos biomiméticos do sítio ativo das PAPs foram sintetizados com o objetivo de elucidar o papel das PAPs nos sistemas vivos e simultaneamente encontrar novas aplicações para estes complexos como nucleases sintéticas. Com este intuito, foi testada a atividade de uma série de complexos heterodinucleares Fe3+M2+, usando o ligante assimétrico H2BPBPMP. Os complexos são: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc. O DNA plasmidial foi utilizado como modelo para testar a clivagem da ligação fosfato pelos complexos. Foram testadas diferentes condições de pH e concentração dos complexos. As reações também foram realizadas na presença de captadores de radicais livres e na ausência de oxigênio. Para verificar a interação complexo/DNA foram realizados experimentos com Distamicina e titulação espectrofotométrica UV-Vis. Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar DNA por um mecanismo hidrolítico em baixas concentrações do complexo (2,5 µM) a 37 oC em pH próximo ao fisiológico (faixa de 6,0 a 7,0). O complexo FeNiOAc não cliva o DNA, mas pode se ligar ao DNA e alterar significativamente sua mobilidade. O complexo FeCuOAc é o mais ativo da série apresentando uma aceleração de 2,71 x 107 vezes quando comparado com o valor do DNA não catalisado, seguido por, FeMnOH, FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular
O aumento do número de microrganismos resistentes a antibióticos constitui uma das grandes problemáticas da atualidade, tornando-se pertinente encontrar terapias alternativas de tratamento de doenças infeciosas. A inativação fotodinâmica (PDI) tem sido proposta como alternativa para o controlo de infeções. A PDI consiste na destruição de microrganismos através da interação entre três componentes: luz, uma molécula de fotossensibilizador e oxigénio na forma molecular. Apesar de existirem numerosos estudos que demonstram a eficiência da PDI em diferentes tipos de microrganismos e com recurso a diferentes fotossensibilizadores, o mecanismo de PDI, ainda não se encontra completamente compreendido, principalmente no que diz respeito ao dano causado no DNA. De um modo geral, são considerados dois mecanismos principais, propostos para os efeitos letais causados nas bactérias pelo processo de PDI: este processo pode produzir alterações na parede celular ou provocar danos no DNA, sendo que os danos na parede celular são, de um modo geral, referidos como os principais responsáveis pela inativação celular. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito fotodinâmico nos ácidos nucleicos de E. coli usando como fotossensibilizadores duas porfirinas catiónicas, a tetra-iodeto de 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina (Tetra-Py+-Me) e a tri-iodeto de 5,10,15-(1-metilpiridinio-4-il)-20-(pentafluorofenil)porfirina (Tri-Py+-Me-PF). Neste sentido, recorreu-se a duas abordagens metodológicas diferentes. No primeiro caso, procedeu-se à fotoinativação das células de E. coli durante diferentes períodos de tempo e extraíram-se os ácidos nucleicos subsequentemente (efeito indireto). No segundo caso, os ácidos nucleicos foram extraídos de células de E. coli e irradiados posteriormente (efeito direto). Em ambas as abordagens metodológicas, os ácidos nucleicos foram analisados por eletroforese em gel de agarose e quantificados por fluorometria. Em geral, os perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli após PDI mostram uma diminuição na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, diretamente proporcional à inativação das células. Com a porfirina Tri-Py+-Me-PF, a diminuição de DNA genómico ocorreu mais rapidamente, comparativamente com a porfirina Tetra-Py+-Me. Relativamente aos perfis eletroforéticos dos ácidos nucleicos extraídos das células de E. coli não irradiadas e posteriormente irradiados na presença do fotossensibilizador, observou-se que não ocorreu variação na quantidade de DNA genómico ao longo do tempo, contudo, observou-se uma diminuição na quantidade de rRNA ao longo do tempo. Embora não tenham sido observados danos no DNA, não se exclui a possibilidade de terem ocorrido danos não detetáveis com a metodologia utilizada neste estudo.
The increase of antibiotic resistance among pathogenic microorganisms is a major public health issue, making it relevant to find alternative therapies for the treatment of infectious diseases. Photodynamic inactivation (PDI) has been proposed as an alternative approach for the treatment of infections. PDI consists in destroying microorganisms through the interaction of three components: light, photosensitizer and molecular oxygen. Although there are numerous studies showing the efficiency of PDI in the inactivation of different types of microorganisms, by different photosensitizers, the mechanism of PDI is not yet fully understood. In general, two main mechanisms are proposed for the lethal effects of PDI on bacterial cells: the PDI process can produce cell membrane damages or cause DNA damage. The damages of the membrane are generally referred to as the main responsible for cell inactivation. The aim of this study was to analyze the photodynamic effect on E. coli nucleic acids, using two cationic porphyrins as photosensitizers (5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridini-um-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and 5,10,15-tris(1-methylpyridinium-4-yl)-20-(pentafluorophenyl)porphyrin tri-iodide (Tri-Py+-Me-PF). In this study, we used two different methodological approaches. In the first approach, the E. coli nucleic acids were extracted from photosensitized cells (indirect effect). In the second approach, the nucleic acids were extracted from non-irradiated E. coli cells and irradiated in the presence of the PS (direct effect). In both cases, nucleic acids were analyzed by agarose gel electrophoresis and quantified by fluorometry. In general, the electrophoretic profiles of nucleic acids extracted from E. coli cells after PDI reveal decreases in the amount of genomic DNA over time, which are directly proportional to the cell inactivation. The porphyrin Tri-Py+-Me-PF induced a faster decrease of the genomic DNA over time, in comparison with Tetra-Py+-Me porphyrin. The electrophoretic profiles of nucleic acids of E. coli irradiated in the presence of photosensitizer show no variation in the amount of genomic DNA over time. In this last case, there was a decrease in the amount of rRNA. Although no damage was observed in the DNA, we cannot exclude the possibility of the occurrence of damages which are not detectable by the methodology applied in this study.

1) Estudio teórico de nucleobases modificadas. Las modificaciones químicas de ácidos nucleicos tienen una amplia variedad de aplicaciones tanto en clínica, utilizadas como agentes antisentido, así como en el estudio de las estructuras de los propios ácidos nucleicos, las interacciones proteína DNA o en la catálisis de ácidos nucleicos por poner algunos ejemplos. Actualmente se sintetizan cientos de análogos de nucleósidos estándar en laboratorios farmacéuticos, algunos de ellos como, por ejemplo, los análogos de la arabinosa de adenosina y citosina, son útiles como fármacos antivirales o anticancerígenos. La mayoría de los fármacos anticancerígenos actúan inhibiendo la síntesis de DNA de alguna manera si bien es cierto que tienen bastantes efectos secundarios. Sin embargo, la combinación de varios de estos fármacos reduce la resistencia y minimizan la toxicidad. Ejemplos de este tipo de análogos son los antimetabolitos que al ser estructuralmente muy similares a los nucleósidos estándar son capaces de interferir en la producción de los ácidos nucleicos inhibiendo las rutas de síntesis de ácidos nucleicos o incorporándose dentro de la estructura del DNA y el RNA. Una vez que se incorporan al DNA, estos compuestos provocan la terminación de la cadena durante la replicación del DNA y en consecuencia la muerte celular. Existen modificaciones del esqueleto azúcar-fosfato de los oligonucleótidos que mejoran la eficacia en la síntesis de siRNAs controlando la expresión génica en unos casos al bloquear estéricamente la actividad enzimática de las nucleasas, en otros inhibiendo la hibridación del mRNA con la hebra antisentido o incluso favoreciendo la formación de triplexes con secuencias específicas de DNA. Un ejemplo de ello son los fosforotioatos que poseen un átomo de oxígeno no enlazante sustituido por azufre en el enlace fosfodiéster. Éste tipo de modificaciones han demostrado ser resistentes tanto para exo- como endonucleasas aumentando la resistencia en cultivos celulares y en suero. Estudio de las propiedades tautoméricas y reconocimiento de las tiocetotiminas. Las bases sintéticas, una vez introducidas en el DNA, son capaces de inducir cambios conformaciones y alterar la estabilidad induciendo incluso mutaciones o modificando los patrones de reconocimiento. La forma tautomérica que suele suponerse para an álogos de nucleobases estándar es la forma ceto/amino. Sin embargo, la influencia del entorno puede en algunos casos favorecer la existencia de formas teóricamente minoritarias. En este estudio se describen las propiedades tautoméricas de la timina, y la 2- y 4-tiocetotiminas mediante métodos ab initio y la combinación de simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre. Los patrones de reconocimiento así como las estabilidades relativas de los tautómeros mayoritarios en diversos entornos fueron identificados. Los resultados teóricos fueron apoyados por los resultados experimentales aportados por el laboratorio del Prof. Dr. Ramón Eritja, y permiten describir las características tautoméricas y de reconocimiento de las tiocetotiminas. 2) Estudio de la influencia de la 6-selenoguanina en diferentes estructuras de DNA. Los análogos de purinas 6-mercaptopurina y 6-tioguanina se utilizan como agentes inhibidores del metabolismo de los ácidos nucleicos en diversos tipos de leucemias. En este trabajo presentamos una caracterización exhaustiva de la estructura y propiedades de interacción de la 6-selenoguanina, un isóstero de la guanina que introducido en el DNA puede afectar diferencialmente en estructuras de mayor orden del DNA. Mediante cálculos exactos de mecánica cuántica y la combinación de simulaciones de dinámica molecular con métodos de energía libre, hemos evaluado la influencia de la sustitución de la guanina estándar por la 6-selenoguanina en sistemas de doble, triple hebra de DNA así como en la estabilidad de estructuras G-cuádruplex. Finalmente, se aborda el estudio de las propiedades electrónicas de la 6-selenoguanina ya que se ha observado que ciertas modificaciones introducidas en el DNA podrían aumentar la capacidad conductimétrica de estos sistemas. 3) Funcionalización de los extremos 3' de oligos de DNA y RNA con derivados modificados con puentes N-etil-N y uso como inhibidor de 3'-exonucleasas. Existen ciertas limitaciones en el desarrollo de ácidos nucleicos modificados con aplicaciones clínicas y es que, la vulnerabilidad a la acción de nucleasas, tanto exo- como endonucleasas, limita la vida media de estos oligos en suero. En la actualidad, los fosforotioatos son las modificaciones que generan mayor resistencia aunque presentan la limitación de que un elevado número de los fosfatos del oligo han de ser modificados. En este trabajo presentamos una nueva modificación en el extremo 3’ de los oligos, en la que dos nucleósidos se unen por el lado de la base en lugar de por enlace fosfodiéster que es eliminado en el diseño. Simulaciones de dinámica molecular del complejo molecular con el fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y el oligo modificado permiten demostrar la base del diseño racional del dímero modificado. Los estudios estructurales se complementaron con los experimentos realizados por la Dr. Montserrat Terrazas y Adele Alagia del grupo del Prof. Dr. Ramón Eritja. Éstos incluían estudios de digestión por 3’-exonucleasas (fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y la fosfodiesterasa de veneno de serpiente) así como experimentos celulares de RNA de interferencia. 4) Estudio de la flexibilidad de ácidos nucleicos de doble cadena. El estudio de la flexibilidad de los ácidos nucleicos ha sido y sigue siendo un campo actual en efervescencia gracias a la desarrollo de las técnicas de moléculas individuales y a los métodos computacionales como la dinámica molecular. En este estudio se aborda la influencia de la secuencia en la estructura, estabilidad y flexibilidad de moléculas de RNA de doble cadena mediante simulaciones de dinámica molecular. Otro de los objetivos del estudio era comparar los dos campos de fuerza que son mayoritariamente utilizados en el campo de los ácidos nucleicos, AMBER (parm99bsc0) y CHARMM (CHARMM27). Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad es dependiente de la secuencia pudiendo agrupar los diferentes dinucleótidos en su mayor o menor capacidad para ser deformados. Medidas experimentales como la longitud de la persistencia o la torsión de las dobles hélices de RNA son parámetros moleculares globales que definen la flexibilidad en una escala mayor. Mediante métodos de dinámica esencial, se calcularon los promedios de las entropías intramoleculares de las cuatro secuencias consideradas así como las estimaciones teóricas de la longitud de la persistencia, de la torsión helicoidal y del estiramiento molecular. Además, los resultados del estudio aportan más datos acerca de la diferente flexibilidad que existe entre el DNA y el RNA de doble cadena.
In this thesis quantum mechanics and classical mechanics techniques have been used to study the tautomeric properties of modified nucleobases with potential application to antisense and biotechnology fields. On the other hand, the study of the mechanical properties of double stranded DNA and RNA (dsDNA versus dsRNA) and their sequence dependency have been addressed. In practice, the work has been divided into the following sections: 1.- Theoretical study of sulfur modified thymines. The tautomeric properties of thymine and two thioketoderivatives, 2- and 4-thioketothymines, have been studied by means of accurate ab initio calculations and molecular dynamics simulations coupled with free energy calculations. Previous results suggested that these modifications could stabilize DNA structure at least as good as the natural thymine leading to the fidelity consequences during the replication. Indeed, those results suggested that some minor tautomeric forms could be present in the DNA double stranded environment which would explain the higher stability of certain mismatches. In the light of these results, we explored the impact of thioketothymines by means of both theoretical and experimental studies. 2.- Theoretical study of seleno modified guanine. We explore the chemical properties of 6-selenoguanine (6SeG) and the influence in duplex, triplex and G-quadruplex structures by means of high-level quantum mechanics calculations and free energy calculations combined with molecular dynamics simulations. 6-Selenoguanine, like other related antimetabolites like thiopurines, has been longtime used against several cancers like lymphomas or hepatomas. Moreover, their applications have been extended to solving X-ray nucleic acids structures (6SeG can be incorporated to these molecules and display anomalous dispersion) and, from the present work we suggest that 6SeG can also exhibit remarkable conductor properties in DNA structures. 3.- Inhibition of 3’-exonucleases with dimeric N-ethyl-N modified nucleosides. Development of synthetic oligonucleotides (ONs) has received much attention in the past years due to their ability to silence the expression of undesired overexpressed genes. Among established therapies, siRNAs have been widely studied due to their high potency and sequence-specificity. However, the application of oligonucleotides in vivo faces important limitations. For example, their high vulnerability to degradation by serum nucleases. Much effort has been made to overcome these limitations but, in many cases, modifications that increase nuclease stability, cause negative effects on RNAi activity. We are interested in creating chemical modifications able to increase nuclease stability without disrupting RNAi activity. In particular, in this work, we explored 3’-terminal modifications by replacing standard nucleobases by N-ethyl-N-coupled nucleosides. We focused special attention on 3’-exonucleases because they are the predominant nuclease activity present in serum. By means of molecular dynamics simulations and in vitro experiments, modified siRNAs resistant to nuclease digestion were evaluated against Bcl-2 in vitro, an antiapoptotic gene which is overexpressed in several cancer processes. 4.- Flexibility study of dsRNA molecules. Despite their chemical similarity, DNA and RNA duplex structures play very different biological roles. While double stranded DNA can display a large variety of structures close to the B-form with very dynamic sugar-phosphate conformations, RNA double stranded has been traditionally considered rigid. However, presented results from CHARMM27 MD simulations that pointed in the opposing direction, stating that RNA2 is more flexible than DNA2. To shed some light on this topic, we study the flexibility of double stranded RNA molecules by means of molecular dynamics simulations on four different 18-mer sequences. AMBER and CHARMM nucleic acid force fields were used to analyze the sequence dependent elastic properties and the results were ultimately compared with the obtained for DNA duplex, were both force fields produced comparable results.

Esta tesis recoge el estudio teórico de algunos de los más importantes tipos de interacciones débiles no covalentes en el ADN. Los sistemas de estudio van desde bases nitrogenadas y nucleósidos en fase gas hasta los ácidos nucleicos en solución.

Concretamente se trataran las interacciones débiles pi-catión y los contactos entre bases con el objetivo de profundizar en su naturaleza. Dentro de las interacciones entre bases podemos diferenciar entre: (i) las interacciones de puente de hidrógeno impropio, (ii) las interacciones con bases modificadas, como la 8-aminoinosina y el difluorotolueno, y finalmente (iii) las interacciones no canónicas: Hoogsteen y Watson-Crick reverso, que pueden dar lugar a nuevas estructuras secundarias del ADN.

Se utilizan todo un conjunto de técnicas teóricas que van desde la mecánica clásica hasta los más elevados niveles de mecánica cuántica, con la finalidad de aportar la máxima información estructural, reactividad y dinámica que complemente así los datos experimentales disponibles sobre las nucleobases y los ácidos nucleicos.

En la primera parte de la presente tesis se describirán los métodos teóricos empleados para caracterizar las interacciones no covalentes. En la segunda parte se detallarán brevemente la estructura y las propiedades de los ácidos nucleicos. A continuación, se presentarán los resultados de las interacciones estudiadas. Y finalmente, se procederá a la discusión de los resultados obtenidos y a las conclusiones.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T12:53:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Annielle Silva.pdf: 4594171 bytes, checksum: 51d05b433109819b0c9846edafc2af58 (MD5)
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CAPES CNPq INAMI
O nanoporo formado pela incorporação da α-hemolisina em bicamadas lipídicas planas é considerado modelo de nanoporo proteico para elucidação do mecanismo de transporte de moléculas e no desenvolvimento de dispositivos analíticos - biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. O conhecimento da interação de nucleotídeos com o nanoporo da α-hemolisina é de especial interesse, pois, alguns estudos sugerem varias metodologias para a utilização deste nanoporo como sequenciador de DNA em tempo real. Apesar de todos os avanços, a principal dificuldade operacional para obtenção de um sequenciador baseado na tecnologia “nanopore sensing”, é a rapidez na translocação do DNA através do nanoporo; dificultando a discriminação adequada das bases. Neste contexto é imprescindível fazer adaptações moleculares no nanoporo visando o aumento do tempo de permanência do DNA e da energia de interação deste com o nanoporo. As principais estratégias disponíveis para produção de nanoporos adaptados são: mutações sítio dirigidas e funcionalização química. Ambas são de elevado custo e tempo de experimentação. Neste trabalho utilizamos técnicas de simulação computacional para obtenção, a nível atomístico, a interação do DNA com o nanoporo da α-hemolisina na sua forma nativa e adaptada em posições estratégicas previamente selecionadas por modelagem molecular. As técnicas utilizadas baseiam-se na dinâmica molecular fora do equilíbrio e na Relação de Jarzynski, na qual a média do trabalho realizado ao deslocar o DNA ao longo do nanoporo proteico é estatisticamente relacionada à energia livre do processo. As informações sobre as interações do DNA-nanoporo obtidas podem predizer, teoricamente, os nanoporos mais promissores para serem testados experimentalmente. Realizou-se a seleção das mutantes que foram usadas e foram obtidos dados importantes sobre a parametrização das dinâmicas usando a relação de Jarzynski, como velocidade e constante de força que devem ser aplicadas ao sistema. Além disso, foram obtidas informações sobre a trajetória e contato do DNA com o interior do poro mutado e na forma selvagem, o que mostra a efetividade do sistema.

O consumo de álcool vem sendo associado a um aumento do risco de câncer e a uma situação de estresse oxidativo. Os metabólitos responsáveis por tais processos permanecem em discussão. Neste trabalho, caracterizamos novos metabólitos radicalares do etanol e examinamos suas interações com ácidos nucléicos. Primeiramente, demonstramos que os radicais 1-hidroxietila e 2-hidroxietila produzidos durante a oxidação do etanol por sistemas Fenton alquilam DNA e RNA in vitro produzindo os adutos 8-(1-HE)Gua e 8-(2-HE)Gua, respectivamente. Esses adutos foram sintetizados e caracterizados quimicamente. Também, demonstramos que acetaldeído, o principal metabólito do etanol, é oxidado por sistemas Fenton, peroxinitrito, xantina oxidase, partículas submitocondriais e ratos a radicais acetila e metila. Esses radicais foram caracterizados e seus mecanismos de formação elucidados, pelo menos in vitro. A possibilidade do radical 1-hidroxietila alquilar ácidos nucléicos in vivo foi também examinada. Inesperadamente, o aduto 8-(1-HE)Gua foi detectado em RNA e DNA do fígado de ratos controle e seus níveis não foram significativamente alterados após administração aguda de etanol. Esses resultados sugerem que os radicais 1-hidroxietila, acetila e metila são importantes metabólitos do etanol in vivo mas atacam preferencialmente outras biomoléculas que não ácidos nucléicos.
Alcohol consumption has been associated with increased cancer risk and an oxidative stress condition. Ethanol metabolites responsible for these processes remain debatable. Here, we characterized novel radical metabolites of ethanol and examined their interactions with nucleic acids. First, we demonstrated that the 1-hydroxyethyl and 2-hydroxyethyl radical produced from ethanol oxidation by Fenton systems alkylated DNA and RNA in vitro to produce 8-(1HE)Gua and 8-(2-HE)Gua, respectively. Both adducts were synthesized and structurally characterized. Next, we demonstrated that acetaldehyde, the main ethanol metabolite, is oxidized by Fenton systems, peroxynitrite, xanthine oxidase, submitochondrial particles and whole rats to acetyl and methyl radicals. These radicals were characterized and their production mechanisms in vitro elucidated. The possibility of the 1-hydroxyethyl radical alkylating nucleic acids in vivo was also examined. Unexpectedly, the adduct 8-(1-HE)Gua was detected in RNA and DNA from liver of control rats and their levels were not increased by acute ethanol treatment. Overall, the results suggest that the radicals 1-hydroxyethyl, acetyl and methyl are important ethanol metabolites in vivo but they preferentially attack biomolecules other than nucleic acids.

1. The Force Field Accuracy Problem. The utility and applicability of MD simulations to model biomolecular systems goes only as far as its ability to sufficiently sample the conformational space and the correct description of the potential in terms of the force field functional form and parameter set. Clearly, the force field defines the shape of the conformational space for a given set of atomic positions and also the accessibility of energy minima. When simulating systems at equilibrium, especially quite stable systems such as DNA, the force fields strive to generate ensembles that reproduce well real systems and this does not have to come as a big trade-off with sampling power. In recent years it has become the business of computer engineers and software developers to address the issue of achieving long and biologically relevant time scales. Convergence and reproducibility of atomistic DNA simulations with state-of-the-art force fields such as our parmbsc1 has been convincingly demonstrated. It also seems that until a significant revolution, where milliseconds of simulation become routine, current sampling ranges completely cover the internal structures and dynamics of B-DNAs at this time scale. The growing confidence has allowed many researchers to use MD for very detailed studies on the sequence-dependent nature of DNA oligomers and on the complex arsenal of mechanisms that govern its behavior. In any such studies careful validation of results is necessary since it is not yet entirely clear how well and to what degree are sequence effects reproduced in MD. The fact that the latest-generation of force fields agree very well between themselves and that they fit with the sparse experimental data is surely very encouraging, but it will be some time until small differences in sequence geometries can be validated. Our own extensive validation of the parmbsc1 force field, as well as a large number of other works that have, since its publication, either specifically set out to assess its performance, or have just applied it with success, speak of a very stable parametrization able to deal with a wide range of DNAs. It is worth to mention that in special conditions small improvements might be necessary, which could be achieved with the inclusion of polarization terms. However, up to date, no force field has been able to model polarization without eventually destabilizing the system and this at a huge cost (a factor of 10) to calculation speed. To sum up, based on the remarkable performance of parmbsc1, we and other groups can employ it with confidence in the detailed study of DNA dynamics and we expect that the number of supporting results will only increase. 2. 2. Sequence-dependence and polymorphisms of B-DNA. So what is it that we actually learn from analyzing the conformation variability of DNA over its sequence space at the tetramer level? It is well established that different bps have different preferences regarding their internal geometries, and to some extent, Calladine’s set of heuristic rules is able to make sense of these differences. At the bps level, some sequences are extremely stable, such as ApT, and some sequences, such as CpG, have a bi-stable equilibrium and they convert between different arrangements of their internal geometries. There are cases where this frustration can be explained by their charge distribution, bulkiness or the strength of their stacking and h-bonding interactions, but in many cases in requires a more holistic view, taking higher-level sequence effects into account. In multi-microsecond MD simulations, intra-base-pair parameters are always unimodal since alternative states that might be accessed through base opening are not sampled in at this time scale. However, their ensemble averages show sizeable differences according to the change in sequence. Inter- base-pair parameters can be bimodal, but only in certain tetranulceotide combinations that make up about 5% of cases. This can be explained considering that the central bps of a particular combination of four nucleotides has a structural preference that is in conflict with those of its neighboring steps. In order to minimize the energy cost and satisfy as best as possible all conformational requirements, a more flexible bps will populate several states, usually a maximum of two. Optimization of geometries between several bps generally involve backbone rearrangements, with the sugar-phosphate acting as a hinge that allows consecutive bps to coordinate in a complex choreography often involving other factors, such as subtle changes in the solvent environment environment. In B-DNA the most important backbone transition is the BI/BII, which can be related to the base chemistry through the sequence-dependent relative strength of unconventional h-bonds that stabilize BII conformations. In a tetramer model of B-DNA, the backbone transitions of different tetramers are translated into motions along different internal degrees of freedom, depending on the sequence. Therefore, we are able now to build a picture of the interconnected conformational space of DNA as an overlap of tetranucleotide sequences with transferable structural descriptors. It is still a matter of speculation how these properties might be exploited by proteins and other binders for biological function. 3. Information transfer through the DNA. There are however a few special cases where the tetramer model does not seem to be sufficient. The CTAG is one such case that demonstrates that for a highly flexible and polymorphic tetramer, long-range sequence composition can have a notable effect on the structural properties of the central bps. Analyzing the mechanism behind this long-range communication through the DNA has meant more than anything else an opportunity to understand rare events of sequence modulation that might be a lot more general in cases of larger, induced distortions on the helix. In CTAG we could observe sequence influence not only from the hexamer level, but even from beyond, and the data points to a complex mechanism of information transfer across DNA through coordinated backbone movements. In performing biological function, DNA is often mistakenly viewed as an inert lattice onto which proteins assemble to replicate or transcribe genes. However, experiments demonstrate that information transfer in the DNA can happen even over long distances and can produce allosteric effects upon ligand binding. Without question, the binding of proteins or small molecules to the DNA can produce coupled conformational changes that may affect a neighboring binding site and increase its affinity for the secondary binding protein. Such changes need not alter ensemble averages and only potentiate modifications in the shape of the energy well at the secondary binding site. As seen from the dynamic information provided by an MD trajectory, maybe in more than one case of protein couples, DNA acts as a wire transmitting pulses of information originated at the primary binding site that travel to distant regions. We show that MD methods can provide reasonable explanations for cooperative binding phenomena on the DNA and open for the first time the possibility of the “allostery without conformational change” in the recruitment of proteins of the DNA scaffold. From a thermodynamic point of view, this type of cooperative binding seems to be entropy-driven. Thus, the first binding event freezes some of the degrees of freedom around it’s own binding region, but also reduces the entropy cost associated to the second binding.
1. Problema de exactitud del campo de fuerza La utilidad y aplicabilidad de las simulaciones de DM para modelar sistemas biomoleculares depende de su capacidad para muestrear suficientemente el espacio conformacional y la descripción correcta del potencial en términos de la forma funcional del campo de fuerza y el conjunto de parámetros. Claramente, el campo de fuerza define la forma del espacio conformacional para un conjunto dado de posiciones atómicas y también el acceso a los mínimos energéticos. Al simular sistemas en equilibrio, especialmente en sistemas bastante estables como el ADN, los campos de fuerza se esfuerzan por generar conjuntos que reproducen sistemas reales y no tiene por qué ser una gran desventaja con el poder de muestreo. En los últimos años, se ha convertido en tarea de los ingenieros informáticos y los desarrolladores de software abordar el problema de lograr escalas de tiempo largas y biológicamente relevantes. La convergencia y reproducibilidad de simulaciones de ADN atomístico con campos de fuerza de última generación, como nuestro parmbsc1, se ha demostrado de forma convincente. También parece que hasta llegar a una revolución significativa, donde los milisegundos de simulación se vuelven rutinarios, los rangos de muestreo actuales cubren por completo las estructuras internas y la dinámica de los ADN-B en esta escala de tiempo. La creciente confianza ha permitido a muchos investigadores utilizar DM para estudios muy detallados sobre la naturaleza dependiente de la secuencia de oligómeros de ADN y sobre el complejo arsenal de mecanismos que rigen su comportamiento. En cualquiera de estos estudios es necesaria una validación cuidadosa de los resultados ya que aún no está del todo claro qué tan bien y en qué grado se reproducen los efectos de secuencia en DM. El hecho de que la última generación de campos de fuerza coincida muy bien entre sí y que se ajusten a los escasos datos experimentales es seguramente muy alentador, pero pasará algún tiempo hasta que se puedan validar pequeñas diferencias en las geometrías de las secuencias. Nuestra propia validación extensiva del campo de fuerza parmbsc1, así como una gran cantidad de otros trabajos que, desde su publicación, se han establecido específicamente para evaluar su rendimiento, o simplemente lo han aplicado con éxito, hablan de una parametrización muy estable capaz de tratar con una amplia gama de ADN. Vale la pena mencionar que en condiciones especiales podrían ser necesarias pequeñas mejoras, lo que podría lograrse con la inclusión de términos de polarización. Sin embargo, hasta la fecha, ningún campo de fuerza ha sido capaz de modelar la polarización sin desestabilizar finalmente el sistema y esto a un costo enorme (un factor de 10) a la velocidad de cálculo. En resumen, con base en el notable desempeño de parmbsc1, nosotros y otros grupos podemos emplearlo con confianza en el estudio detallado de la dinámica del ADN y esperamos que el número de resultados de soporte solo aumente. 2. Dependencia de la secuencia y polimorfismos del ADN-B. Entonces, ¿qué es lo que realmente aprendemos al analizar la variabilidad de conformación del ADN sobre su espacio de secuencia a nivel de los tetrámeros? Está bien establecido que diferentes bps tienen diferentes preferencias con respecto a sus geometrías internas, y hasta cierto punto, el conjunto de reglas heurísticas de Calladine es capaz de dar sentido a estas diferencias. A nivel de bps, algunas secuencias son extremadamente estables, como ApT, y algunas secuencias, como CpG, tienen un equilibrio biestable y convierten entre diferentes disposiciones de sus geometrías internas. Hay casos en que esta frustración puede explicarse por la distribución de cargas, el volumen o la fuerza de sus interacciones de apilamiento y los puentes de hidrógeno, pero en muchos casos requiere una visión más integral, teniendo en cuenta los efectos de secuencia de más alto nivel. En simulaciones de DM de multi-microsegundos, los parámetros de pares intra-base son siempre unimodales ya que los estados alternativos a los que se puede acceder a través de la apertura de la base no se muestrean en esta escala de tiempo. Sin embargo, sus promedios de conjunto muestran diferencias considerables de acuerdo con el cambio en la secuencia. Los parámetros de pares de bases pueden ser bimodales, pero solo en ciertas combinaciones de tetranulceótidos que constituyen aproximadamente el 5% de los casos. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que el bps central de una combinación particular de cuatro nucleótidos tiene una preferencia estructural que está en conflicto con la de sus pasos vecinos. Con el fin de minimizar el costo de energía y satisfacer de la mejor manera posible todos los requisitos conformacionales, un bps más flexible poblará varios estados, generalmente un máximo de dos. La optimización de las geometrías entre varios bps generalmente implica reorganizaciones de la red troncal, con el azúcar fosfato actuando como una bisagra que permite la coordinación consecutiva de bps en una coreografía compleja que a menudo involucra otros factores, tales como cambios sutiles en el entorno del solvente. En los ADN-B, la transición principal más importante es BI/BII, que se puede relacionar con la química a través de la fuerza relativa dependiente de la secuencia de puentes de hidrógeno no convencionales que estabilizan las conformaciones BII. En un modelo de tetrámero de ADN-B, las transiciones de la cadena principal de diferentes tetrámeros se traducen en movimientos a lo largo de diferentes grados internos de libertad, dependiendo de la secuencia. Por lo tanto, ahora podemos construir una imagen del espacio conformacional interconectado del ADN como una superposición de secuencias de tetranucleótidos con descriptores estructurales transferibles. Todavía es una cuestión de especulación cómo estas propiedades podrían ser explotadas por proteínas y otras moléculas que se unen al ADN para diferentes funciones biológicas. 3. Transferencia de información a través del ADN. Sin embargo, hay algunos casos especiales en los que el modelo de tetrámero no parece ser suficiente. El CTAG es uno de esos casos que demuestra que, para un tetrámero altamente flexible y polimórfico, la composición de la secuencia de largo alcance puede tener un efecto notable sobre las propiedades estructurales del bps central. Analizar el mecanismo detrás de esta comunicación de largo alcance a través del ADN ha significado más que nada una oportunidad para comprender los raros eventos de modulación de secuencia que podrían ser mucho más generales en casos de distorsiones mayores e inducidas en la hélice. En CTAG pudimos observar la influencia de la secuencia no solo desde el nivel del hexámero, sino incluso más allá, y los datos apuntan a un complejo mecanismo de transferencia de información a través del ADN mediante movimientos coordinados de la cadena principal. En la realización de la función biológica, el ADN a menudo se considera erróneamente como un retículo inerte sobre el cual las proteínas se ensamblan para replicar o transcribir genes. Sin embargo, los experimentos demuestran que la transferencia de información en el ADN puede ocurrir incluso a largas distancias y puede producir efectos alostéricos sobre la unión al ligando. Sin lugar a duda, la unión de proteínas o moléculas pequeñas al ADN puede producir cambios conformacionales acoplados que pueden afectar a un sitio de unión vecino y aumentar su afinidad por la proteína de unión secundaria. Tales cambios no necesitan alterar los promedios del conjunto y solo potencian modificaciones en la forma del pozo de energía en el sitio de unión secundario. Como se ve a partir de la información dinámica proporcionada por una trayectoria de DM, tal vez en más de un caso de parejas de proteínas, el ADN actúa como un cable que transmite pulsos de información originados en el sitio primario de unión que viajan a regiones distantes. Mostramos que los métodos de DM pueden proporcionar explicaciones razonables para los fenómenos de unión cooperativa en el ADN y abren por primera vez la posibilidad de la "alostería sin cambio conformacional" en el reclutamiento de proteínas al ADN. Desde un punto de vista termodinámico, este tipo de enlace cooperativo parece estar impulsado por la entropía. Por lo tanto, el primer evento vinculante congela algunos de los grados de libertad alrededor de su propia región de unión, pero también reduce el costo de entropía asociado al segundo enlace.

The mitochondrial transcription factor A, TFAM, has a dual function in the organelle: it activates mitochondrial DNA transcription by binding to the HSP and LSP promoters, while in higher concentrations compacts the mtDNA. In this thesis the mechanism of complex formation between the mitochondrial transcription factor A (TFAM) and its cognate DNA binding sequences is analysed. TFAM is a DNA binding protein that belongs to the HMG- box family. Previous crystallographic works have shown that, by its two HMG-boxes and the intervening linker, TFAM binds to the DNA minor groove of mitochondrial DNA promoters imposing severe DNA distortions. These include two sharp 90-degree kinks that bend the cognate DNA into a U-turn. We here present the crystallographic structure of TFAM in complex with site Y, which together with site X are protein binding sites alternative to the promoter binding regions at the control region of mitochondrial DNA (mtDNA). The structure of the TFAM/site Y complex shows the two HMG-box domains (HMG-box1 and 2) organized in an “L”-shape fold that bends the contacted DNA by 90 degrees. Each HMG-box domain inserts a leucine, Leu 58 from HMG-box1 and Leu182 from HMG-box2, into a base-pair step from respective DNA contacted regions. The two DNA steps are separated by a DNA helix turn. Each insertion disrupts the DNA stacking and, together with additional interactions, facilitates the 90º DNA bending, the two bends resulting in the U-turn conformation. A structural comparison between available TFAM/DNA complexes shows that the linker between HMG-domains is instrumental for the protein to adapt to a conformation variability induced by the different DNA sequences. In addition, while all other crystal structures are unambiguous in the assigned DNA sequence, TFAM/site Y electron density maps indicated a surprising DNA disorder that suggested to trace the DNA in an alternative, not predicted, orientation. Thus in order to better characterize the binding mechanism of TFAM to the DNA and the role of the DNA properties in this process, we further studied the TFAM/site Y, TFAM/site X and TFAM/LSP complexes by molecular dynamics (MD) simulations, isothermal titration calorimetry (ITC) and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). All these techniques showed a recurrent result, which is that TFAM has a clear preference in binding and bending site Y over site X and LSP. The three DNAs present intrinsic distortions that facilitate binding, which occurs by a mechanism in all cases endothermic and spontaneous and TFAM presents similar affinities to all of them. However, site Y is intrinsically more rigid but easier to distort into the shape found in the crystal, it competes better for TFAM binding, and the enthalpy and entropy of binding are much higher than for the other two sequences. These results suggest a specific binding and bending mechanism significantly dependent on the DNA sequence. Finally, by multi-angle laser light scattering (MALLS) and analytical ultracentrifugation the multimerization ability of TFAM detected by EMSA and size exclusion chromatography was analysed. The results indicate multimerization of the protein either alone or on the DNA in a cooperative manner at increased complex concentrations, which is consistent with the alternative function of TFAM as an mtDNA packaging protein. Altogether, our results suggest that the DNA sequence properties mediate TFAM binding, involving either specific interactions at the mtDNA control region, or non-specific contacts during mtDNA compaction. For this latter, the regulation of TFAM binding exerted by the DNA sequence might be combined with regulation of protein multimerization processes, all together determining mtDNA compaction, which is essential for cell life.
Este trabajo de tesis doctoral está centrado en el análisis del mecanismo de unión del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) con sus secuencias de reconocimiento en la región control del ADN mitocondrial (mtADN). En la mitocondria TFAM está implicado en dos procesos fundamentales: la regulación de la trascripción del mtADN, cuando está unido a las secuencias promotoras del filamento ligero y pesado (HSP y LSP), y la compactación del mismo ADN cuando está presente en alta concentración. TFAM pertenece a la familia de los HMG-box y está constituida por dos dominios HMG conectados por un “linker” de 20 residuos. En este trabajo se presenta la estructura cristalográfica de TFAM en complejo con su sitio de reconocimiento alternativo a los promotores, site Y. Desde el análisis de la estructura se ha evidenciado que TFAM presenta el mismo plegamiento observado también cuando está en complejo con LSP, HSP, ADN no específico (nsADN) y su otro sitio de unión site X. Además en todos estos complejos el ADN resulta doblado 180° por medio de dos inserciones mediadas por LEU58 y 182, cada una responsable de un “kink” de 90°. La diferencia principal entre todas las estructuras se observa a nivel del linker que presenta una desviación en respuesta a las diferentes propiedades de los ADNs que contacta. Para caracterizar mejor el mecanismo de unión de TFAM con sus secuencias de reconocimiento en la región control del mtADN (LSP, site Y and site X), se realizaron diferentes análisis de tipo biofísico y bioquímico. La flexibilidad de estas secuencias se estudió primero por dinámica molecular. Estudios de “isothermal titration calorimetry” y “electrophoresis mobility shift assays” permitieron evidenciar que también si TFAM tiene el mismo mecanismo de unión y la misma afinidad por las tres secuencias, la cinética de formación de los complejos parece ser diferente. Para el análisis de la estequiometria de la unión de TFAM a los diferentes ADN fueron empleadas las técnicas de “multi angle laser light scattering” y “analytical ultracentrifugation”. Estos estudios evidenciaron la tendencia de TFAM de multimerizar, en presencia y ausencia de ADN, en respuesta a aumento de su concentración.

El objetivo general de esta tesis doctoral fue el desarrollo de biosensores basados en aptámeros para la detección de bacterias enteropatógenas. Para ello se estudiaron diferentes estrategias de detección gracias a las propiedades únicas de los aptámeros, tales como su capacidad de adoptar diferentes estructuras conformacionales tras el enlace con la molécula diana, su estabilidad y la facilidad con que se pueden modificar químicamente, introduciendo marcajes o ciertos grupos funcionales. Las bacterias utilizadas en todas las estrategias de detección fueron: Salmonella typhimurium (diana del aptámero seleccionado, específicamente las proteinas transportador ABC, OmpA y precursor OmpD), Eschericia coli O157 Shiga, Shigella sonnei, Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea. En la primera fase de la tesis se realizó la caracterización de la bacteria Salmonella typhimurium y de la afinidad del aptámero por este microorganismo. La afinidad del aptámero por la bacteria se comprobó utilizando las técnicas de impresión por microcontacto (μCP), la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la microscopía de fluorescencia. Posteriormente en la fase siguiente se desarrolló un sistema de detección basado en partículas magnéticas como plataforma de captura, preconcentración y detección basada en un ensayo competitivo indirecto. Se llevó a cabo la detección colorimétrica, por absorbancia, y electroquímica, por voltametría de pulso diferencial (DPV). En ambas alternativas de detección se observó reactividad cruzada de la bacteria Salmonella typhimurium con E. coli O157 Shiga y con Shigella sonnei, no presentándose dicha reactividad con las otras bacterias. El porcentaje de similitud de las proteinas diana análogas fue mayor en relación a las proteinas correspondientes a E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei, y menor respecto a las proteinas análogas de las otras bacterias. En la tercera fase de la tesis se desarrollaron dos biosensores electroquímicos. Uno basado en la detección directa del enlace con la bacteria por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). El otro biosensor se basó en la inhibición enzimática causada por el cambio conformacional del aptámero tras su enlace con la bacteria. En este caso se utilizó la técnica electroquímica DPV para medir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Con el primero se lograron los mejores resultados, por cuanto los parámetros de comportamientos fueron los mejores (menor LOD, mayor sensibilidad, menor tiempo de análisis), pero además es una estrategia en la cual la construcción del aptasensor es simple puesto que consta de un solo paso. Finalmente los ensayos de selectividad llevados a cabo en todas las estrategias de detección muestran que todos los sistemas de detección fueron capaces de discriminar el grupo de bacterias clasificadas como enteropatógenos (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga y Shigella sonnei) del resto de bacterias (Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea), demostrando que la afinidad del aptámero por Salmonella typhimurium no es específica para esta bacteria, sino que también existe una afinidad equivalente por E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei.
The overall objective of this Thesis was to develop different biosensors based on aptamers to detect enteropathogen bacteria. This objective was accomplished through the study of different detection strategies which were proposed based on the unique properties of aptamers such as the capacity to present different conformational structures after linking to the target molecule, stability and ease of chemical functionalization. The affinity of the aptamer against the Salmonella typhimurium was confirmed by Microcontact Printing (μCP), Atomic Force Microscopy (AFM) and Fluorescence Microscopy. Then, a magnetic particle detection system was developed as a capture, pre-concentration and detection platform based on an indirect competitive test. Colorimetric and electrochemical detection, using differential pulse voltammetry (DPV) were performed. In both detection alternatives, cross-reactivity of Salmonella typhimurium with Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei was observed, with no cross- reactivity with Proteus mirabilis, Bacillus cereus, Kocuria lutea and Escherichia coli k5. In the next phase of the thesis, two electrochemical biosensors were developed, one based on the direct detection of the binding to the bacterium by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and the other based on the enzymatic inhibition caused by the conformational change of the aptamer after binding with the bacterium. In the second case the DPV technique was used to measure the activity of alkaline phosphatase. The best results were obtained with the impedance biosensor because as it showed improved behavior parameters (lower LOD, higher sensitivity and shorter analysis time). In addition, the construction of the aptasensor is simple as it consists of a single step. Selectivity tests carried out on all detection strategies showed that the developed detection systems were able to discriminate the bacterial group classified as enteropathogens (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga and Shigella sonnei) from other bacteria (Escherichia coli K5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus and Kocuria lutea). Hence, the affinity of the aptamer for Salmonella typhimurium is not specific for this bacterium and there is also an equivalent affinity for E. coli O157 Shiga and Shigella sonnei.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
O trabalho de investigação desenvolvido teve como objectivo o estudo das interacções não covalentes de um grupo de porfirinas catiónicas, quatro bases livres e uma metalada, com hélices duplas constituídas por sequências de desoxirribonucleotídeos, de 6 a 12 bases, auto-complementares e não auto-complementares, diferindo entre si no tipo de bases e na respectiva sequência, utilizando Espectrometria de Massa com Ionização por Electrospray. Os aductos oligonucleotídeo-porfirina foram formados por electrospray em condições optimizadas. A caracterização destes aductos foi efectuada através de experiências de Espectrometria de Massa Tandem com Ionização por Electrospray, tendo-se detectado para os aductos [ds + porfirina]n- com as porfirinas com o maior número de cargas, a formação de fragmentos resultantes de perdas de ambas as cadeias das dupla hélices Os resultados obtidos indicam que, nas condições experimentais usadas, a ligação dos aductos [ds + porfirina]n- é predominantemente electrostática, estando as porfirinas ligadas à superfície da cadeia dupla e não intercaladas. O número de cargas das porfirinas é um factor muito importante na estabilidade daqueles aductos, que aumenta com o aumento daquelas, não se tendo observado variações significativas do comportamento daqueles aductos para diferentes motivos (AT ou GC) das hélices duplas. Os resultados obtidos no estudo dos aductos [ds + 2 porfirina]nconfirmam a estabilização dos aductos com o aumento do número de carga das porfirinas e a importância das repulsões/atracções electrostáticas na formação de aductos não-covalentes. A investigação de outras estruturas secundárias como “hairpins”, triplexes e quadruplexes e dos seus aductos com as porfirinas, foi também efectuada. Os resultados obtidos indicam que, nas condições experimentais utilizadas, a formação de estruturas do tipo “hairpin”, é muito pouco provável. No caso dos triplexes, quadruplexes e dos aductos das porfirinas com os triplexes, os dados obtidos permitem propor mecanismos específicos para a sua formação, sendo a abundância de cada espécie formada resultante do balanço de vários processos competitivos de associação e dissociação. ABSTRACT: The main goal of the present work was to investigate the non covalent interactions of a group of cationic porphyrins, four free bases and one complex, with double-stranded oligonucleotides, from sixmers to twelvemers, both self and non-self complementary, with different types of bases and sequences, using Electrospray Mass Spectrometry. The oligonucleotide-porphyrin adducts were formed by elecrospray in optimized conditions. The characterization of these adducts was done by Electrospray Tandem Mass Spectrometry. For the [ds + porphyrin]nadducts, with the porphyrins with a higher number of charges, the formation of fragment ions by losses from both strands was a novel feature observed. The results show that, in the experimental conditions used, the binding of the [ds + porphyrin]n- adducts is predominantly of an electrostatic nature, and also that the porphyrins are bound to the surface and not intercalated. The number of the charges of the porphyrins is an important factor in the stability of these adducts and significant changes in their behaviour were not observed when the motifs (AT or GC) of the double strand were different. The study of the [ds + 2porphyrin]n- adducts confirmed the stabilization of these type of structures with the number of charges of the porphyirns and the importance of the electrostatic interactions in the formation of non covalent adducts. The study of other secondary structures such as hairpins, triplexes and quadruplexes and of their adducts with the cationic porphyrins, was also implemented. The results show that, in the experimental conditions used, the formation of structures involving hairpins is not very probable. In the case of triplexes, quadruplexes and porphyrin-triplex adducts, the data obtained allowed the proposal of specific mechanisms for their formation, the abundance of each species formed being the result of the balance of several association /dissociation processes

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
Uma partícula viral é um elemento genético não celular que depende de uma célula para se replicar, uma vez que é metabolicamente inerte e não desempenha funções de biossíntese nem respiratórias. No seu estado extracelular é uma partícula submicroscópica composta por uma molécula de ácido nucleico, RNA ou DNA, envolvida por proteínas e, em certos casos, por outras macromoléculas. O genoma viral é pequeno e, de um modo geral, codifica apenas componentes metabólicos e estruturais que não podem ser adaptados do hospedeiro, o que torna a sua replicação, transcrição e tradução altamente dependente da maquinaria celular: o vírus redirecciona funções metabólicas e a maquinaria celular preexistente para se multiplicar e dar origem a novas partículas infecciosas - viriões. O genoma de muitos vírus de DNA, como é o caso do herpes vírus, é dirigido para o núcleo da célula infectada, onde interage com a maquinaria do hospedeiro, capaz de transcrever o DNA viral em mRNA que, por sua vez, é traduzido em proteínas virais pelos tRNAs, ribossomas e factores de tradução celulares. Surpreendentemente, o genoma do gama–herpes vírus-68 murino (MHV-68), contrariamente a outros vírus, codifica oito sequências do tipo tRNA –vtRNAs– expressos em níveis elevados durante as fases de infecção lítica e de latência. Estas moléculas são processadas em tRNAs maduros, com adição póstranscripcional do terminal 3’CCA mas, no entanto, não são aminoaciladas pelas aminoacil-tRNA-sintetases da célula infectada, indicando que não devem participar nas vias de síntese proteica. Até à data, a função biológica desempenhada pelo vtRNAs permanece desconhecida. O principal objectivo do presente trabalho foi contribuir para elucidar a função biológica e caracterização molecular dos vtRNAs codificados pelo genoma do vírus MHV -68. Numa primeira fase, recorrendo a estudos de bioinformática, o alinhamento das sequências nucleotídicas dos vtRNAs revelou a presença de um motivo semi-conservado na região do loop D dos oito vtRNAs. Uma pesquisa de sequências homólogas a este motivo, numa base de dados, detectou que a mesma sequência nucleotídica também está presente e conservada na região do loop D de tRNAs mitocondrialmente importados de protozoários. Além disso, verificou-se que, em Leishmania, esta sequência conservada – UGGYAGAGC – é necessária e suficiente à importação dos tRNAs para a mitocôndria. Assim, numa segunda fase do trabalho, foi proposto e investigado se o motivo semi-conservados no loop D dos tRNAs virais actua como um sinal capaz de dirigir in vivo, os vtRNAs para as mitocôndrias de células infectadas por MHV -68. Os resultados indicam que não existe um mecanismo de importação para a matriz mitocondrial dos vtRNAs. Por último, com o intuito de criar um novo modelo, facilmente manuseável, para o estudo das características e funções dos vtRNAs, Saccharomyces cerevisiae foi transformada com o vector pRS426, contendo as sequências codificantes para os vtRNAs1, 2, 3, 4 e 5. Os resultados revelam que os vtRNAs podem ser expressos em levedura e indicam que estas moléculas têm um comportamento semelhante ao que apresentam quando são expressas em células infectadas pelo vírus MHV -68.
A virus particle is a noncellular genetic element that relies on the host cell for its own replication since it is metabolically inert and does not carry out respiratory or biosynthetic functions. In the extracellular state it is a submicroscopic particle containing nucleic acid, DNA or RNA, surrounded by proteins and occasionally containing other macromolecular components. Viral genomes are very limited in size and they encode primarily those functions that they cannot adapt from their hosts. Therefore, during reproduction inside a susceptible cell, there is a heavy dependence on host-cell structural and metabolic components. The virus redirects pre-existing host machinery and metabolic functions necessary for virus replication. The DNA genome of most DNA-containing viruses, such as herpes viruses, ends up in the cell nucleus where it interacts with the host machinery for transcribing mRNA, which is translated into viral proteins by the host cell ribosomes, tRNAs and translation factors. Surprisingly the Murine gammaherpesvirus-68 (MHV-68) genome encodes eight novel tRNA-like sequences– vtRNAs - expressed to high levels during both latent and litic infection and constituted the first report of tRNA-like sequences encoded by a virus of eucaryotes. These vtRNAs are processed into mature tRNAs with post-transcriptionally added 3’CCA termini but they are not aminoacylated by aminoacil-tRNA synthetases present in the infected cell. Therefore the biological function that these vtRNAs may fulfil is currently unclear. The aim of the present work was to contribute for the biological and molecular characterization of novel vtRNAs encoded by MHV -68. In the first stage of this study, using bioinformatic tools, the alignment of the nucleotide sequences of the vtRNAs revealed a shared semi-conserved motif, present in the D arm, and homology searches of this sequence against a database showed that this motif is also present and conserved in the D arm of protozoa tRNAs mitochondrialy imported. Besides that, in Leishmania, this conserved sequence is necessary and sufficient for import of tRNAs into mitochondria. Therefore it was proposed and investigated that the short semi-conserved motif in the D arm of vtRNAs acts as a targeting sinal and directs in vivo the import of vtRNAs into mitochondria of MHV-68 infected cells. According to the results it doesn’t appear to exist an import mechanism of MHV-68 vtRNAs into mitochondria. Finally, in order to create a new easy to handle model, for the study of the function and features of vtRNAs, Saccharomyces cerevisiae was transformed with a pRS426 vector containing the vtRNAs 1, 2, 3, 4 and 5. The results proved that vtRNAs are expressed in yeast and it seems that these molecules have the same behaviour as when they are expressed during an in vivo infection.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Considered the most destructive disease of rice (Oryza sativa), the blast caused by the fungus M. oryzae is of concern worldwide. Because the pathogen staying power in the soil and crop residues for long and indeterminate periods is essential monitoring before the pathogen's entry into new areas, due to the commitment of nearby plantations. The seeds are considered the main ways of spread of disease due to storage, transportation and introduction into harmless areas. The methodology currently recommended by the Ministry of Agriculture for fungi monitoring seed is the "Blotter test", however, the morphological characterization can often be uncertain due to the rapid growth of fungal invasion and the similarity between structures of some pathogens. Morphologically M. oryzae can be indistinguishable from some species, such as the causal agent of rice blast wheat and other grasses therefore the most adequate way for safe diagnosis is the molecular detection. In seeds percentage infestation is often low, which is nevertheless important because the seed of transmission capacity for the seedling, however small conidia concentrations may be insufficient for the molecular detection by techniques potentially used as PCR (Polymerase Chain Reaction). Technically a methodology for molecular amplification isothermal LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification) simpler recently been developed, which allows to safely identify the target, due to the projection of specific primers based on exclusive regions of the genome of the organism. The technique has advantages as high sensitivity due to the recognition by the initiators of six regions of the target, in addition to specificity, speed and security in the diagnosis. It is important to consider the cost reduction compared with PCR, due to use of constant temperature and straightforward interpretation of results using turbidity generated in positive samples or color change if the addition of dyes, eliminating the use of devices, specialized professionals in handling high standard laboratories. The interpretation the results with the naked eye makes the seed control in environments such as laboratories, warehouses, cooperatives with minimal structure, reflecting positively on the proper targeting of lots, either for planting, consumption or disposal. Therefore, the aim of this study was to survey the main potentially destructive pathogenic fungi found in seeds, and develop a rapid detection kit by LAMP methodology for M. oryzae.
Considerada a doença mais destrutiva do arroz (Oryza sativa), a Brusone, causada pelo fungo Magnaporthe. oryzae é motivo de preocupação no mundo todo. Devido a capacidade de permanência do patógeno no solo e em restos culturais por longos e indeterminados períodos é essencial o monitoramento perante a entrada do patógeno em novas áreas, em razão do comprometimento dos próximos plantios. As sementes são consideradas as principais formas de disseminação da doença devido à capacidade de armazenamento, transporte e introdução em áreas indenes. A metodologia atualmente recomendada pelo Ministério da Agricultura para monitoramento de fungos em sementes é o “Blotter test”, entretanto, a caracterização morfológicapode muitas vezes ser incerta devido à invasão de fungos de crescimento rápido e a semelhança entre estruturas de alguns patógenos. Morfologicamente M. oryzae pode ser indistinguível de algumas espécies, como é o caso do agente causal da brusone de diversas gramíneas, portanto, a maneira mais adequada para diagnose segura é a detecção molecular. Em sementes, a porcentagem de infestação muitas vezes é baixa, o que não deixa de ser importante devido a capacidade de transmissibilidade da semente para a plântula, no entanto as pequenas concentrações de conídios podem ser insuficientes para a detecção molecular, por meio de técnicas potencialmente utilizadas como a PCR (Reação Polimerase em Cadeia). Tecnicamente mais simples, recentemente foi desenvolvida uma metodologia de amplificação molecular isotérmica LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), que permite identificar de forma segura o alvo, em decorrência da projeção de iniciadores específicos, baseados em regiões exclusivas do genoma do organismo. A técnica apresenta vantagens como, alta sensibilidade devido ao reconhecimento pelos iniciadores de seis regiões do alvo, além da especificidade, agilidade e segurança no diagnostico. È importante considerar a redução de custos em comparação com a PCR, devido ao uso de temperaturas constantes, e interpretação direta dos resultados por meio da turbidez gerada em amostras positivas, ou mudança de coloração no caso da adição de corantes, dispensando o uso de aparelhos, profissionais especializados e manuseio em laboratórios de alto padrão. A intepretação dos resultados a olhos nus facilita o controle de sementes em ambientes como laboratórios, armazéns, cooperativas com estrutura mínima, refletindo positivamente sobre o direcionamento adequado de lotes, seja para o plantio, consumo ou descarte. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento dos principais fungos patogênicos potencialmente destrutivos encontrados em sementes, e desenvolver um kit de detecção rápida por meio da metodologia LAMP para M. oryzae.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013.
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Agentes que possam interagir e/ou clivar a molécula de DNA possuem uma grande importância devido a sua potencial aplicação antitumoral ou ainda como antibióticos. Vários compostos de coordenação clivam o DNA de forma oxidativa. Porém este mecanismo de clivagem possui uma grande desvantagem por afetar as biomoléculas de forma indiscriminada e aleatória, o que é indesejável em aplicações bioquímicas ou mesmo em estudos de interação com DNA.Desta forma é absolutamente necessário nestes estudos o desenvolvimento de compostos que possam clivar o DNA através de um mecanismo hidrolítico. Algumas metalonucleases naturais fazem uso de íons metálicos em seus sítios ativos de modo a se beneficiar das características desses metais. Dentre elas podem-se destacar a acidez de Lewis que pode ser usada na ativação do átomo de fósforo bem como na formação de um nucleófilo em condições de pH fisiológico. No caso de nucleases binucleares os centros metálicos podem atuar na orientação do nucleófillo em relação ao substrato de modo a facilitar a hidrólise da ligação fósforo-diester.Inspirados nestas metalonucleases vários complexos modelo foram desenvolvidos visando a clivagem hidrolítica do DNA, porém em sua maioria não possuem seletividade quanto ao sítio de clivagem, sendo o grande desafio atual o aumento da seletividade de interação compexo-DNA. Uma estratégia que vem sendo utilizada é a inserção de grupos intercalantes, que interagem com o sulco maior ou menor do DNA. Estes grupos serviriam então como direcionadores, o que pode gerar um grande aumento da atividade de clivagem, bem como na seletividade.Considerando o exposto, o objetivo principal deste trabalho é sintetizar e caracterizar novos ligantes contendo grupos intercalantes e seus complexos metálicos (sistemas conjugados) que apresentem as características requeridas para o estudo de interação e clivagem eficiente de ácidos nucléicos.

Abstract : Agents that can interact and / or cleave the DNA molecule have a great importance due to their potential application as antibiotics or antitumor drugs. Several coordination compounds cleave DNA oxidatively. However, this cleaving mechanism has a great disadvantage because it affects the biomolecules indiscriminately and random, which is undesirable in applications or even biochemical studies of interaction with DNA.Thus, it is necessary in these studies to develop compounds that can cleave DNA by a hydrolytic mechanism. Some natural metallonucleases make use of metal ions in their active sites in order to benefit from the characteristics of these metals. Among them we can emphasize the Lewis acidity which can be used in activating the phosphorus atom as well as the formation of a nucleophile under conditions of physiological pH. In the case of the binuclear metal centers nucleases can act in nuclephile orientation relative to the substrate in order to facilitate hydrolysis of the phosphorus-diester.Inspired in these metallonucleases, various biommimetic models were developed to hydrolytic cleavage of DNA, but mostly lack selectivity regarding cleavage site, and the current challenge increased selectivity complex-DNA interaction. One strategy that has been used is the insertion of intercalating groups that interact with the major or minor groove of DNA. These groups then serve as drivers, which can generate a large increase in cleavage activity and selectivity.Considering the above, the main objective of this work is to synthesize and characterize new ligands containing intercalating groups and their metal complexes (conjugated systems) having the characteristics required for the study of interaction and efficient cleavage of nucleic acids.

Molt sovint les seqüències de DNA repetitives adopten conformacions diferents a l'habitual estructura de B-DNA. Aquestes conformacions alternatives afecten esdeveniments genètics fonamentals, com poden ser la replicació, la transcripció, la reparació i la recombinació del DNA, induint inestabilitat en el genoma i, en darrer terme, conduint a diferents malalties. En les patologies neurològiques causades per l'expansió de repeticions de triplets, aquestes seqüències repetitives poden adoptar estructures inusuals en el DNA, mentre que els trànscrits de RNA poden, en alguns casos, estructurar-se en forma de llargues forquetes (hairpins) amb bases desaparellades, les quals es troben implicades en la patogènesi dels trastorns. L'ús d'oligonucleòtids curts com a models per analitzar les conformacions de llargues cadenes de DNA i RNA es veu obstaculitzat per la baixa estabilitat, tant estructural com tèrmica, dels primers en comparació amb els àcids nucleics nadius. En aquest sentit, la incorporació de restriccions conformacionals als models d'oligonucleòtids pot facilitar el seu estudi estructural. El nostre objectiu ha estat el desenvolupament de diferents eines químiques que redueixin la variabilitat conformacional dels oligonucleòtids sintètics amb seqüències repetitives, en particular els formats per les repeticions dels triplets CTG i CUG implicats en la distròfia miotònica. La primera aproximació que vam dur a terme per tal d’introduir restriccions conformacionals va consistir en la ciclació d’oligonucleòtids en fase sòlida, però va resultar infructuosa. A continuació, vam intentar una estratègia de ciclació assistida per motlle, on les guanosines del precursor lineal van ser parcialment protegides per així evitar la hibridació amb el motlle. Aquesta aproximació va requerir la preparació d'un nou derivat fosforamidit de la guanosina, en el qual la nucleobase es trobava protegida tant en N2 com en O6. Usant aquesta estratègia vam poder preparar amb èxit un 42mer cíclic, el qual contenia catorze repeticions del triplet CUG i on part de les guanines es trobaven parcialment protegides. No obstant això, les condicions per a la desprotecció final de les guanines no van poder ser totalment optimitzades. Una segona aproximació per tal de reduir la variabilitat conformacional dels àcids nucleics, de la qual es troben descrits nombrosos precedents, és la introducció d'entrecreuaments en els oligonucleòtids. En aquest sentit hem dissenyat i desenvolupat un mètode senzill i eficaç per introduir un entrecreuament entre les cadenes complementàries d'un dúplex. Aquest enllaç covalent no natural no pertorba de forma significativa l'estructura de B-DNA i augmenta de manera important l'estabilitat tèrmica dels dúplexs. A més a més, l'entrecreuament és reversible, podent-se eliminar si així es desitja, sent aquesta reversibilitat una de les propietats desitjades en tals unions.
Quite often, non-B DNA structures are constituted by repetitive DNA sequences. These alternative conformations affect key genetic events such as DNA replication, transcription, recombination and repair, inducing genome instability and eventually leading to human diseases. In the neurological diseases caused by triple repeat expansions, these repeats form unusual non-B DNA structures and, in some cases, long mismatched hairpins of the RNA transcripts are involved in the pathogenesis of the disorders. Use of short oligonucleotide models to get insight into the conformations of large DNAs and RNAs is hampered by the low structural and thermal stability of the former as compared to the native nucleic acids. Therefore, the incorporation of conformational constraints into the oligonucleotide models may facilitate their structural study. Our aim has been to develop chemical tools that reduce the conformational space accessible to synthetic oligonucleotides, in particular those formed by the CTG and CUG triple repeats involved in myotonic dystrophy. Our first approach to introduce conformational constraints was solid-phase cyclization, but it proved impractical. We then tried a template-assisted cyclization approach, where the guanosines of the linear precursor were partially protected to prevent hybridization with the template. This required preparation of a new guanosine phosphoramidite derivative in which the nucleobase was both N2- and O6-protected. This approach successfully furnished a partially guanine-protected cyclic 42mer containing fourteen CUG repeats. However, conditions for the final guanine deprotection could not be completely optimized. The second, well-established approach to reduce the conformational mobility of nucleic acids is to form cross-links. We have devised and developed a straightforward method to introduce a cross-link between the complementary chains of a duplex. The nonnatural covalent linkage did not significantly perturb B-DNA structure and dramatically increased the thermal stability of the duplex. Additionally, the cross-link is reversible, which is one of the desired properties of such unions.

Mestrado em Microbiologia Molecular
O fenótipo maligno exibido pelos vírus do papiloma humano de alto-risco (HPV-16 e HPV-18) depende da expressão de dois oncogenes, E6 e E7. Quando o controlo de expressão da E6 é perdido, ocorre a imortalização das células infectadas por estes vírus e em consequência um processo oncogénico. O principal objectivo deste trabalho é determinar, no modelo levedura, se a proteína E6 interfere com a resposta normal das células a situações de “stress”, por interacção com a maquinaria bioquímica de regulação celular. Uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae, W303-1A, foi transformada com o vector pYES2, onde se inseriu o gene E6 marcado com a sequência FLAG. A sensibilidade desta estirpe, a altas temperaturas, à feromona e à cafeína foi comparada com as estirpes controlo, W303-1A e W303- 1A.pYES2 (estirpe controlo com o plasmídeo vazio). A incubação das estirpes à temperatura permissiva de 41 ºC durante 6 horas revelou que, ao contrário das estirpes controlo, a estirpe W303-1A pYES2.E6 não apresenta uma redução de viabilidade celular. No entanto, este fenótipo termotolerante só é observável quando há níveis de proteína E6 detectáveis por Western-blot utilizando os anticorpos anti-FLAG M2. A quantificação dos níveis de expressão relativa do gene E6 mostra que a expressão desta proteína é interrompida quando as células são colocadas a 41 ºC. Portanto, o fenótipo termotolerante depende da proteína expressa e sintetizada durante o crescimento normal a 30 ºC, que se mantém activa durante pelo menos as 4 horas iniciais de incubação a 41 ºC. A estirpe que expressa a proteína E6 apresenta uma resposta alterada ao factor-? . Assim, observou-se que a feromona não induz a paragem do ciclo celular que ocorre nas estirpes controlo. Por outro lado, em relação às estirpes controlo, a estirpe W303-1A.pYES2.E6 apresenta uma taxa superior de alteração morfológica (“shmoos”). Este resultado sugere que a oncoproteína E6 actua de forma diferencial na via de sinalização que responde à presença de feromona inibindo a paragem de crescimento e activando a via que regula as alterações morfológicas. A cafeína, um agente que afecta a integridade da parede celular, a partir da concentração 10 mM impede o crescimento das estirpes controlo W303-1A e W303-1A pYES2. No entanto a estirpe W303-1A pYES2.E6 é capaz de crescer até 20 mM de cafeína. Este resultado parece indicar que esta oncoproteína poderá interferir com via de sinalização mediada pela proteína cinase C, ou com algum regulador desta via. A construção de um sistema “yeast two-hybrid” utilizando a estirpe PJ69-4A, mostrou que a E6 funciona como um activador transcripcional nesta estirpe de levedura, revelando a existência de alvos moleculares de interacção da oncoproteína E6 com o genoma de levedura. Neste trabalho é descrito pela primeira vez que a proteína E6 é capaz de, numa célula eucariota, antagonizar a tendência para a morte celular, independentemente da presença de p53. Revela-se ainda a possibilidade de uma oncoproteína viral poder interagir com a maquinaria bioquímica da levedura, tornando-a mais resistente a situações adversas.
The malignant phenotype of the high-risk human papilloma virus (HPV-16 and HPV-18) mainly depends on the expression of two viral genes, E6 and E7. If control of E6 is lost, this protein can trigger immortalization of cells and cancer. The main objective of this study was to determine, in the yeast model, if the protein E6 interferes with the physiological response to stress situations by interacting with biochemical machinery of cellular regulation. The strain W303-1A of Saccharomyces cerevisiae, was transformed with the vector pYES2, carrying the gene E6 tagged with FLAG sequence. The sensibility of this transformed strain to high temperature, to pheromone and to caffeine, was compared with the sensibility of the control strains W303- 1A and W303-1A pYES2 (empty plasmid). The incubation of the strains to a permissive temperature of 41 ºC during 6 hours revealed that, in contrast to the control strains, the strain W303-1A pYES2.E6 does not show a marked decreased in cell viability. Nevertheless, this thermotolerant phenotype is only observed when, intracellularly, there are levels of protein E6 detectable by Western Blot analysis using antibodies anti- FLAG M2. The levels of expression of the gene E6, measured by real time PCR, showed that E6 expression is stopped when the cells are transferred to 41 ºC. It can be concluded that the thermotolerant phenotype is dependent upon the expression and synthesis of E6 protein during the normal growth at 30 ºC. Apparently, this protein remains “active” during the first 4 hours of incubation at 41 ºC. The strain W303-1A pYES2.E6 presented an anomalous response to the presence of pheromone, the ? -mating factor. In that strain the pheromone does not blocks the cell cycle. However, the strain W303-1A pYES2.E6 presented a higher rate of shmoo formation. These results indicated that the oncoprotein E6 acts in different targets of the pathway that controls the response to pheromone, preventing the cell cycle arrest and over-stimulating the morphological alterations. Caffeine, a drug that affects the yeast cell wall integrity, prevented the cell growth of control strains at concentrations above 10 mM. The strain W303- 1A.pYES2.E6 was able to grow up to 20 mM caffeine. It was concluded that the E6 protein interacts with the PKC1 MAPkinase pathway or with some regulator of this pathway. The construction of a yeast two-hybrid system, albeit failing to provide information about specific molecular targets, showed that E6 functions as a transcriptional activator of the yeast S. cerevisiae genome. These work reports, for the first time, that a viral oncoprotein, once successfully expressed, interacts with the biochemical machinery of the yeast S. cerevisiae, resulting in a strain more resistant to adverse conditions.

Introducción: Los pacientes con patología aórtica abdominal (aneurismática u obstructiva) poseen una disfunción endotelial que se ve agravada en el momento de la cirugía por el clampaje-desclampaje. La lesión por isquemia-reperfusión conlleva unas consecuencias funcionales como una merma en la síntesis endotelial de óxido nítrico (NO), activación de sistemas celulares, cascada inflamatoria y estrés oxidativo.Objetivos: Determinar los cambios de la hemodinámica, perfusión, equilibrio ácido-base, metabolismo anaerobio y estado oxidativo en los territorios sistémico y esplácnico durante la cirugía de aorta abdominal y la influencia de una dieta inmunomoduladora rica en arginina, ácidos grasos ω3, nucleótidos y antioxidantes sobre la perfusión esplácnica.Material y método: Ensayo clínico, prospectivo, aleatorizado, abierto y controlado donde se incluyeron 40 pacientes programados para cirugía reconstructiva de aorta abdominal (aneurismática y/o obstructiva). Veintidós pacientes fueron asignados a una dieta inmunomoduladora (dieta tratamiento -Impact Oral-) mientras que otros 18 recibieron una dieta isocalórica e isonitrogenada (dieta control -Isosource Protein-) durante los siete días previos a la intervención. Se determinó la frecuencia cardiaca, presión arterial media, presión venosa central, pH, exceso de bases (EB), lactato, índice de extracción de oxígeno (IEO2) y marcadores oxidativos (superóxido dismutasa, glutation reductasa y estado antioxidante total) en aurícula derecha (AD), vena mesentérica inferior (M) y vena suprahepática (SH) en situación preclampaje, postclampaje, postdesclampaje y al ingreso en UCI.Resultados: Las principales variaciones hemodinámicas fueron al ingreso en UCI. El clampaje motivó un aumento del IEO2, un descenso del pH, mayor déficit de bases y un leve incremento del lactato. Tras el desclampaje se apreció el mayor aumento del lactato, así como un mayor descenso del pH. Las variables oxidativas sufrieron escasas modificaciones. La dieta tratamiento motivó un mayor IEO2 en AD al ingreso en UCI y menor nivel de lactato en SH postclampaje. Los niveles de arginina y NO tras 7 días de suplementación, no experimentaron modificaciones.Conclusiones: La cirugía aórtica determina cambios notables en el pH, EB, IEO2 y lactato a nivel sistémico y regional, al contrario que el estado oxidativo. La dieta tratamiento posee escasa influencia sobre las distintas variables estudiadas.
Introduction: Patients with an abdominal aortic pathology (aneurysm or obstructive) have an endothelial dysfunction which is seen to be aggravated at the moment of clamping/unclamping surgical maneuvers. The ischemia-reperfusion injury implies functional consequences such as a reduction of endothelial synthesis of nitric oxide (NO), activation of cellular systems, inflammatory cascade and oxidative stress. Objectives: To determine the hemodynamic, perfusion, acid-base equilibrium, anaerobic metabolic and oxidative state changes in the systemic and splanchnic areas during abdominal aorta surgery, and the influence of an immune-enhancing diet rich in arginine, ω3 fatty acids, nucleotides and antioxidants on splanchnic perfusion.Material and methodology: By clinical trial through a randomized, open and controlled prospective study, in which 40 patients scheduled for reconstructive surgery of the abdominal aorta (aneurysm and/or obstructive). 22 patients were given an immune-enhancing diet (treatment diet -Impact Oral-) while the remaining 18 were given an isocaloric and isonitrogenous diet (control diet -Isosource Protein-) for seven days prior to intervention. The heart rate, mean arterial pressure, central venous pressure, pH, bases excess (BE), lactate, the oxygen extraction rate (O2ER) and oxidative markers (superoxide dismutase, glutathione reductase and the total antioxidant state) in the right atrium (RA), the inferior mesenteric vein (M) and hepatic vein in a preclamping, postclamping, unclamping situations and ICU admission were assessed.Results: The hemodynamic variations were from ICU admittance. Clamping caused an increase of O2ER, a pH decrease, a great lack of bases, and a slight increase of lactate. After unclamping, you can notice the greatest increase of lactate and decrease of pH. The oxidative variables hardly underwent any changes. The treatment diet caused greater O2ER in RA with ICU admittance, and a lower level of lactate in SH postclamping. The arginine and NO levels after 7 days of supplements did not experiment any changes.Conclusion: The aortic surgery caused notable changes of pH, BE, O2ER, and lactate at a systemic and regional level, contrary to an oxidative state. The treatment diet had little influence on the different variables studied.

The nucleic acid determination in biological samples has been essential in the last decades for many analytical processes, such as polymerase chain reaction (PCR), genotyping, clinical diagnosis, genetically modified organism determination in food ingredients, fetal DNA maternal blood test, forensic applications and others. Absorbance measurements in the UV-vis region are frequently employed for nucleic acid quantifications. Nevertheless, the results are often approximated and measurement accuracy is limited. Thus, this work presents a low-cost and simple method for DNA and/or RNA determination employing Thioflavin T (TT) by molecular fluorescence. The reaction mechanism consists of the interaction of TT and DNA or RNA. This mechanism is based on the off-on concept in which the free TT in solution shows low fluorescence but when interacts with the nucleic acid there is a rotation restriction in the TT molecule, becoming rigid, which allows the alignment of π orbitals and consequently increases its fluorescence intensity. After the addition of DNA, TT showed a redshift (bathochromic effect) in the molecular absorption spectra, indicating that there is interaction with the macromolecule. Experimental conditions were optimized applying salmon test DNA as experimental model for nucleic acids (stDNA) in pH = 5, MES buffer solution (10 mM) and TT concentration of 5 μM. For the ionic strength studies, it was observed that increasing NaCl concentration (0 – 150 mM) the TT-DNA interaction process is disfavored, indicating that the interaction mechanism occurs through electrostatic attractions. Moreover, binding mode assays with competitors (ethidium bromide and berenil) were performed, showing that the second type of interaction occurs preferentially by groove. In those conditions, the probe was able to respond immediately to different nucleic acids, with the signal stable for at least 120 min. The proposed method presents a 0.1 – 1.5 mg L-1 linear range in stDNA, with a LOD of 0.012 mg L-1 relative standard deviation lower than 3.7 %. Applying RNA as a standard, the method shows linear range of 0.25 – 3.0 mg L-1, LOD of 0.073 mg L-1 and RSD lower than 3.2 %. Fe(III) ion and albumin and lysozyme proteins were the main interference species to the method. At last, the concentration of nucleic acids in a DNA sample extracted from blood plasma was determined (stDNA – 57 mg L-1 and ctDNA – 48,5 mg L-1 standards), moreover, it was performed a recovery assay applying ctDNA and stDNA in saliva samples whose recoveries in the range of 67 – 89%.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
A determinação de ácidos nucleicos em amostras biológicas tem sido imprescindível nas últimas décadas para muitos processos analíticos, como reação de polimerase em cadeia (PCR), genotipagem, diagnóstico clínico, determinação de organismos geneticamente modificados em ingredientes alimentares, testes para determinação de DNA fetal em sangue materno, aplicações forenses, entre outros. Medidas de absorvância no UV-vis são comumente usadas para quantificação de ácidos nucleicos. Entretanto, os resultados obtidos são aproximados e a exatidão das medidas é limitada. Dessa forma, este trabalho apresenta um método simples e rápido empregando a Tioflavina T (TT) como sonda sensível e seletiva para determinação de DNA e/ou RNA através de fluorescência molecular. O mecanismo da reação consiste na interação da TT com DNA ou RNA. Este mecanismo se baseia no conceito off-on em que a tioflavina livre em solução apresenta baixa fluorescência, mas ao interagir com o ácido nucleico, ocorre restrição de rotação na molécula de TT, tornando-a planar e possibilitando o alinhamento dos orbitais π, desta forma, provocando aumento na intensidade de fluorescência. Após a adição de DNA, a TT mostrou um desvio para o vermelho (efeito batocrômico) nos espectros de absorção molecular, indicando que ocorre interação com a macromolécula. As condições experimentais foram otimizadas empregando DNA de salmão como modelo experimental de ácido nucleico (stDNA) em pH = 5, tampão MES (10 mM) e a concentração de TT em 5 μM. No estudo da força iônica observou-se que o aumento da concentração de NaCl (0 - 150 mM) desfavorece o processo de interação TT-DNA, indicando que a interação se dá por meio de atrações eletrostáticas. Além disso, realizou-se o estudo do modo de ligação com os competidores como brometo de etídio e berenil evidenciando que um segundo tipo de interação ocorre preferencialmente via groove. Nestas condições, a sonda respondeu a diferentes ácidos nucleicos (DNA e RNA) de forma imediata, sendo o sinal estável pelo menos até 120 min. O método proposto apresentou faixa linear de concentração de 0,1-1,5 mg L-1 em stDNA com limite de detecção (LOD) de 0,012 mg L-1 e desvio padrão relativo (RSD) menor que 3,7%. Quando se utilizou RNA como padrão a faixa linear foi de 0,25-3,0 mg L-1 com LOD de 0,073 mg L-1 e RSD menor que 3,2 %. Os íons Fe(III) e as proteínas albumina e lisozima foram os principais interferentes do método. Por fim, determinou-se a concentração de ácidos nucleicos em uma amostra de DNA extraído de plasma sanguíneo (padrão stDNA – 57 mg L-1 e ctDNA – 48,5 mg L-1), além disso, também foi realizado o ensaio de recuperação empregando ctDNA e stDNA em amostras de saliva, no qual obteve-se recuperações na faixa de 67-89%.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-26T19:37:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maron_LyzaGontow_M.pdf: 2238825 bytes, checksum: 4a67ca7cb16ababccc6f8418622be2c0 (MD5) Previous issue date: 2000
Mestrado

Computational methods are increasingly important to help to predict and characterize protein interactions. However, most of the efforts so far have focused on protein-protein and protein-ligand interactions, and few computer methods are available for modeling and characterizing protein-RNA interactions, in spite of their biological and biomedical importance. Given the difficulties and resource limitations of experimental procedures, developing computer methods for studying protein-RNA interactions is essential in order to get a better understanding of gene expression and cellular function. In this context, the main purpose of this thesis has been the development and application of computational methods for the structural prediction and characterization of protein-RNA complexes. This Doctoral thesis has fulfilled all the expected objectives. A more detailed summary is given below. In 2008 it was proposed the first protein-RNA docking case by the CAPRI (Critical Assessment of Prediction of Interactions) communitywide experiment. We devised a new protocol for this new challenge, based on our previous protein-protein docking programs, and obtained excellent results, generating the second best model among all participants. This experiment showed for the first time the potential of our new approach and the possibilities for further improvements. The next step was the extraction of statistical potentials to be applied for protein-RNA docking and interface prediction. For that purpose, we compiled the largest structural set of non-redundant protein-RNA complexes reported so far in order to derive individual and pairwise propensities of ribonucleotides and amino acid residues to be located at the binding interfaces. We found that the most significantly populated residues at protein-RNA interfaces were Arg, Lys and His, while the less favoured were Asp, Glu, Cys, Val, Leu and Ile. On the other hand, we did not observe a significant preference among the four types of ribonucleotides to be at protein-RNA interfaces. In the same line, pairwise propensities showed similar propensity values for the different types of ribonucleotides. We then developed the OPRA method to identify regions on protein surface with global preference to bind RNA. This method was tested with an independent set of known protein-RNA structures and showed to have a high positive predictive value for the prediction of residues involved in RNA binding. In addition, we found that this method was able to identify RNA-binding proteins. The next objective was the application of pairwise statistical potentials to the scoring of protein-RNA docking solutions. Unexpectedly, the statistical potentials showed worse predictive success rates than the FTDock scoring function (highly related to structural complementarity), although the results improved when both scoring terms were combined. However, we still needed more test cases in order to extract more reliable and general conclusions. Therefore, the next objective was to build a benchmark that could be used for the optimization and development of protein-RNA docking methods. For this, we collected as many non-redundant protein-RNA cases as possible with known complex structure and known or modeled structure for at least one of the subunits. This was the first publicly available protein-RNA docking benchmark and was composed of 106 cases, with 71 cases with at least the available unbound coordinates for one of the molecules, and 35 cases in which at least one of the molecules was built by homology modelling. One of the conclusions that emerged from the analysis of this set of structures is that protein-RNA complexes are much more flexible than protein-protein and even protein-DNA complexes. We then performed a docking study over the full protein-RNA docking benchmark which showed that the use of pairwise statistical potentials for identifying protein-RNA near-native solutions is noisy. The results confirmed that the best docking success determinant is structural interface complementarity as defined by parameters such as the FTDock score or the van der Waals energy. The combination of these efficient terms with electrostatics yields a scoring function that is able to identify high quality models in most of the cases when the bound coordinates of the interacting molecules are used. However, its efficiency in a more realistic scenario (using the unbound coordinates of the molecules) is highly dependent on the capability of sampling methods to generate high quality docking solutions. Results also underlined important differences with protein-protein interactions. The experience acquired during these more methodological parts of this PhD thesis has facilitated the application of computational methods to the study of translin, a highly conserved nucleic acid-binding protein of significant biomedical interest. By combining computational tools with experimental techniques, we contributed to the elucidation of the translin multimerization interfaces and nucleic acids binding sites and provided a first structural and dynamic picture of the functions carried out by the protein.
La caracterización estructural de complejos proteína-ARN es esencial para lograr una mayor comprensión en el campo de la biología molecular y la regulación celular. Los métodos computacionales de predicción estructural representan una alternativa rápida y poco costosa para la detección y caracterización de complejos biológicos. No obstante, en contraste con la gran variedad de métodos computacionales orientados a la predicción estructural de las interacciones proteína-proteína, existen muy pocos métodos enfocados al estudio de complejos proteína-ARN. En este contexto, el propósito principal de este proyecto de tesis ha sido el desarrollo y aplicación de métodos computacionales para el análisis, caracterización y predicción estructural de complejos proteína-ARN. Con este objetivo, en la primera fase de esta tesis doctoral, se han desarrollado nuevos protocolos para la predicción estructural de este tipo de complejos a partir de métodos de docking entre proteínas previamente descritos, y se han generado potenciales estadísticos por residuo, nucleótido y por pares residuo-nucleótido a partir de estructuras conocidas de complejos proteína-ARN. Dichos potenciales estadísticos por residuo se han aplicado al desarrollo de un método para la predicción de sitios de unión a ARN en proteínas y la identificación de proteínas que unen ARN. Por otro lado, se ha construido un conjunto de pruebas de complejos proteína-ARN para la evaluación de métodos de docking. Usando dicho conjunto de pruebas, se ha estudiado el poder predictivo de los potenciales estadísticos de pares residuo-nucleótido, así como otros términos energéticos, para la evaluación de soluciones de docking de complejos proteína-ARN y se ha desarrollado una nueva función de evaluación de posibles orientaciones de docking en complejos proteína-ARN, integrando aquellos términos energéticos más efectivos a nivel individual. La experiencia acumulada durante las fases iniciales de la tesis permitió la aplicación de técnicas de modelado computacional, en combinación con técnicas experimentales llevadas a cabo por colaboradores, al estudio de translin, una proteína de unión a ácidos nucleicos de gran interés biológico. Así pues, durante la fase final de este proyecto de tesis doctoral se contribuyó a la identificación de los sitios de multimerización y de unión a ácidos nucleicos en translin, y se propuso una primera aproximación estructural y dinámica de las funciones llevadas a cabo por la proteína, contribuyendo a resolver aspectos tan fundamentales como los determinantes estructurales de la unión a ARN.

In this thesis, single-molecule experiments using LOT are employed to extract accurate information about the thermodynamics and kinetics of various molecular systems, with special emphasis on the elastic properties of single-stranded DNA (ssDNA). The thesis is divided in three parts. Part I provides a general description of the research field as well as the main theoretical framework for the basic concepts that will be developed in parts II and III. In Chapter 2 the miniTweezers and the experimental setup used throughout the thesis is described, as well as the physical basis of its working mechanisms, introducing the phenomenon of optical trapping. Chapter 3 contains a brief introduction of the biomolecules of study in this thesis, with an explanation of their historical discoveries, as well as their structure and function. The main focus of this chapter is on ssDNA, which is the main object of study of the thesis. Chapter 4 introduces the polymer models that are widely used in describing the elasticity of nucleic acids and proteins. Specifically, the Freely-Jointed Chain and Worm-Like Chain models are presented. Part II deals with the elasticity of single-stranded DNA. This is the main part of the thesis, and it includes chapters 5-7. Chapter 5 is about the study of the elasticity of ideal ssDNA chain, i.e. the one that can be modelled as ideal polymers (presented in Chapter 4). The study of the elasticity of different DNA sequences is presented. The blocking-splint oligo technique is described, a experimental technique developed for studying the elasticity of short (tens of bases) DNA molecules. This study shows the need of using extensible models to succesfully describe ssDNA elasticity over a large range of forces, which explains the previous discrepancies on the elastic parameters obtained in different studies. We also provide an explanation for the required extensibility of the model: a transition experienced at the nucleotide level: a change in DNA sugar pucker conformation. A simple two-states model is introduced and preeliminary results regarding its energetics are presented. The characterization of the ssDNA elasticity is central for the works developed in the following chapters. Chapter 6 studies the stacking-unstacking transition for ssDNA, previously observed for certain sequences (mainly purine-rich ones). Several molecules, with different degrees of stacking, are studied by obtaining their force extension curves (FECs). A cooperative helix-coil model including heterogeneity is developed and used to fit the obtained FECs, allowing to obtain elastic parameters to describe the stacked chain. The salt dependence of the unstacking transition is also measured by studying two of the sequences by varying the salt concentration over two decades. The free energy of formation of dsDNA duplexes depends on the salt concentration. The obtained salt dependence on the stacking free-energy of ssDNA provides a possible explanation for the salt dependence of duplex formation. Chapter 7 deals with the non-specific structures that arise at low forces and high salt concentration when pulling ssDNA molecules longer than $\sim 100$ bases. A helix-coil model with cooperativity is proposed and used to extract some mean-field characteristics of these structures. 8 different sequences are studied, characterizing their elasticity and deviation from the ideal elastic behaviour. The results for a $14$kb molecule for 3 decades of varying \ce{NaCl} and \ce{MgCl2} are also shown. All experimental FECs are fitted to the helix-coil model. The model can be used to predict the formation of secondary structures at zero force. A comparison between the predicted structures from the model and those obtained from Mfold is also investigated. Part III contains two studies which also need of the correct determination of ssDNA elasticity. In Chapter 8, we study the interaction between the RecQ helicase from E. coli and DNA, i.e. how the RecQ unwinds double-stranded DNA molecules, releasing single-stranded DNA. We obtain some of its kinematic properties as well as study the entropy production of the system using the Fluctuation Theorem. In Chapter 9, the effect of DNA mismatches, i.e. non complementary base pairing, on the stability of DNA is studied. To do so, two types of experiments on several DNA sequences are performed: stretching and releasing the molecule by moving the optical trap (pulling experiments) and monitoring the folding/unfolding of the molecule passively (hopping experiments).
En aquesta tesi hem realitzat experiments fent servir pinces òptiques per tal d’extreure informació precisa sobre les propietats termodinàmiques i cinètiques de diferents sistemes moleculars, posant especial èmfasi en les propietats elàstiques de la cadena simple d’ADN (ssDNA, pel seu acrònim en anglès). La tesi es troba dividida en tres parts. A la primera part s’introdueix de forma general el camp de recerca dels experiments de molècula única, així com s’expliquen els conceptes més bàsics que es desenvoluparan en les parts II i III. La configuració experimental emprada al llarg de tota la tesi, les pinces òptiques, s’introdueix al capítol 2. Per a fer-ho, s’expliquen els principis físics de funcionament de les pinces, que es basen en l’atrapament òptic. Breument, la focalització d’un feix de llum d’alta intensitat permet atrapar i exercir forces en micropartícules dielèctriques (pilotes fetes de plàstic de la mida d’un bacteri), que són recobertes químicament de manera que la molècula d’estudi pot estirar-se, de forma individual, repetides vegades. El capítol 3 conté una breu introducció a les biomolècules que apareixen en aquesta tesi, amb una breu explicació de la seva descoberta, així com la seva estructura i funció (íntimament relacionades). Ens centrem en la descripció de la ssDNA que és el principal objecte d’estudi de la tesi. Al capítol 4 s’introdueixen els models de polímers que s’empren habitualment per a descriure l’elasticitat d’àcids nucleics i proteïnes. En concret, es descriuen els models de la Freely-Jointed Chain i la Worm-Like Chain. La Part II tracta de l’elasticitat de la ssDNA, i inclou els capítols 5, 6 i 7. El capítol 5 es basa en la caracterització de l’elasticitat de la cadena ideal de ssDNA, és a dir, aquella que pot ser modelitzada pels polímers ideals introduïts en el capítol 4. S’estudia l’elasticitat de diferents seqüències de ssDNA, introduint un nou mètode experimental, blocking-splint oligo, per tal d’ampliar el rang de forces estudiat habitualment en molècules curtes (d’una longitud de desenes de bases) de ssDNA. L’estudi mostra la necessitat d’emprar models elàstics extensibles per a la correcte caracterització de l’elasticitat de ssDNA, que explica les discrepàncies existents entre els paràmetres elàstics trobats a la literatura. També hipotetitzem que l’extensibilitat del model pot ser explicada gràcies a la transició experimentada a nivell de nucleòtids: el canvi que experimenta la distància interfosfat de l’ADN es veu modificada segons quina sigui la configuració de l’anell de desoxiribosa. Tot i que és un fenomen molt més conegut en la cadena doble d’ADN, l’apilament-desapilament de bases també s’ha observat en certes seqüències de ssDNA (especialment les que són riques en contingut de purines). Al capítol 6 s’estudien quatre molècules amb un grau d’apilament diferent a partir de les seves corbes força-extensió (FECs). Es desenvolupa un model helix-coil (hèlix-cabdell) per tal d’ajustar les FECs, fet que permet d’obtenir, indirectament, les propietats elàstiques de la cadena apilada. També s’estudia la dependència d’aquesta transició variant la concentració de sal dels experiments en més de dos ordres de magnitud. A través d’aquests experiments, trobem una dependència amb la concentració de sal de l’energia lliure de formació de l’apilament de la ssDNA, fet que ens permet explicar, parcialment, la dependència que es troba en la literatura per la hibridació de la cadena doble d’ADN. El capítol 7 tracta de la formació d’estructures no específiques que apareixen a forces baixes i a concentració de sal alta per a molècules de ssDNA de més de ~100bases. Es proposa un model helix-coil amb cooperativitat per tal de caracteritzar propietats de camp mitjà de les estructures estudiades. S’estudien vuit seqüències diferents, entre 120 i ~14000 bases, i es caracteritza el seu desviament respecte de la corba elàstica ideal amb el model. També s’estudia la dependència de l’estructura secundària de la ssDNA en funció de la concentració de la sal. Analitzant experiments variant la concentració de MgCl2 i NaCl, aconseguim reproduir les FECs a partir de fer dependre els paràmetres del model amb la sal. Finalment, el model desenvolupat ens permet predir la formació d’estructura secundària a força zero (fet que no podem detectar directament a partir d’experiments d’espectroscopia de forces). Es comparen les previsions del model amb les trobades per Mfold, trobant una compatibilitat per als resultats per a molècules de de menys de 1000 bases. La darrera part se centra en col·laboracions que he fet durant a tesi i que necessiten una determinació precisa de les propietats elàstiques de la ssDNA. Al capítol 8 s’estudia la interacció entre l’helicasa del bacteri E. coli i l’ADN, que s’encarrega d’obrir la cadena doble d’ADN, alliberant ssDNA. S’extreuen les seves propietats cinètiques, com la velocitat de translocació – obtenim, independentment de la força aplicada, d’uns 50bp/s, d’acord amb la literatura –. També n’estudiem les seves propietats termodinàmiques, a partir del Teorema de Fluctuació. Finalment, al capítol 9 s’estudien els efectes de certs defectes en molècules d’ADN. A partir d’experiments fora de l’equilibri s’extrau la penalització que suposa per a la hibridització d’ADN la presència d’aquestes bases no complementàries (és a dir, que no són enllaços de A-T o G-C).

Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_vitorio_ioc_mest_2014.pdf: 8997482 bytes, checksum: 58bdb04feb407967d076809db7227935 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. A partir de análises in silico, das sequências proteicas dessas calpaínas, selecionamos uma região consenso e um peptídeo correspondente a essa região foi sintetizado e empregado na imunização de coelhos A reatividade do anticorpo gerado (Anti-TryTrip CALPAIN) foi avaliada por Western blotting, citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose
The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.
The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-25T16:16:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5635225 bytes, checksum: 95ddb52f9761379763555962c8aa641f (MD5)
Made available in DSpace on 2016-05-25T16:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5635225 bytes, checksum: 95ddb52f9761379763555962c8aa641f (MD5) Previous issue date: 2016-03-21
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Neste trabalho, utilizando tres técnicas experimentais (pinoa optica, espalhamento di- namico de luz e calorimetria isotérmica de titulaoao), nés investigamos alguns ligantes que, além da intercalagao simples, apresentam outro mecanismo de interaoao com a molécula de DNA. Inicialmente, nos fizemos a caracterizaoao da molécula de DNA com dois ligantes: a Actinomicina D, que é um farmaco largamente utilizado em doen- Qas trofoblasticas gestacionais, tumor de Wilms e rabdomiossarcoma e o GelRed, um marcador de acidos nucléicos utilizado em experimentos de eletroforese. Utilizando dois modelos teoricos (o modelo estatistico de dois sitios e o modelo de exclusao de Vizinhos), foi possivel extrair os parametros fisico-quimicos das interaoo'es utilizando-se apenas os dados obtidos a partir dos experimentos de estiramento. Por liltimo, nos investigamos a interagao do DNA com dois ligantes (Brometo de Etidio e GelRed) em solugo'es contendo Poli(etileno glicol) 8000, a fim de estudarmos o comportamento do DNA em solugo'es contendo outras macromoléculas, simulando, de forma bastante simplificada, o meio no qual 0 DNA se encontra in viva.
In this work, by using three experimental techniques (optical tweezers, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry), we have investigated some ligands that, beside simple intercalation, have an additional mechanism of interaction with the DNA molecule. Firstly, we have performed the characterization of DNA molecule with two ligands: Actinomycin D, which is a drug widely used in gestational trophoblastic disease, Wilm’s tumor and rhabdomyosarcoma and GelRed, which is a fluorescent nucleic acid stain, used in electrophoresis technique. By using two theoretical models (quenched disorder statistical model and neighbor exclusion model), it was possible to extract some physicochemical parameters of the interaction from the data obtained by single molecule stretching experiments. Finally, we have investigated the interaction of the DNA molecule with two ligands (Ethidium Bromide and GelRed) in Poly(ethylene- glycol) 8000-rich solutions, in order to study the behavior of the DNA molecules in a crowd environment, mimicking, in a very simple way, the in viva environment.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados.
Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Davant la necessitat de nous enfocaments en el tractament de determinades malalties, en els darrers anys s’han desenvolupant sistemes nanoestructurats no virals com a vehiculitzadors d’agents terapèutics -entre els que es troben els àcids nucleics- com a alternativa tant a les formes farmacèutiques clàssiques com als sistemes virals, els quals presenten riscos associats que no compensen els eventuals beneficis. Entre els diversos tipus de sistemes no virals per a transfecció d’àcids nucleics (DNA i RNA) dirigits a la regulació de l’expressió gènica, es troben les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP i les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN). El diàmetre mitjà de les nanopartícules i el potencial superficial obtingut (entès com a potencial Z) són variables clau per determinar la seva idoneïtat per a l’ús previst. Les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP s’obtenen majoritàriament pel mètode de gelificació ionotròpica. En aquest treball, s’han optimitzat certs paràmetres operacionals del mètode per tal de reduir el temps de síntesi i aconseguir nanopartícules de mida i potencial Z adients. Enfront la variabilitat que presenta aquesta classe de sistema nanoparticulat, i molt particularment a causa de la puresa i grau de desacetilació de la matèria primera, es proposa l’estudi d’un sistema alternatiu per a transfecció d’àcids nucleics. Aquest sistema d’elecció són les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN), obtingudes pel mètode la microemulsificació en calent. A partir d’una formulació original, i per tal de reduir al màxim els components de la formulació i per tant, els riscos de citotoxicitat, s’avaluen diferents components i la quantitat mínima necessària a la formulació, sense comprometre ni la mida de partícula ni el potencial Z. La caracterització dels components i les seves interaccions, així com la determinació de les propietats de la formulació resultant per mitjà de diverses tècniques instrumentals, indiquen la idoneïtat de les cSLN per a l’ús previst. Els estudis de citotoxicitat en les línies cel·lulars HEK293T i HeLa demostren que la viabilitat cel·lular no es veu compromesa per la presència de cSLN en determinades quantitats. A partir de plasmidis d’expressió eucariota, es determina per mitjà d’assajos de retardament en gel la relació òptima cSLN:pDNA per a un 100% d’eficiència d’unió. A partir d’aquesta dada, es porten a terme estudis d’expressió funcional d’un fragment del gen que codifica per al factor de transcripció TCERG1 per mitjà d’immunoblotting, i del gen Luc que codifica per a l’enzim luciferasa per mitjà d’un assaig de bioluminescència, que demostren l’expressió proteica a partir de la transfecció de lipoplexos cSLN:pDNA. Així mateix, i a partir d’un fragment de siRNA contra TCERG1, s’estableix la relació òptima cSLN:siRNA per a un 100% d’eficiència d’unió. En aquest cas, l’estudi es complementa amb l’avaluació de l’eficiència de transfecció dels lipoplexos cSLN:siRNA. Es pot concloure que el siRNA és capaç d’arribar a la cèl·lula quan s’utilitzen cSLN com a agent de transfecció, obrint la porta a la possibilitat de regulació de l’expressió gènica a partir de lipoplexos cSLN:siRNA.
Nanostructured non-viral delivery systems have recently being developed for transfection of therapeutic agents such as nucleic acids. Cationic polymeric nanoparticles of chitosan-TPP and cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) are two of these delivery systems. In this work, several key operational parameters linked to the ionotropic gelation method were optimized to develop cationic polymeric chitosan-TPP nanoparticles. Because of the variability of the methodology and the raw material in the properties of nanoparticles, cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) were chosen as an alternative system for delivery of various nucleic acids such as plasmid DNA. To this goal, the first specific aim was to decrease the components of a starting formulation to minimize the risk of cell toxicity. The components of the formulation were qualitatively and quantitatively assessed to achieve the minimum amount necessary for obtaining cSLN, while maintaining a proper particle size and Z potential. The suitability of the cSLN was studied through the characterization of the components, their interactions, and the properties of the resulting formulation. The optimal ratio for cSLN:pDNA lipoplexes was determined by using gel retardation assays, with an achievement of 100% binding efficiency. Minimal toxicity of the cSLN was observed in cell cultures using the established HEK293T and HeLa cell lines. More importantly, the cSLN were able to transiently express proteins from transfected DNA, which were detected by using bioluminescence assays. In addition, the optimal ratio for cSLN:siRNA (a 21-oligonucleotide targeting a transcription factor) was established to achieve 100% binding efficiency. The transfection efficiency of the cSLN:siRNA lipoplexes was confirmed in HEK293T and HeLa cells. The results demonstrate the efficacy of the developed cSLN-based lipoplexes for delivery of nucleic acids to regulate gene expression.

This work is focused on the study of Polypurine Reverse Hoogsteen hairpins (PPRHs) as a gene silencing tool, and on the search of alternative methods for their delivery, including viral and non-viral vectors. PPRHs are single stranded non-modified DNA hairpins formed by two antiparallel polypurine mirror repeat strands linked by five thymidines and bound intramolecularly by Hoogsteen bonds. These hairpins can bind specifically to a pyrimidine target sequence in genomic DNA and induce the displacement of the purine strand, resulting in the inhibition of gene expression. During the last decade, our laboratory has demonstrated the ability of PPRHs to silence different targets involved in cancer progression both in vitro and in vivo (Ciudad et al. 2017). In this work, we expand the use of PPRHs as a silencing tool of replication stress response (RSR) genes WEE1 and CHK1, and Thymidylate synthase (TYMS). We demonstrated that PPRHs were able to decrease the expression WEE1 and CHK1, leading to a disruption of cell cycle progression, an increase of apoptosis, and a decrease of survival in tumor cells. Moreover, the inhibition of either WEE1 or CHK1 using PPRHs enhanced the response to the DNA-damaging agents 5-Fluorouracil and Methotrexate. Regarding TYMS, we identified and validated a G-quadruplex (G4) structure in its 5’UTR that could act as a regulatory element of TYMS expression. Moreover, we demonstrated that the complementary strand of this secondary structure could be targeted by a PPRH, which promoted G4 formation and down-regulation of TYMS expression. This PPRH induced cancer cell death as a single agent and showed synergic effect with the classical TYMS inhibitor 5-Fluorouracil. In this work we also showed the capacity of viruses to transduce PPRHs in vitro. We demonstrated that an adenoviral based vector encoding a PPRH against survivin could downregulate its mRNA and protein levels, causing a reduction in cell viability. Before attempting that approach, we first demonstrated that PPRHs could also work as RNA species. We confirmed that an RNA-PPRH directed against survivin was able to selectively bind to its target sequence, leading to a decrease on mRNA and protein levels. The inhibition of survivin using the RNA-PPRH induced an increase of apoptosis and cell death in cancer cells. Finally, in collaboration with other departments of our School of Pharmacy, we synthesized a new gemini cationic liposome-based formulation (DOPY) for nucleic acids delivery. We characterized the DOPY/PPRHs lipoplexes and validated the use of DOPY as transfection agent of PPRHs in both gene silencing and gene repair approaches. Overall, in this work we expand the use of PPRHs as a gene silencing tool of WEE1, CHK1 and TYMS, and we validate two new strategies for PPRHs delivery: an adenoviral vector and the liposome DOPY.
Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines (o PPRHs per Polypurine reverse Hoogsteen hairpins) com a eina de silenciament gènic i en la cerca de mètodes alternatius per a la seva vehiculització, tant amb vectors virals com no virals. Els PPRHs són molècules d'ADN no modificades formades per dues cadenes de polipurines unides per un bucle de 5 timidines i per enllaços de Hoogsteen intramoleculars. Aquestes pinces es poden unir a una seqüència específica de l'ADN i induir el desplaçament de la cadena de purines, tot causant la inhibició del gen diana. Durant l'última dècada, el nostre laboratori ha demostrat la capacitat dels PPRHs per silenciar diferents gens implicats en la progressió del càncer in vitro i in vivo (Ciudad et al. 2017). En aquest treball, vam demostrar que els PPRHs eren capaços de disminuir l'expressió WEE1 i CHK1, tot desencadenant una alteració del cicle cel·lular, un augment de l'apoptosi i una disminució de la supervivència en cèl·lules tumorals. A més, vam identificar i validar una estructura G-quàdruplex (G4) al 5' UTR del gen timidilat sintasa (TYMS) que podria actuar com a element regulador de la seva expressió. Vam demostrar que un PPRH dirigit contra aquesta regió disminuïa l'expressió de TYMS i era capaç d'induir la mort a cèl·lules canceroses com a agent únic i en combinació amb 5-Fluorouracil. També hem mostrat la capacitat d'un vector viral per transduir PPRHs in vitro. Vam demostrar que un vector adenoviral que codificava un PPRH dirigit contra la survivina podia disminuir els seus nivells de proteïna i mRNA, tot provocant una reducció de la viabilitat cel·lular. Abans, però, vam demostrar que un PPRH dirigit contra la survivina en forma d'ARN també tenia activitat silenciadora. Finalment, vam sintetitzar una nova formulació basada en liposomes catiònics gèminis (DOPY). Vam caracteritzar els complexos DOPY/PPRHs i vam validar l'ús de DOPY com a agent de transfecció de PPRHs. En resum, en aquest treball ampliem l'ús de PPRH com a eina de silenciament dels gens WEE1, CHK1 i TYMS, i validem dues noves estratègies de vehiculització de PPRHs: un vector adenovirus i el liposoma DOPY.

Ureases são enzimas que catalisam a hidrólise de ureia para formar amônia e dióxido carbono, sendo produzidas por plantas, fungos e bactérias. A toxina de estudo, Jaburetox, é um peptídeo recombinante derivado de uma das isoformas de urease presentes em Canavalia ensiformis. Esta molécula mostrou toxicidade a insetos de diferentes ordens quando administrada oralmente ou por injeção e, além disso, apresenta atividades antifúngica e bacteriostática, não exibindo efeitos tóxicos para mamíferos, demonstrando um enorme potencial biotecnológico. Em estudos realizados com Rhodnius prolixus, um dos principais vetores da Doença de Chagas na América Latina, observamos que o Jaburetox é capaz de interagir com hemócitos, células do sistema imune. Concomitante a esta interação, também demonstramos que o peptídeo é capaz de induzir a agregação de hemócitos, característica da resposta celular, e também é capaz de aumentar a atividade da fenoloxidase (PO), enzima envolvida na resposta humoral dos insetos. Estes efeitos sugerem que o peptídeo é capaz de ativar o sistema imune dos insetos. Os insetos apresentam somente imunidade inata, sendo esta subdividida em resposta celular e humoral. A resposta celular, mediada por hemócitos, é caracterizada pela fagocitose, agregação e encapsulação de patógenos. Em contraste, a resposta humoral é representada pela produção de peptídeos antimicrobianos, melanização desencadeada pela enzima PO e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Recentemente, outro mecanismo de resposta imune inata tem sido estudado: as armadilhas extracelulares - Extracellular Traps (ETs), sendo bem caracterizadas em mamíferos, porém pouco estudadas em insetos. As ETs são armadilhas de ácidos nucleicos extracelulares associados a proteínas citoplasmáticas, que podem auxiliar na captura e na morte de patógenos. Essa resposta é desencadeada por receptores extracelulares de células granulares que induzem o aumento de Ca2+ intracelular, levando à produção de ROS, que parece ser parte fundamental para liberação dos ácidos nucleicos, permitindo com que estes passem para o citoplasma e associem-se com as proteínas. O presente estudo tem como objetivo avaliar o papel de ácidos nucleicos extracelulares na resposta imune e na proteção contra o peptídeo entomotóxico Jaburetox. As respostas imunológicas foram avaliadas por meio da contagem de agregados, através de hemocitômetro, e por ensaio colorimétrico para dosar alterações da resposta humoral, 6 e 18 h após injeção de Jaburetox e/ou RNA extracelular (RNAet). A liberação de RNA e DNA foi avaliada 6 h pós injeção de tratamentos para ensaios in vivo e 1 h pós incubação para ensaios in vitro, através do kit Qubit RNA HS e Qubit dsDNA HS. Para avaliar a liberação de ROS e viabilidade celular, realizamos culturas de hemócitos, que foram tratados por 24 h com Jaburetox. Por fim, avaliamos a imunocompetência dos insetos após tratamentos com Jaburetox, RNAet ou Jaburetox + RNAet e desafiamos o inseto contra uma bactéria patogênica. A hemolinfa dos insetos foi coletada e unidades formadoras de colônia foram mensuradas pelo método de drop-plate. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o RNAet é capaz de ativar as defesas do organismo, tanto celular quanto humoral e, quando associado à toxina, apresentam um efeito protetor. Jaburetox não foi capaz de induzir alterações na liberação de ácidos nucleicos em nenhuma das abordagens, mas modificou a liberação de ROS na dose de 6 M. A viabilidade celular não foi alterada em nenhuma das condições testadas. Nos ensaios de imunocompetência, observamos que o peptídeo modula a resposta do organismo, deixando-o mais susceptível a infecções. Os tratamentos com RNAet desencadeiam uma resposta protetora. Nossos dados sugerem que o RNAet modula as defesas do organismo de forma benéfica para combater patógenos, enquanto que o Jaburetox, nas condições testadas, não induz resposta imune através de ETs, mas torna o inseto mais susceptível a infecções por patógenos. Os presentes achados enfatizam a importância dos ácidos nucleicos extracelulares para as defesas imunológicas em insetos. Também elucidamos os efeitos desencadeados pelo peptídeo, aprimorando os conhecimentos referentes a esta toxina, enfatizando o potencial uso deste composto como um bioinseticida.
Ureases are enzymes that catalyze the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide, being produced by plants, fungi and bacteria. The studied toxin, Jaburetox, is a recombinant peptide derived from one of the urease isoforms present in Canavalia ensiformis. This molecule showed toxicity to insects of different orders when administered orally or by injection and, in addition, presents antifungal and bacteriostatic activities, not exhibiting toxic effects to mammals, demonstrating an enormous biotechnological potential. Studies with Rhodnius prolixus, one of the main vectors of Chagas' disease in Latin America, have shown that Jaburetox is capable of interacting with hemocytes, the cells of the immune system. Concomitant with this interaction, we also demonstrated that the peptide induces hemocyte aggregation, a characteristic of the cellular response, and is also capable of increasing the activity of phenoloxidase (PO), an enzyme involved in the humoral response in insects. These effects suggest that the peptide is able of activating the insect immune system. Insects present only innate immunity, which is subdivided into cellular and humoral responses. The cellular response, mediated by hemocytes, is characterized by phagocytosis, aggregation and encapsulation of pathogens. In contrast, the humoral response is represented by the production of antimicrobial peptides, melanization triggered by the PO enzyme and the production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). Recently, another mechanism of innate immune response has been studied: the Extracellular Traps (ETs), being well characterized in mammals, but little studied in insects. ETs consist of extracellular nucleic acids associated with cytoplasmic proteins that may aid in the capture and killing of pathogens. This response is triggered by extracellular granular cell receptors that induce the increase of intracellular Ca2+, leading to the production of ROS, which appear to play a key role in the release of nucleic acids, allowing them to pass into the cytoplasm and associate with proteins. The present study aims to evaluate the role of extracellular nucleic acids in the immune response and protection against the entomotoxic peptide Jaburetox. Immunological responses were evaluated by means of hemocytometer counting and by colorimetric assays to measure changes in the humoral response, 6 and 18 h after injection of Jaburetox and/or extracellular RNA (RNAet). The release of RNA and DNA was evaluated 6 h post injection of treatments for in vivo assays and 1 h post incubation for in vitro assays, using the Qubit RNA HS and Qubit dsDNA HS kits. In order to evaluate the release of ROS and 14 the cell viability, hemocyte cultures were treated for 24 h with Jaburetox. Finally, the immunocompetence was evaluated after treatment with Jaburetox, RNAet or Jaburetox + RNAet and challenging the insects with a pathogenic bacterium. Hemolymph of the insects was collected and colony forming units were measured by the drop-plate method. The results obtained in this work indicated that RNAet is able to activate the organism defenses, both cellular and humoral, and displays a protective effect when associated with the toxin. Jaburetox was not able to induce changes in the release of nucleic acids in any of the approaches, but modified the release of ROS at the dose of 6 μM. Cell viability was not altered in any of the conditions tested. In the immunocompetence assays, we observed that the peptide modulates response of the organism, making it more susceptible to infections. RNAet treatments elicit a protective response. Our data suggest that RNAet modulates the insect defenses in a beneficial way to fight pathogens, while Jaburetox, in the conditions tested, does not induce an immune response through ETs, but makes the insect more susceptible to pathogen infections. The present findings emphasize the importance of extracellular nucleic acids for immune defenses in insects. We also elucidate the effects triggered by the peptide, improving the knowledge regarding this toxin, reinforcing its potential use as a bioinsecticide.

Given the increasing interest in i-motif structures, obtaining such structures as well as detailed structural information under physiological conditions have become hot topics in the structural biology field. In this context, the main objectives of this thesis are focused on the design and detailed characterization of several oligonucleotide sequences that may form stable i-motif structures at neutral pH. The starting point is the mini i-motif structure, extensively studied in the research group that exhibits unusual high pH and thermal stability. These are dimeric structures stabilized by the formation of two hemiprotonated C:C+ base pairs capped at both ends by minor groove G:T:G:T tetrads. With the aim of getting deeper insights in this type of structures and enhance their stability at physiological conditions, different approaches were followed. A first strategy consisted in the incorporation of a neutral analogue of protonated cytidine (pseudoisocytidine, psC) occupying specific positions of the motif. The 3H-tautomer of psC, thanks to the extra hydrogen-bond donor, can form neutral base pairs completely isomorphic to hemiprotonated C:C+ pairs. psC was incorporated in different positions of dimeric mini i-motifs and in the telomeric sequence (HT0). The effect of the incorporation of psC depends on its position in the structure, being in most cases destabilizing. Neutral psC:C base pairs stabilize i-motifs at neutral pH, but the stabilization only occurs when psC:C base pairs are located at the ends of intercalated C:C+ stacks. Structural and stability data on the incorporation of pseudocytidine in i-motifs suggest that positively charged base pairs in the core of the structure are necessary to stabilize this non-canonical DNA structure. A second approach focused on exploring the compatibility of i-motif structures with other reported minor groove tetrads. The effect of different minor groove tetrads in i-motifs was studied in the context of short linear and cyclic oligonucleotides, affording dimeric mini i-motifs, but also in longer sequences that may form monomeric mini i-motif structures. The results show that the mini i-motif is compatible with different type of minor groove tetrads and a stability ranking could be established: G:C:G:T ≥ G:C:G:C >> G:T:G:T, exhibiting monomeric structures enhanced stability. Interestingly, a consensus sequence was outlined based on the results obtained for the set of mini i-motif-forming sequences. The mapping of this sequence throughout the human genome by bioinformatics analysis revealed a statistical prevalence. The distribution found for these sequences is not random, being much more frequent in regulatory regions Finally, a fluorescent cytidine analogue (1,3-diaza-2-oxophenoxazine, tCo), capable to hybridize as a cytosine and maintaining the ability to form Watson-Crick as well as hemiprotonated base pairs, was tested as an internal probe for the characterization of local environments within i-motif structures. NMR spectroscopy indicated both types of hybridization (tCo:C+ and G:tCo) are compatible with the mini i-motif structure at neutral pH. Interestingly, the fluorescence signal of tCo suffers a sever quenching when forming an hemiprotonated base pair, compared to the very little quenching that shows upon WC hybridization. Hence, tCo was successfully used as fluorescent probe for monitoring conformational transitions between different species of tCo-containing sequences. Moreover, when replacing a cytosine residue involved in a C:C+ pair, the favorable stacking between tCo and G:C base pairs from the capping minor groove assemblies provokes enhanced stability of the structure against both pH and temperature. Very remarkably, the visualization of mini i-motif structures in cellular media was accomplished by confocal fluorescence microscopy after the successful transfection of HeLa cells with tCo-containing oligonucleotides.
En el marc de les estructures no canòniques dels àcids nucleics i les seves possibles implicacions biològiques, aquesta tesi te com a objectiu principal l’obtenció i caracterització estructural d’estructures i- motif que siguin estables a pH neutre. El punt de partida és l’estructura mini i-motif, un tipus de motiu que presenta una inusual elevada estabilitat front pH i temperatura. Es tracta d’una estructura dimèrica estabilitzada per la formació de dos parells hemiprotonats C:C+ que interaccionen per apilament amb dues tètrades G:T:G:T de solc menor que actuen de tapa de l’estructura. Per a aprofundir en l’estudi d’aquest tipus de motius i augmentar-ne la seva estabilitat a pH fisiològic, diferents aproximacions s’han dut a terme. En la primera aproximació, s’ha explorat la incorporació d’un anàleg neutre de citidina protonada (pseudoisocitidina, psC), capaç de formar parells neutres isomòrfics als parells hemiprotonats C:C+. Els estudis realitzats demostren que l’efecte de la psC en depèn fortament de la posició dins l’estructura. La formació de parells hemiprotonats al centre de l’estructura és fonamental i la formació de parells neutres només és tolerada pels parells terminals, produint-se en aquest cas una certa estabilització. Una segona línia de treball s’ha centrat en explorar la compatibilitat d’estructures i-motif amb altres tètrades de solc menor. S’han estudiat diferents seqüències, lineals i cícliques, que donarien lloc a estructures mini i-motif amb diferents associacions de nucleobases a les tètrades. Els estudis demostren que el mini i-motif és compatible amb diferents tètrades de solc menor i s’ha pogut establir el següent rànquing d’estabilitat G:C:G:T ≥ G:C:G:C >> G:T:G:T. Cal destacar que, la seqüència consens per aquest tipus d’estructures s’ha determinat que és prevalent al genoma humà. Finalment, s’ha incorporat un anàleg de citidina fluorescent (1,3-diaza-2-oxofenoxazina, tCo), substituint citosines en posicions especifiques de l’estructura. Els resultats demostren que tCo actua de forma eficient com a sonda local per a monitoritzar transicions conformacionals i que, en posicions específiques te un efecte força positiu en l’estabilitat tèrmica del motiu. Aquest fet ha permès utilitzat un d’aquests derivats per a visualitzar el plegament de l’estructura en medi cel·lular.

Orientador: Silvia Regina Brandalise
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-06T21:43:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aguiar_SimonedosSantos_D.pdf: 43958145 bytes, checksum: b9dafbbd99ad0e567b3c1f03a0c7b37e (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: Introdução Os osteossarcomas (OS) são tumores agressivos, primários de osso, com prognóstico reservado. As deleções dos genes supressores de tumor, RBl e P53, localizados nos cromossomos 13 e 17 respectivamente, são freqüentemente encontradas neste tipo de tumor. As alterações citogenéticas encontradas nos OS são de alta complexidade, porém nenhuma delas é recorrente, não podendo caracterizá-lo. A técnica da Hibridização Genômica Comparativa (CGH) é uma ferramenta muito precisa para o estudo das deleções e amplificações gênicas ocorridas neste tumor. Materiais e Métodos. Tecido tumoral de 41 crianças com OS foi analisado pela técnica de CGH para pesquisar possíveis ganhos e/ou perdas gênicas . A técnica da Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) foi realizada para estudar as deleções dos genes P53 e RBl. Vinte e quatro pacientes eram do sexo feminino e 17 do sexo masculino, com mediana de 12 anos e 4 meses. Resultados. As anormalidades cromossômicas observadas com a técnica de CGH foram diversas e variadas, especialmente ganhos nos cromossomos lp, 2p, 3q, 5q,5p e 6p e, perdas nos cromossomos 14q (50% no - 14q 11.2), 15q e 16p. Alto índice de perdas foi observado no cromossomo 21 (26 de 41 casos; p=0,008), sendo a região mais freqüentemente afetada a 21ql 1.2. Com relação ao estudo dos supressores tumorais, a deleção do P53 ocorreu em 68,3% dos casos (p=0,02) e do RBl em 87,5% dos casos (p=0,000001). Conclusão. Apesar de ambos supressores (PS3 e RBl) estarem deletados na maioria dos pacientes, este evento parece não estar associado ao prognóstico. Anormalidades ainda não reportadas presentes no cromossomo 21 nos OS pediátricos, sugerem que a seqüência mapeada nesta região cromossômica possa estar envolvida na patogênese deste tumor
Abstract: Background. Osteosarcomas (OS) are aggressive bone tumors and often have a poor prognosis. It is already known that abnormalities in chromosomes 13 and 17 are frequently observed in OS patients, being also expected a deletion of RBI and P53 genes. The tumors exhibit karyotypes with a high degree of complexity, that has made it difficult to determine if any recurrent chromosomal aberrations could characterize OS. To address inherent difficulties associated with classical cytogenetic analysis, comparative genomic hybridization (CGH) has been applied to OS tissue. Patients and Methods. Forty one pediatric OS specimens were analyzed by CGH techniques, and the expression of RBI and P53 were analyzed by FISH . Twenty four patients were girls and 17 boys. Median age was 12 years and 4 months.Results. Chromosomal abnormalities were highly diverse and variable specially gains in chromosome lp, 2p, 3q, 5q , 5p and 6p and losses in chromosome 14q (50% in - 14q 11.2), 15q and 16p. High level of losses in chromosome 21 were present (26 of 41 cases; p-0,008), being 21 q 11.2 region the most frequent one. Concerning about genes expression, P53 is deleted in 68,3% of the cases (p=0,02) and RBI in 87,5% (p=0,000001) .Conclusion. Although both oncogenes (P53 and RBI) are deleted in OS population, it remains impossible to determine if this abnormality is a prognostic factor. These new and unreported findings in chromosome 21 of pediatric OS tumors, suggest that specific sequences mapping these chromosomal regions, would likely to play a role in the development of OS
Doutorado
Pediatria
Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um teste não invasivo para a trissomia do cromossomo 21 através da análise de ácidos nucleicos fetais livres no plasma materno por sequenciamento de última geração realizado no sequenciador automático Ion Torrent. A metodologia proposta para o teste é a análise de SNPs com alta taxa de heterozigosidade na população brasileira localizados em dois genes presentes no cromossomo 21 (PLAC4 e C21orf105), e a detecção da cópia extra do cromossomo 21 é feita pela razão dos alelos desses SNPs, sendo que a razão de 1:1 indica que o feto é normal, e a razão de 2:1 indica que o feto tem uma cópia extra do cromossomo 21. Para a validação da metodologia foram utilizadas 50 amostras de DNA livre extraídas de líquido amniótico, previamente caracterizadas por análise citogenética consideradas como o padrão ouro pois contém apenas material genético fetal abundante. A metodologia foi validada com sucesso nessas amostras, sendo que as 24 amostras de fetos com trissomia foram claramente distinguidas das 26 amostras de fetos normais. A metodologia validada foi aplicada a 44 amostras de DNA livre extraídas de plasma de gestantes (21 amostras de fetos com trissomia do 21 e 23 de fetos normais), porém não foi possível fazer a distinção entre fetos normais e fetos com trissomia do 21, possivelmente devido à variações na fração fetal do DNA livre em relação à fração materna. Como nosso objetivo principal não foi alcançado, Propomos aqui que o teste realizado em líquido amniótico seja utilizado como uma alternativa mais simples, rápida e barata ao cariótipo convencional atualmente utilizado para fazer o diagnóstico da trissomia do cromossomo 21 em amostras coletadas por procedimentos invasivos, enquanto as deficiências do teste não-invasivo pelo plasma materno são aprimoradas
The purpose of this study was to develop a test for trisomy 21 by analyzing cell-free fetal nucleic acids in maternal plasma by next-generation sequencing performed on automated sequencer Ion Torrent. The proposed methodology for the test is based on analysis of SNPs with high heterozygosity rates in Brazilian population, located in two genes present on chromosome 21 (PLAC4 and C21orf105), and the detection of the extra copy of chromosome 21 is made by the allelic-ratio of these SNPs, where 1:1 ratio indicates a normal fetus, and the 2:1 ratio indicates that the fetus has an extra copy of chromosome 21. In order to validate the methodology 50 cell-free DNAs extracted from amniotic fluid were used representing a gold standard since it contains abundant genetic material exclusively from the fetus. The methodology has been successfully validated in these samples, all the 24 samples from fetuses with trisomy 21 were clearly distinguished from 26 samples of normal fetuses. The validated method was applied to 44 cell-free DNA samples extracted from plasma of pregnant women (21 samples from fetuses with trisomy 21 and 23 from normal fetuses), but unfortunately it was not possible to distinguish between normal and trisomy 21 fetuses, possibly due to variations on the fetal fraction of the cell-free DNA in relation to maternal fraction. As our main goal was not achieved, we propose here that the test performed on amniotic fluid sample could be used as a simpler, faster and cheaper alternative test to traditional karyotype, which is used nowadays to make the diagnosis of trisomy 21 in samples collected by invasive procedures. In parallel, minor improvements in the described method may enable its clinical use

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos.
The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.

En las últimas décadas, el análisis de compuestos biomarcadores en muestras biológicas se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de diversas enfermedades. Las principales dificultades en muchos casos son la baja concentración de los biomarcadores, la complejidad de la matriz de la muestra y la limitada disponibilidad de muestra. En esta tesis doctoral, se presentan nuevas estrategias basadas en electroforesis capilar- espectrometría de masas (CE-MS) para la separación, detección, caracterización y cuantificación de péptidos, proteínas y microARNs (miRNAs) biomarcadores en fluidos biológicos. La CE-MS es una técnica excelente para la separación de biomoléculas cargadas y su identificación inequívoca. En esta tesis, se han desarrollado estrategias novedosas para la predicción y optimización de las separaciones de mezclas complejas de péptidos en CE. Para evaluar estas estrategias, se han estudiado los péptidos beta amiloides. Una limitación importante de la CE es su baja sensibilidad en términos de concentración para la mayoría de analitos a causa del pequeño volumen de inyección de muestra. La extracción en fase sólida en línea con la electroforesis capilar (SPE-CE) es una excelente estrategia para disminuir los límites de detección. En esta tesis se han investigado diferentes metodologías de SPE-CE-MS unidireccional empleando sorbentes selectivos, como los sorbentes de inmunoafinidad, afinidad a aptámero, afinidad a metal inmovilizado y el carburo de silicio, para el análisis de proteínas intactas (transtiretina y α-sinucleína), digestos de proteínas y miRNAs en fluidos biológicos. También se ha investigado el potencial de la SPE-CE-MS con una nanoválvula (nvSPE-CE-MS) para el análisis de péptidos en fluidos biológicos. Se ha desarrollado un método de nvSPE-CE-MS empleando un sorbente C18 para el análisis de péptidos opioides y péptidos beta amiloides y se han comparado las ventajas e inconvenientes de la nvSPE-CE-MS respecto a la SPE-CE-MS unidireccional. Finalmente, se han investigado nuevas estrategias para el análisis rápido y eficiente de digestos de proteínas. La tripsina es la enzima proteolítica más comúnmente utilizada y la digestión se realiza habitualmente en disolución, requiriéndose largos tiempos de digestión. Con el objetivo de disminuir el volumen de muestra, su manipulación y el tiempo total de análisis, en esta tesis se ha desarrollado una metodología de análisis de proteínas empleando microrreactores empaquetados con partículas con tripsina inmovilizada en línea con la CE-MS (IMER-CE-MS).
In recent years, an increased emphasis has been placed on the analysis of biomarker compounds in biological samples for the diagnosis, follow-up and prognosis of numerous diseases. The leading difficulties in many of these analyses are the low concentration of the biomarkers, their structural complexity, the sample matrix effects and the limited availability of sample. In this doctoral thesis, we present novel strategies based on capillary electrophoresis- mass spectrometry (CE-MS) for the separation, detection, characterization and quantification of peptide, protein and microRNA (miRNA) biomarkers in biological fluids. MS is a powerful technique for the unequivocal identification of biomolecules due to its potential with regard to the detailed structural characterization of unknown compounds. However, due to the complexity of most biological fluids, the hyphenation of high-performance separation techniques is essential prior to MS analysis. In this regard, CE is a microscale technique that is very suitable for the separation of charged biomolecules. Nevertheless, electrophoretic separation methods must be properly optimized to achieve rapid, efficient, sensitive and high-resolution separations. In this thesis, we have investigated novel strategies to predict and optimize the separation of complex mixtures of peptides in CE. To assess these strategies, amyloid beta peptides, which are biomarkers of Alzheimer’s disease, were studied. A major limitation of CE is the relatively poor concentration sensitivity for most analytes due to the small sample volume that can be injected in the separation capillary. On-line solid- phase extraction capillary electrophoresis (SPE-CE) is a powerful approach for sample clean-up and reduction of the limits of detection. In SPE-CE, analytes from a large volume of sample are retained on a sorbent contained in a microcartridge. In unidirectional SPE-CE, the most typical configuration, the microcartridge is mounted in series to the separation capillary, inserted near the capillary inlet. After sample loading, the microcartridge is washed to remove non-selectively retained molecules. Then, the retained analytes are desorbed in a small volume of eluent, resulting in sample clean-up and concentration enhancement before electrophoretic separation and detection. In the present thesis, selective sorbents, such as immunoaffinity, aptamer affinity, immobilized metal affinity and silicon carbide sorbents have been explored in unidirectional SPE-CE-MS for the analysis of intact proteins, such as transthyretin, which is a biomarker of familial amyloidotic polyneuropathy type I, and α-synuclein, which is related to Parkinson’s disease, protein digests and miRNAs, which are related to cancer, in biological fluids. Unidirectional SPE-CE-MS is straightforward to implement. However, this simple setup has some inherent limitations. On the one hand, the sample volumes introduced using pressure depend on the dimensions of the separation capillary. On the other hand, sample loading is conducted in the same direction as the subsequent separation. Therefore, some of the matrix components could be irreversibly adsorbed in the inner wall of the separation capillary. Furthermore, in many cases, the requirements of on-line preconcentration are incompatible with the BGE necessary for an efficient separation or sensitive MS detection. In order to overcome these drawbacks, some new configurations where the sample is introduced in an orthogonal direction to the separation have been proposed, requiring the use of valves. We have investigated SPE-CE-MS with a nanoliter valve (nvSPE-CE-MS). A nvSPE-CE-MS method with a C18 sorbent for the analysis of opioid peptides and amyloid beta peptide fragments has been developed and the advantages and disadvantages compared to the unidirectional SPE-CE- MS have been discussed. New strategies for high-throughput bottom-up analysis of proteins have also been investigated. Tryptic digestion has been traditionally conducted in solution and requires long digestion times. In contrast, immobilized enzymes allow decreasing the sample volume and the total digestion times, minimize the sample handling, improve the digestion yields, as well as to stabilize the enzyme, avoid its autoproteolysis and simplify its recovery making it reusable. In this thesis, we have investigated on-line immobilized enzyme microreactor capillary electrophoresis-mass spectrometry (IMER-CE-MS) using microreactors packed with immobilized trypsin particles.

Bactérias metanotróficas são capazes de utilizar metano como única fonte de carbono e energia, e sua importância no ambiente está relacionada à mitigação das emissões deste gás para a atmosfera. Os manguezais brasileiros são altamente produtivos, apresentam potencial para a produção de metano, e infere-se que a comunidade metanotrófica seja fundamental neste ecossistema. O escopo do projeto foi pesquisar a diversidade taxonômica e funcional de bactérias metanotróficas presentes em sedimento do manguezal de Bertioga (SP, Brasil), através de novas técnicas de cultivo e enriquecimento, incluindo a técnica de DNA-SIP com utilização do metano como substrato marcado, o que permite estudar o papel das bactérias não cultiváveis na oxidação do CH4. Consórcios que utilizam metano para o crescimento foram obtidos nos pontos estudados. Representando a microbiota ativa (DNA marcado), foram identificadas metanotróficas clássicas da família Methylococcaceae, além de grupos de micro-organismos cujo papel no ciclo do CH4 é incerto, como os da Família Methylophilaceae e do Filo TM7.
Methanotrophic bacteria are able to use methane as sole carbon and energy source, and its importance in the environment is related to the mitigation of methane emissions to the atmosphere. Brazilian mangroves are highly productive, have potential to methane production, and it is inferred that methanotrophic community is of great importance for this ecosystem. The scope of the project was to investigate the functional and taxonomic diversity of methanotrophic bacteria present in sediments from Bertioga´s mangrove (SP, Brazil), through new techniques of cultivation and enrichment, including the technique of DNA-SIP with the use of methane as a labeled substrate, which allows to study the role of non-culturable bacteria in the oxidation of CH4. Microbial consortia using methane for growth were obtained from studied samples. Representing the active microbiota (labeled DNA), were identified classic metanotrophs belonging to Family Methylococcaceae, and groups of micro-organisms whose role in methane cycle is uncertain, as the Family Methylophilaceae and the Phylum TM7.

Los IRES o Sitios Internos de Entrada Ribosomal son secuencias altamente estructuradas que se encuentran en la región no traducida del extremo 5' (5'-UTR) de diversos virus y mRNAs eucariotas que habilitan un mecanismo de traducción alternativo independiente de cap. La elevada conservación entre los genotipos virales hacen de los elementos IRES dianas potenciales hacia las que orientar el diseño de nuevos compuestos antivirales. Hace unos años, un cribado masivo por espectrometría de masas para seleccionar ligandos del IRES de hepatitis C (HCV IRES) permitió identificar un derivado de 2-aminobenzimidazol. Estudios adicionales de relación estructura-actividad originaron Isis-11, un derivado de 2¬aminobenzimidazol que inhibía la replicación de HCV a concentraciones submicromolares. Además, Isis-11 exhibió una afinidad micromolar por el subdominio Ila del IRES de HCV, un segmento esencial para la unión correcta del IRES al ribosoma. Los estudios estructurales sobre el subdominio Ila demostraron que los ligandos basados en 2-aminobenzimidazol se unen a una protuberancia de cinco nucleótidos altamente conservada produciendo un cambio conformacional que conlleva la inhibición de la función IRES. La fiebre aftosa (FMDV o Foot-and-Mouth Disease Virus) es un picornavirus cuya traducción es también mediada por IRES. A pesar de diferir en secuencia y estructura, los IRES de HCV y FMDV comparten ciertas similitudes. Éstas han llevado a conjeturar sobre la posibilidad que los derivados de 2-aminobenzimidazol pudieran comportarse también como ligandos del IRES de FMDV e inhibir su actividad. En la presente Tesis, se ha descrito la preparación de nuevos derivados de Isis-11, a los que hemos nombrado IRAB (IRES Aminobenzimidazol Binder). Para ello, se ha desarrollado una nueva ruta sintética, reduciendo el número de etapas y la complejidad del procedimiento original. Tras la síntesis se ha evaluado la interacción de los compuestos con la estructura del IRES de FMDV mediante ensayos biofísicos y de footprinting. Los experimentos biofísicos se han llevado a cabo mediante diferentes técnicas. En un primer bloque, se intentó evaluar la interacción de los ligandos con el IRES de FMDV mediante curvas de fusión y dicroísmo circular. Tras esta evaluación preliminar, se han realizado valoraciones por fluorescencia que han permitido determinar la afinidad de los ligandos por diferentes segmentos del IRES de FMDV. A modo de comparación, se han realizado los mismos experimentos con el subdominio Ila de HCV IRES. Los resultados han mostrado afinidades en los rangos submicromolar y micromolar bajo. Por último, se llevó a cabo una caracterización termodinámica completa de la interacción mediante valoraciones por calorimetría isotérmica (ITC) Los experimentos de footprinting mediante el radical hidroxilo y por SHAPE (Selective 2'- Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) han permitido determinar el impacto de la interacción de los ligandos sobre las estructuras secundaria y terciaria del IRES de FMDV. En conjunto, los resultados no han mostrado un lugar único de interacción con el IRES de FMDV. No obstante, todo parece sugerir que la interacción de los ligandos con el IRES tiene lugar preferentemente con uno de los dominios del IRES esenciales para su correcta actividad, produciendo con ello un cambio conformacional sutil pero suficiente para inhibir el mecanismo de traducción mediado por IRES. El estudio se ha completado llevando a cabo estudios de actividad de los derivados aminobenzimidazol, midiendo en primer lugar la inhibición de la traducción mediada por IRES, en FMDV y HCV, mediante experimentos in vitro, y también determinando in vivo la inhibición de replicación viral en células infectadas. En vista de los resultados, se puede concluir que la actividad antiviral de los dos compuestos ensayados, Isis-11 e IRAB-1, tiene relación con su capacidad en interferir en la traducción de FMDV mediada por IRES por interacción directa con el RNA. Una ruta sintética más directa y la actividad sensiblemente mejor de IRAB-1 en relación a Isis-11 permiten pensar que podrán desarrollarse otros derivados IRAB con mayor actividad antiviral, producto de una mejor selectividad por el RNA IRES.
IRES or Internal Ribosomal Entry Sites are highly structured sequences harbored on the 5' untranslated region (5'-UTR) of several virus and eukaryotic mRNAs that enable an alternative cap-independent translation. Highly conserved in virus genotypes, IRESs are attractive targets to design novel antiviral drugs. A few years ago, massive MS-screening for the selection of Hepatitis C virus IRES (HCV IRES) ligands identified a 2-aminobenzimidazole-containing compound. Further SAR studies conducted on 2-aminobenzimidazoles originated Isis-11, which inhibited HCV replication with a submicromolar EC50. Isis-11 exhibited a micromolar affinity against subdomain Ila of hepatitis C virus IRES (HCV IRES), an essential motif for the proper binding of the IRES to the ribosome. Structural studies showed that subdomain Ila contains a highly conserved 5-nucleotide bulge to which Isis-11 and related compounds can bind to promote a conformational switch that ultimately leads to IRES function inhibition. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a picornavirus whose translation is also driven by the IRES element present at the 5'-UTR of RNA. Although HCV and FMDV IRES differ significantly in nucleotide sequences and structure, the similarities between both IRESs led us to hypothesize that 2-aminobenzimidazole derivatives could also act as FMDV IRES binders, and lead to the inhibition of FMDV IRES-mediated translation. We describe the preparation of new Isis-11 analogues, collectively referred to as IRAB (IRES aminobenzimidazole binders), that have been shown to inhibit FMDV IRES-dependent protein synthesis and viral replication at micromolar concentracions. A series of biophysical assays, such as circular dichroism, fluorescence and microcalorimetry, have been performed to determine the binding affinity of these ligands for segments of FMDV IRES. For comparison purposes, the same compounds have been also evaluated as HCV IRES ligands. In both cases, affinities in the micromolar and submicromolar range have been determined. SHAPE (Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) analysis and hydroxyl radical footprinting have been also carried out to characterize the binding of IRAB analogues to FMDV IRES.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Os produtos biofarmacêuticos englobam os produtos à base de proteínas terapêuticas, de ácidos nucleicos e os que são usados em terapia celular. Com o crescimento exponencial que se tem verificado nos últimos anos para a biotecnologia farmacêutica, o uso clínico destes produtos tem vindo a aumentar. Contudo, tendo em conta as características físico-químicas das moléculas, têm surgido algumas limitações relativas à administração de produtos biofarmacêuticos. Com efeito, a investigação tem-se focado nos estudos relativos ao desenvolvimento de novos sistemas para veicular estes produtos. Neste contexto, e tendo em conta as vantagens que apresentam, as nanopartículas lipídicas têm sido apresentadas como promissoras. Na primeira parte deste trabalho é efectuada uma revisão bibliográfica relativa aos diferentes produtos biofarmacêuticos, às suas características e limitações de administração. Na segunda parte, é apresentada uma revisão relativa ao estado da arte do uso de nanopartículas lipídicas para promover a administração de produtos biofarmacêuticos. Biopharmaceutical products include therapeutic proteins, nucleic acids and cell-based products. Within the exponential growth of pharmaceutical biotechnology the clinical use of these products has been increasing. Nevertheless, according to the physical and chemical nature of the molecules, some limitations have appeared, limiting the use of biopharmaceutical products. In this way, the number of studies related with the development of new solutions for using biopharmaceutical products has been growing. Accordingly, due to its advantages, lipid nanoparticles have been presented as promising candidates. The first part of this work provides a bibliographic overview of the different biopharmaceutical products, and their characteristics and limitations for therapeutic use. In the second part, is presented a review of the state-of-the-art of using lipid nanoparticles systems to improve the therapeutic efficacy of biopharmaceutical products.

Aquesta tesi doctoral s’ha basat en el desenvolupament de nous compostos amb capacitat per interaccionar de forma selectiva i específica amb l’estructura secundària localitzada al final de l’exó 10 del pre-mRNA codificant de la proteïna tau, ja que l’aparició de mutacions que la desestabilitzen està relacionada amb l’aparició de malalties degeneratives, com ara la FTDP-17 (Demència Frontotemporal i Parkinsonisme associat al cromosoma 17). La identificació dels lligands, s’ha dut a terme mitjançant la química combinatòria dinàmica (DCC) a travès de reaccions reversibles de bescanvi d’enllaços tiol-disulfur sobre una biblioteca dinàmica formada per un total de 10 compostos orgànics derivatitzats amb un grup tiol, tots ells amb capacitat per interaccionar amb els diversos motius estructurals presents a l’RNA. Concretament, s’han sintetitzat quatre molècules denominades Janus amb l’objectiu de reconèixer específicament els parells G-U, que es troben tant a la seqüència nativa com a les mutades, i un derivat de l’ametantrona amb capacitat per intercalar-se a la regió del bulge present a l’estructura de l’RNA diana. A més, també s’ha incorporat un compost heteroaromàtic per al reconeixement de bases desaparellades, dos derivats aminoglicosídics i l’agent intercalant acridina. Els resultats obtinguts han confirmat que els lligands derivats de l’ametantrona interaccionen preferentment amb la seqüència nativa de la diana d’RNA en comparació amb els que contenen acridina, on la combinació amb l’aminoglicòsid ha estat la més afavorida. A continuació, tant la seva síntesi a gran escala com la d’un segon grup de compostos de segona generació, basats en la guanidinilació del fragment neamina i en la doble funcionalització del residu amentatrona, s’ha dut a terme en solució. Un cop sintetitzats els diferents compostos, en una segona part del treball s’ha estudiat la seva interacció amb la diana a través de diverses tècniques biofísiques (espectroscòpia de fluorescència, d’UV-visible i d’RMN), amb l’objectiu de determinar, d’una banda, l’afinitat i l’especificitat amb la seqüència oligoribonucleotídica i, de l’altre, el seu lloc d’unió. Finalment, també s’ha determinat la capacitat estabilitzant dels lligands amb la seqüència nativa i les mutades, clau per al desenvolupament de nous fàrmacs que permetin regular el processat alternatiu de l’exó 10 del pre-mRNA de tau.
RNA plays an essential role in many cellular processes, from the regulation of gene expression to protein synthesis, as well as in the progression of viral diseases. Hence, the discovery of selective and, more importantly, specific ligands for this macromolecule represents a challenge for medicinal and bioorganic chemistry and therapy. Moreover, the potential for targeting RNA with small molecules is immense given its ability to adopt complex three-dimensional structures, similar to those observed in proteins. Most of the known RNA-binding ligands can each bind to several different RNA targets of unrelated sequence and structure, which compromises their biological applications. We hypothesize that affinity and specificity could be improved by combining two or more small molecules with different abilities to recognize some of the secondary structural motifs present in a particular RNA target. This fragment-based lead-discovery search approach offers new perspectives and opportunities for identifying RNA ligands with improved properties, as well as for increasing our understanding of RNA recognition mechanisms. In this PhD thesis, we have used dynamic combinatorial chemistry (DCC) to identify ligands for the stem-loop structure located at the exon 10-5’-intron junction of tau pre-mRNA, which is involved in the onset of several tauopathies, including frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). These compounds bind to the stem-loop RNA target with high affinity (70 – 300 nM) and are able to stabilize both the wild-type and the +3, +14 and +16 mutated sequences associated with the development of FTDP-17. In addition, some of them seem to have a preferred binding site in the target RNA, as inferred from spectroscopic studies (UV-visible, fluorescence and NMR).

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-14T13:46:13Z No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5)
Made available in DSpace on 2012-05-14T13:46:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) Previous issue date: 2010
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Este trabalho teve com objetivo o desenvolvimento e a validação/aplicação de um sistema integrado de genotipagem de protozoários, utilizando uma abordagem multidisciplinar envolvendo, PCR multiplex e análise bioinformática envolvendo evolução e filogenia molecular. Para isso, trinta e seis genes ortólogos universal (UOG) foram identificados e usados como marcadores para genotipagem de protozoários parasitas, a nível inter-específico. Temos extraído os dados genéticos de genes ortólogos universal selecionado. Para isso, estamos utilizando sequências de grupos ortólogos (COG e KOG). O COG é composto de genes ortólogos individuais ou grupos de ortólogos de parálogos de 3 ou mais linhagens filogenéticas. Os COG de interesse selecionados estão envolvidos processo de tradução protéica, categoria J do COG, e estes genes foram selecionados porque eles estão presentes em todos os organismos estudados até agora, o que facilita a montagem de um sistema integrado de protozoários patogênicos. As sequências desses genes foram obtidos a partir do banco de dados GenBank. Seqüências de espécies de Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum e P. vivax foram obtidas e armazenadas localmente. Estas sequências nucleotídicas foram traduzidas em proteínas, e então validadas usando a ferramenta COGnitor/KOGnitor, que mostra a sequência selecionada pertence ao respectivo COG de interesse. Após essa validação, as sequências foram utilizadas nos alinhamentos e construção de iniciadores que foram usados para gerar fragmentos gênicos amplificados por PCR. Os programas para a construção dos iniciadores foram: Mafft para a construção de alinhamentos múltiplos de cada COG, JalView para visualizá-los e o programa Primer3 para o desenho dos iniciadores. Todo o processo foi realizado por um pipeline de integração destes programas escritos em linguagem de programação Perl. Após o processo automatizado de validação, alinhamento e construção dos iniciadores, realizamos uma análise final dos iniciadores, considerando suas características e da região de pareamento. Quando necessário, definiu-se manualmente a degeneração da posição dos nucleotídeos que contem a variação. Criamos 33 pares de iniciadores, que foram utilizados para a amplificação destes genes via PCR. As reações de amplificação da PCR fora bem-sucedida em 19 UOG nas espécies Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax e Plasmodium vivax, utilizando-se iniciadores com posições degeneradas. Para genotipagem das seqüências geradas pela PCR, foi utilizado o programa Phred que realizou a leitura dos cromatogramas com qualidade por base, Phred ≥ 15, e o programa Blast foi utilizado para a caracterização das sequências geradas, estas duas etapas foram realizadas em pipeline de anotação que está disponível através de um website. As árvores filogenéticas foram geradas com o método de máxima verossimilhança utilizando o pipeline ARPA, e revelou que a metodologia apresenta potencial para ser utilizado na genotipagem destes organismos e os genes da metionil-tRNA sintetase e Seril-tRNA sintetase mostraram boa resolução para a genotipagem inter-específicas de tripanosomatídeos.
The aim of this work is to develop and validate an integrated genotyping system for protozoan parasites, using a multidisciplinary approach involving, multiplex PCR, and bioinformatics analysis involving molecular evolution and phylogeny. For this, thirty three universal orthologous genes (UOG) has been identified [1] and used as markers for genotyping parasitic protozoan at the intraspecific level. We have mined genomic data of universal orthologous genes selected. For this, we are using sequences of orthologous groups (COGs and KOGs). The COG's consists of individual orthologous genes or orthologous groups of paralogous of 3 or more phylogenetic lineages. The selected COGs of interest are involved protein translation process, category J of the COG and these genes are selected because they are present in all organisms studied so far, facilitating the assembly of an integrated system for the pathogenic protozoa. Note that all these genes are part of the process of protein translation. The sequences of these genes were obtained from GenBank database. Sequences of species, Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum and P. vivax were obtained and locally stored. Nucleotide sequences were translated into proteins. So, they are validated using the Blast similarity tool and the database as the COG itself, which shows the sequence selected belongs to the respective COG. After this validation, the sequences were used in alignments and construction of primers that are used to generate amplicons by PCR. The programs for the primer construction were: Mafft for construction of multiple alignments of each COG, JalView to view them and the program Primer3Plus [6] for the design of primers. The whole process was performed by a pipeline integrating these programs written in Perl [7] programming language. After the automated process of validation, alignment and construction of the primers, we perform a final analysis of the primers manually, which gives its characteristics and the annealing region. When necessary, we manually define the degeneration of nucleotide position containing variations. We have designed 33 primer pairs, and these primers were designed and used for PCR amplification. The reactions of PCR amplification was successful for 19 UOG in species: Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax and Plasmodium vivax, using primers with degenerate positions. For genotyping the sequences generates by PCR amplification was used the program Phred for reading chromatograms file with quality ≥ 15, and Blast to the characterization of sequences generated, this two steps was make with a pipeline and is available through a website. The phylogenetic trees was generated with methods of maximum likelihood using the pipeline ARPA, and revealed that the methodology has potential to be used in genotyping of these organisms, and genes of methionyl-tRNA synthetase, seryl- tRNA synthetase showed good resolution for the inter-specific genotyping of trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 3641805 bytes, checksum: 551d726828aba255caeef4c323eae9ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Esta tese descreve o projeto conceitual do sistema de banco de dados ProteinWorldDB (PWDB). Um ponto importante da proposta do PWDB é permitir a construção de consultas e procedimentos no domínio da genômica comparativa sem a necessidade de comparação de sequências. Além disso, o PCG comparou milhões de sequências de proteína, incluindo o conjunto proteico total de centenas de genomas completos, utilizando programação dinâmica, e não um método heurístico, para os cálculos de similaridade. A estratégia do PCG, assim como a genômica, está fundamentada no conhecimento de que sequências biológicas por si só são pouco informativas; elas precisam ser analisadas a partir de um enfoque comparativo para a inferência de homologia. A comparação de sequências de diferentes organismos introduz uma perspectiva evolutiva ao processo, e o estudo comparativo de genomas completos pode ampliar a escala do conhecimento de um único processo biológico para o de sistemas biológicos complexos em células e organismos. Para responder eficientemente questões dessa natureza, o esquema conceitual apresentado associa bases de dados biológicos de referência aos índices de similaridade já pré-calculados e armazenados pelo PCG Utilizando um formato gráfico de fácil compreensão para representar conceitos e relacionamentos (diagrama ER), o esquema foi proposto para facilitar o planejamento de consultas e procedimentos por pesquisadores da área de genômica (sem conhecimento de linguagens de bancos de dados), assim como guiar o desenvolvimento e a implementação física do PWDB por profissionais da área de computação. Alguns exemplos são apresentados com o objetivo de demonstrar a utilização do esquema conceitual para a especificação de consultas e procedimentos, mesmo antes da existência de um esquema lógico. O esquema pode ser facilmente estendido. Módulos anexos podem ser inseridos/removidos para incluir outros projetos, baseados em comparação de sequências de proteína, que se beneficiem das informações fornecidas pelo módulo central do esquema e novas bases de dados, específicas de diferentes áreas (-ômicas, por exemplo), podem ser integradas ao esquema
This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema
This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-19T13:39:08Z No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5)
Made available in DSpace on 2012-09-19T13:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) Previous issue date: 2011
Universidade Federal Fluminense. Centro de Estudos Gerais. Instituto de Biologia. Niteroi, RJ, Brasil
A família Trypanosomatidae inclui parasitas de uma grande variedade de vertebrados, invertebrados (principalmente insetos), plantas e algumas espécies de protozoários, sendo, depois do nematóides, os de maior distribuição de hospedeiros na natureza. No presente trabalho, um novo isolado foi obtido por coprocultivo de trato intestinal de Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae), capturado no município de Itaguaí/RJ. O isolado original e três clones (obtidos por citometria de fluxo) foram depositados na "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses." Um clone foi caracterizado por diversas abordagens em comparação com espécies de referência de diferentes gêneros. Foi analisado o crescimento em meio de cultivo em intervalos de 24 h, entre 48-144 h, a diferenciação celular e a morfometria dos principais estágios evolutivos encontrados. A análise de isoenzimas foi realizada utilizando-se os seguintes sistemas: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH e ACON. RAPD-PCR foi realizado utilizando-se 6 iniciadores, conjuntamente com outros tripanosomatídeos. Os dados destas análises foram processados numericamente e submetidos à análise computacional utilizando-se o coeficiente de associação Jaccard e o algoritmo de agrupamento UPGMA. Realizou-se seqüenciamento do amplicon do gene de SSU rRNA e o fragmento analisado foi alinhado com vinte e uma seqüencias depositadas no GenBank, gerando uma árvore filogenética resultante do pareamento. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que a amostra obtida constitui nova espécie, pertencendo a um novo gênero, nomeada Vickermania itaguaiensis.
The Trypanosomatidae family includes parasites of a wide variety of vertebrates, invertebrates (mainly insects), plants and some species of protozoa, and after the nematodes, the highest distribution of hosts in nature. In this study, an isolate was obtained by coproculture from Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae) intestinal tract, captured in the city of Itaguaí/RJ. The original isolate and clones (obtained by flow cytometry) were deposited in the "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmaniose". One clone was characterized by several approaches in comparison with the reference species of different genus. Growth was analyzed in culture medium at 24 h intervals between 48-144 h, cell differentiation and morphometric parameters of the main evolutionary stages matches. The isoenzyme analysis was performed using the following systems: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH and ACON. RAPD-PCR was performed using 6 primers, together with other trypanosomatids. The analysis of these data were numerically processed and submitted to computer analysis using the Jaccard association coefficient and UPGMA clustering algorithm. We carried out sequencing of the amplicon from SSU rRNA gene and the fragment analyzed was aligned with twenty-one sequences deposited in GenBank, generating a phylogenetic tree resulting from the pairing. The result set of this work suggests that the sample obtained represents a new species belonging to a new genus, named Vickermania itaguaiensis.

The purpose of my doctoral studies has been the development of bioinformatics methods to quantitatively evaluate associations between proteins and nucleic acids (NAs). This thesis aims at providing insights into molecular features and still relatively unknown mechanisms of protein-NAs associations, such as RNA-binding proteins and long noncoding RNAs as well as transcription factors and regulatory DNA elements. In this work, I present two algorithms, catRAPID omics express and PAnDA, for the prediction of RNA- and DNA-protein interaction respectively. Those computational methods offer the possibility to address experimental problems and guide new approaches largely facilitating experimental design and procedures
Mis estudios de doctorado han tenido como propósito principal el desarrollo de herramientas bioinformáticas para la evaluación de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos (ANs) de forma cuantitativa. Por consiguiente, esta tesis apunta a proporcionar conocimientos sobre características moleculares y mecanismos de asociación proteína-AN aún relativamente desconocidos; concretamente, la asociación de proteínas a ARNs y ARNs no codificantes, a la vez que factores de transcripción y elementos de regulación del ADN. En este proyecto presento dos algoritmos: catRAPIDomics express y PAnDA, cuyas finalidades son las de predecir interacciones proteína-ARN y proteína-ADN respectivamente. Dichos métodos computacionales ofrecen la posibilidad de abordar problemas experimentales, así como de guiar el diseño y procedimiento de nuevas estrategias para su resolución.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-20T17:10:28Z No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5)
Made available in DSpace on 2012-07-20T17:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) Previous issue date: 2006
Cnpq
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
O estudo de tripanosomatídeos de plantas teve início em 1909, quando foram encontradas formas flageladas em látex, sendo depois encontradas em floema, frutas e flores. Desde a refutada tentativa de Donovan de criar o gênero Phytomonas, temos atualmente, várias espécies classificadas dentro do gênero Phytomonas, incluíndo Phytomonas serpens, organismo alvo de nosso estudo. O ciclo de vida de P. serpens compreende planta e inseto. A transmissão é feita do tomate para inseto, do inseto para tomate. O vetor natural é o hemíptero Phthia picta (Hemiptera: Coriidae) que quando se alimenta de tomates infectados, se torna infectado após 10 a 15 dias, apresentando parasitos nas fezes, urina, tubo digestivo e glândulas salivares. Pouco se sabe sobre P. serpens e o conhecimento é ainda mais escasso se levarmos em conta todos os organismos dentro do gênero Phytomonas. O objetivo deste projeto é explorar o genoma de P. serpens gerando e analisando seqüências de seu genoma, aumentando o conhecimento deste organismo e comparando seu genoma com outros organismos. A cepa 9T de P. serpens (CT–IOC-174) foi cultivada a 27oC em meio Schneiders ́insect medium suplementado com 10% de soro fetal bovino. O DNA genômico foi extraído por lise alcalina para a construção da biblioteca genômica. O DNA foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA com tamanhos entre 1-3 kb foram recuperados do gel de agarose e purificados. Os fragmentos de DNA foram clonados no sítio BamHI do vetor de clonagem pUC18. A reação de sequenciamento foi realizada na plataforma de sequenciamento ABI3730 – 48 capilar PDTIS/FIOCRUZ e na plataforma MegaBase na UERJ. Todas as seqüências foram armazenadas em banco de dados “open source” nos servidores Linux no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos (DBBM/IOC/FIOCRUZ). Foram seqüenciados 829 clones da biblioteca de DNA genômico obtendo-se um total de 379 seqüências GSS (Genomic Sequence Survey) de alta qualidade. Foram utilizadas para a complementação deste estudo, as seqüências do projeto EST de P. serpens que estavam disponíveis no GenBank. Os 221 clusters GSS e os 697 clusters de EST (Expressed Sequence Tag) foram comparados com o programa de busca de similaridade Blast a diferentes bancos de dados, utilizando como parâmetro evalue 10 -5, gerando 599 clusters com entradas positivas (Hits) e 303 clusters com nenhum hit, representando possíveis genes espécie específicos. Os clusters foram anotados de acordo com sua função quando comparados ao banco de dados Gene Ontology (GO) representando uma análise inédita no genoma de P.serpens. Inferências filogenéticas e de similaridade com o banco “Taxonomy” do NCBI foram realizados, usando inclusive seqüências do genoma ambiental, para verificar se as mesmas pertencem a Kinetoplastida, o que não se comprovou. As inferências filogenéticas realizadas com genes concatenados mostraram que P. serpens é mais próximo de T. cruzi, enquanto que inferências com genes individuais apontaram para L. major. Com base na literatura, inferimos que a análise da árvore de genes concatenados é correta. Foram encontradas com o GLIMMER 20 genes hipotéticos nas seqüências de GSS. Encontramos 22 cluters em GSS que não foram encontrados anteriormente em EST, como por exemplo, Piroglutamil-peptidase I, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Peptidase_M8.
The study of trypanosomatids of plants began in 1909, when flagellate forms were found in latex from Euphorbiaceae, being later found in phloem, fruits/seeds and flowers in a wide variety of plants species. Since the refuted attempt of Donovan to create the genus Phytomonas, a great number of species were classified in the genus Phytomonas, including Phytomonas serpens, the major organism of our study. The described life cycle of P. serpens involves plant (tomato) and insect. The natural vector is the Coreid bug, Phthia picta (Hemiptera: Coriidae), that becomes infected 10 a 15 days after feeding on infected tomatoes, presenting the parasite in excrements, urine, digestive tube and salivary glands. Very little is known about these organisms and even less is known about the genus Phytomonas. The goal of this project is to explore the P. serpens genome by generating and analyzing sequences of its genome aiming to increase the knowledge of this organism and to analyze comparatively with genomes of other organisms. P. serpens infects tomatoes but we still have doubts about its pathogenicity. A strain of P. serpens 9T (CT-IOC-174) was cultured at 27oC in Schneiders ́insect medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum. The DNA was extracted by alkaline lyses for the construction of a genomic library. Genomic DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3A. DNA fragments with an average size of 1.0-3.0 kb were recovered and purified from agarose gel. DNA inserts were cloned into the BamHI restriction site of pUC18 cloning vector. The sequencing reaction was made at the Sequencing Platform ABI3730 - PDTIS/FIOCRUZ and MegaBase platform at UERJ. All the sequences were stored in an open source database in the Linux server in the Laboratory of Molecular Biology of Trypanosomatids and Phlebotomines (DBBM/IOC/FIOCRUZ). 829 clones of the P. serpens genomic DNA library were sequenced obtaining a total of 379 high quality sequences GSS (Genome Sequence Survey). Sequences from the EST (Expressed Sequence Tag) project of P. serpens available at GenBank were used for the complementation of this study. 221 GSS clusters and 697 EST clusters were compared with different databases with the similarity search program Blast, using evalue 10 -5 as default, obtaining 599 clusters with positive hits and 303 clusters without hit, indicating possible species-specific genes. 357 clusters that were identified when compared with Gene Ontology (GO) had their function classified, representing the first analysis of P. serpens genome using GO. Phylogenetics and similarity studies with Taxonomy database from NCBI were carried out confirming the position of P. serpens in relations to the others trypanosomatids and disclosing similarity with T. cruzi genome. The phylogenetic study included sequences of the enviromental genome, in order to verify if these sequences belong to the Kinetoplastid, what was not proven to be true. Phylogenetic studies using concatenated genes showed that P. serpens is phylogenetically closer to T. cruzi, but studies with individuals genes pointed to L. major. Based on literature, we infer that the analysis of the tree of concatenated genes is correct. 20 hypothetical genes in the GSS sequences were found with the GLIMMER. We found 22 clusters in GSS sequences that were not found in EST before, among others, Pyroglutamil-peptidase I, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Peptidase_M8.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T15:22:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Monica Lemos Ammon Fernandez.pdf: 8355019 bytes, checksum: dfee6b67fb0314370a761d01a0ee90d4 (MD5)
Made available in DSpace on 2012-12-26T15:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Monica Lemos Ammon Fernandez.pdf: 8355019 bytes, checksum: dfee6b67fb0314370a761d01a0ee90d4 (MD5) Previous issue date: 2011
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Febre Q é uma zoonose cosmopolita causada por Coxiella burnetii, pequena bactéria intracelular obrigatória gram-negativa e pleomórfica da ordem Legionellales. A doença, que ocorre como pequenos surtos ou como casos isolados, tem amplo espectro de manifestações clínicas, desde uma doença febril limitada, pneumonia, hepatite a endocardite e meningoencefalite. Carrapatos, animais de fazenda, domésticos e selvagens são reservatórios da infecção. A transmissão para o homem ocorre por inalação de aerossóis provenientes de urina, fezes, leite e produtos de abortamento ou menos comumente pela ingestão de leite cru de animais infectados. No Brasil, desde a primeira descrição de febre Q em 1953, em São Paulo, todos os casos têm sido identificados com base em teste sorológico e os poucos estudos soroepidemiológicos em população de risco apontam para a circulação de C. burnetii. Em 2008 foi possível confirmar um caso de febre Q em um paciente, a partir de análise sorológica e molecular. Com o objetivo de rastrear um foco de infecção por C. burnetii, um estudo epidemiológico descritivo foi desenvolvido na área de ocorrência do primeiro caso no Brasil de febre Q confirmado, em 2008, por análise molecular, no Município de Itaboraí, Rio de Janeiro. Análises sorológicas e moleculares foram realizadas em amostras biológicas de familiares e de cães, gatos, cabras e equinos existentes na área estudada, em 2009. Amostras de soro foram submetidas ao teste comercial de imunofluorescência indireta (PANBIOTM), título de corte de 64, para a pesquisa de anticorpo anti-C. burnetii, fases I e II. Amostras de sangue dos familiares e dos animais, assim como de leite, fezes e de secreção nasal, vaginal, além dos artrópodes, coletados nos animais, foram submetidas à PCR (reação em cadeia da polimerase) para a presença da bactéria, utilizando oligonucleotídeos para o gene alvo htpAB. Reatividade foi identificada em amostras de soro da esposa, de 2 dos 13 caninos, 05 de 10 caprinos e 02 das 03 ovinos. O genoma foi recuperado em amostra de sangue e/ou leite ou swab anal de 02 cães e 06 cabras. O sequenciamento dos produtos de PCR amplificados, do soro dos cães e do leite das cabras, mostraram identidade de 99% para as sequências depositadas no GenBank. Embora não seja uma doença de notificação, os dados obtidos confirmam a circulação deste agente zoonótico e servem de alerta para a necessidade de vigilância epidemiológica da febre Q, em especial em Itaboraí, devido, entre outros fatores, ao crescente desmatamento com ocupação de vastas áreas e da criação, informal e de caráter familiar, de cabras leiteiras por pequenos proprietários nas diversas áreas do território nacional.
Q fever is a zoonosis caused by Coxiella burnetii, a obligate intracellular and pleomorphic, small gram-negative bacterium of Legionellales order. The disease, which can occur as small outbreaks or isolated cases, has a broad spectrum of clinical manifestations, from a limited febrile illness, pneumonia, hepatitis, endocarditis, and meningoencephalitis. Ticks, farm animals, domestic and wild are reservoirs of infection. Transmission to humans occurs through inhalation of aerosols from urine, feces, milk and products of abortion or less commonly by ingestion of raw milk from infected animals. In Brazil, since the first description of Q fever in 1953, in Sao Paulo, cases have been identified by serological tests and very few seroepidemiological studies in the population at risk have been performed showing the circulation of C. burnetii. In 2008 it was possible to confirm a case of Q fever in a patient, from molecular and serological analysis. Aiming to track the source of infection for C. burnetii, a descriptive epidemiologic study was developed in the area of occurrence of the first case of Q fever in Brazil in 2008, confirmed by molecular analysis in Itaboraí, Rio de Janeiro. Serological and molecular analysis was performed on biological samples from family and dogs, cats, goats and horses in the area of studied in 2009. Serum samples were tested with commercial indirect immunofluorescence (PANBIOTM), a cutoff of 64, for the detection of anti-C. burnetii, phases I and II. Blood samples from family members and animals, like milk, feces and nasal discharge, vaginal, and arthropods collected in animals were subjected to PCR (polymerase chain reaction) for the presence of bacteria, using primers for htpAB the target gene. Reactivity was detected in serum samples from his wife, two of the 13 dogs, 05 of 10 goats and 02 of 03 sheeps. The genome was recovered in a sample of blood and / or milk or anal swabs from 02 dogs and 06 goats. The sequencing of the PCR products amplified from the serum of dogs and goats' milk, showed 99% identity to the sequences deposited in GenBank Although not a notifiable disease, our data confirm the circulation of this zoonotic agent and serve as a reminder of the need for surveillance of Q fever, especially in Itaboraí due, among other factors, the increasing deforestation and occupation of vast areas and the creation of informal and familiar character in dairy goats by smallholders in various areas of the country.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2013.
Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-07T15:28:39Z No. of bitstreams: 1 2013_VytorPinheiroOliveira.pdf: 3505319 bytes, checksum: b33b0f7e6c2abf22d80df49de484fb7b (MD5)
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Atualmente, apenas estudos teóricos de alto nível são capazes de tratar de maneira acurada interações específicas entre o Mg2+ e os ácidos nucleicos. Esses estudos são importantes para desvendar o papel do Mg2+ no dobramento e no mecanismo de reação de ribozimas. O presente trabalho tem como objetivo definir uma estratégia computacional capaz de descrever as contribuições energéticas envolvidas nas reações de complexação do Mg2+ com as bases nucleicas timina, uracila, guanina, citosina e adenina nos sistemas [Mg(H2O)n-base nucleica]2+ (n=6,5 e 4) com a melhor razão possível entre acurácia e custo computacional. A combinação entre as energias eletrônicas de reação obtidas pelo método MP2(FC)/6-31+G(2d,p) e as correções térmicas do cálculo de frequência B3LYP/6-311G(2d,d,p) foram capazes de fornecer resultados semelhantes ao método de alto custo computacional CBS-QB3. As contribuições do solvente foram estimadas pelo modelo de contínuo CPCM; porém a definição da cavidade do solvente nos métodos PCM pode gerar desvios absolutos e relativos difíceis de serem estimados. Independentemente do modo de coordenação, o magnésio interagiu mais fortemente com os sítios O2 da citosina, O6 e N7 da guanina e mais fracamente com sítios da adenina, timina e uracila. Também observou-se que a aproximação de pares empregada por campos de força subestimou a energia de interação dos sistemas [Mg(H2O)5-base nucleica]2+ em até 40% e mesmo no solvente contínuo os efeitos de polarização e transferência de cargas entre o metal e as bases nucleicas foram significativos. A estratégia computacional aqui definida poderá ser aplicada a sistemas análogos, assim como a sistemas maiores que envolvam interações similares. Os resultados apresentados poderão ser utilizados para parametrizar e validar outros métodos de menor custo computacional, como campos de força clássicos e métodos semi-empíricos. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Currently, only high-level theoretical studies are able to treat specific interactions between Mg2+ and the nucleic acids accurately. These studies are important to unveil the role of Mg2+ in the folding and in the reaction mechanism of ribozymes. The present work is aimed at defining a computational strategy capable of describing the energies involved in the complexation reaction of Mg2+ with nucleic bases thymine, uracil, guanine, cytosine and adenine, in [Mg(H2O)n-nucleobase]2+ (n=6,5 and 4) systems with the best possible ratio between accuracy and computational cost. The combination between reaction electronic energies obtained at MP2(FC)/6-31+G(2d,p) level with thermal corrections calculated by B3LYP/6-311G(2d,d,p) frequencies were able to provide results similar to the high computational cost CBS-QB3. The solvent contributions were estimated using the CPCM. However, the electrostatic cavities definitions can produce absolute and relative errors in solution free energies difficult to be evaluated. Regardless of the coordination mode, magnesium interacted stronger at the cytosine O2, O6, and guanine N7 sites and weaker in adenine, thymine and uracil sites. It was also noted that the pairwise additive approach used by force fields underestimated the binding energy of [Mg(H2O)5-nucleobase]2+ systems by as much as 40% and even in the continuum solvent, polarization and charge transfer effects between metal and nucleic bases are significant. The method defined herein can be applied to study analog systems, as well as larger systems involving similar interactions. The presented results can be used to parameterize and validate other methods of lower computational cost, such as semi-empirical and classical force fields.

No grupo pediátrico, as principais causas de ascite são aquelas relacionadas à hipertensão do sistema porta, especialmente a cirrose de causas variadas. O desenvolvimento de ascite está associado a algumas complicações como a hiponatremia dilucional, a insuficiência renal funcional e a infecção da ascite. Na ausência de uma causa cirúrgica ou intra-abdominal de peritonite, distinguem-se duas formas principais de infecção da ascite: a peritonite bacteriana espontânea (PBE) e a bacteriascite (BA). Define-se a PBE como aquela situação associada a uma contagem de polimorfonucleares (PMN) na ascite > 250 células/μL. A BA é diagnosticada quando a cultura da ascite é positiva, na presença de uma quantidade de PMN na ascite < 250 células/μL. Como a cultura convencional da ascite mostra baixa sensibilidade, sua positividade não é necessária ao diagnóstico da PBE. O advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido a detecção de microrganismos em baixas concentrações, de cultivo exigente, demorado ou não disponível.O objetivo geral deste estudo foi comparar os resultados do método de amplificação da subunidade 16S do gene rRNA com aqueles obtidos pela técnica de cultura automatizada (BACTEC 9240) no diagnóstico de PBE, em crianças e adolescentes com ascite por hipertensão porta (gradiente albumina soro-ascite > 1,1 g/dl), acompanhados na unidade de gastroenterologia pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram estudados 31 pacientes e 40 paracenteses. A mediana da idade foi de 2,9 anos (intervalo interquartílico: 0,8-8,5 anos). Dezesseis pacientes foram do sexo masculino. Vinte e quatro pacientes eram cirróticos e, destes, vinte foram classificados com Child-Pugh C. A mediana do escore PELD foi de 18,5 (intervalo interquartílico: 0,8 – 8,5 anos). Aproximadamente, 10 mL de ascite foram inoculados, à beira do leito, em frascos de cultura, e incubados no sistema BACTEC 9240. Cerca de 20 mL da amostra foram enviados ao laboratório para a realização da coloração de Gram, para a análise bioquímica, para a contagem total e diferencial de células e para o estudo citopatológico. Simultaneamente, 10 a 30 mL de ascite foram estocadas a – 20o C para detecção do DNA bacteriano. Após extração do DNA com Trizol, a técnica de amplificação foi realizada utilizando-se primers para o gene 16S rRNA. Houve 12 episódios de ascite infectada (8 PBE e 4 BA). A cultura foi positiva em 4/8 casos de PBE. A sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) da cultura para o diagnóstico de PBE foram 50%; 87,5%, 50,0% e 87,5%, respectivamente. A técnica de amplificação do DNA bacteriano foi positiva em 7/8 casos dePBE, em 3/4 casos de BA e em 8 casos que apresentavam ascite com cultura negativa e não neutrocítica (ACNNN). A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN da PCR no diagnóstico de PBE foram 85,7%, 65,6%, 38,8% e 95,5%, respectivamente. Os pacientes com ACNNN foram classificados de acordo com os resultados do DNA bacteriano e comparados em relação ao escore PELD, ao gradiente de albumina soro-ascite e à mortalidade em três meses. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada. Concluímos que o método molecular foi mais sensível do que o da cultura no diagnóstico de PBE, podendo se constituir em um teste de triagem dessa complicação. A detecção de DNA bacteriano em 8 pacientes com ACNNN suscita questões a respeito da utilidade do teste também no diagnóstico de BA.
Cirrhosis is the most important cause of portal hypertensive ascites in children. The development of ascites in these patients is related to several complications such as dilutional hyponatremia, functional renal failure and infection of ascites. In the absence of secondary bacterial peritonitis, there are two forms of infected ascites: spontaneous bacterial peritonitis (SBP) defined as a polymorfonuclear (PMN) cell count in ascites > 250/μL and bacterascites (BA) defined as a positive ascites culture with a PMN count < 250 cells/μL. Because ascites culture is often negative, the positivity of ascites culture is not necessary to diagnose SBP. The main applications of the polymerase chain reaction (PCR) include the detection of bacteria in low concentrations, fastidious bacterial pathogens and the detection of slowly growing bacteria. The aim of this study was to compare the amplification of 16S rRNA gene with the BACTEC culture in the diagnosis of SBP, in pediatric patients with portal hypertension ascites (a serum to ascites albumin gradient > 1.1 g/dL) attending the pediatric gastroenterology unit at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Thirty-one patients and forty paracentesis were studied. The median age of patients was 2.9 years (interquartílicoe range: 0.8-8.5). Sixteen patients were male. Cirrhosis of several causes was presented in 24 patients, 20 were classified as Child-Pugh C and the median of PELD score was 18.5 (interquartil range:10.0-27.5). Bacterial aerobic and anaerobic cultures were obtained by bedside inoculation of 10 mL of ascitic fluid into culture bottles wihich were incubated in BACTEC 9240 culture system. A volume of 20 mL of ascites was send to laboratory for the biochemical analyses, Gram’s stain, total and differential cell counts and citology. Simultaneously, 10 to 30 mL of ascites was stored at - 20o C to posterior bacterial DNA detection. After DNA extraction, detection of bacterial DNA was performed using primers for 16S rRNA gene. There were twelve episodes of infected ascites (8 SBP and 4 BA). Culture was positive in 4/8 cases of SBP. The molecular technique was positive in 7/8 cases of SBP and 3/4 cases of BA. For the diagnoses of SBP, the sensitivity, specificity positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of BACTEC culture was 50%, 87.5%, 50% and 87.5%, respectively. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of bacterial DNA was 87.5%, 65.6%, 38.8% and 95.5%. Eight patients with culture-negative nonneutrocytic ascites (CNNNA) had positive bacterial DNA.They are not different of those with CNNNA and negative bacterial DNA in respect of PELD score, serum to albumin ascites gradient or mortality in three month. In conclusion, the amplification of 16S rRNA gene was most sensitive than BACTEC culture in the diagnosis of SBP. The finding of positive bacterial DNA in patients with CNNNA indicates that the method could be useful in the diagnoses of BA as well.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 guilherme_oliveira_ipec_mest_2013.pdf: 367173 bytes, checksum: 5d7981c2440bb9c06602493f281a31ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
A leishmaniose tegumentar americana (LTA), em cães, costuma estar associada à resposta humoral baixa ou mesmo negativa, o que inviabiliza os métodos sorológicos convencionais, como ferramenta única no diagnóstico. A busca por métodos mais sensíveis no diagnóstico tem avançado muito com o emprego de métodos moleculares, e a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem fornecido inúmeros resultados fundamentais nos estudos epidemiológicos. Métodos convencionais de diagnóstico parasitológico, não têm sido capazes de detectar a presença do parasito em outros sítios anatômicos diferentes da lesão cutânea, em cães naturalmente infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. Diante dos questionamentos sobre o papel do cão doméstico no ciclo de transmissão da LTA e sobre o valor de métodos diagnósticos aplicados na rotina, principalmente em áreas de sobreposição da forma tegumentar e visceral, faz-se necessário a avaliação desses animais sob diversos aspectos. O presente estudo teve como objetivo empregar a PCR específica associada à hibridização molecular e a técnica da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) visando detectar a presença de DNA parasitário e investigar a variabilidade genética de populações parasitárias presentes em diferentes tecidos de cães naturalmente infectados por L. (V.) braziliensis. Os animais foram selecionados entre os cães sororeatores para Leishmania procedentes de cidades do estado do Rio de Janeiro e encaminhados para eutanásia ao Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz. Durante a necropsia, foram obtidas amostras de lesão cutânea, pele íntegra (região escapular e abdominal), baço, fígado e linfonodos (poplíteo e cervical) Os fragmentos teciduais foram submetidos ao isolamento parasitário e à extração de DNA. A detecção de DNA de L. (V.) braziliensis foi realizada através da amplificação, pela PCR específica, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam a região variável dos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) de espécies do subgênero Viannia. Os produtos positivos na PCR foram reamplificados, pela técnica de LSSP-PCR, utilizando-se um único iniciador do par específico, em condições de baixa temperatura de anelamento. O polimorfismo genético da região variável dos minicírculos foi avaliado através de métodos de análise numérica. Nove animais foram estudados. O isolamento parasitário foi possível somente nos fragmentos de lesão cultivados em todos os animais, no entanto com a aplicação das técnicas moleculares mencionadas, foi possível detectar DNA de L. (V.) braziliensis em pele íntegra de cães naturalmente infectados tendo sido, ao nosso conhecimento, o primeiro relato no Brasil. Foi também possível observar o tropismo diferenciado e a capacidade de disseminação parasitária para outros sítios anatômicos, além da lesão cutânea, no cão naturalmente infectado. Nossos resultados contribuirão para o diagnóstico e a epidemiologia da LTA canina no Rio de Janeiro fornecendo elementos na discussão da importância do papel do cão no ciclo de transmissão e subsídios para os programas de controle
In dogs, A merican tegumentary leishmaniasis (ATL) is usually associated to a low humoral response or even to negative results which turns not unfeasible the conventional serological methods. The search for more sensitive methods in the diagno sis has progressed by the use of molecular methods and, the technique of polymerase chain reaction (PCR) has been furnishing several results which can be consider of fundamental importance in epidemiological studies. Conventional methods of parasitologic al diagnosis have failed to detect the presence of the parasite anatomic sites others than the cutaneous lesion, in dogs naturally infected by Leishmania (Viannia) braziliensis. Regarding the questions on the rule of domestic dogs in the transmission cycle of ATL and, on the applicability of diagnostic methods mainly in areas where both visceral and tegumentary disease are found, the evaluation of these animals under different aspects is needed. The objective of this project is to apply specific PCR assays associated to molecular hybridization and the technique of Low - Stringency Specific - Single Primer – PCR (LSSP - PCR) in order to detect the presence of parasite DNA and evaluate the gen etic variability of parasite populations found in different tissues of dog s naturally infected by Leishmania (V.) braziliensis . The animals were selected among dogs which were Leishmania seropositive from cities of Rio de Janeiro state and referred for euthanasia to the Derm o zoo laboratory ( Laboratório de Pesquisa Clínica em Der matozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz ) . Samples were obtained from cutaneous lesions, health skin, spleen, liver and lymph nodes (popliteal and cervical). Tissue fragments were submitted to parasite isolation and to DNA extractions. The detection of L. (V.) braziliensis was performed by specific PCR assays, using a par of primers that amplify the variable region of the minicircles of the kinetoplast DNA (kDNA) from species of the Viannia subgenus. The positive PCR products were re - amplified by the technique of LSSP - PCR using a unique primer of the specific par, in low stringency conditions. The genetic polymorphism of the variable region of kDNA minicircles were investigated through numeri cal analysis methods. Nine animals were studied. The parasitic isolation was only possible in fragments cultured in lesion of all animals. U sing such methods, it was possible to detect L. (V.) braziliensis DNA in heath skin of dogs naturally infected. To o ur knowledge this is the first report in Brazil. It was also possible to observe the differentiate tropism and the capacity of parasite dissemination to other anatomic sites beyond the cutaneous lesion. Our results will contribute, at the same time, to the diagnosis and the epidemiology of canine ATL in Rio de Janeiro, providing basis for the discussion of the rule of the dog in the transmission cycle of ATL and, also providing subsidies to the control programs.

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica.
Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Estratégias guiadas por genoma foram utilizadas a fim de examinar o potencial biossintético de microorganismos da classe Betaproteobacteria no âmbito de Produtos Naturais. Uma estratégia capaz de ser expandida para todos os tipos de microorganismos foi criada para estimar as reações enzimáticas das Peptideo Sintetases Não Ribossomais a fim de sistematizar a e analisar suas similaridades biossintéticas. Todas as bases de dados e software user-friendly foram adotadas a fim de tornar esta estratégia simples e mais abrangente. Elas foram NCBI, KEGG, NORINE, antiSMASH, Cystoscape, Gitools, MEGA e Clustal. Os resultados tornaram possível a criação de uma stratégia, chamada XPAIRT (eXPAndable Identification of amino acids in nonRibosomal peptides Tendencies) correlacionando pares de peptídeos e seus genomas similares via Jaccard Index e filogenia. Neste contexto, espécies Betaproteobacteria mostraram sintetizar produtos naturais seguindo certa similaridade biossintética na montagem de monômeros para a construção do esqueleto peptídico. Subunidades estruturais tais como asp.ser e orn.ser foram amplamente encontradas. Essas similaridades foram correlacionados gerando índice de similaridade entre espécies e sua distribuição entre genomas semelhantes, que foram nomeados como contribuíntes. Quanto maior a identidade genômica de um cluster de gene biossintético para um produto natural de forma geral, maior a chance de um contribuínte expressar pares similares relativos ao cluster em questão. A partir de análises de contagem de clusteres de genes biossintéticos, pôde-se eleger microorganismos promissores para isolamento de amostras ambientais. Essas análises mostraram que espécies do gênero Burkholderia são as mais promissoras quando comparadas a todos os genomas disponíveis da subclasse Betaproteobacteria. Análises genômicas da espécie padrão do gênero, Burkholderia thailandensis mostraram que cromossomos 1 e 2, em comparação a uma cepa produtora de antibióticos padrão, S. coelicolor, não apresentarem mesmas informações para biossíntese de compostos, mas apresentam similaridades de classes, sendo elas, Terpenos, T1PKS, Bacteriocinas e Peptídeos Não Ribossomais. Todos os resultados não tiveram correlações com os clusteres de S. coelicolor evidenciando que B. thailandensis apresenta-se promissora para a descoberta de novos compostos. Como espécies do gênero Burkholderia foram o principal alvo neste trabalho, um método guiado por genoma foi desenvolvido para isolar tanto quanto possível cepas de amostras ambientais. O método levou em consideração as necessidades básicas de um microorganismo para sobreviver: a) o tipo de microbioma que os microorganismos de interesse se encontram, analizados através de resultados de metagenômica, b) resistência à antibióticos e metais, c) capacidade de metabolizar compostos com papel biológico, d) crescimento celular e nutrientes, e e) variações de pH e crescimento celular. Todas as análises foram cruzadas e os melhores candidatos à composição de meios de culturas celular específicos para o isolamento de microorganismos do gênero Burkholderia foram selecionados. A estratégia foi bem-sucedida para diversos tipos de amostras. Estes experimentos excepcionais demonstraram a eficácia na resolução de problemas químico-biológicos auxiliando a análise posterior de novos produtos naturais.
Genome-guided strategies were applied to examine Betaproteobacteria species potential for the biosynthesis of nonribosomal peptides. A generalizable strategy was created to track similarities in enzymatic reactions of nonribosomal peptides synthetases in order to organize their capability of assembling monomers building the peptides backbones. Databases and user-friendly software were adopted making this strategy a comprehensive one. Databases and software adopted, as well as, NCBI, KEGG, NORINE, antiSMASH, Cystoscape, Gitools, MEGA e Clustal were used for this purpose. Betaproteobacteria species showed to possess biosynthetic similarities in assembling monomers for the peptide backbone of a nonribosomal peptide. These evidences were correlated giving similarities indexes between species and their distribution between similar genomes. Predictions were fragmented in several ways, for example, monomers, pairs and triads. Correlation analyses displayed that pairs it is the best way of tracking similarities. This result turned possible to create a strategy, named XPAIRT (eXPAndable Identification of amino acids in nonRibosomal peptides Tendencies) correlating pairs of peptides and their similar genomes via Jaccard Index and phylogeny. Thought these investigations it was noticed that Betaproteobacteria species generally assemble asp.orn and orn.ser, mainly Burkholderia species, among other pairs of peptides. Further analysis showed that species from the genera Burkholderia are the most promising ones due to their Biosynthetic Gene Cluster counting for all available Betaproteobacteria genomes. These species were further analyzed and a standard strain, Burkholderia thailandensis, was used to the identification of intraspecific variation for their biosynthetic potential. A specific study on Biosynthetic Gene Cluster variation was proceeded for discovering disparities between chromosomes 1 and 2, and a standard antibiotic producer strain, S. coelicolor. Results showed that B. thailandensis have different possibilities for biosynthesizing natural products. Even thought, common classes of compounds such as, Terpenes, Bacteriocins, T1PKS and Nonribosomal Peptides were identified for all strains. As Burkholderia species were the main target in this work, a genome-guided method was developed for isolating as much strains as possible from environmental samples. This very method took into account the basic needs for a microorganism to survive: a) the type of microbiome that microorganisms of interest coexist, analyzed through metagenomics, b) resistance to antibiotics and metals, c) ability to metabolize compounds with biological role, d) cell growth related to different nutrients, and e) cell growth under pH variations. The strategy was successful for diverse types of samples. These exceptional experiments are part of a novel way of working with Natural Products, using genomic, bioinformatics and visual statistical analysis in order to access common characteristics and uniqueness of species guiding the search of medically relevant natural products.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Foi demonstrado que o gosto doce é transduzido por receptores acoplados a proteína G classe III (GPCRs), T1R2 e T1R3. Essas proteínas exibem longas extremidades amino-terminais que formam um domínio de ligação globular extracelular. Elas são expressas em células associadas ao gosto (células epiteliais que constituem os botões gustativos nas papilas gustativas), que respondem a moléculas associadas ao gosto doce. Quando T1R2 e T1R3 são co-expressas em células heterólogas, elas respondem, como heterômeros, a uma série de açúcares, alguns D-aminoácidos, edulcorantes artificiais e proteínas doces. Foi também demonstrado que o receptor humano T1R2/T1R3 para o gosto doce apresenta múltiplos sítios de ligação. Para melhor compreender a estrutura desse receptor e responder à pergunta de como um único quimiorreceptor pode ser responsivo a uma variedade de ligantes, foi utilizada a abordagem denominada evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para isolar, a partir de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos, aptâmeros de RNA resistentes a nuclease que se ligam ao receptor humano para o gosto doce com alta afinidade. Após um enriquecimento de doze ciclos do pool original de RNA contendo em torno de 1013 sequências diferentes (contra preparações de membrana de células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3) e outros ciclos de contrasseleção negativa (para eliminar moléculas de RNA que se ligam de forma inespecífica à membrana de nitrocelulose e a outras proteínas diferentes do alvo, ou seja, proteínas de membrana de células HEK293T selvagem), realizou-se a transcrição reversa do RNA seguida de amplificação por PCR e sequenciamento. Aptâmeros do ciclo 12 com sequências consenso foram selecionados, e a ligação de alguns deles com hT1R2/hT1R3 foi então avaliada. Cinco desses aptâmeros mostram claramente uma maior afinidade por células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3. Como segunda parte desta tese, estudamos outro receptor, denominado CD36, que, como o receptor T1R2/T1R3, é expresso na língua. Estudos indicam que ele age como receptor gustativo de gordura. Neste trabalho, verificamos que essa proteína é expressa em uma subpopulação de neurônios olfatórios presentes no epitélio olfatório, indicando que ela pode ter também uma função olfatória, ainda não caracterizada.
It has been shown that sweet taste is transduced by the Class III G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) T1R2 and T1R3, which show long N-termini that form a globular extracellular ligand-binding domain. These receptors are expressed in the taste cells (epithelial cells that constitute the taste buds in taste papillae) that respond to sweet tastants, and when T1R2 and T1R3 are coexpressed in heterologous cells, they respond, as heteromers, to a series of sugars, some D-amino acids, artificial sweeteners and sweet proteins. It has also been demonstrated that the sweet taste receptor has multiple binding sites. In order to better understand the structure of this receptor and answer the question of how a single chemoreceptor can respond to a variety of ligands, we used the combinatorial oligonucleotide library screening approach, denominated Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), to isolate nuclease-resistant RNA aptamers that bind to the human sweet taste receptor with high affinity. Following a twelve round enrichment of the previous random RNA pool containing around 1013 different sequences (against membrane preparations of hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells) and negative counterselection cycles (to eliminate RNA molecules that bind nonspecifically to the nitrocellulose membrane and to proteins other than the target, that is, HEK293T cells membrane proteins), the RNA was reverse-transcribed for DNA sequencing. Aptamers from cycle 12 with consensus sequences were selected, and the binding of some of them to the human sweet taste receptor was then evaluated. Five out of the aptamers clearly show greater affinity for hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells than for hT1R2/hT1R3-non-expressing HEK293T cells. In this thesis we have also analyzed another receptor, denominated CD36, which is also expressed in the tongue. Studies indicate that it acts as a receptor for fat. In this work, we found that CD36 is expressed in a subset of the olfactory neurons localized in the olfactory epithelium, indicating that it may also have an as yet uncharacterized olfactory function.

Mestrado em Biotecnologia Molecular
As infeções do trato urinário associadas a cateteres (CAUTI) são o principal tipo de infeções adquiridas em hospital. Estas infeções resultam, na sua maioria, de biofilmes que se formam na superfície dos cateteres, no entanto pouco é conhecido sobre a dinâmica dos biofilmes e sobre as interações entre as diferentes espécies presentes. O objetivo deste trabalho foi estudar a interação entre as espécies Escherichia coli e Achromobacter xylosoxidans utilizando hibridação fluorescente in situ (FISH) para discriminar entre as duas espécie em biofilmes mistos, comparando a dinâmica populacional em biofilmes simples e mistos e o comportamento em dois materiais usados no fabrico de cateteres urinários: silicone e poli (óxido de etileno). Através de contagens de células cultiváveis em biofilmes simples e mistos verificou-se que A. xylosoxidans não afetou significativamente o crescimento de E. coli, no entanto esta última prejudicou o crescimento de A. xylosoxidans durante as primeiras 24h, favorecendo-o a partir das 48h. Neste trabalho foi realizada uma primeira abordagem ao estudo de biofilmes associados a CAUTI utilizando sondas de LNA e 2’OMe em protocolos de FISH, tendo-se verificado a existência de interações entre espécies patogénicas e não patogénicas que podem alterar o crescimento destas. Provou-se que o método de FISH pode ser usado para estudar a distribuição populacional em biofilmes mistos e que as sondas de LNA e 2’OMe podem ser usadas nestes biofilmes pois permitem a discriminação das espécies presentes.
Catheter associated urinary tract infections (CAUTI) are the main kind of hospital acquired infections. These infections arise mostly of biofilms formed on the catheter’s surface, however little is known about biofilm’s dynamics and the interactions between the different species in the biofilm. The purpose of this work was to study the interaction between the species Escherichia coli and Achromobacter xylosoxidans, applying fluorescence in situ hybridization (FISH) for discriminating between the two species in mixed biofilms, comparing simple and mixed biofilm population dynamic and the behavior in two materials used in urinary catheter: silicon and poly (ethylene oxide). Through cultivable cells counting in simple and mixed biofilms it was found that A. xylosoxidans did not affect the growth of E. coli, however E. coli impairs A. xylosoxidans growth during the first 24 hours, and helps it after 48 hours. In this work a first approach to the study of mixed biofilms associated with CAUTI using LNA and 2’OMe probes in FISH protocols was made and it was verified the existence of interactions between pathogenic and non-pathogenic species that can change their growth. It was proved that the FISH method can be used to study the population distribution in mixed biofilms and that the LNA and 2’OMe probes can be used in these biofilms as they allow the discrimination between the present species.

As micorrizas arbusculares (MAs) são simbiontes mutualísticas entre alguns fungos do solo e raízes de plantas de notória importância tanto em ecossistemas naturais quanto agrícolas, pois contribuem para o aumento da absorção de nutrientes do solo e sua transferência para as plantas. As MAs podem promover o crescimento de várias plantas, dentre elas a cana-de-açúcar. Assim, fatores que restringem o desenvolvimento das MAs podem também restringir a produção das culturas agrícolas. Muito embora os herbicidas utilizados em sistemas agrícolas possam contribuir para a alteração das estruturas das comunidades de microrganismos no solo e o desenvolvimento de simbioses, pouco se sabe sobre seu efeito sobre fungos micorrízicos arbusculares (FMAs). O presente estudo teve por objetivo determinar o efeito dos herbicidas Ametrina e Imazapique na germinação de esporos de Glomus clarum e desenvolvimento de MA em cana-de-açúcar, bem como as alterações no transcritoma de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por G. clarum e cultivada em solo tratado com Imazapique. Ametrina não teve efeito significativo na germinação de esporos e colonização intrarradicular, nas doses avaliadas. Já, o aumento da concentração de Imazapique promoveu uma diminuição na germinação de esporos e aumento de colonização intrarradicular. Embora tenha sido observada maior taxa de colonização intrarradicular em plantas tratadas com Imazapique, a presença do fungo parece não ter aliviado os efeitos deletérios promovidos pelo uso do herbicida nas condições estudadas. Através de hibridização em macroarranjo de cDNA, foi possível detectar vários genes com expressão diferencial estatisticamente significativa em raízes micorrizadas e não- micorrizadas cultivadas em solo tratado com herbicida. Dentre as proteínas codificadas pelos genes com expressão induzida em raízes micorrizadas, em relação ao controle não-inoculado, se destacam um receptor de glutamato, uma metalotioneína, uma ATP sintase, e várias com função desconhecida. Já, dentre os genes com expressão suprimida estão: a proteína WALI7, uma proteína de catabolismo dependente de ubiquitina, uma tubulina e uma remorina. Nas raízes não-inoculadas e cultivadas em solo com Imazapique as proteínas codificadas pelos genes com expressão induzida são: um receptor de glutamato e uma proteína tipo lípase; e dentre as que foram suprimida está a proteína transcritase reversa. O Imazapique altera a expressão de vários genes modulados pela MA, dentre as proteínas codificadas por esses genes estão: uma ATP sintase, uma proteína de catabolismo dependente de ubiquitina, uma poliubiquitina, uma tubulina, uma quinase de histidina e várias com função desconhecida. Os resultados indicam que a formação MA altera o programa genético das raízes de cana-de-açúcar e que o herbicida Imazapique altera a expressão dos genes relacionados à simbiose de cana-de-açúcar com G. clarum.
The arbuscular mycorrhizae (AM) are symbiotic root-fungus associations that play a key role in natural and agricultural ecosystems, through the enhancement of nutrients absorption in the soil and its transference into the plants. The AM may promote the growth of many plants, among them are the sugarcane. Even thought the herbicide utilized in the agriculture system may contribute to soil microbial community alteration and the symbioses development, limited is know about the herbicide effects on arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and on AM formation. The aim of the present work was to evaluate the Ametrine and Imazapic effects in the spores germination of Glomus clarum and AM development in sugarcane, as well transcriptome alterations of sugarcane roots colonized with G. clarum and growing in soil treat with Imazapic. It was not detected significant effect on the spores germination and intraradical colonization in the evaluated doses of Ametrine. Whereas, the enhance of Imazapic concentration promoted a decrease in the spores germination and increase of intraradical colonization. Although the higher intraradical colonization has been observed in the plants treat with Imazapic, the presence of the fungi seems not alleviated the damage effect promoted by the use of the herbicide, in these studies conditions. By macro array cDNA hybridizations, it was possible to detect several genes with differential expression statistically significant in AM plants, and plants not inoculated growing in soil treated with herbicide. Among the proteins codified by genes with induced expression in AM roots, compared to the control no-inoculated, are: a putative ionotropic glutamate receptor, a metallothionein-like protein, a ATP synthase and many others with unknown function. Whereas, among the proteins codified by genes with suppressed expression are: Wali7 protein, a ubiquitin-dependent protein catabolism, a tubulin alpha-1 chain and a remorin. In the no-inoculated roots growing in the soil treat with Imazapic the proteins codified by genes with induced expression are: a putative ionotropic glutamate receptor and a lipase-like; and the reverse transcriptase like protein was suppressed. The Imazapic treatment alter several gene expression modulated by AM, among the proteins codified by those genes are: a ATP synthase, a ubiquitin-dependent protein catabolism, polyubiquitin, a tubulin alpha-1 chain, a signal transduction histidine kinase and many others with unknown function. The results indicate the AM formation alter the sugarcane roots genetic program and that the Imazapic herbicide alter the gene expression related to symbioses between sugarcane with G. clarum.

Introdução: A meningite tuberculosa (MTB) é a forma mais grave e fatal de tuberculose. O diagnóstico oportuno e o tratamento adequado e precoce são os principais fatores associados com o bom prognóstico. Os métodos utilizados na prática médica diária - achados clínicos, exames de imagem e análise de líquido cefalorraquidiano (LCR) - têm baixa acurácia. A pesquisa do DNA do Mycobacterium tuberculosis no LCR através da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polimerase chain reaction) com a metodologia nested é promissora, especialmente quando associada à praticidade da amplificação do DNA em tempo real. Objetivo: Avaliar o valor diagnóstico da nested PCR em tempo real (nRT-PCR, do inglês nested real-time PCR) na investigação de pacientes com MTB. Métodos: Estudo observacional realizado em duas fases: uma prospectiva e outra retrospectiva. Na fase prospectiva, foram incluídos pacientes com suspeita de MTB internados no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER). Informações clínicas, laboratoriais e radiológicas foram coletadas, assim como amostra de LCR de todos os pacientes. A partir de critérios internacionais padronizados, os pacientes foram categorizados como \"MTB Definitiva\", \"MTB Provável\", \"MTB Possível\" e \"Não MTB\". A nRT-PCR, utilizando o gene alvo mpt64, foi realizada em todas as amostras de LCR no Laboratório de Meningites Bacterianas do Instituto Adolfo Lutz. Sensibilidade, especificidade e intervalos de confiança (IC 95%) da nRT-PCR foram calculados com base no padrão-ouro (cultura positiva para M. tuberculosis ou isolamento de BAAR no sistema nervoso central) e nos pacientes com outros diagnósticos estabelecidos (Não MTB). Também foi calculada a proporção de pacientes com a nRT-PCR positiva em cada categoria clínica. Na fase retrospectiva, foi realizada uma revisão de prontuários de pacientes que tiveram a nRT-PCR solicitada no IIER e no Centro de Referência e Treinamento em DST/AIDS. Os mesmos procedimentos de categorização diagnóstica, cálculos de sensibilidade e especificidade foram adotados. Resultados: Na fase prospectiva, foram incluídos 102 pacientes, sendo 92 deles infectados por HIV. Nove deles tiveram o padrão-ouro positivo e foram classificados como \"MTB Definitiva\" e 81 deles tiveram outros diagnósticos estabelecidos (\"Não MTB\"). A sensibilidade e a especificidade da nRT-PCR foi 100% (IC95%:70-100 e 95-100, respectivamente). A positividade da nRT-PCR na categoria \"MTB Provável\" foi 50% (4/8 pacientes) e 25% na \"MTB Possível\" (1/4). Na fase retrospectiva, 56 pacientes foram incluídos, sendo 48 infectados por HIV. A nRT-PCR teve sensibilidade de 83% (5/6) e especificidade de 100% (0/45). A positividade na categoria \"MTB Provável\" foi 60% (3/5) e não houve pacientes classificados como \"MTB Possível\". Conclusão: A nRT-PCR apresentou boa sensibilidade e ótima especificidade, demonstrando seu valor diagnóstico na identificação oportuna de casos de MTB
Background: Tuberculous meningitis (TBM) is the most serious and lethal presentation of tuberculosis. Timely diagnosis and appropriated treatment are the main factors associated with good outcome. Methods used in the daily medical practice - clinical, radiological and cerebrospinal fluid (CSF) findings - have low accuracy. Search for Mycobacterium tuberculosis DNA in the CSF by polymerase chain reaction (PCR) using the nested methodology is promising, especially when combined with the practical approach of the real time DNA amplification. Objective: To evaluate the diagnostic value of a nested real-time PCR (nRT-PCR) in the investigation of patients with TBM. Methods: A two-phase observational study was carried out: prospective and retrospective. In the prospective phase, patients with suspected TBM hospitalized at \"Instituto de Infectologia Emílio Ribas\" (IIER) were included. Clinical, laboratory and radiological data were collected, as well as CSF samples of all patients. According to international standard criteria, patients were categorized as \"TBM Definite\", \"TBM Probable\", \"TBM Possible\" and \"Not TBM\". The nRT-PCR, using the mpt64 gene, was performed on all CSF sample in the Laboratory of Bacterial Meningitis, Adolfo Lutz Institute. Sensitivity, specificity and confidence intervals (95% CI) of the nRT-PCR were calculated based on the gold standard (culture positive for M. tuberculosis or AFB isolation on the central nervous system) and on patients with other established diagnoses (\"Not TBM\"). The proportion of patients with a positive nRT-PCR in each clinical category was also calculated. In the retrospective phase, medical chart review was performed in those patients who had the nRT-PCR requested in IIER and in the \"Centro de Referência e Treinamento em DST/AIDS\". The same diagnostic categorization and calculations of sensitivity and specificity were adopted. Results: 102 patients were included in the prospective phase, 92 of them HIV-infected. Nine of them had the gold standard positive and were classified as \"TBM Definite\" and 81 of them had other diagnoses established (\"Not TBM\"). The sensitivity and specificity of the nRT-PCR were 100% (95%CI: 70-100 and 95-100, respectively). The nRT-PCR positivity in category \"TBM Probable\" was 50% (4/8 patients) and 25% in \"TBM Possible\" (1/4). In retrospective phase, the nRT-PCR had a sensitivity of 83% (5/6) and specificity of 100% (0/45), among the 56 included patients (48 of them HIV infected). Positivity in \"TBM Probable\" category was 60% (3/5) and no patients were classified as \"TBM Possible\". Conclusion: The nRT-PCR showed good sensitivity and excellent specificity, showing its diagnostic value in the timely identification of TBM