Academic literature on the topic 'ADF/cofiline'

Le maintien de la morphologie et la production des forces par les cellules sont possibles grâce au cytosquelette, constitué de trois types de polymères protéiques dont les microfilaments d’actine. Les filaments d’actine s’organisent en différentes architectures, dont l’assemblage et le désassemblage sont étroitement contrôlés dans le temps et l’espace. En effet, une des caractéristiques d’un filament d’actine est son vieillissement, par l’hydrolyse progressive de l’ATP au sein des sous-unités. Pour assurer un renouvellement continu de l’ actine celle-ci doit donc être recyclée. Lorsque l’assemblage et désassemblage se compensent, les architectures d’actine sont alors dans un état stationnaire dynamique, dans lequel la concentration demonomères d’actine est perpétuellement renouvelée. Le désassemblage permet également de maintenir un réservoir important d’actine monomérique polymérisable, pour répondre rapidement aux besoins cellulaires. Le lamellipode, organe moteur de la cellule, est essentiellement composé d’unfeuillet fin mais très dense d’actine dendritique ainsi que de protéines régulatrices. Une protéine essentielle dans le turnover rapide du lamellipode est l’ADF/Cofiline. Elle est responsable du désassemblage des filaments âgés par fragmentation et pardébranchement. Jusqu’à présent, les études portaient le plus souvent sur les mécanismes microscopiques, à l’échelle du filament individuel. Or, pour comprendre la dynamique des réseaux branchés notamment au cours de la motilité cellulaire, il nous faut comprendre le désassemblage collectif et macroscopique du réseau d’actine dendritique. En combinant des milieux de motilité reconstitués à partir de protéinespurifiées à une nouvelle technique de micro-structuration de surfaces, j’ai pu reconstituer in vitro des réseaux dendritiques semblables au lamellipode. Ainsi, j’ai exploré au cours de ma thèse les paramètres qui contrôlent leur désassemblage macroscopique. Il en ressort que le désassemblage des réseaux dépend de leur architecture (densité) et de leur géométrie (taille) : les réseaux denses ou étendus sont moins efficacement désassemblés et restent cohésifs plus longtemps. Des modélisations montrent que c’est la déplétion locale en ADF/Cofiline autour du réseau d’actine qui semble responsable des effets observés. De plus, les réseaux constitués de densités d’actine hétérogènes acquièrent une directionnalité, qui peut être modulée par le désassemblage sélectif par ADF/Cofiline. Parallèlement, ces études ont permis de déterminer que pour avoir un réseau à l’état dynamiquestationnaire (ou à l’équilibre), il fallait atteindre un certain ratio d’ADF/Cofiline par actine. Ce travail a permis d’aller plus loin que les études fondamentales sur la fragmentation de filaments d’actine individuels, à l’échelle microscopique, et d’établir deux nouveaux paramètres qui contrôlent le désassemblage de réseaux d’actine dendritique à l’échelle macroscopique
Cells maintain their morphology and produce forces thanks to the cytoskeleton, which is composed of three types of protein polymers, amongst which the actin microfilaments. Actin filaments assemble into diverse architectures, which assembly and disassembly is tightly controlled in space and time. Indeed, the progressive hydrolysis of ATP in the monomers causes the actin filaments to age. Thus, actin needs to be recycled. When assembly and disassembly compensate, different actin architectures are in a dynamic steady state, in which the pool of actin monomers is renewed. Disassembly of actin structures also maintains a large reservoir of polymerization-ready monomers ready to assemble when needed by the cell.The lamellipodium is the locomotory organelle of the cell, and is made of a thin yet very dense sheet of dendritic actin network, with regulatory proteins. A pivotal protein is ADF/Cofilin, which is responsible of the disassembly of old actin filaments by fragmentation and debranching. To date, there have been extensive studies about the microscopic mechanisms, but if one wants to understand cell motility, one must decipher the collective and macroscopic disassembly of the dendritic actin network.By combining motility media reconstituted from purified proteins, and a new surface micro-patterning technique, I was able to reconstitute lamellipodium-like dendritic networks in vitro. During this thesis I explored the parameters that control the macroscopic disassembly of these networks. This work shows that the disassembly of dendritic actin networks depends on their architecture (density) and geometry (size): dense or extended networks are less efficiently disassembled and remain cohesive longer. Simulations show that these effects can be explains by a local depletion of ADF/Cofilin in the volume surrounding the network. Besides, networks of heterogeneous densities acquire directionality. This steering is modulated by selective disassembly of the networks by ADF/Cofilin. In parallel, these studies established a ratio at which networks are at a dynamic steady state.This work goes further than the fundamentally important studies about fragmentation of individual actin filaments, and establishes new parameters that control the disassembly of dendritic actin at the macroscopic scale

Durant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle central de l'ADF/cofiline, une protéine qui se lie au cytosquelette d'actine, décore spécifiquement les parties ‘âgées' des filaments d'actine, diminue localement par un facteur 5 la rigidité du filament et provoque la fragmentation du filament à l'interface entre les sections nues et décorées. Dans ma première étude (Suarez et al., Current Biology, 2011), j'ai utilisé la microscopie à onde évanescente et une ADF/cofiline fluorescente pour démontrer que l'ADF/cofiline est un marqueur de l'état nucléotidique (ATP, ADP-Pi ou ADP) des sous-unités d'un filament d'actine en cours de polymérisation. De plus, l'ADF/cofiline, en accélérant la dissociation du phosphate inorganique (Pi), limite la taille du cap ATP/ADP-Pi du filament d'actine, sans toutefois le réduire à une taille zéro. Des analyses statistiques sur filaments isolés établissent une corrélation parfaite entre la densité de fixation de l'ADF/cofiline et son efficacité de fragmentation. Paradoxalement, l'efficacité de fragmentation est maximale pour une densité d'ADF/cofiline de 0.5. Ceci est confirmé par des analyses supplémentaires qui montrent que les sites de fragmentation du filament coïncident avec la position des frontières entre zones décorées et zones nues. Les conséquences de ce dernier résultat paradoxal sont l'objet de ma seconde étude (McCullough et al., 2011, Biophysical Journal). En combinant différentes sources d'ADF/cofilines (vertébré et levure) et d'actines (vertébré et levure), nous montrons, sur les quatre couples actine-ADF/cofiline possibles, qu'il existe une très forte corrélation entre (1) l'efficacité de fragmentation (qui dépend de la combinaison entre actine et ADF/cofiline) et (2) la déformation du filament, mesurée à la frontière entre zone décorée et zone nue. Au cours de ma troisième étude (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), nous montrons que le mécanisme de fragmentation ADF/cofiline-dépendant, établi à l'échelle d'un filament isolé, peut s'appliquer aussi à l'échelle d'une comète d'actine qui comporte un réseau complexe de filaments. Mon travail de thèse a montré que le mode d'action de l'ADF/cofiline se situe à l'intersection entre mécanismes microscopiques et macroscopiques, d'une part, et entre chimie et physique, d'autre part. Les caractéristiques microscopiques des interactions de cette protéine avec un filament d'actine isolé sont fondamentales pour expliquer des évènements macroscopiques, comme la fragmentation de filaments ou de structures complexes. D'autre part, nous avons montré comment les propriétés chimiques de l'ADF/cofiline modifient les propriétés physiques locales du filament et conduisent à la fragmentation. L'ADF/cofiline a un rôle central pour l'intégration de mécanismes physico-chimiques, à l'échelle microscopique, afin d'assurer un comportement cohérent à l'échelle de la cellule
During my thesis, I have studied the pivotal role of ADF/cofilin, a protein that binds to the actin cytoskeleton, specifically decorates ‘old' actin filament parts, decreases by a factor of 5 the local filament rigidity and triggers filament fragmentation at boundaries between decorated and non-decorated filament sections. In my first study (Suarez et al., Current Biology, 2011), I have used evanescent wave microscopy and labeled ADF/cofilin to demonstrate that ADF/cofilin is a marker of the nucleotide state (i.e. ATP, ADP-Pi or ADP) associated with the actin sub-units in actively polymerizing filaments. In addition, because ADF/cofilin accelerates inorganic phosphate (Pi) release, the size of the ATP/ADP-Pi cap is diminished, although it cannot be reduced to zero. Fragmentation events frequency, determined from a thorough analysis of a population of single filaments decorated with labeled ADF/cofilin, is perfectly correlated with the binding density of ADF/cofilin on filaments. However, the maximal severing efficiency is obtained for half ADF/cofilin density. This paradoxical result is confirmed by analysis showing that severing sites are mainly associated with boundaries between decorated and bare actin filament sections. In consequence, in a second paper (McCullough et al., Biophysical Journal, 2011), I have took part in the study of actin filament deformation in relation with severing efficiency. Using different ADF/cofilin (vertebrate and yeast) and actin (vertebrate and yeast), we have shown that filament deformation at the boundary between bare and ADF/cofilin-decorated filament sections (which depends on the ADF/cofilin/actin combination) and severing are highly correlated. During my third study, (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), we established that stochastic dynamics, discovered at the molecular level for single filaments (or bundles of them), is also relevant to describe the macroscopic fragmentation of a comet tail consisting of hundreds of thousands filaments. I have shown that ADF/cofilin activity is at the crossroad between macroscopic and microscopic systems, on one hand, and physics and chemistry, on the other hand. The characteristics of microscopic interactions of ADF/cofilin with a single filament are fundamental to understand the macroscopic dynamics of a fragmenting comet. In addition, we have established how the binding of ADF/cofilin (chemistry) controls the mechanical properties of the filament (physics) before fragmentation. ADF/cofilin is essential in the integration of physical and chemical mechanisms at the microscopic level, to ensure consistent behavior at the cell scale

Durant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle central de l'ADF/cofiline, une protéine qui se lie au cytosquelette d'actine, décore spécifiquement les parties 'âgées' des filaments d'actine, diminue localement par un facteur 5 la rigidité du filament et provoque la fragmentation du filament à l'interface entre les sections nues et décorées. Dans ma première étude (Suarez et al., Current Biology, 2011), j'ai utilisé la microscopie à onde évanescente et une ADF/cofiline fluorescente pour démontrer que l'ADF/cofiline est un marqueur de l'état nucléotidique (ATP, ADP-Pi ou ADP) des sous-unités d'un filament d'actine en cours de polymérisation. De plus, l'ADF/cofiline, en accélérant la dissociation du phosphate inorganique (Pi), limite la taille du cap ATP/ADP-Pi du filament d'actine, sans toutefois le réduire à une taille zéro. Des analyses statistiques sur filaments isolés établissent une corrélation parfaite entre la densité de fixation de l'ADF/cofiline et son efficacité de fragmentation. Paradoxalement, l'efficacité de fragmentation est maximale pour une densité d'ADF/cofiline de 0.5. Ceci est confirmé par des analyses supplémentaires qui montrent que les sites de fragmentation du filament coïncident avec la position des frontières entre zones décorées et zones nues. Les conséquences de ce dernier résultat paradoxal sont l'objet de ma seconde étude (McCullough et al., 2011, Biophysical Journal). En combinant différentes sources d'ADF/cofilines (vertébré et levure) et d'actines (vertébré et levure), nous montrons, sur les quatre couples actine-ADF/cofiline possibles, qu'il existe une très forte corrélation entre (1) l'efficacité de fragmentation (qui dépend de la combinaison entre actine et ADF/cofiline) et (2) la déformation du filament, mesurée à la frontière entre zone décorée et zone nue. Au cours de ma troisième étude (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), nous montrons que le mécanisme de fragmentation ADF/cofiline-dépendant, établi à l'échelle d'un filament isolé, peut s'appliquer aussi à l'échelle d'une comète d'actine qui comporte un réseau complexe de filaments. Mon travail de thèse a montré que le mode d'action de l'ADF/cofiline se situe à l'intersection entre mécanismes microscopiques et macroscopiques, d'une part, et entre chimie et physique, d'autre part. Les caractéristiques microscopiques des interactions de cette protéine avec un filament d'actine isolé sont fondamentales pour expliquer des évènements macroscopiques, comme la fragmentation de filaments ou de structures complexes. D'autre part, nous avons montré comment les propriétés chimiques de l'ADF/cofiline modifient les propriétés physiques locales du filament et conduisent à la fragmentation. L'ADF/cofiline a un rôle central pour l'intégration de mécanismes physico-chimiques, à l'échelle microscopique, afin d'assurer un comportement cohérent à l'échelle de la cellule.

Les oncogènes Bcr-Abl (p190bcr-abl et p210bcr-abl) sont issus d'une translocation chromosomique t(9,22) qui fusionne en phase les gènes bcr et c-abl. p210bcr-abl est généralement responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) alors que p190bcr-abl induit un sous type de Leucémie Aigue Lymphoblastique (LAL). La seule différence structurale entre ces deux protéines est la présence d'un domaine DH/PH au sein de p210bcr-abl activateur spécifique de RhoA. L'expression de Bcr-Abl dans la lignée Ba/F3 est associée au déclenchement d'une migration spontanée, dépourvue de directionnalité, sous la dépendance de la GTPase Rac1.L'activation de RhoA, spécifique des cellules Ba/F3p210, est associée à un phénotype migratoire amœboïde dans une matrice de Matrigel™ en 3D où les cellules Ba/F3p190 dépourvues de RhoA activé, présentent une mobilité de type roulement. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que l'activation spécifique de ROCK1 par RhoA détermine deux voies parallèles et mutuellement indispensables pour le mouvement amœboïde : 1) la voie de la Chaine Légère de Myosine (CLM) 2) celle des protéines de la famille ADF (Actin Depolymerizing Factor), et plus particulièrement l'isoforme ADF/destrine. Nous démontrons également l'existence d'invadopodes spécifiquement dans les cellules Ba/F3p190, dont la formation est sous la dépendance de l'absence d'activation de RhoA corrélée à une augmentation de l'activation de Cdc42. Enfin nous démontrons que la voie de signalisation RhoA/ROCK est spécifiquement activée dans les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de patients atteints de LMC et ce, indépendamment de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl
Bcr-Abl chimeric oncogenes (p190bcr-abl and p210bcr-abl) result from the t(9,22) chromosomal translocation that fuse the bcr and the c-abl genes. p210bcr-abl and p190bcr-abl are associated with Chronic Myelogenous Leukemia (CML) and a subset of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) respectively. The only difference between these two chimeras is the presence of a specific RhoA-GEF domain in the p210bcr-abl oncogene. Bcr-Abl expression in Ba/F3 lymphoblasts induces spontaneous migration of these cells without apparent directionality. Motility triggering of Bcr-Abl-expressing Ba/F3 depends on the RhoGTPase Rac1.RhoA activity is associated with a typical amoeboid movement of Ba/F3p210 cells embedded in Matrigel™ 3D matrix, whereas the Ba/F3p190 cells, devoid of RhoA activity, display a rolling-type motility. In this work we showed that activation of the RhoA effector ROCK1 triggers two parallel pathways which are both necessary for amoeboid movement: 1) the Myosin Light chain (MLC) pathway 2) ADF family proteins (Actin Depolymerizing Factor) pathway, specifically the ADF/destrin isoform. Besides, we showed that Ba/F3p190 cells could assemble invadopodia-like structures. The formation of these structures is driven by the reduction of RhoA activity associated with the absence of the DH/PH domain in p190bcr-abl and correlates with an increase in Cdc42 activity. We finally demonstrated that the RhoA/ROCK pathway is constitutively activated in CD34+ cells isolated from CML patients while not in their normal counterparts. We also demonstrated that this activation is independent of the tyrosine Kinase activity of Bcr-Abl

L'actine est une protéine abondante dans le cytosquelette des eucaryotes qui se polymérise pour former des filaments. Ces filaments jouent un rôle fondamental dans de nombreux processus biologiques (contraction musculaire, division et motilité cellulaire, etc...). La dynamique d'assemblage et de désassemblage des filaments est sous le contrôle de plusieurs protéines associées à l'actine, en particulier l'ADF/cofiline. Cette protéine s'associe aux filaments et les fragmente, accélérant ainsi le désassemblage du cytosquelette d'actine. Au cours de cette thèse, nous avons développé des modèles mathématiques pour étudier l'effet de l'ADF/cofiline sur le cytosquelette d'actine. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la cinétique d'assemblage des filaments en présence d'ADF/Cofiline. Des simulations basées sur l'algorithme de Gillespie ont mis en évidence un équilibre dynamique dans lequel la polymérisation des filaments est contrebalancée par la fragmentation. Nous avons pu caractériser cet équilibre et comparer nos prédictions à des données in vitro obtenues dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Laurent Blanchoin (CEA/iRTSV/LPCV, Grenoble). Dans un second temps, nous nous sommes penchés sur la mécanique des polymères d'actine pour expliquer les bases physiques de la fragmentation. Un modèle mésoscopique du filament a permis de prouver l'existence d'un couplage entre les déformations en flexion et en torsion dans le filament. Ce couplage permet de convertir les fluctuations thermiques en un effort qui cisaille la section du filament, entraînant ainsi la fragmentation. Les résultats extraits de ces modèles ont donc permis d'améliorer notre compréhension de l'action d'ADF/cofiline sur le cytosquelette d'actine.

L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.
Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

Les filaments d'actine sont des polymères biologiques très abondants dans le cytosquelette des eucaryotes. Leur auto-assemblage et leur auto-organisation sont très dynamiques et ils jouent un rôle majeur dans la motilité cellulaire et dans les déformations de la membrane. Nous présentons dans cette thèse trois approches de modélisation, à différentes échelles, afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'assemblage, de l'organisation et de la production de forces par des filaments biologiques tels que les filaments d'actine. Nous avons tout d'abord développé un outil de simulation multi-agent stochastique pour l'étude de la dynamique de filaments biologiques prenant en compte les interactions à l'échelle du nanomètre. Ce nouvel outil nous a permis de mettre en évidence l'accélération du turnover des monomères d'actine par fragmentation des filaments par l'ADF/Cofiline ainsi que les ruptures de symétries induites par cette protéine, résultats concordant avec les expériences de l'équipe de L. Blanchoin (CEA Grenoble). Nous avons également mené l'étude d'un modèle continu pour le flambage de filaments qui a permis d'estimer les forces exercées in vivo et in vitro en fonction des conditions d'attachement des extrémités et de donner des conditions limites de certains paramètres permettant le flambage. Troisièmement, nous avons développé un cadre pour l'organisation des données de cinétique biochimique de réseaux de régulation que nous avons utilisé pour la régulation de la polymérisation de l'actine. Ces trois approches de modélisation ont permis d'améliorer la connaissance sur la dynamique de l'actine et sont complémentaires aux approches expérimentales de la biologie.