Dissertations / Theses on the topic 'Activités dirigées'

La thèse s'intéresse à la place et la forme des savoirs dans l'éducation scientifique et technologique de l'école primaire. La transposition du matériau est explorée en situation réelle de classes, dans le processus de conception-production-utilisation d'objet. L'étude porte sur l'influence des mises en relation des contraintes qui interagissent au niveau fonctionnel, structurel et de la forme des éléments sur le choix du matériau. L'influence est mesurée dans une tâche de tri de matériaux et à partir des cactéristiques didactiques qui agissent sur l'activité des élèves. Nous montrons qu'il est possible d'introduire dans l'activité de producions d'objets des connaissances technologiques ; de construire des situations d'enseignement viables à l'école primaire sans dénaturer ces savoirs, tout en les rendant "manipulables" par les élèves ; de mettre en oeuvre des dispositifs didactiques dans des classes "ordinaires" et d'apprendre.

Les beta-lactamases et les Penicillin Proteins (PBPs) sont deux familles d’enzymes dont les rôles diffèrent mais pour lesquelles l’hypothèse d’une évolution à partir d’un gène ancestral commun est aujourd’hui largement admise. Néanmoins, le chemin évolutif entre ces deux familles de protéines n’est pas encore parfaitement élucidé. Les PBPs sont impliqués dans la synthèse et le remodelage du peptidoglycane constituant la paroi bactérienne. Les beta-lactamases sont responsables de certaines résistances bactériennes aux antibiotiques et suscitent à ce titre de nombreuses études afin de développer des inhibiteurs de cette activité enzymatique. Le but de cette étude est de faire évoluer un fragment d’anticorps anti-idiotypique à activité beta-lactamases, le scFv 9G4H9, afin d’approfondir l’étude structure-fonction d’une activité beta-lactamase et de comprendre les liens existants entre les beta-lactamases et les PBPs. L’évolution dirigée du scFv 9G4H9 présenté en surface de phage a permis d’isoler un mutant nommé H29, dont le résidu I181 a été muté en thréonine et dont l’activité est apparemment améliorée. La deuxième partie concerne la possibilité de réguler l’activité beta-lactamase par des peptides. Le peptide cycle Pep90 (CYHFLWPC), sélectionné sur l’anticorps 9G4H9, permet d’inhiber de manière compétitive l’activité de la beta-lactamase (Ki = 333µM). Les peptidomimétiques dérivés, nommés Pep90-WAza et Pep90-PD, conservent la capacité à inhiber l’enzyme avec des valeurs de Ki comparables à celle du peptide modèle. Ainsi, Pep90, sous sa forme naturelle ou dérivée, apparaît comme un modèle prometteur pour l’élaboration de molécules utilisables en antibiothérapie
Beta-lactamases and Penicillin Binding Proteins (PBPs) are two enzymes families whose roles are different but for wich the hypothesis of an evolution from a common ancestral gene is now widely accepted. However, the evolutionary pathway between these two families of proteins is not yet fully elucidated. PBPs are involved in the synthesis and remodeling of the peptidoglycan composing bacterial cell wall. Beta-lactamases are responsible for certain bacterial resistance to antibiotics and raise as such numerous studies to develop inhibitors of this enzymatic activity. The purpose of this study is to force evolution of an anti-idiotypic antybody fragment endowed withi a beta-lactamase activity, scFv 9G4H9, in order to further study structure-function relationship of a beta-lactamase activity and to understand the linkage between beta-lactamases and PBPs. Directed evolution of phage displayed scFv 9G4H9, allowed to isolate a mutant named H29 which residue I181 was replaced by threonine. Its activity is apparently improved. The second part concerns the possibility of regulating the beta-lactamase activity by peptides. The cyclic peptide Pep90 (CYHFLWPC), selected on antibody 9G4H9, inhibits competitively the activity of beta-lactamase (Ki = 333 µM). The peptidomimetic derivatives, named Pep90-WAza and Pep90-PD retain capacity to inhibit the enzyme with similar Ki values compared to that of the peptide model. Thus, Pep90, in its natural form or derivative, appears as a promising model for the design of molecules for antibiotherapy application

La langue d'enseignement dans le système éducatif Gabonais est le français. L'apprentissage de cette langue repose sur plusieurs matières notamment l'orthographe qui est notre objet d'étude. Nous constatons malheureusement que les élèves éprouvent des difficultés au niveau de l'apprentissage de cette matière. Nous observons une augmentation exponentielle des erreurs au niveau des productions écrites des apprenants de cinquième année primaire au Gabon. L'enquête exploratoire révèle en effet que les élèves se heurtent à des difficultés par rapport à l'application des règles orthographiques. Cette recherche a pour visée première de répertorier et classer les erreurs d'orthographe sur la base de la typologie de Nina catch (1980). La dictée test montre que les scripteurs des classes de cinquième année primaire commettent une multitude d'erreurs au niveau des productions écrites. Notre recherche s'est intéressée à un échantillon de 226 apprenants de cinquième année primaire issu de huit classes. Il ressort que l'orthographe syntaxique est la difficulté majeure qui pose problème. Par ailleurs, nous relevons au terme de l’organisation des ateliers de négociation graphique un développement des compétences en orthographe chez les élèves de cinquième année primaire au Gabon. Le taux de réussite enregistré repose sur les échanges survenus au sein des groupes. Les interactions verbales ont entraîné des conflits socio-cognitifs et un changement des représentations chez les apprenants. Par conséquent, le pourcentage d’erreurs a diminué au niveau des scripteurs
The language of instruction in the Gabonese education system is French. The learning of this language is based on several subjects including spelling which is our object of study. Unfortunately, we note that the pupils experience difficulties in learning this subject. We observe an exponential increase in errors in the written productions of learners of the fifth year of primary education in Gabon. The exploratory survey indeed reveals that the pupils encounter difficulties with regard to the application of the orthographic rules. The primary aim of this research is to identify and classify spelling errors based on the typology of Nina catch (1980). The test dictation shows that the writers of the fifth year primary classes make a multitude of errors in terms of written productions. Our research focused on a sample of 226 fifth grade primary learners from eight classes. It appears that syntactic spelling is the major difficulty that poses a problem. Furthermore, at the end of the organization of the graphic negotiation workshops, we noted a development of spelling skills among pupils of the fifth year of primary education in Gabon. The success rate recorded is based on the exchanges that took place within the groups. Verbal interactions have led to socio-cognitive conflicts and a chang in representations among learners. As a result, the percentage of errors has decreased for scripters

Dans le premier chapitre de cette these, nous nous sommes interesses a deux anticorps monclonaux murins, produits a partir d'hybridomes. Ces deux anticorps, appeles ac7 et b2a sont capables d'empecher l'agregation des plaquettes sanguines. Nous avons entrepris l'analyse moleculaire de ces deux anticorps dans le but de determiner les sequences en acides amines des regions hypervariables ou cdr, responsables de la specificite des anticorps, et d'identifier ainsi d'eventuelles sequences antagonistes de l'agregation plaquettaire. Nos resultats montrent que le peptide h3, correspondant a la region hypervariable 3 de la chaine lourde de l'anticorps ac7, possede une activite anti-agregante pouvant servir de base au developpement de nouveaux composes. Le second chapitre de ce manuscrit decrit l'analyse d'anticorps obtenus a partir de banques combinatoires d'immunoglobulines exprimees a la surface de bacteriophages filamenteux et diriges contre une molecule adhesive specifique des cellules endotheliales, la ve-cadherine. Ce type de technologie doit nous permettre d'isoler de nouveaux anticorps dont l'obtention est difficile par la technique classique des hybridomes et presente la possibilite d'une eventuelle manipulation genetique des anticorps. La premiere partie de ce chapitre decrit la generation d'une banque de fabs murins et la caracterisation par elisa de deux anticorps selectionnes. Dans la seconde partie, nous avons utilise une banque de fabs humains representant un large repertoire d'anticorps. Cette banque, generee par l'equipe du dr. Barbas, nous a permis de selectionner trois fabs. Ces anticorps ont ete caracterises pour leur specificite pour la ve-cadherine par elisa, deplacement a l'equilibre et immunodetection par la technique du western blot

Ce travail a porte sur une proteine liant les phospholipides acides en presence de calcium: l'annexine i. Nous avons tout d'abord mis au point en combinant genie genetique et biochimie, un systeme d'expression/modification/purification d'annexines i recombinantes. Ce systeme a ete ensuite applique a l'etude de 2 motifs structuraux precis de l'annexine i: la sequence de 9 acides amines proposee pour l'inhibition de la pla2, situee dans l'helice d du domaine iii, et le site calcium consensus situe dans la boucle a-b du domaine ii. Concernant la phospholipase a2, les resultats obtenus laissent penser que la sequence etudiee n'intervient pas dans le phenomene d'inhibition de la phospholipase, dans les limites du test utilise. Ceci nous amene, dans la discussion, a proposer un mode d'action alternatif des peptides antiflammine, ainsi qu'a favoriser un modele d'action de l'annexine quant a cette activite anti-phospholipase. Concernant le site calcium du domaine ii, nos resultats nous permettent tout d'abord des conclusions structurales, concernant le role de chacun des residus mutes dans la reponse de la proteine au calcium et aux lipides. De plus, ils nous permettent de proposer, dans la discussion, des modeles concernant l'activation du monomere par le calcium pour des phenomenes apparemment differents: liaison aux lipides, agregation de particules lipidiques, liaison a l'actine, auto-association de monomeres

Les igm monoclonales associees a des atteintes du systeme nerveux peripherique reagissent le plus souvent avec la glycoproteine associee a la myeline (mag pour myelin-associated glycoprotein) et avec les sulfoglycolipides a acide glucuronique du nerf peripherique. Nous avons caracterise deux nouvelles specificites d'igm associees a des atteintes neurologiques peripheriques. L'une etait reactive avec plusieurs gangliosides polysialyles et l'autre etait dirigee contre un epitope peptidique commun a la proteine de 200 kda de neurofilament, aux histones h1 et h2b et a des proteines ribosomiques. Grace a la realisation des cultures primaires de cellules nerveuses humaines, nous avons pu montrer l'action cytotoxique pour les neurones, en presence de complement, d'une igm monoclonale a activite anti-gangliosides gm1 et gd1b associee a un syndrome de la corne anterieure. L'etude de la reactivite des igm anti-mag avec les cellules neuronales et les oligodendrocytes nous a permis de montrer que ces autoanticorps reagissaient in vitro avec des proteines de masses moleculaires differents de celui de la mag. La mise en evidence d'integrines au niveau de ces cellules et la reconnaissance de proteines de masses moleculaires similaires reconnues par les igm anti-mag et certains anticorps specifiques des chaines alpha et de la chaine beta 1 des integrines suggerent que ces igm anti-mag peuvent reconnaitre un epitope implique dans l'adhesion cellulaire neuronale et/ou neuro-gliale exprime par des proteines differentes de la mag et de la n-cam

Les mollicutes constituent un groupe de bacteries pathogenes pour l'homme, les animaux et les vegetaux. Ils sont caracterises par un genome de tres petite taille, une enveloppe sans paroi, un metabolisme simplifie et un spectre d'hote etroit. Les mycoplasmoses respiratoires des animaux d'elevage sont des maladies chroniques affectant principalement porcins, bovins, caprins et volailles. Elles sont responsables de pertes economiques significatives dans les pays producteurs. La lutte contre les mycoplasmes constitue donc un enjeu important et implique des innovations dans les techniques de depistage, les vaccins et l'antibiotherapie. En fait, l'eradication des mycoplasmoses necessite de poursuivre et d'approfondir les recherches sur, notamment, les antigenes de surface et les nouveaux antibiotiques. Les travaux realises au cours de cette these sont de nature fondamentale et s'inscrivent dans le contexte defini ci-dessus. Les objectifs poursuivis etaient la purification et la caracterisation de lipoproteines membranaires de mycoplasma mycoides ssp. Mycoides sc (un mycoplasme pathogene pour les bovins) et l'etude de l'activite anti-mycoplasmique d'anticorps anti-lipoproteines et de peptides membranotropes. L'analyse du proteome de m. Mycoides ssp. Mycoides sc par electrophorese bidimensionnelle a permis de cibler plusieurs lipoproteines membranaires dont les composants majoritaires lp36, lp42 et lp65. Nous avons purifie lp36 et lp42 par chromatographie liquide a haute performance (hplc) en conditions non denaturantes et lp65 par electrophorese micropreparative en conditions denaturantes. D'autre part, nous avons ameliore de facon significative la methode de purification par hplc de la lipoproteine lp67 (pmga) de m. Gallisepticum, un mycoplasme pathogene pour les volailles. Le sequencage partiel des proteines purifiees indique que lp65 est en fait lppb dont la sequence du gene est decrite dans la litterature. En revanche, lp36 et lp42 sont des proteines nouvelles. L'analyse et la comparaison des sequences publiees de lp67 de m. Gallisepticum et lppa, lppb et lppq de m. Mycoides ssp. Mycoides sc, predisent que ces lipoproteines sont toutes des antigenes de surface ancres dans la membrane par lipoylation d'une cysteine n-terminale. Nous avons confirme la localisation cellulaire de lp36, lp42, lp65 et lp67 par attaque proteolytique. Enfin, nous avons construit des iscoms (complexes immunostimulants) en utilisant comme immunogenes des lipoproteines membranaires. Ceci offre la possibilite d'evaluer les potentialites de vaccins mono- ou multicomposants modernes contre les deux especes de mycoplasmes etudiees. Les anticorps anti-membrane ou anti-lp67 inhibent tres efficacement la croissance de m. Gallisepticum et leur activite bactericide est amplifiee par le complement. Dans les memes conditions, les anticorps anti-membrane sont beaucoup moins actifs sur m. Mycoides ssp. Mycoides sc et les anticorps monospecifiques anti-lp36, lp42 ou lp65 semblent sans effet. Ceci suggere un effet protecteur de la capsule de galactane de ce mycoplasme. La meillitine du venin d'abeille et l'alamethicine d'origine fongique sont deux peptides membranotropes possedant une activite bactericide contre m. Gallisepticum et m. Mycoides ssp. Mycoides sc. Leurs concentrations minimales inhibitrices sont sensiblement plus fortes que celles d'antibiotiques classiques. En revanche, leur effet bactericide est tres rapide et leur efficacite essentiellement independante de la concentration cellulaire. La resistance des mycoplasmes aux dermaseptines d'amphibien confirme que ces bacteries sont beaucoup plus sensibles aux peptides membranotropes d'origine microbienne qu'a ceux produits par les animaux (vertebres et invertebres) ou les vegetaux.

Les acylases sont des enzymes qui hydrolysent des acylaminoacides, libérant un aminoacide libre et une fonction acyle. En fonction de la spécificité de substrat, elles sont représentées par plusieurs types. Nous nous sommes intéressés à l’acylase de type I de rein de rat (rr-ACYI), à l’acylase I humaine (ACYIh) et à l’aspartoacyalse humaine (ASPh). Pour nos études les enzymes ont été exprimées sous forme de protéines recombinantes en utilisant le système procaryote E. Coli. Nous avons montré qu’aucune cystéine n’est impliquée dans la catalyse enzymatique de l’rr-ACYI et que D82 retrouvé dans le motif H80xD82x’ permet la protonation de H80 impliquée dans la coordination d’un des atomes de zinc. Par la suite nous avons décrit pour la première fois une nouvelle maladie métabolique très certainement consécutive à l’absence d’une activité ACYIh. Par mutagenèse dirigée nous avons montré que la mutation R353C observée chez le patient était responsable de la perte d’activité qui pourrait être en relation directe avec le faible taux d’ ARNm détecté. Enfin, l’étude menée sur l’ASPh, responsable de la maladie de Canavan, montre que cette protéine est une métalloenzyme à zinc catalytique et non pas une enzyme à sérine. Les acides aminés H21, E24 et H116 ont été caractérisés comme étant impliqués dans la coordination du métal et se trouvant au voisinage de E178 qui est le résidu catalytique
Acylases are enzymes which hydrolyze acylamino acids releasing a free amino acid and an acidic group. Different types have been described according to the substrate. We studied kidney rat acylase I (rr-ACYI), human acylase I (ACYIh) and human aspartoacylase (ASPh). The proteins were expressed as recombinant proteins using the E. Coli prokaryotic system. We showed that any cysteine residue was implicated during the catalysis phenomenon and that D82 belonging to the H80xD82x’ motif is to ensure a proper protonation of H80 residue implicated in zinc coordination. For the first we described a novel inborn error of metabolism with ACYIh deficiency. By site-directed mutagenesis, we have demonstrated that R353C mutation observed in the patient was responsible for enzyme deficiency, in correlation with mRNA level. Finally, we confirmed that ASPh, an enzyme involved in the Canavan disease, is a zinc metalloenzyme. H21, E24 and H116 were characterized as amino acids implicated in the metal coordination and that are in the vicinity of the catalytic E178

La méthionyl-tARN synthétase (metRS) d'E. Coli catalyse le transfert de la méthionine sur les tARNmet(s)·Sa structure tridimensionnelle est connue à 1. 8Å de résolution et les paramètres cinétiques des deux étapes de la réaction (activation de la méthionine et transfert sur l'extrémité 3'-acceptrice du tARNmet) ont été déterminés. L'étude présentée dans cette thèse est destinée à élucider les relations structure-activités de cette enzyme en utilisant les techniques de la mutagénèse dirigée. Dans un premier temps des vecteurs (pNAV) permettant d'exprimer des formes modifiées de la metRS ont été construits. L'organisation en domaines fonctionnels a ensuite été analysée en étudiant les propriétés catalytiques de variants protéiques raccourcis dans la partie C-terminale. L'implication de la région 530-547 a ainsi été démontrée. Dans le but de préciser le rôle fonctionnel de cette région, une étude par mutagénèse dirigée à l'aide d'oligonucléotides a été effectuée. Ces résultats conduisent à la définition d'une synthétase minimale fonctionnelle, 547 acides aminés sont nécessaires et suffisants pour catalyser le transfert de la méthionine sur le tARNmet. Le gène codant pour cette protéine formée des 547 premiers résidus a été utilisé comme matrice pour les expériences ultérieures de mutagénèse dirigée. En accord avec les études effectuées par marquage chimique, la substitution de la lysine 335 se traduit par une inactivation complète des deux activités catalysées par la méthionyl-tARN synthétase, indiquant que cette lysine pourrait jouer un rôle direct dans la catalyse. La recherche des points de contact du tARN a permis de localiser deux régions de la protéine impliquées dans l'interaction avec la boucle de l'anticodon (trp461) d'une part et l'extrémité 3'-acceptrice du tARNmet d'autre part (530-537). En particulier, la région 530-537 doit assurer le guidage du bras accepteur du tARN vers le centre catalytique de l'enzyme (lysine 335). L'intercalation du tryptophane 461 entre deux bases de la boucle de l'anticodon qui contribue de manière très importante à la stabilisation du complexe spécifique démontre bien l'importance de la reconnaissance de la boucle anticodon du tARN.

Le 26RFa, un neuropeptide de la famille RFamide, est le ligand endogène d’un RCPG, le GPR103. Le 26RFa exerce d’importantes fonctions physiologiques telles que le contrôle de la prise alimentaire, de la reproduction et de l’ostéogenèse. Nous avons montré que le 26RFa(20-26) est la forme moléculaire la plus pertinente pour développer des ligands du GPR103 et que la substitution du résidu Ser23 par une norvaline conduit à un analogue 3 fois plus puissant que l’heptapeptide à mobiliser le Ca2+ intracellulaire dans une lignée CHO transfectée par le GPR103. L’étude par dichroïsme circulaire indique que le 26RFa(20-26) adopte un coude en milieu micellaire. L’introduction dans le 26RFa(20-26) d’un acide aminé de type aza-3, connu pour induire la formation de liaisons hydrogène intramoléculaires, combinée à la présence d’un motif carboxyméthylpipérazine, génère le pseudopeptide [Cmpi21,aza-3-Hht23]26RFa(21-26), qui est 8 fois plus puissant à mobiliser le Ca2+, 5 fois plus puissant à déplacer la liaison du 26RFa radio-iodé et 3 fois plus stable dans le sérum que l’heptapeptide. In vivo, le pseudopeptide induit un effet orexigène 2 fois plus long. A l’aide d’un modèle 3D du GPR103 par homologie, dans lequel a été docké le 26RFa(19-26), nous avons observé que l’Arg25 du peptide établit une liaison hydrogène avec la Gln(3. 32) du récepteur. La mutation de cette glutamine induit un défaut d’activation par le 26RFa du GPR103. Enfin, la substitution de l’Arg25 du 26RFa(20-26) par une ADMA génère un analogue qui se comporte comme un antagoniste du GPR103. A terme, ces nouvelles données devraient contribuer au développement de nouveaux ligands du GPR103 à visée thérapeutique.

Chez certains pathogènes, les flavohémoglobines (flavoHbs) jouent un rôle important dans le système de défense des microorganismes en leur conférant une résistance contre le stress nitrosant généré par les cellules du système immunitaire. Dans la mesure où ces protéines sont absentes chez l’homme, plusieurs études ont été réalisées en vue de comprendre le fonctionnement des flavoHbs au niveau moléculaire en les considérant comme des cibles attractives potentielles pour des inhibiteurs sélectifs. L’inactivation de ces enzymes chez les pathogènes entraîne une perte de virulence. Des composés chimiques (dérivés azolés) ont été identifiés comme étant capables d’inhiber leur activité enzymatique et d’affecter les facteurs de virulence bactérienne. Si ces composés sont très utilisés dans le traitement d’infections fongiques cutanées invasives, leur activité antibactérienne potentielle n’est pas encore exploitée.Typiquement, les flavoHbs sont composées de trois domaines : un domaine à hème de type globine, un domaine de site de fixation d’une flavine et un domaine de fixation du substrat de l’enzyme, le NADH. Les structures cristallographiques des flavoHbs montrent que ce sont des protéines capables d'adopter des conformations différentes selon la nature et la présence de ligand de l’hème mais aussi selon l’organisme d’origine. Ces différentes conformations se traduisent par une mobilité d’un seul des trois domaines sans modification majeure des deux autres domaines. Nous avons entrepris, dans ce travail, l’étude de la flavoHb d’une bactérie pathogène, Staphyloccocus aureus (pathogenic bacteria), peu étudiée dans la littérature et sa comparaison avec celle issue de Ralstonia eutropha (bactérie non pathogène), mieux caractérisée, afin de tenter d’apporter des informations nouvelles voire plus spécifiques de leur fonctionnement chez les pathogènes.Le travail présenté dans ce manuscrit décrit tout d’abord la caractérisation fonctionnelle et biochimique de la flavoHb de S.aureus, et approfondi celle de R. eutropha. Du fait de l’absence de structure cristallographique de la flavoHb de S. aureus, nous avons construit un modèle structural théorique en se basant sur l’homologie de séquence forte entre la séquence d’acide aminée de S. aureus et celle de Saccharomyces cerevisiae dont la structure 3D a été récemment déterminée. Dans l’hypothèse où le mécanisme enzymatique des flavoHbs implique une transition entre différentes conformations, les flavoHbs de R. eutropha et S. aureus ont été modifiées génétiquement au niveau du résidu phénylalanine suggéré par l’analyse structurale comme pouvant jouer un rôle dans la transition entre les différentes conformations. Les conséquences de la mutation de Phe396 en Ser ou Ala ont été analysées au regard des activités catalytiques et des propriétés biochimiques de l’enzyme mais aussi des propriétés des transferts d’électrons intramoléculaires entre les groupements prosthétiques (hème et flavine) par différentes techniques spectroscopiques. Ce travail a permis de montrer que l’effet de la substitution du résidu Phe sur les propriétés enzymatiques diffère selon la flavoHb considérée et révèle dans certains cas un site de fixation de substrat autre que le substrat natif. L’effet d’inhibiteurs (dérivés azolés) mais aussi des quinones et de composés aromatiques nitrés sur le fonctionnement des protéines natives et modifiées génétiquement ont été également étudiés dans ce travail, ces derniers composés pouvant agir en tant que "substrats subversifs" pour les flavoHbs, transformant leurs fonctions de protection en fonctions cytotoxiques.L’ensemble de ce travail a montré que, malgré des structures et des séquences protéiques très voisines, les flavoHbs issues de bactéries différentes sont susceptibles de se comporter différemment vis-à-vis de l’introduction d’une même mutation, de l’effet d’un même inhibiteur et peuvent le cas échéant présenter aussi des cycles catalytiques sensiblement différents
For some pathogens, flavohemoglobins (FlavoHbs) play an important role in the defense of microorganisms by conferring them a resistance against nitrosative stress generated by the immune system cells. Since these protein are absent in human, several studies have been conducted in order to understand the functioning of these proteins at the molecular level, considering them as potential attractive targets for selective inhibitors. Their inactivation results a loss of virulence. Chemical compounds such as azole derivatives have been identified as being capable of inhibiting their enzymatic function and thereby affecting the bacterial virulence factors. If these compounds are widely used in the treatment of invasive fungal skin infections, their potential antibacterial activity is not yet operated.Typically, flavoHbs are composed of three domains: an N-terminal globin domain which harbors a single heme b and a C-terminal ferredoxin reductase-like FAD- and NAD-binding module. The crystallographic structures of flavoHbs show that these proteins are able to adopt different conformations depending on the nature and the presence of heme ligand but also depending on different organisms they are coming from. The different conformations are characterized by a rigid body motion of one of the three domains. We have undertaken in this work, the study of the Staphyloccocus aureus flavoHb, poorly studied in the literature, and compared it to the Ralstonia eutropha flavoHb (non pathogenic bacteria) to provide new and more specific information on behaviors of these proteins derived from pathogens.This PhD work describes first the functional and biochemical characterization of the S. aureus flavoHb. Due to the lack of its crystallographic structure, a theoretical structural model was designed based on the strong sequence homology between the amino acid sequence of S. aureus and Saccharomyces cerevisiae for which the 3D structure was recently determined. We hypothesized that the relative movement of protein domains could be a way to regulate its enzymatic activity by controlling the substrate accessibility. The Phe396 residue (nomenclature according to R. eutropha), suggested by the structural data to play an important role in the enzyme functioning, but also in the equilibrium between different conformations, was substituted by the Ala or Serine amino acids. The effects of the punctual mutations were investigated with respect to the enzyme functioning and biochemical properties. The mutations effect on the internal electron transfer between flavoHbs cofactors (heme and FAD) was also studied by spectroscopic techniques. This work showed that the impact of Phe substitution on the enzymatic properties is different, depending the considered flavoHb and revealed an additional binding site for other substrate than the native one. The effects of azole derivative inhibitors and also quinones and nitroaromatic compounds have been studied on native and genetically modified enzymes functioning. The latter compounds may act as the ‘subversive substrates’ for flavoHb, converting its protective functions into the cytotoxic ones.Taken as a whole, this work showed that, although the protein structures and sequences are similar, the flavoHbs from different bacteria may behave differently towards an identical mutation, an identical inhibitor and could display different catalytic cycles

Les cellules Kurloff sont des cellules mononucléaires de cobaye caractérisées par la présence d'un grand corps d'inclusion prenant la coloration P.A.S. (Periodic Acid Schiff). Les cellules Kurloff sont présentes dans divers tissus et organes mais elles sont plus nombreuses chez la femelle que chez le mâle. Leur nombre augmente significativement pendant la grossesse et sous l'effet de l'administration d'oestrogènes. Les cellules Kurloff possèdent une activité cytotoxique tueuse naturelle (NK) contre diverses cellules cibles tumorales et cette activité NK est indépendante du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC). Les buts principaux de notre étude étaient de déterminer l’effet du traitement aux oestrogènes sur l'augmentation du nombre de cellules Kurloff dans divers tissus et organes et de produire des anticorps monoclonaux (Acm) contre ces cellules afin de mieux les caractériser. Nous nous sommes intéressés à la mesure de l'activité NK au niveau des 5 sous-populations de cellules Kurloff identifiées selon leur densité. Nous avons aussi étudié la reconnaissance de ces sous-populations par les Acm anti-cellules Kurloff ainsi que l'effet d'un de ces Acm (le 14D1) sur l'activité NK. Nos résultats ont montré que l'augmentation du nombre de cellules Kurloff dans la rate au cours du traitement hormonal est proportionnelle à l'augmentation du nombre de ces cellules dans la moëlle oseuse. Les 5 sous-populations de cellules Kurloff purifiées par différents gradients continus de Percoll (densité cellulaire: 1.048, 1.062, 1.076, 1.087 et 1.100 g/ml) sont reconnues par les 8 Acm préalablement sélectionnés. Ces Acm ont été sélectionnés a l'aide des techniques d'ELISA et de cytométrie de flux pour leur reconnaissance sélective des cellules Kurloff et pour leur titre. Des études d'immunofluorescence et d'ImmunoGold ont montré que les Acm anti-cellules Kurloff reconnaissent autant les cellules Kurloff provenant de cobayes témoins que de cobayes traités aux oestrogènes. Un certain pourcentage (entre 55 et 70 %) des cellules Kurloff ont été reconnus par l'Acm anti-CD56h qui est un marqueur très spécifique des cellules NK humaines et de rat. Nos expériences de relâchement spécifique de 51Cr ont montré que les cellules Kurloff de plus faible densité (1.048 à 1.076 g/ml) possèdent l'activité NK la plus importante. Enfin l'Acm produit par le clone 14D1 ne semble pas moduler l'activité NK des cellules Kurloff.

L'objectif général de cette thèse est d'étudier dans les mouvements complexes, les propriétés psychophysiques de flexibilité d'un programme moteur suite à une perturbation inattendue et certaines de ses bases neurales. Pour ce faire, trois études comportementales et une étude en imagerie par résonance magnétique fonctionnelles ont été menées. (1)Les principaux résultats de notre première étude démontrent que lors de la réalisation de mouvements complexes, après un déplacement inattendu de la cible visuelle, des corrections motrices peuvent apparaître très rapidement en une centaine de millisecondes dans les muscles de la jambe et du bras. De telles latences pourraient indiquer que les corrections motrices rapides à partir des entrées visuelles pourraient être générées grâce à des boucles corticales de bas niveaux. (2) Lors d'un déplacement imprévu de la cible visuelle pendant l'exécution d'un mouvement complexe dirigé, les temps de correction sont significativement corrélés entre certaines paires de muscles, indépendamment de leur localisation anatomique ou de leur ordre d'apparition dans la séquence temporelle de recrutement musculaire. Ces résultats suggèrent que le système nerveux central est capable d'utiliser des synergies motrices fonctionnelles et complexes lors de la génération de corrections motrices. (3) Lorsque la taille de la cible est modifiée de manière imprévisible pendant l'exécution du plan moteur initial, la durée du mouvement augmente, indépendamment de la variabilité de la précision terminale du mouvement de pointage. Ce résultat suggère que les retours sensori-moteurs et une représentation en (quasi) temps réel de la vitesse de l'effecteur sont utilisés pour générer et contrôler le déplacement de la main. (4) Enfin, lors d'une tâche de rattrapés de balles répétitifs, en manipulant les conditions de prédiction a priori de la masse des balles utilisées, la dernière étude de ce travail expérimental démontre qu'un réseau cérébelleux bilatéral, impliquant les lobules IV, V et VI, est très majoritairement impliqué dans les processus de calcul de l'erreur sensori-motrice. Dans les boucles corticales classiques impliquées dans la flexibilité motrice, le cervelet est engagé dans la génération de l'erreur sensori-motrice. Néanmoins, il semblerait que d'autres boucles de plus bas niveaux puissent être également employées afin de générer des corrections motrices très rapides. La coordination entre ces différentes boucles reste à être étudiée plus précisément.

Les antiviraux actuels, dirigés contre les enzymes virales du VHC et du VIH, conduisent à l’émergence rapide de souches résistantes. Une approche intéressante pour contourner ce problème consiste à cibler des fragments d’ARN non traduits. De façon générale, deux approches sont envisagées pour cibler des fragments d’ARN : l’inhibition par des petites molécules et l’approche antisens. Dans le cadre de la recherche de petites molécules dirigées contre les deux boucles E des domaines IIb et IIId de l’IRES du VHC, nous avons synthétisé 52 peptides et dérivés de peptides linéaires et cycliques contenant la séquence d’acides aminés Lys-Lys-Pro-Lys. En parallèle, nous avons tenté d’améliorer la pénétration cellulaire d’oligonucléotides antisens de type PNA. Ainsi, nous avons synthétisé deux synthons contenant un groupement fluorescent et une cystéine liée au cation lipophile 4-thiobutyltriphénylphosphonium (TBTP) via un pont disulfure biolabile en milieu réducteur. Nous avons conjugué ces synthons à un PNA cyclique dirigé contre la boucle SL3 du VIH et étudié la pénétration cellulaire par microscopie de fluorescence et cytométrie de flux. Nous avons montré que la pénétration cellulaire de ces conjugués de PNA n’a pas lieu par un processus d’endocytose, sensible à la température ou dépendant de l’ATP, mais par une translocation passive à travers la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. Finalement, nous avons synthétisé un second type de vecteur constitué du TBTP lié, via un pont disulfure, au 2-mercaptoéthanol, qui, une fois conjugué aux PNAs par une liaison de type carbamate, est susceptible de délivrer ces derniers intacts dans le cytoplasme de la cellule (non liés à un groupement résiduel)
Current antiviral drugs, directed against viral enzymes of HCV and HIV, lead to the fast emergence of resistant variants. An interesting approach to circumvent this problem consists in targeting untranslated RNA fragments. In a general way, two approaches are envisaged to target RNA fragments: the inhibition by small molecules and the antisens approach. We have synthesized 52 linear and cyclic peptides and peptide derivatives constituted by the amino-acids sequence Lys-Lys-Pro-Lys targeting the two E loops of the HCV RNA. In parallel, we have tried to improve the cellular uptake of antisens PNA. We have synthesized two cysteine synthon incorporating both a fluorescent group and a triphenylphosphonium derivative (TBTP) via an intracellular scissile disulphide bond. We have conjugated these synthons to a cyclic PNA-based compound and investigated the cellular uptake of these conjugates by fluorescence microscopy and flow cytometry. We have shown that the cellular uptake of these cyclic PNA conjugates is not driven by an endocytotic temperature-sensitive or ATP-dependent process but by a passive translocation through the lipid matrix of the cell membrane. Finally, we have synthesized a second vector constituted by TBTP linked, via a disulfide bond, to 2-mercaptoethanol, which, once conjugated to PNAs by a carbamate bond, could release an unaltered PNA in the cytoplasm of the cell

La mesentericine y105 est une bacteriocine de 7 acides amines secretee par la bacterie lactique leuconostoc mesenteroides. Elle appartient au groupe des bacteriocines actives sur le genre bacterien listeria et presente le motif consensus caracteristique tyr-gly-asn-gly-val- x- cys dans sa partie n terminale. Le peptide a ete produit chez escherichia coli par la technologie de l'adn recombinant. Il est purifie sous la forme d'une proteine de fusion contenant une sequence polyhistidine. La mesentericine recombinante est obtenue par clivage enzymatique (endoproteinase aspn) et chimique (le bromure de cyanogene) de la proteine de fusion, comportant 4 copies de la mesentericine. Elle est ensuite caracterisee par le sequencage n ter des acides amines et la mesure de sa masse par spectrometrie. Testee pour son activite anti-listeria, la mesentericine y105 recombinante est conforme au peptide naturel. La mesentericine reduite par le dithiothreitol a une activite identique a la mesentericine oxydee ce qui suggere que le pont disulfure naturellement present entre les residus cysteine 9 et 14 n'est pas indispensable a l'activite de la bacteriocine. Une strategie de mutagenese dirigee a ete developpee afin de determiner les roles respectifs de la region consensus n terminale et de la region asn#1#7#- asn#3#1 dont la structure predite est une helice amphiphile. Les mutations de la region n terminale engendrent des peptides dont l'activite anti-listeria est diminuee a des degres variables. Le motif consensus qui s'avere donc necessaire pour l'activite anti-listeria, pourrait etre implique dans la reconnaissance des cellules cibles. En revanche, la modification ou l'elimination de l'helice conduisent a des peptides inactifs. Sur la base de ces resultats, un modele d'action de la mesentericine sur les cellules de listeria est propose.

Ce travail de thèse décrit la synthèse, la réactivité et les propriétés biologiques des dérivés 2-pyridoniques obtenus à partir de substrats simples appartenant à la famille des chromones. Lors de ce projet, les énaminochromanones - représentant une nouvelle classe d’hétérocycles - ont été identifiées comme étant des intermédiaires cinétiques stables et facilement isolables. Certains composés de type pyridin-2-one ont été diversifiés et, parmi les produits synthétisés, certains ont montré des activités anticancéreuses via inhibition du processus de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ultimement, en utilisant le même substrat de type chromone, une approche innovante de la synthèse des analogues d’aromathécines (ARTs) a été également abordée et a abouti au squelette A-B-C-D de ces dernières avec un rendement global de 32%
This work is focused on the synthesis, reactivity and biological properties of 2-pyridone derivatives obtained from simple substrates such as chromone scaffold. During this project, the enaminochromanones - belonging to a new class of heterocycles - was identified as stable an easily isolable kinetic intermediates. Some pyridin-2-one compounds have been diversified and, among the synthesized products, some of them showed anticancer activities via inhibition of epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. Ultimately, an innovative approach to synthesize aromathecin analogs (ARTs) by using the same chromone substrate as starting material was also discussed and led to A-B-C-D core of the latter in 32% overall yield

Atteindre un objet visuel avec la main requiert une transformation de la position d l'objet (représenté par rapport au regard) en une commande motrice du bras (coordonnées centrées sur l'épaule). Cette représentation doit être mise à jour chaque fois que les yeux bougent. De plus, la position de la main doit être comparée à celle de l'objet afin de produire un mouvement précis. Nous examinons la coordination oeil-main chez des sujets normaux et des patients avec des lésions du cortex pariétal. Cette thèse démontre que le cortex pariétal est essentiel dans la tranformation visuo-motrice - et ce surtout pour les mouvements à courte latence - mais non indispensable dans la mise à jour de la mémoire visuelle. De plus, la position de la main est comparée à la position de la cible en coordonnées centrées sur l'épaule, ainsi que dans des coordonnées centrées sur le regard, comme suggéré précédemment

L'objectif de cette thèse est, d'une part, axée sur les glycosidases modifiées pour la synthèse d'analogues de l'antigène H-1 et, d'autre part, de créer une activité hydratase à partir d'une pectate lyase. A cet effet, nous avons évalué trois glycosynthases et des transglycosidases. Nos résultats montrent que les glycosynthases permettent d'obtenir des disaccharides avec des rendements quasi quantitatifs. De plus, les transglycosidases permettent la synthèse de composés de transglycosylation avec des rendements de 60 à 75% selon l'accepteur utilisé. La modification de la pectate lyase de Thermotoga maritima (TmPel) aux travers d'approches complémentaires a été tentée. Nos efforts pour l'évolution dirigée de TmPel nous ont permis de mettre au point un système de sélection in vivo dans Escherichia coli pour la recherche de nouvelles activités enzymatiques. Nous avons également construit un modèle de TmPel permettant de discuter des possibilités d'ingénierie rationnelle
The aim of this PhD thesis was first to use modified glycosidases for the synthesis of antigen H-1 analogs and second to generate an hydratase activity from a pectate lyase. In this end, we evaluated three glycosynthases and transglycosidases. We showed that glycosynthases can synthesize disaccharides with nearly quantitative yields. Furthermore, transglycosidases can synthesize transglycosylation compounds with 60 to 75% yields depending of the acceptor. Modification of the Thermotoga maritima pectate lyase (TmPel) was attempted with complementary approaches. Our efforts for the directed evolution of TmPel led us to the development of an in vivo selection system in Escherichia coli allowing the seak of new enzymatic activities. We also constructed a model of TmPel to discuss about its rationnal engineering

Les beta-lactamases constituent la voie majeure de resistance aux beta-lactamines, antibiotiques tres utilises. Plusieurs residus de la beta-lactamase tem-1 d'escherichia coli, situes au niveau de la cavite catalytique de la proteine, ont ete etudies. Pour cela, chacun de ces residus a ete substitue par 15 autres acides amines grace a la methode de suppression informationnelle. Apres analyse de l'activite des variants ainsi obtenus, certains revertants ont ete construits par mutagenese dirigee, puis cinetiquement caracterises par microacidimetrie. A l'aide de ces donnees, mais aussi grace aux informations apportees par la structure tridimensionnelle de la proteine tem-1 resolue a 1,8 a, le role de chaque residu a alors pu etre determine. Ainsi, il apparait que l'arginine 244 intervient dans l'hydrolyse enzymatique en destabilisant le complexe enzyme-produit. La methionine 69 et la leucine 169 jouent quant a elles un role different: ces deux residus imposent des contraintes structurales au niveau du site actif qui permettent de maintenir une topologie optimale pour la fixation et l'hydrolyse des differents substrats de l'enzyme. Enfin, l'acide glutamique 166 est essentiel pour la catalyse enzymatique; ce residu intervient en tant que base generale dans l'etape de deacylation. La comparaison des structures tridimensionnelles de l'enzyme sauvage et du variant e166y, determinees a l'ibmc de strasbourg, a egalement apporte des indications sur l'adaptation conformationnelle de la beta-lactamase tem-1

Cette recherche s’intéresse à l’activité « apprendre à diriger » à partir de l’étude d’une formation entraînant des professionnels à savoir agir face à l’imprévu, l’inattendu, l’incertain, voir l’insoutenable.À partir des théories de l’activité et plus spécifiquement du cadre théorique et méthodologique du cours d’action (Theureau 2004, 2006, 2009), elle tente de saisir, décrire, comprendre et expliquer : (i) comment s’organise la structure de cette activité, (ii) en quoi les différentes dimensions somatiques, affectives et cognitives participent aux apprentissages des acteurs, et enfin (iii) quelles sont les différentes catégories de situations génératrices de perturbations.Nous y soutenons la thèse qu’apprendre à diriger au sein de dispositifs de formations simulés de haute intensité conduit les individus, par une mise à l’épreuve, à déployer des apprentissages par corps, qui participent à la transformation de leur manière d’être au monde dans le sens d’une vigilance à soi et aux autres, qui n’est autre qu’une coprésence à ce qui est et advient
This PhD dissertation examines the activity “learning how to command” thanks to a study of professionals undergoing training to learn how to face unpredictable, unexpected, uncertain, and even unbearable situations.This dissertation relies on theories of activity and more specifically on theories and methodologies of action course (Theureau 2004, 2006, 2009), and aims at grasping, describing, understanding, and explaining: (i) the structure of that activity, (ii) how the different somatic, affective and cognitive dimensions participate in the learning processes of participants, and finally (iii), what the different categories ofsituations generating perturbations are.This PhD dissertation argues that learning how to command within high-intensity simulated training environments lead individuals to experientally deploy learning activities involving their body. In turn, that bodily learning participates to the transformation of the individuals’ being in the world and to the development of both self and other-oriented forms of vigilance. Such a vigilance can only be described as a co-presence to what takes and will take place

La 17-hydroxysteroide deshydrogenase de type 1 (17-hsd1) est responsable de la synthese de l'stradiol, strogene biologiquement actif implique dans le declenchement et la proliferation des cancers du sein hormono-dependants. Cette enzyme appartient a la famille des deshydrogenases reductases a chaine courte dans laquelle les residus ser142 tyr155 et lys159, tres conserves, sont supposes intervenir dans le transfert de proton. La 17-hsd1 presente une specificite exclusive, mais inexpliquee vis-a-vis des steroides possedant un cycle a aromatique. De plus, elle utilise, in vitro, aussi bien le nad#+ que le nadp#+ comme cofacteur. Au cours de ce travail, nous avons tente d'identifier les interactions qui regissent ces specificites et de proposer un mecanisme reactionnel. Pour ce faire, des mutants s142a, y155f, s142a/y155f, k159m, h221l, h221q et -17-hsd1 (deletion des 38 residus c-terminaux) ont ete construits et exprimes dans le systeme baculovirus-cellules d'insecte. Les parametres de cinetique enzymatique de ces mutants ont ete compares a ceux de l'enzyme sauvage et une etude structurale a ete menee sur certains de ces mutants. Ainsi, des complexes h221l/nadp#+/stradiol, -17-hsd1/nadp#+/estradiol, h221l/nad#+ et h221q/stradiol ont ete resolus respectivement a 2. 7 a, 1. 9 a, 3. 0 a et 2. 7 a de resolution. Ces structures nous montrent une image detaillee des interactions enzymes-nadp#+ dans lesquelles intervient une boucle mobile (191-199), desordonnee dans toutes les structures precedemment decrites. Stabilisee uniquement en presence de cofacteur, cette boucle se rabat sur le site actif et le protege du solvant. De plus, le residu phe192 stabilise le groupement nicotinamide par un contact hydrophobe fort. Conjointement, ces deux elements favorisent le transfert d'hydrure. Par ailleurs, le groupement 2-phosphate du nadp#+ est stabilise par deux interactions ioniques avec les residus arg37 et lys195 et par une liaison hydrogene avec la ser11. Cette stabilisation demontre la preference de l'enzyme pour le coenzyme nadp(h) et souligne l'originalite de la 17-hsd1 dans laquelle un des deux residus basiques est situe en dehors du motif rossmann fold. De plus, l'analyse des proprietes catalytiques et du mode de liaison de l'stradiol pour les deux mutants h221l et h221q suggere que la liaison hydrogene normalement observee entre le residu his221 et l'oxygene o#3 du steroide joue un role primordial dans le determinisme de la specificite de l'enzymze vis-a-vis des substrats possedant un cycle a aromatique. Enfin, l'analyse structurale du site catalytique des complexes ternaires associee a la perte d'activite enzymatique des mutants s142a, y155f, s142a/y155f et k159m nous a permis de proposer un mecanisme catalytique dans lequel le residu tyrosine jouerait le role d'acide en donnant son proton a l'oxygene o#1#7, le residu serine stabiliserait l'intermediaire reactionnel et contriburait a reduire le pka de la tyrosine alors que le role principal de la lysine serait de stabiliser le groupement nicotinamide.

Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque
The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure

Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme
Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes

L’activité économique et le nouveau marché électronique sont les notions qui motivent les économistes ainsi que les juristes à réorganiser le nouvel espace du commerce. Un marché électronique donne son caractère électronique à l’activité sur les réseaux, ce qui a motivé les États à adopter certaines règles pour régir ce marché. Cette utilisation de réseau mondial nous encourage à traiter la question de commerce électronique en droit, et plus précisément la question de contrat de vente électronique en droit international privé. La première partie de cette thèse traite d’un côté les questions de la particularité et les problématiques du commerce électronique en droit international privé. Ces problématiques prennent en compte la question du cyberespace en tant que nouveau marché virtuel: la territorialité, l’internationalité, l’immatérialité de cet espace. D’un autre côté, se trouve l’applicabilité des conventions internationales au contrat de vente électronique. La seconde partie de cette thèse analyse la technique et la stratégie d’adaptation des lois nationales afin d’être applicables au contrat électronique. Les deux exemples de cette analyse d’adaptation sont la loi française et la loi syrienne
Economic activity and the new electronic marketplace are the concepts that motivate economists and lawyers to reorganize the new area of commerce. An electronic market provides its electronic character of the activity on the networks, which motivated the states to adopt certain rules governing this market. This use of global network encourages us to address the issue of electronic commerce law, and specifically the question of contract electronic sales in private international law. The first part of this thesis deals with one side of the particular issues and problems of electronic commerce in international private law. These issues take into account the issue of cyberspace as a new virtual marketplace: territoriality, internationality, the immateriality of this space. On the other hand, is the applicability of international conventions on electronic sales contrac. The second part of this thesis analyzes the technique and strategy of adapting national laws to be applicable to electronic contracts. Two examples of this analysis are adjusting to French law and the Syrian law

Les elicitines secretees par phytophtora sp. Sont des proteines de 10 kda inductrices de necroses de type hypersensible et de resistance systemique acquise chez le tabac. De structures primaires tres conservees, elles se distinguent cependant en elicitines faiblement et tres necrosantes, correspondant respectivement a des proteines de phi acide et basique. Dans cette etude, plusieurs acides amines impliques dans la modulation des activites biologiques d'une elicitine fortement necrosante, la cryptogeine, ont ete identifies. L'importance de la conformation de la cryptogeine pour l'integrite de son activite biologique a ete montree par reduction et denaturation, puis renaturation de la proteine. Les acides amines impliques dans la modulation de l'activite necrosante de la cryptogeine ont ete recherches par mutagenese dirigee et production des elicitines modifiees dans escherichia coli. La cryptogeine exprimee dans un systeme utilisant l'arn polymerase du phage t7 est insoluble et partiellement denaturee. Apres avoir mis au point des conditions de solubilisation et de renaturation, la cryptogeine produite dans e. Coli est une proteine stable et dosable, d'activite biologique identique a celle de la cryptogeine fongique sur plant de tabac. Ce protocole d'expression/renaturation a aussi permis d'obtenir la proteine correspondant a une nouvelle sequence codante d'elicitine isolee de p. Cryptogea au cours de cette etude. Presentant des caracteristiques de sequence primaire atypiques par rapport aux elicitines connues, cette elicitine n'est biologiquement pas differente de la classe des elicitines peu necrosantes deja decrites, telle que la parasiticeine. La mutagenese dirigee des 6 lysines de la cryptogeine a conduit a l'obtention d'une famille de 11 elicitines modifiees. La caracterisation des mutants simples sur plant de tabac montre que 5 positions sont impliquees dans l'intensite de la necrose. Chez les doubles mutants, les diminutions de l'activite necrosante dues a chaque simple mutation sont cumulees de facon additive. Une elicitine portant 5 substitutions de lysines n'induit plus de necrose foliaire distale. De plus, il est montre que le phi basique de la cryptogeine n'est pas, en soi, le facteur determinant le niveau d'activite necrosante, et qu'un residu acide participe aussi a l'intensite de la necrose induite. Ensemble, ces resultats montrent que l'activite necrosante de la cryptogeine est modulee par plusieurs acides amines charges repartis sur la chaine peptidique. Par ailleurs, les elicitines modifiees moins necrosantes que la cryptogeine induisent chez le tabac une resistance plus faible vis a vis de p. Parasitica var. Nicotianae. Ceci suggere que les acides amines echanges chez ces proteines modulent simultanement les deux activites biologiques des elicitines. Cependant, la protection induite n'est jamais inferieure a celle de la parasiticeine, meme chez le mutant non necrosant. Cette etude montre que la necrose induite par les elicitines n'est pas necessaire a l'etablissement de la resistance systemique acquise chez le tabac, mais qu'elle en amplifie le niveau

Par l'accumulation de mutations bénéfiques lors de cycles successifs de mutagénèse, l'évolution dirigée offre un cadre rationnel pour l'amélioration des protéines à vocation industrielle. Elle permet une exploration large de l'espace possible des séquences ainsi que leurs capacités fonctionnelles. Elle est cependant lourde à mettre en oeuvre et nécessite des moyens importants. Des approches in silico font usage d'un jeu minimal de données expérimentales et utilisent la modélisation statistique combinée à des algorithmes d'apprentissage machine. Elles ont été développées pour explorer de façon heuristique l'espace possible des séquences et de la fitness et d'identifier les mutations et interactions entre résidus les plus intéressantes. C'est l'objet de cette thèse qui explore la construction et l'application de modèles statistiques s'appuyant sur des jeux minimaux de données expérimentales pour relier fitness, ou activité, à la séquence biologique des variants. L'étude s'articule autour d'un choix crucial d'une méthode de numérisation, de descripteurs de la séquence et de méthodes de régression. La méthode ProSAR de R. Fox (2005) et les limites de son applicabilité sur des jeux de données expérimentales ont été étudiées. De nouvelles méthodes ont aussi été développées, prenant en compte les propriétés physico-chimiques des acides aminés et leurs périodicités. Elle a permis de découvrir de nouveaux descripteurs reliant la séquence à l'activité et propose des approches innovantes qui ont la capacité de traiter des cadres biologiques très divers, même lorsque peu de données biologiques sont disponibles
Via the accumulation of beneficial mutations through successive rounds of mutations, directed evolution offers a rational framework for the amelioration of protein of industrial interest. It enables the large exploration of the sequence space and fitness. However, they are wet-lab intensive and may reveal to be time consuming and costly. In silico approaches using minimal sets of experimental data and statistical models combined with machine learning algorithms have been developed to explore heuristically the sequence space and to identify the effect of the potential epistatic interactions between residues on protein fitness. This work focused on the construction and application of statistical models relying on minimal experimental datasets to study protein sequence to activity relationships (ProSAR). In particular, the choices of appropriate numerical encoding methods, of descriptors extracted from protein sequences and of regression methods were investigated. The original ProSAR method from R. Fox (2005) and the limits of its applicability on experimental datasets have been studied. New methods that consider physico-chemical features of amino acids and their periodicities have been explored. This study unveils novel descriptors of the sequence-activity relationship and provides innovative approaches that can deal with very diverse biological datasets, even when few biological data are available

La glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase glycolytique (GAPDH) est étudiée en tant qu'enzyme modèle, afin de développer des concepts en matière de remodelage d'enzyme. Par mutagénèse dirigée, on modifie certains aminoacides impliqués dans la fixation des substrats et du coenzyme. Les conséquences de ces mutations sont étudiées sur le plan enzymatique

La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est une enzyme tétramérique à cofacteur NAD**(+) , catalyse la phosphorylation oxydative du d-glycéraldéhyde-3-phosphate en acide 1-3 diphosphoglycérique. Deux acides aminés, dits catalytiques jouent un rôle essentiel : la cystéine 149 et l'histidine 176. À partir de la structure tridimensionnelle déterminée à haute résolution de l'enzyme de bacillus stearothermophilus et en appliquant la technique de mutagénèse dirigée sur le gène de l'enzyme de eschérichia Coli, l'histidine 176 est remplacée par une asporagine et la cystéine 149 par une glycine et une périne. L'analyse des mutants a été effectuée à l'aide de deux modèles chimiques, l'iodoacétamide et le P nitrophénylacétate

Les cellulases, enzymes responsables de la degradation de la cellulose, sont couramment utilisees dans les industries textiles (lessives, detergents) et papetieres (desencrage du papier). Le developpement de nouvelles enzymes (plus stables et plus actives) pour la modification selective de la cellulose a l'echelle industrielle, necessite une parfaite connaissance du mode d'action des cellulases. Afin d'etudier les relations entre la structure et l'activite de ces glycoside hydrolases, nous avons synthetise differents inhibiteurs de cellulases destines a des etudes cristallographiques de complexes enzyme/inhibiteur. Apres une mise au point bibliographique sur les cellulases, nous decrivons dans le deuxieme chapitre la conception et la synthese d'un aza-c-pseudo-disaccharide susceptible de mimer la distorsion du substrat observee dans le sous-site 1 du site actif des -glycoside hydrolases qui agissent avec retention de configuration. Dans le troisieme chapitre, nous presentons la preparation d'une /-thio-cellodextrine et l'etude aux rayons x du complexe enzyme/inhibiteur avec la cellulase cel5a de bacillus agaradhaerans. Ce tetrasaccharide presente une inhibition competitive sur differentes cellulases et grace a la presence d'une liaison , il se fixe dans le centre actif de cel5a en evitant la distorsion necessaire dans le sous-site 1. Enfin, le dernier chapitre aborde l'utilisation en synthese oligosaccharidique d'une cellulase issue de l'ingenierie des proteines. Le mutant cel7b e197a, depourvu d'activite hydrolytique par mutagenese dirigee, catalyse avec efficacite et selectivite la condensation de mono- et disaccharides sur les fluorures d'-lactosyle et cellobiosyle.

La paraoxonase humaine (ec 3. 1. 8. 1, pon1) est une metalloenzyme a calcium associee aux lipoproteines plasmatiques de type hdl. Elle est impliquee dans la prevention de l'oxydation des lipoproteines de type ldl. Notre interet pour la pon1 tient a son activite d'hydrolase d'organophosphores (opase). Notre objectif est d'utiliser une forme ingenierisee de cette enzyme dans le traitement de l'intoxication par les ops neurotoxiques de guerre et pour la decontamination. L'optimisation de l'efficacite catalytique de la pon1 implique l'elucidation prealable de son mecanisme catalytique et la determination de sa structure tridimensionnelle. La nature et la concentration du detergent associe a la pon1 purifiee determinent la stabilite et l'activite de l'enzyme. La modification chimique selective d'aminoacides et la mutagenese dirigee ont permis l'identification de residus essentiels aux activites opase et arylesterase (are) de la pon1 humaine. Ces residus sont : c41, c352, h114, h133, h154, h242, h284, e52, e194, d53, d168, d182, d268, d278 et w280. Chez le lapin, les aminoacides h114, h133, h154, e52, d53 et d268 sont essentiels a l'activite are de la pon1, mais d168, e194, h242 et w280 ne le sont pas. Afin d'identifier les ligands du calcium et de sonder son environnement, la liaison du 4 5ca, apres electrophorese en conditions non denaturantes, et du terbium, un analogue fluorescent du calcium, ont ete etudiees. L'etude de substrats suicides a ete envisagee afin d'identifier des residus du centre actif. Des electrophoreses realisees en conditions non denaturantes et des modifications chimiques par pontage avec des reactifs bifonctionnels ont montre que les pon1 de l'homme et du lapin sont dimeriques, actives et homogenes en presence d'une concentration micellaire de triton x-100. La structure quaternaire, l'activite et la stabilite de la pon1 dependent de la nature et de la concentration du detergent ainsi que de la concentration en ions calcium.

Enseigner l’espagnol comme langue étrangère (ELE) et utiliser la Littérature comme moyen didactique n’est pas une activité qui a été favorisée, ni dans l’aspect théorique comme pratique, dans les salles de classe, on l’a plutôt évitée. On a constaté que la plupart de temps on l’a réduit à un échantillon culturelle qui se situe à la fin des unités didactiques dans le manuelles d’ELE. Ces visions ont radicalement changé ces dernières années et des nombreux auteurs ont revendiqué son potentiel didactique et pédagogique. La présente mémoire s’inscrit dans la courante qui revendique l’utilisation du texte littéraire (TL) à cause du potentiel didactique qu’il renferme. On propose une série d’activités didactiques qui s’appuient dans le texte littéraire pour renforcer les compétences du discours au niveau de la description, la narration et la argumentation dans le cours d’espagnol langue étrangère (ELE) au niveau collégial et universitaire au Québec (Canada), en s’ appuyant sur les critères établis par le Cadre européen commun de référence pour les langues, le Plan curricular de l’Institut Cervantès, et le Programme du Ministère de l’Éducation du Québec. Auparavant, on a fait un bref parcours sur les différentes méthodes et approches pédagogiques dans l’enseignement de l’espagnol (ELE) ainsi que plusieurs études et articles qui proposent l’utilisation du texte littéraire en ayant comme objectif d’améliorer les compétences linguistique et communicatives des étudiants.
Teaching Spanish as a Second Language (ELE) and using literature as a didactic tool has never been an educational activity which received much support, in theory or in practice, it has rather been avoided. Most often, it has been relegated to a “cultural” sample at the end of the units in the ELE manuals, as “extra” material which the teacher did not really know what to do with. In recent years, these views have changed radically and many authors have claimed their teaching and learning potential. This thesis follows this tendency and claims the use of literary texts (TL) for the didactic potential they carry. It proposes a series of didactic activities, supported by literary texts, to strengthen the skills of discourse at the descriptive, the narrative and the argumentative level in teaching ELE to college and university students in Quebec (Canada), taking into account the criteria set by Common European Framework of Reference for Languages, the Plan curricular of the Instituto Cervantes and the Program of the Ministry of Education of Quebec. First, it offers a brief tour exposing the different currents and pedagogical approaches in the teaching of ELE and the various treaties and studies postulating the use of literary texts for this purpose.
Incursionar en la enseñanza del español para extranjeros (ELE) y utilizar la Literatura como herramienta didáctica no es una actividad docente que haya tenido siempre apoyo, tanto teórico como práctico, más bien se ha evitado. La mayoría de las veces se ha relegado a una muestra cultural al final de las unidades de los manuales de ELE, como un material extra con el que el docente no sabía bien qué hacer. Estas visiones han ido cambiando radicalmente en los últimos años, y numerosos autores han reivindicado su potencial didáctico y pedagógico. Esta memoria se inscribe en dicha corriente y reivindica el uso del texto literario (TL) por el potencial didáctico que conlleva. Se propone una serie de actividades didácticas, apoyadas en el texto literario, para fortalecer las competencias discursivas en el plano de la descripción, la narración y la argumentación en el ámbito de la enseñanza de ELE dirigidas a alumnos de nivel colegial y universitario de Quebec (Canadá), teniendo en cuenta los criterios establecidos por el Marco común europeo de referencia para las lenguas, el Plan curricular del Instituto Cervantes y el Programa del Ministerio de Educación de Quebec. Anteriormente, se hace un breve recorrido para exponer las diferentes corrientes y enfoques pedagógicos en la enseñanza de ELE y los diferentes tratados y estudios que postulan el uso del texto literario para este fin.

Au cours de l’ovogenèse chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appelées cellules de bord, migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Cet événement, nécessitant la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM), la réorientation, puis l’arrêt, ressemble à la formation de métastases. L’endocytose est un régulateur clé de plusieurs événements polarisés, y compris la migration cellulaire. En effet, différentes protéines impliquées dans la migration, comme les intégrines et les E-cadhérines (cadhérines épithéliales), sont régulées par transport à travers les endosomes. De même, l’endocytose restreint au front de migration l’activité des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mécanismes moléculaires de cette restriction spatiale de l’activité des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons testé l’implication du trafic vésiculaire à travers la machinerie d’endocytose, dans la migration dirigée des cellules de bord, car ce système est facilement accessible pour l’expression de protéines et l’analyse de mutants. Nous avons commencé par confirmer une observation précédente du rôle de l’endosome précoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifié l’endosome de recyclage (ER) comme un régulateur clé de cette migration. En effet, nous avons démontré que l’expression dans les cellules de bord d’une forme dominante négative de Rab11, la petite GTPase régulant le transport vésiculaire à travers l’ER, bloque la migration ou entraîne de sévères défauts de migration dans environ 80% des chambres d’œufs examinées. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de l’activité des RTKs alors que d’autres protéines de migration ne sont pas affectées par Rab11 dominant négatif. Ce résultat a été par la suite confirmé par une interaction génétique entre Rab11 et les RTKs. D’autre part, nous avons montré que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqué dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouvé par microscopie confocale en tissu fixé et par microscopie en temps réel que Sec15, un composant de ce complexe, est polarisé, de façon Rab11- dépendante, dans des vésicules qui s’accumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de l’activité de Sec15 perturbe à son tour la migration. Ainsi, toutes ces données démontrent le rôle fondamental d’un cycle d’endo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.
During Drosophila melanogaster’s oogenesis, a cluster of folllicle cells, called border cells, perform an invasive migration through the surrounding nurse cells to reach the oocyte. This event resembles metastasis formation since it requires epithelial- mesenchymal transition, reorientation and arrest. Endocytosis plays a fundamental role in many polarized processes, including cell migration, since different migration proteins, like integrins and E-cadherins traffic through the endocytic pathway. Furthermore, receptor tyrosine kinases (RTKs) that guide border cells during their migration are regulated by endocytosis, although the mechanisms involved are largely unknown. We tested the implication of vesicular trafficking through the endocytic machinery, in border cells’ directed migration, because this system is easily accessible for protein expression and mutant analysis. We first confirmed previous observation that trafficking through the early endosome is necessary for border cells migration, and then we identified the recycling endosome as a key compartment for this migration. Indeed, we showed that overexpression in border cells of a dominant negative form of Rab11, the small GTPase regulating vesicular trafficking through the recycling endosome, blocks migration or leads to severe migration defects in about 80% of examined egg chambers. Furthermore, using immunofluorescence, we observed a relocalization of RTKs activity, whereas other migration proteins were not redistributed upon dominant negative Rab11 expression. This result was further confirmed by a genetic interaction between Rab11 and RTKs. Moreover, we showed that the exocyst complex, an effector of Rab11, is also involved in border cells migration. We found by using confocal microscopy of fixed tissues and time-lapse microscopy of living egg chambers, that Sec15, a member of this complex, is distributed in vesicles which are polarized, in a Rab11- dependent manner, throughout border cells migration. In addition, loss of Sec15 also impairs migration. Together these data demonstrate a fundamental role for an endo- exocytic cycle in the maintenance of active RTKs at the leading edge of border cells during their migration.