Dissertations / Theses on the topic 'ADN G-quadruplexe'

Les acides nucléiques riches en guanines ou en cytosines peuvent se replier sur eux-mêmes et former des systèmes tétramériques tels que les G-quadruplexes (G4) ou les i-motifs. Ces motifs, abondamment représentés dans certaines régions du génome humain semblent contribuer à la régulation cellulaire et suscitent depuis plusieurs années un intérêt grandissant. Ils sont notamment présents dans la région télomérique, mais aussi dans les promoteurs d’oncogènes ou au sein des génomes viraux et sont impliqués dans certaines pathologies humaines. Ils représentent ainsi des cibles thérapeutiques et diagnostiques potentielles. Cependant, les G4 adoptent in-vitro des topologies variées qui compliquent le développement de ligands spécifiques et affins. Dans ce contexte, le laboratoire a développé le concept du TASQ pour ‘‘Template Assembled Synthetic G-Quadruplex’’ dans le but d'accéder à des G4 se structurant en une topologie définie.Le premier chapitre décrit l’assemblage de mimes de motifs G4 contraints en une topologie unique. En utilisant un gabarit cyclodécapeptide rigide et différentes méthodes de conjugaison, nous avons assemblé des motifs G4 ARN parallèle et hybride ADN/ARN dérivant de la séquence télomérique ainsi qu’un motif G4 d’ADN présent dans la séquence promotrice du VIH-1. L’utilisation du concept TASQ nous a également permis de préparer un motif G-triplexe (G3), intermédiaire à la formation des motifs G4. Nous avons montré une forte stabilisation de tous les édifices G4 contraints ainsi préparés.Le second chapitre concerne les études de caractérisation et de sélection de ligands vis-à-vis des motifs G4 et G3 contraints. La caractérisation repose sur l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de différentes familles de ligands pour ces édifices, par résonance plasmonique de surface ou par interférométrie bio-couche. La sélection de ligands a été réalisée par la méthode SELEX dans le but d’obtenir des aptamères affins et spécifiques d’un motif G4 contraint<br>Guanines or cytosines rich nucleic acids can fold into tetrameric G-quadruplexes (G4) or i-motifs structures. G4 motifs are found within the human genome and should contribute to cellular regulation. In particular G4 are found at telomeric region and also in promoters of oncogenes or within viral genomes. They are suspected of participating in the regulation of human pathologies and have therefore been envisioned as potential therapeutic and diagnostic targets. However, the intrinsic conformational polymorphism of G4 motifs complicates the development of specific and affine ligands. In this context, the laboratory has developed the TASQ concept for "Template Assembled Synthetic G-Quadruplex" with the aim to obtain a defined G4 topology.The first chapter reports on the assembly on the peptide template of RNA and DNA:RNA hybrid G4 structures that derive from the human telomeric sequence as well as of DNA G4 structure found within the HIV virus promoter. G-triplex (G3) motif which is supposed to be an intermediate during the formation of the G4 motifs has also been prepared. By using appropriate ligations of the oligonucleotide strands on the peptide template we were able to control the folding of G-quadruplex motifs and stabilize them.The second chapter reports the studies for the characterization and the selection of ligands against G4 and G3 motifs. The evaluation of the affinity and selectivity of different families of ligands for these constrain motifs was performed by using surface plasmon resonance or by bio-layer interferometry. The selection of ligands was carried out by the SELEX method in order to obtain affine and specific aptamers of a constrained G4 motif

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à la synthèse et l'utilisation d'outils chimiques pour l'étude des interactions intermoléculaires dans le domaine des nanostructures et dans celui de la biologie.<br />Dans ce but, nous avons développé une famille de molécules, les triazatrinaphthylènes (TrisK), se caractérisant par un large coeur aromatique ainsi que par la diversité des chaînes latérales qui peuvent y être introduites, leur nature gouvernant le type d'application désirée.<br />L'introduction de chaînes lipophiles confère aux TrisKs des propriétés d'auto-assemblage sur des surfaces. Les monocouches auto-assemblées obtenues sont étudiées par microscopie à effet tunnel (STM). Ces études constituent un premier pas dans la caractérisation des TrisKs en tant qu'éventuels composants actifs dans le domaine des matériaux organiques.<br />La substitution des TrisKs par des chaînes aminées leur apporte de l'hydro-solubilité, les rendant particulièrement adaptés pour le ciblage d'une structure particulière d'ADN,<br />l'ADN G-quadruplexe. Cette structure est actuellement étudiée de manière intensive pour son rôle central dans ce qui pourrait constituer une nouvelle stratégie anti-cancéreuse. Nous avons également développé l'utilisation de complexes de platine pour interagir sélectivement avec ces structures.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques protégeant l’extrémité des chromosomes de la dégradation et assurant la réplication de l’ADN terminal. En effet, de nombreuses protéines de réplication sont impliquées dans le maintien de ces structures, comme le complexe RPA (Replication Protein A). Ce complexe très conservé chez les eucaryotes se fixe à l’ADN simple brin et est impliqué dans la réplication, les mécanismes de recombinaison et la réparation de l’ADN. Chez S.pombe, la mutation ponctuelle de la sous-unité RPA1 (Rpa1-D223Y) provoque le raccourcissement des télomères. Dans cette étude, nous montrons que cette mutation provoque l’accumulation de structures aberrantes de haut poids moléculaire aux télomères corrélant avec une présence persistante de Polα aux télomères suggérant une accumulation de structures sur le brin riche en G. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression d’hélicases de la famille Pif1 incluant S.cerevisiae Pif1 et PIF1 humain ainsi que Pfh1 (S.pombe) sont capable de restaurer une longueur de télomères sauvage dans mutant rpa1-D223Y. Ces résultats suggèrent que RPA pourrait empêcher l’accumulation de G4 au niveau du brin retardé télomérique afin de faciliter l’élongation des télomères par la télomérase. De plus, des expériences in vitro ont montré que la mutation correspondante de RPA1 humain réduisait spécifiquement l’affinité de RPA pour le simple brin télomérique humain dans les conditions ou il forme des G4.Enfin l’étude de la stabilité de séquences répétées formant des G4 (minisatellite CEB25), chez S.pombe, a permis de renforcer l’hypothèse selon laquelle RPA pourrait empêcher la formation ou aiderait à la résolution de G4<br>Telomeres are nucleoprotein structures that protect chromosome ends from degradation and ensure replication of the terminal DNA. In fact, many of replication proteins are involved in telomere maintenance, like RPA (Replication Protein A). RPA is a highly conserved heterotrimeric single-stranded DNA-binding protein involved in DNA replication, recombination and repair. In S. pombe a mutation in the largest RPA subunit (Rpa1-D223Y) leads to substantial telomere shortening. In this study, we found that the D223Y mutation leads to the accumulation of aberrant secondary structures at telomeres. The presence of these secondary DNA structures correlates with a high association of Polα with telomeres suggesting that this mutation impairs lagging strand (G-rich) telomere replication. Strikingly, heterologous expression of the budding yeast Pif1 known to efficiently unwind G-quadruplex, human PIF1 and Phf1 (homolog of Pif1 in S.pombe) rescue the telomeric length defects of the D223Y cells. Furthermore, in vitro data show that the identical D to Y mutation in human RPA specifically affects its ability to bind G-quadruplex. We propose that RPA prevents the formation of G-quadruplex structures at lagging strand telomeres to facilitate telomerase action at telomeres. Furthermore, the study, in S.pombe, of the stability of G-rich repeat sequences (minisatellite CEB25) as known to form G4 enforce the hypothesis that RPA can prevents the formation of G4 or helps to solve this structure

Les G-quadruplexes (G4) sont des structures non canoniques des acides nucléiques qui peuvent être formés dans des régions d’ADN ou d’ARN riches en guanines. Les ligands G4 (LG4), sont des molécules capables d’interagir et de stabiliser les structures G4, qui présentent de nombreuses propriétés anti-cancéreuses. Nous avons travaillé avec le LG4 20A, appartenant à la famille des triarylpyridines, qui stabilise efficacement les structures G4 in vitro. Les objectifs de ce travail ont été de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables des effets anti-prolifératifs du 20A dans des cellules cancéreuses. Dans cette étude, nous avons montré que le 20A induit un arrêt de la croissance cellulaire de cellules en culture et dans un modèle de xénogreffe tumorale, grâce à l’induction de la sénescence et de la mort cellulaire par apoptose. Ces réponses sont associées à l’activation de la voie des réponses aux dommages à l’ADN (DDR) via la kinase ATM, qui favorise l’autophagie (un processus catabolique) et la sénescence, tout en protégeant les cellules de l’apoptose. De plus, nous avons observé que le 20A induit un échec de la cytokinèse, conduisant à l’accumulation de cellules binucléées qui présentent une résistance à la mort cellulaire. De façon inattendue, nous avons trouvé que le 20A s’accumule dans les lysosomes, induisant une augmentation de la taille de ces derniers. La combinaison du 20A et de l’agent lysomotropique chloroquine, potentialise de façon importante la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP) et la mort cellulaire. En particulier, cette combinaison sensibilise de façon notable ces cellules binucléées à la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultats révèle une relation entre les processus de mort cellulaire et de sénescence induits par le LG4 20A, et les voies de DDR et lysosomales. Ces régulations devraient être prises en considération lors de l’utilisation d’agents antiprolifératifs susceptibles d’interférer avec les fonctions lysosomales<br>G-quadruplexes (G4) are unusual nucleic acid structures that can be formed by guanine-rich DNA and RNA. Through their ability to stabilize G4 structures, G4 ligands (G4L) have been described to display potent anticancer properties. Here, we studied the G4L 20A belonging to the triarylpyridine family of compounds that have the ability to efficiently bind to and stabilize G4 structures in vitro. The objectives of this work were to determine the molecular and cellular mechanisms responsible for the anti-proliferative effects of 20A in cancer cells. In this study, we showed that 20A causes cancer cell growth arrest in cell culture and a mice tumour xenograft model, through induction of senescence and apoptotic cell death. These cellular responses are associated with the induction of the DNA damage response pathway (DDR), in particular ATM activation, which promotes the induction of both autophagy (a lysosomal catabolic pathway) and senescence, while protecting cells against apoptosis. Furthermore, we found that 20A induces failure of cytokinesis which results in the accumulation of binucleated cells that display marked resistance to 20A-induced cell death. Unexpectedly, we found that 20A accumulates in the lysosomal compartment and causes lysosome enlargement. The combination of a lysosomotropic agent, chloroquine, and 20A promotes a significant induction of lysosomal membrane permeabilization (LMP) and a robust cell death. In particular, this combination significantly sensitizes binucleated cells to cell death. Altogether, our results uncover the relationship of the DDR and lysosomal pathways to cell death and senescence induced by the G4L 20A. Such regulation should also be taken into account when using antiproliferative drugs susceptible to interfere with the lysosomal functions

Des structures secondaires d’acides nucléiques atypiques, les structures G-quadruplex, peuvent se former autour d’un cation (K+ ou Na+) dans les régions riches en guanines, grâce à une association de type Hoogsteen. La formation de ces structures est impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques, comme la réplication, la transcription ou l’épissage. Elles peuvent affecter l’architecture de l’ADN jusqu’au niveau de la chromatine et provoquer une instabilité importante, tant génétique qu’épigénétique. De nombreuses méthodes ont été développées afin de détecter ces structures in vivo et de comprendre leurs implications au niveau cellulaire. Cependant, le panel d’outils moléculaires disponible actuellement ne permet pas une exploration du génome complète et sélective. Nous avons souhaité développer des outils, capables de sonder efficacement un milieu biologique complexe à la recherche de structures G-quadruplex et d’évaluer le potentiel d’une stratégie thérapeutique anti-tumorale ciblant ces structures. Nous avons mis au point un panel de composés combinant des ligands d’ADN G-quadruplex (PDC, PhenDC3 et Métal-ttpy) avec une biotine et un groupement photoactivable, permettant la capture et l’extraction de structures G-quadruplex de milieux biologiques complexes. Les ligands ont été évalués grâce aux techniques de FID et de FRET-melting, et sélectionnés pour leur affinité mais aussi pour leur affinité pour l’ADN G-quadruplex, assurant un ciblage efficace. Il a également été possible de piéger directement une séquence G-quadruplex en utilisant un complexe de platine, formant un adduit métallique avec les bases de l’ADN. Grâce ce type de ligand d’ADN G-quadruplex, la liaison de coordination métallique joue le rôle de marqueur covalent. Nous avons déterminé sur gel d’électrophorèse la localisation des adduits formés par des complexes dérivés du tolylterpyridine-platine (Pt-ttpy) et étudié la cinétique de platination de l’ADN G-quadruplex. La fonctionnalisation du complexe Pt-ttpy par des groupements photoactivables a permis de réaliser un double-ancrage covalent dans une structure d’ADN G-quadruplex. Par ailleurs, la fonctionnalisation avec un fluorophore a conduit aux premières évaluations en milieu cellulaire.Enfin, notre panel de composés a été testé dans des conditions de capture supportée d’ADN G-quadruplex. Une mise au point de la technique de capture a été réalisée en utilisant des billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Les expériences de capture sur billes ont montré que l’efficacité de nos outils varie en fonction de la topologie de la structure G-quadruplex ciblée et du ligand utilisé. Par ailleurs, le groupement photoactivable introduit sur certains de ces outils n’a pas permis d’améliorer la capture d’ADN G-quadruplex. Cependant, il a été possible d’utiliser ces outils en présence d’ADN génomique pour capturer efficacement de fragments d’ADN télomérique, par effet G-quadruplex<br>Nucleic acids secondary structures may form in guanine-rich regions by Hoogsteen base-pairing around a cation (K+ or Na+) and stacking of guanine quartets. Those nucleic acid secondary structures called G-quadruplex are believed to play regulatory roles in the main functions related to DNA processing. However, although numerous sequences, potentially forming G4-structures are present in genomes, evidence concerning their in vivo formation and biological role remains limited. Primary aim of our research is to provide new chemical biology tools for evaluating the biological impacts of quadruplexes and the potential of our compounds for quadruplex-targeted anticancer therapy. We have synthetized a set of compounds equipped with biotin and cross linking moieties in order to trap and pull-down G4-structures in various cellular contexts. The G4-ligands (PDC, PhenDC3 and Metal-ttpy) were evaluated thanks to FID and FRET-melting assays, and carefully chosen to efficiently target G-quadruplexes but also to display enough selectivity for cellular assays. Direct trapping of a G-quadruplex structures can also be done by metal complexes, thanks to coordination with DNA bases. Platinum tolylterpyridine derivatives have been studied on gel electrophoresis to map the platination sites and to evaluate the kinetics of the phenomenon. By adding photo crosslinking moieties to Pt-ttpy, efficient double-anchoring has been done on DNA G-quadruplex structure. Moreover, first cellular imaging evaluations were done by adding a fluorophore to this platinum tolylterpyridine complex. To eventually probe quadruplex DNA at the genome-wide scale, full control of the trapping protocol is indeed a key step. Full development of the pull-down step has been done, using streptavidin-coated magnetic beads. On-beads experiments indicate that efficacy of trapping can vary dramatically depending on quadruplex and G4-ligand topologies. Moreover, photo crosslinking moiety, introduced on some compounds, has not shown any improvement of the trapping. However, the development of this method and the design of the capture compounds have led to an optimal isolation of telomeric G-quadruplex forming sequences, from genomic DNA

La maturation en 3' des pré-ARNm constitue une étape de régulation posttranscriptionnelle indispensable à l'expression d'un gène. Elle est composée de deux réactions : le clivage de l'extrémité 3' qui permet de libérer l'ARNm du site de transcription et l'ajout de la queue poly(A) qui contrôle à la fois l'export nucléaire, la stabilité et la traduction du transcrit mature. Plusieurs études montrent, d'une part, que la maturation en 3' est inhibée de manière globale lors de dommages à l'ADN et d'autre part, que des dérégulations de cette maturation peuvent contribuer au développement tumoral. Nos travaux se sont axés sur l'étude de la régulation de la maturation en 3' (i) du pré-ARNm de p53 lors de dommages à l'ADN (ii) du pré-ARNm de MSH6 impliqué dans le syndrome de Lynch. (i) Nos travaux ont mis en évidence que le pré-ARNm de p53 résiste à l'inhibition de la maturation en 3' due aux dommages à l'ADN, grâce au recrutement des protéines hnRNP H/F sur une structure appelée G-quadruplexe située en aval du site de clivage. (ii) Nous avons ensuite identifié une duplication des 20 nucléotides précédant le signal de polyadénylation du pré-ARNm de MSH6 dans deux familles distinctes atteintes du syndrome de Lynch. Cette duplication entraîne une diminution de l'efficacité de la maturation en 3' du pré-ARNm de MSH6 qui semble être à l'origine de la pathologie<br>Pre-mRNA3'-end processing is an essential post-transcriptional step. It is composed of two reactions: cleavage at the pre-mRNA 3' end that allows release of mRNA from the transcription site and addition of the poly(A) tail that controls nuclear export, stability and the translation of the mature transcript. Several studies show that 3'end processing is globally inhibited during DNA damage and that deregulation of this process may contribute to tumor development. Our work focused on 3'-end processing regulation of (i) p53 pre-mRNA during DNA damage (ii) MSH6 pre-mRNA involved in Lynch syndrome. (i) We have shown that p53 pre-mRNA resists to DNA damagedependent inhibition of 3'-end processing through the recruitment of the protein factor hnRNP H/F on a RNA structure called G-quadruplex located downstream of the cleavage site. (ii) We then identified a duplication of 20 nucleotides upstream of the polyadenylation signal at the MSH6 pre-mRNA in two distinct families with Lynch syndrome. This duplication causes a reduction of MSH6 pre-mRNA 3'-end processing efficiency and in consequence, it may be causal of Lynch syndrome

Des complexes salen et dipyrrophénolate de fer comportant des unités phénolatesenrichies en électron (substituants tert-butyl ou methoxy) ont été préparés. Leur chimieoxydative conduit à des espèces radicalaires dont une a été caractérisée par diffraction desRX. Les complexes dipyrrophénolate de manganèse et cuivre ont été également étésynthétisés et oxydés, engendrant des espèces radicalaires. Le premier s’est avéré efficace entermes d’oxygénation d’oléfines, le second pour l’oxydation d’alcools.La fonctionnalisation des phénols par des chaînes alkylimidazolium rend les complexeshydrosolubles. Les salophen de nickel ainsi préparés interagissent fortement avec l’ADN Gquadruplexe(KD &lt; 1-2 mM) en s’empilant sur le dernier quartet de guanine. Ils stabilisent lesG-quadruplexes contre la dénaturation thermique et bloquent l’activité de la télomérase avecdes IC50 &lt; 3 mM<br>We prepared salen and dipyrrophenolate iron complexes involving electron rich (tertbutyland methoxy substituents) phenolate moieties. Their oxidative chemistry leads to radicalspecies, one of them being characterized by X-Ray diffraction. The manganese and copperdipyrrophenolate complexes were also synthesized and oxidized, affording radical species.The first ones are efficient catalysts for the oxygenation of olefins, while the second ones areactive towards alcohol oxidation.Functionnalization of the phenols by alkylimidazolium chains makes the compoundshydrosoluble. The so-prepared nickel salophen complexes interact strongly with GquadruplexDNA (KD &lt; 1-2 mM), mainly through p-stacking interactions over the lastguanine quartet. They stabilize the G-quadruplex structures against thermal denaturation andinhibit telomerase activity with IC50 &lt; 3 mM

Formés à partir de brins d’ADN ou d’ARN riches en guanines, les quadruplexes résultent de l’empilement de tétrades de guanines constituées chacune par l’auto-assemblage dans un même plan de quatre guanines, stabilisées entre elles par un réseau de liaisons hydrogènes. En s’inspirant de cet édifice naturel, il est présenté au long de ce manuscrit de thèse la synthèse et l’étude de molécules de type TASQ (pour template-assembled synthetic G-quartet) hydrosolubles capables de former de manière intramoléculaire une tétrade de guanines synthétique : les DOTASQ, le PorphySQ et le PNADOTASQ. La première application développée pour ces composés est le ciblage des quadruplexes d’ADN et d’ARN, présents dans des régions clefs du génome (télomères, promoteurs d’oncogènes) et du transcriptome (5’-UTR et TERRA), et dont la stabilisation par un ligand pourrait ouvrir de nouvelles perspectives en terme de thérapie antitumorale ciblée. Les résultats in vitro sont présentés et permettent de démontrer que les TASQ hydrosolubles développés sont des composés offrant une bonne sélectivité pour les quadruplexes mais surtout une excellente sélectivité grâce à un mode d’action bioinspiré basé sur une reconnaissance biomimétique. La seconde application mise au point est l’utilisation des TASQ comme catalyseurs pour des réactions de peroxydation : leur architecture même leur permet de mimer l’activité catalytique de l’ADN (ou DNAzyme) ainsi que celle de protéines (enzyme) comme la horseradish peroxidase. Ce processus est dépendant de la formation intramoléculaire de la tétrade de guanines synthétique et ouvre de nombreuses perspectives en terme d’utilisation en biologie ainsi qu’en nanotechnologie<br>Natural G-quartets, a cyclic and coplanar array of four guanine residues held together via Hoogsteen H-bond network, have recently received much attention due to their involvement in G-quadruplex-DNA, an alternative higher-order DNA structure strongly suspected to play important roles in key cellular events (chromosomal stability, regulation of gene expression). Besides this, synthetic G-quartets, which artificially mimic native G-quartets, have also been widely studied for their involvement in nanotechnological applications (i.e. nanowires, artificial ion channels, etc.). In contrast, intramolecular synthetic G-quartets, also named template-assembled synthetic G-quartet (TASQ), have been more sparingly investigated, despite a technological potential just as interesting.In this way, we designed and synthesized three series of innovative hydrosoluble TASQ: DOTASQ (for DOTA-Templated Synthetic G-Quartet), PorphySQ (containing a porphyrin template) and the most effective PNADOTASQ where PNA-guanine arms replace native DOTASQ alkyl-guanine arms. We report herein the results of both DNA and RNA interactions (notably their selective recognition of quadruplex-DNA according to a bioinspired process) and peroxidase-like hemin-mediated catalytic activities (either in an autonomous fashion as precatalysts for TASQzyme reactions, or in conjunction with quadruplex-DNA as enhancing agents for DNAzyme processes). These results provide a solid scientific basis for TASQ to be used as multitasking tools for bionanotechnological applications

Le paludisme continue d'être l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays en développement. Le développement de la résistance aux médicaments antipaludiques disponibles et la rareté des vaccins efficaces ont rendu nécessaire la recherche urgente de nouvelles cibles antipaludiques. La forme grave du paludisme est causée par Plasmodium falciparum, qui présente un cycle de vie complexe impliquant diverses formes morphologiquement et fonctionnellement distinctes chez deux hôtes différents - l'humain et le moustique anophèle. Afin de se développer dans l'environnement de deux hôtes distincts, ces parasites utilisent différents mécanismes pour réguler leur expression génétique étroitement coordonnée. Ce projet de thèse se concentre sur l'exploration de cette régulation, qui est médiée par des structures secondaires d'ADN riches en guanine, principalement des G-quadruplexes. Ces structures se trouvent dans une large gamme d'organismes et sont impliquées dans la régulation des gènes tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la maintenance télomérique. Récemment, on a découvert qu'elles sont également impliquées dans le processus de virulence pour échapper à la réponse immunitaire de l'hôte dans de nombreux pathogènes tels que les bactéries, les protozoaires et les virus. Chez Plasmodium, les motifs formant le quadruplex-G sont enrichis dans les régions télomériques et sous-télomériques, où les gènes de virulence sont présents. L'existence de G4 dans le génome de ces parasites riches en AT indique leur rôle dans le mécanisme de régulation des gènes et de variation antigénique. Cependant, il y a un manque de preuves expérimentales pour appuyer cette hypothèse. Le but de ce projet est de fournir la première étude complète de l'interactome G4 afin de comprendre le rôle des mécanismes de régulation médiés par le G4 dans la biologie du Plasmodium. En utilisant une combinaison d'approches non biaisées (levure hybride et test d'ADN pull-down), nous avons identifié ~152 protéines interagissant potentiellement avec les motifs G4 Plasmodium falciparum. Il a été démontré que les orthologues de certaines de ces protéines interagissent avec les G4, ce qui renforce nos résultats. De plus, pour comprendre comment ces candidats contribuent aux processus de régulation médiés par les G4, nous avons sélectionné et caractérisé deux protéines (GBP2 et DNAJ) pour effectuer des études fonctionnelles après validation de leurs propriétés de liaison. Il est démontré que ces protéines jouent un rôle important dans la biologie du Plasmodium. Dans cette étude, nous avons découvert que la GBP2 est une protéine dispensable qui interagit avec la G4 sélectionnée. Même si la délétion du gène n'est pas mortelle pour les parasites, elle affecte toujours l'expression des gènes var. Alors que l'ADNJ putatif est une protéine essentielle et que sa délétion entraîne l'arrêt des parasites aux derniers stades du cycle érythrocytaire. Collectivement, cette étude fait la lumière sur ce mécanisme de régulation basé sur la structure de l'ADN, encore peu étudié, et fournit la première étude systématique de l'interactome G4. Etant donné leur rôle essentiel dans le développement des parasites, une caractérisation plus poussée des candidats obtenus permettra probablement de générer de nouvelles cibles pour les antipaludiques qui contribueront à long terme à l'éradication de la maladie<br>Malaria continues to be one of the major causes of morbidity and mortality in the developing countries. The development of the resistance against the available antimalarial drugs and scarcity of effective vaccines have demanded the urgent need of finding new antimalarial targets. The severe form of malaria is caused by Plasmodium falciparum, which manifests a complex life cycle involving various morphologically and functionally distinct forms within two different hosts - human and Anopheles mosquitoes. In order to thrive in two distinctive host’s environment, these parasites employ different mechanisms to regulate their tightly coordinated gene expression. This thesis project is focused on exploring the regulation, which is mediated by guanine-rich DNA secondary structures, predominantly G-quadruplexes. These structures are found in wide range of organisms and are involved in gene regulation such as transcription, DNA replication and telomeric maintenance. Recently, they are also found to be involved in the process of virulence to evade the host’s immune response in numerous pathogens such as bacteria, protozoa and viruses. In Plasmodium, the G-quadruplex forming motifs are found to be enriched in the telomeric and sub-telomeric regions, where the virulence genes are present. The G4 existence in these AT biased genome points towards their role in the mechanism of gene regulation and antigenic variation. However, there is a lack of experimental evidence to support this hypothesis. The aim of this project is to provide the first comprehensive survey of the G4-interactome in order to understand the role of G4-mediated regulatory mechanisms in Plasmodium biology. Using a combination of unbiased approaches (Yeast one-hybrid and DNA pull-down assay), we have identified ~152 putative G4 interacting proteins in Plasmodium falciparum. The orthologs of some of these proteins were shown to interact with G4s, thus strengthening our results. Furthermore, to understand how these candidates contribute to G4 mediated regulatory processes, we have selected and characterized two proteins (GBP2 and DNAJ) to perform functional studies following validation of their binding properties. These proteins are shown to play an important role in Plasmodium biology. In this study, we have found that the GBP2 is a dispensable protein that interacts with the selected G4. Even though the deletion of the gene is not lethal to the parasites, it still affects the expression of var genes. Whereas putative DNAJ is an essential protein and its deletion results into the arrest of the parasites at the late stages of erythrocytic cycle. Collectively, this study sheds light on this understudied DNA structure based regulatory mechanism and provide the first systematic survey of the G4 interactome. Given their essential role in parasite development further characterization of obtained candidates will likely generate new targets for antimalarial drugs that will in the long term contribute to the eradication of the disease

Des séquences compatibles avec la formation de G4 sont présentes au niveau de certaines régions clés du génome telles que les extrémités des chromosomes, mais également les régions de commutation de classe des immunoglobulines, les promoteurs de certains gènes dont des oncogènes et des séquences transcrites. Plus de 370 000 cibles potentielles ont été prédites lors des analyses bioinformatiques du génome humain. Cependant, ces prédictions ne sont pas exhaustives étant limitées par la formulation des algorithmes de prédiction utilisés. En effet, les séquences recherchées suivent la formule consensus suivante G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+. Ainsi, en apportant plus de souplesse dans la description du quadruplex nous pourrons identifier et localiser plus de cibles potentielles. C’est pourquoi, nous proposons un nouvel algorithme G4-Hunter qui permettra l’identification la plus exhaustive possible de séquences cibles en prenant en compte la totalité de la région et non plus uniquement la cible potentielle. Par ailleurs, une étude expérimentale à grande échelle (sur une centaine de séquences cibles) a été menée afin de valider et tester la robustesse de G4-Hunter. A l’aide de ce nouvel outil, nous avons pu identifier de nouvelles séquences cibles non identifiées par les approches déjà existantes au sein des génomes humain, HIV et Dictyostelium discoideum<br>Biologically relevant G4 DNA structures are formed throughout the genome including immunoglobulin switch regions, promoter sequences and telomeric repeats. They can arise when single-stranded G-rich DNA or RNA sequences are exposed during replication, transcription or recombination. Computational analysis using predictive algorithms suggests that the human genome contains approximately 370 000 potential G4-forming sequences. These predictions are generally limited to the standard G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+ description. However, many stable G4s defy this description and escape this consensus; this is the reason why broadening this description should allow the prediction of more G4 loci. We propose an objective score function, G4- hunter, which predicts G4 folding propensity from a linear nucleic acid sequence. The new method focus on guanines clusters and GC asymmetry, taking into account the whole genomic region rather than individual quadruplexes sequences. In parallel with this computational technique, a large scale in vitro experimental work has also been developed to validate the performance of our algorithm in silico on one hundred of different sequences. G4- hunter exhibits unprecedented accuracy and sensitivity and leads us to reevaluate significantly the number of G4-prone sequences in the human genome. G4-hunter also allowed us to predict potential G4 sequences in HIV and Dictyostelium discoideum, which could not be identified by previous computational methods

L’acide désoxyribonucléique se structure chez les êtres vivants de différentes façons. La plus connue est sa forme double hélice mais de nombreuses autres structures secondaires existent et notamment les G-quadruplex. Il s’agit d’une structure basée sur le repliement d’un brin d’ADN possédant des répétitions de guanines. L’association de quatre guanines entre elles par liaisons hydrogène forme un plan appelé G-quartet. Ce réseau de liaisons hydrogène est appelé appariement de Hoogsteen. L’empilement d’au moins deux quartets autour d’un cation monovalent comme le potassium ou le sodium constitue la structure G-quadruplex. Ces structures ont été très étudiées lors des vingt dernières années et il a été montré qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques tels que la réplication, la transcription, la traduction et également le maintien des télomères. La présence des G-quadruplex peut provoquer une instabilité importante aussi bien génétique qu’épigénétique. C’est pourquoi de nombreuses méthodes ont été développées afin de localiser et comprendre le rôle de ces structures in vivo. Pour cela, un large panel d’outils moléculaires a été utilisé cependant il est encore difficile, à partir de ce panel, d’apporter une réponse à toutes les questions sur l’implication des G-quadruplex au niveau du génome. Lors de ce travail de thèse, nous avons alors développés de nouvelles molécules capables de cibler sélectivement les G-quadruplex au sein d’un milieu biologique complexe à partir de deux ligands PDC et PhenDC3 affins et sélectifs pour les structures G-quadruplex.Sur la base de molécules de référence que sont PhenDC3 et PDC, de nombreux ligands ont été mis au point. D’une part, des ligands fonctionnalisés avec une biotine et/ou un groupement photoactivable ont été synthétisés afin de capturer et d’extraire des structures G-quadruplex dans un milieu biologique. D’autre part, des dérivés capables d’être fonctionnalisés in cellulo par l’utilisation de chimie bioorthogonale ont également été obtenus. Ceci permet d’ajouter une fonction (fluorescente ou biotine…) après que le dérivé ait interagi avec sa cible cellulaire. L’ensemble des composés a été évalué par des techniques biophysiques, l’expérience de FRET-melting et l’expérience de FID, afin de mesurer leur affinité pour différentes structures G-quadruplex et leur sélectivité. Nous avons proposé une relation entre les deux expériences afin d’avoir un classement de ligands le plus approprié pour les G-quadruplex.Un des objectifs majeurs de ce travail était de localiser les ligands de G-quadruplex au sein de cellules cancéreuses humaines. Dans un premier temps, toute une étude au sein de cellules fixées a été réalisée en utilisant deux réactions de chimie « click », la réaction de cycloaddition d’un azoture et d’un alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) et la réaction de cycloaddition d’une cyclooctyne et d’un azoture (SPAAC). L’étude s’est, dans un second temps, poursuivie au sein de cellules vivantes en utilisant uniquement la réaction SPAAC à cause de la toxicité in cellulo du cuivre.Ces composés ont également été testés pour l’extraction de G-quadruplex à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’une fonction cyclooctyne. Cependant, les résultats observés, lors de cette étude préliminaire, n’ont pas été concluants et demandent une mise au point pour optimiser le système<br>Deoxyribonucleic acid has different structures in human beings. The most known is the double helix but a lot of secondary structures exist and particularly G-quadruplex. It consists of guanine-rich nucleic acid sequences. The association of four guanines through hydrogen bonds forms a plan called G-quartet. This set of hydrogen bonds is called Hoogsteen base pairs. The stacking of at least two quartets around a monovalent cation like potassium or sodium establishes the G-quadruplex. These structures have been much studied over the past twenty years. They are involved in numerous biological mechanisms like replication, transcription, translation and also telomere maintenance. G-quadruplex presence can cause an important genetic as well as epigenetic instability. That is why many methods have been developed in order to localize these structures and to understand their role in vivo. To this end, a broad panel of molecular tools has been used. However, it is still difficult to bring an answer to all the questions about the involvement of G-quadruplex at the genomic level with this panel. In this thesis work, we developed new molecular tools able to target selectively G-quadruplex in a complex biological medium from two benchmark ligands, PhenDC3 and PDC, which have very good affinity and selectivity for G-quadruplex.On the one hand, functionalized ligands have been synthetized with a biotin and/or a photoactivatable group in order to trap and pull-down G-quadruplex in various cellular contexts. On the other hand, derivative compounds which are able to be functionalized in cellulo by bioorthogonal reactions have been obtained. Once the compound interacts with its cellular target, a function (fluorophore or biotin) can be added through an orthogonal reaction. The new panel of compounds has been evaluated by biophysical techniques, FRET-melting experiment and FID assay, in order to determine their affinity to G-quadruplex and their selectivity. We proposed a relation between the two biophysical experiments in order to have a good ranking of ligands for G-quadruplex structures.One of the most important objectives of this work was to localize G-quadruplex ligands in human cancer cells. First, a complete study in fixed cells has been performed using two reactions of click chemistry: reaction of copper-catalyzed-alkyne-azide-cycloaddition (CuAAC) and reaction of strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC). Secondly, the study has been pursued in living cells using SPAAC reaction because of the toxicity of copper in cells.These compounds have also been used to extract G-quadruplex from biological systems with cyclooctyne-coated magnetic beads. However, results obtained in this preliminary study are not decisive so it could be interesting to optimize the system before concluding

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques situés à lʼextrémité des chromosomes. Le rôle des télomères dans la protection du génome, et leur implication dans la sénescence et le cancer en font une cible privilégiée dans la lutte contre le cancer. Une stratégie originale consiste à bloquer lʼaccès de lʼextrémité télomérique aux protéines nécessaires à sa réplication et à sa stabilité comme par exemple la télomérase qui est activée dans 85% des cancers ou les protéines POT1 et TRF2 qui protègent lʼextrémité télomérique. A cause de la répétition en guanines du brin G, lʼextrémité des télomères peut former des structures en quadruplexes de guanines (G- quadruplexes) dont la stabilisation par des ligands spécifiques (Ligands G4) bloque la réplication des télomères et altère son intégrité. Le traitement de cellules tumorales par des ligands G4 provoque une dysfonction télomérique associée à une dissociation des protéines POT1 et TRF2 et conduit à une apoptose ou une sénescence des cellules. Lʼanalyse de la séquence terminale de lʼextrémité télomérique par la méthode STELA (Single Telomere Length Analysis) montre que la séquence terminale du brin C se termine majoritairement par la séquence ATC-5ʼ. La protéine POT1 est responsable de la résection du brin C des télomères en recrutant une exo- nucléase capable de créer le substrat simple-brin pour la télomérase. La déplétion de POT1 par ARN interférence provoque une dérégulation de la terminaison du brin C. Nous avons étudié au cours de notre travail lʼeffet de ligands G4 sur la séquence terminale du brin C télomérique au niveau des télomères du chromosome XpYp et au niveau de lʼensemble des télomères en utilisant une modification de la technique de STELA. Nos résultats montrent quʼune faible concentration des dérivés de la série des pyridines dicarboxamides provoque un effet mineur mais significatif au niveau de la séquence terminale des télomères XpYp et au niveau de lʼensemble des télo- mères dans la lignée HT1080. Au contraire, une concentration plus importante ne modifie pas la séquence terminale du brin C dans les cellules HT1080, A549 et HeLa, mais induit un stress réplicatif. Lʼeffet modeste de ces ligands sʼexplique par une activité de dissociation incomplete de la protéine POT1 des télomères comparativement à sa déplétion par ARN interférence. En effet, nous avons également montré que la déplétion quasi complète de POT1 par shARN induit une randomisation de la séquence terminale du brin C<br>The role of telomeres in protecting the genome, and their involvement in senescence and cancer make them a prime target in the fight against cancer. An original strategy is to block the access of proteins to the telomeric end necessary for replication and stability, such as telomerase which is activated in 85% of cancers or TRF2 and POT1, proteins that protect the telomeric end. Because of the guanine repetition on the G strand, telomeric ends can form quadruplex structures in guanine (G-quadruplexes) whose stabilization by specific ligands (G4 ligands) blocks the replication of telomeres and alters its integrity. Treatment of tumor cells with G4 ligands causes a dysfunction associated with the dissociation of telomeric proteins POT1 and TRF2 and leads to apoptosis or cell senescence. The analysis of the telomeric end terminal sequence by the STELA method (Single Telomere Length Analysis) shows that the C-terminal sequence of the strand ends mainly by the sequence ATC-5 ʼ. POT1 protein is responsible for the resection of the C strand of telomeres by recruiting an exonuclease capable of creating a single-stranded substrate for telomerase. Depletion of POT1 by RNA interference causes a deregulation of the C strand end. We studied in our work the effect of G4 ligands on the terminal sequence of the telomeric C strand at the telomere of chromosome XpYp and at all telomeres using a modification of the technique of STELA. Our results show that a low concentration of derivatives of the pyridine dicarboxamides series causes a minor but significant effect on the terminal sequence of XpYp telomeres and of all telomeres in HT1080 cell line. On the contrary, a higher concentration does not alter the C strand termination in HT1080, A549 and HeLa cells but induces a replicative stress. The modest effect of these ligands can be explained by an incomplete activity of dissociation of the protein POT1 of telomeres compared to its depletion by RNA interference. Indeed, we also showed that the nearly complete depletion of POT1 by shRNA randomizes the terminal sequence of the C strand

Ce travail sur la synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le ciblage de l'ADN G-quadruplex télomèrique s'inscrit dans le cadre de la recherche de nouveaux agents anti-cancéreux. L'objectif du travail est la conception des molécules capables d'inhiber la télomérase par stabilisation des G-quadruplex au niveau des télomères. Trois familles de composés polyaromatiques dérivés de quinoxaline ont été synthétisées : (i) la famille benzymidazopyridoquinoxaline, (ii) la famille indoloquinoxaline et (iii) la famille triazoloquinoxaline. Ces macrocycles ont été ensuite quaternarisés pour améliorer la solubilité dans l'eau et l'affinité vers l'ADN quadruplex. Nous décrivons la synthèse d'un noyau pentacyclique dérivé du benzimidazole à partir de la sérine et l'o-phénylènediamine non substituée dans un milieu acide. La quaternarisation de cette molécule avec le triflate de méthyle donne un produit méthylé soluble dans l'eau. Puis nous décrivons la synthèse de quatre noyaux tetracyclique dérivés du 6H-indolo[2,3- b]quinoxaline en deux étapes : une alkylation d'indole-2,3-dione suivie d'une condensation isatines substituées avec l'o-phénylènediamine dans un milieu acide. La quaternarisation de ces composés a été effectuée avec le sulfate de diméthyle pour obtenir des produits solubles dans l'eau. Enfin nous avons préparé quelques molécules polycycliques de la famille triazoloquinoxaline, ainsi qu'un produit de forme ouverte que nous avons isolé sous forme cristalline. Dans une dernière partie l'étude des interactions des ligands de la famille de benzymidazopyridoquinoxaline et d'indoloquinoxaline avec l'ADN G-quadruplex télomérique par la méthode de FRET a été réalisée. Cette étude a montré que le composé aromatique et cationique de la série benzimidazopyridoquinoxaline, décrite dans le chapitre II, est apparu comme un ligand de l'ADN G-quadruplex modeste mais sélectif pour l'ADN quadruplex. Le composé pentacyclique sous forme de croissant semble plus prometteur que les aromatiques linéaires plus classiques comme les dérivés d'ellipticine ou d'indoloquinoxaline décrits dans le chapitre III. Certains composés ont été également testés comme inhibiteurs de l'enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis. Le composé 6(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline que nous avons synthétisés au chapitre III peut être considéré comme une molécule " lead" pour la conception de nouveaux inhibiteurs d'INhA<br>This work on the synthesis of polyaromatic heterocyclic ligands quinoxaline derivatives for targeting G-quadruplex telomeric DNA be part of the search for new anti-cancer agents. The objective of the work is the design of molecules capable of inhibiting telomerase by stabilizing G-quadruplex at the telomeres. Three families of polyaromatic compounds quinoxaline derivatives were synthesized: (i) benzymidazopyridoquinoxaline family, (ii) the indoloquinoxaline family and (iii) triazoloquinoxaline family. These macrocycles were then quaternized to improve the water solubility and the affinity to the quadruplex DNA. We describe the synthesis of a pentacyclic ring of the benzimidazole derivative from serine and unsubstituted o-phenylenediamine in an acidic medium. The quaternization of this molecule with methyl triflate gives a methylated product soluble in water. Then we describe the synthesis of four tetracyclic cores derivatives 6H-indolo [2,3-b] quinoxaline in two steps: alkylating a indole-2,3-dione followed by condensation isatins with substituted o-phenylenediamine in an acidic medium. The quaternization of these compounds was carried out with dimethyl sulfate to obtain water-soluble products. Finally we have prepared some polycyclic molecules triazoloquinoxaline family and a product of open form that we isolated in crystalline form. The last part of the study of the interactions of ligands family benzymidazopyridoquinoxaline and indoloquinoxaline with G-quadruplex telomeric DNA by the method of FRET was performed. This study showed that the aromatic compound and the cationic benzimidazopyridoquinoxaline series, described in Chapter II, has emerged as a ligand G-quadruplex DNA modest but selective for DNA quadruplex. The pentacyclic compound crescent looks brighter than most conventional linear aromatic as ellipticine derivatives or indoloquinoxaline described in Chapter III. Some compounds were also tested as inhibitors of the enzyme InhA of Mycobacterium tuberculosis. Compound 6 (diethylaminoethyl) indoloquinoxaline we synthesized in Chapter III can be considered a "lead" molecule for designing new Inha inhibitors

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable<br>G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them

Les origines de réplication sont les sites à travers le génome où est initiée la synthèse de l’ADN. Les multiples cartographies des origines de réplication dans des cellules de vertébrés ont identifié une association entre origines de réplication et motifs G4. Les motifs G4 sont des séquences ayant le potentiel de se replier en G-quadruplexe. Des travaux menés précédemment au laboratoire ont montré que la capacité d’un motif G4 à se replier en G-quadruplexe est essentielle pour l’activité de deux origines de réplication modèles dans la lignée cellulaire de poulet DT40. Cependant, le motif G4 n’est pas suffisant pour spécifier une origine de réplication. Dans l’origine modèle βA, un élément cis de 227 pben 3’ du motif G4 est également nécessaire pour l’initiation de la réplication. L’analyse de la séquence de cet élément indique qu’il comporte plusieurs motifs connus pour être des sites de fixation de facteurs de transcription. Nous avons testé le rôle potentiel de ces motifs en évaluant l’effet de leurs délétions individuelles sur l’activité de l’origine βA. Ces travaux ont identifié les boites TATA et CCAAT, pouvant être liées par le facteur TBP (TATA Binding Protein) et NFY (Nuclear Factor Y) respectivement, comme étant les éléments cruciaux avec le motif G4 pour l’initiation de la réplication. Nous avons cherché à éclaircir de quelle manière ces éléments permettent la spécification d’une origine de réplication. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les motifs G4 qui se trouvent au niveau des origines de réplication sont ceux qui in vivo sont capables de former un G-quadruplexe. La formation du G-quadruplex dans l’origine βA dépendrait alors de la présence des boites TATA et CCAAT qui peuvent recruter des facteurs de transcription favorisant l’ouverture de la double hélice de l’ADN et le repliement du G-quadruplex. Cette hypothèse prévoit que la stabilisation d’un G-quadruplexe in vivo est nécessaire et suffisante pour former une nouvelle origine de réplication. Nous avons donc testé cette hypothèse de deux manières. D’abord, nous avons entrepris de stabiliser un G-quadruplex à une position donnée du génome en induisant la transcription d’un motif G4. Ensuite, nous avons déterminé les effets d’une stabilisation globale des G-quadruplexes à travers le génome sur la position des origines de réplication. Pour cela, nous avons cartographié les origines de réplication dans des lignées de cellules DT40 dans lesquelles des facteurs impliqués dans la linéarisation des G-quadruplexes ont été inactivés. Selon notre hypothèse, en l’absence de tels facteurs, comme l’hélicase FancJ ou l’ADN polymérase translésionnelle Rev1, davantage de motifs G4 pourraient se replier et former une origine de réplication. Les résultats obtenus avec chacune des deux approches indiquent que la stabilisation de G-quadruplexes ne permet pas de produire de nouvelles origines de réplication. L’ensemble de nos données indique que l’activité de l’origine βA dépend d’un motif G4 et des boites TATA et CCAAT. La manière par laquelle l’ensemble de ces éléments permettent l’initiation de la réplication reste à éclaircir<br>Replication origins are the position where DNA synthesis is initiated. Mapping of replication origins across the genome showed a link between origins and G4 motifs. G4 motifs are sequences the potential for forming G-quadruplexes. Works carried out previously in the laboratory showed that the ability to fold into G-quadruplex is critical for the activity of two model origin in the DT40 cell line. However, the G4 motif is not enough to specify a replication origin. In the βA model origin, a 227 bp cis element is required for the initiation of replication. The analysis of this sequence indicates the presence of several motifs known to be binding sites for transcription factors. We tested the potential roles of these motifs by evaluating the effect of their individual deletion on the activity of the βA origin. This work identified the TATA and CCAAT boxes who bind TBP (TATA Binding Protein) and NFY (Nuclear Factor Y) respectively as the crucial elements, with the G4 motifs, pour the initiation of replication.We endeavored to shed light on the manner by which these elements enable the specification of a replication origin. We hypothesized that the G4 motifs associated with replication origins are those able to form a G-quadruplex in vivo. The formation of the G-quadruplex of the βA origin would require the presence of the TATA and CCAAT boxes who could recruit transcription factors facilitating the opening of the double helix and G-quadruplex folding. We tested this hypothesis by two different manners. First, we undertook to stabilize a G-quadruplex at a given position in the genome by inducing the transcription of a G4 motif. Then, we observed the effects of a genome wide stabilization of G-quadruplexes on the position of replication origins. For that, we mapped replication origins in DT40 cell lines in which factors implicated in G-quadruplex linearization are inactivated. According to our hypothesis, without such factors, like the FancJ helicase of the translesional DNA polymerase Rev1, more G4 motifs could fold into G-quaduplexes and specify replication origins

Les G-quadruplex (G4), structures secondaires pouvant être adoptées par les acides nucléiques, jouent des rôles biologiques dans de nombreux processus cellulaires : maintenance des télomères, réplication cellulaire et virale, réarrangements génomiques, réponse au dommages de l’ADN, régulation transcriptionnelle. Dans le génome humain, il existe une forte présence de séquences potentiellement capables de former des G4 et, en fonction des algorithmes de recherche utilisés pour les identifier in silico, le nombre de motifs est variable et peut atteindre plusieurs centaines de milliers. Récemment, le développement de ligands qui se lient spécifiquement aux G4 et sont capables de stabiliser ces structures, permettrait de moduler leur formation in vivo et donc d’étudier les processus biologiques associés et de développer des agents anti-cancéreux visant des proto-oncogènes.Des travaux menés dans notre unité, basés sur un modèle levure (insertion de la séquence du minisatellite humain CEB25 dans le génome de Saccharomyces cerevisiae), ont montré que les divers motifs G4 ne sont pas tous capables d’induire de l’instabilité génétique et qu’ils n’ont pas le même comportement vis-à-vis des ligands. En particulier, les G4 composés de boucles courtes - dits G4-L1, du type G3N1G3N1G3N1G3, sont beaucoup plus stables in vitro (Tm &gt; 70°C) et corrélativement sont plus instables in vivo. Ces observations mènent à la question de comment ces motifs ‘à risque’ se forment in vivo, sont maintenus dans les génomes et comment ils évoluent. Pour aborder ces questions, nous avons mis au point et employé des approches expérimentales et bio-informatiques pour : (1) localiser, annoter et comparer les motifs G4-L1 dans le génome humain, en utilisant le génome de référence hg38 et les données du projet 1000 Génomes pour évaluer leur polymorphisme, ainsi qu’examiner leur maintien dans plus de 500 espèces ; (2) caractériser le potentiel mutagène des G-quadruplex par une approche de capture-NGS (séquençage à très haute profondeur), en utilisant diverses lignées cellulaires humaines traitées par des ligands de G4 (notamment, les ligands de la famille de PhenDC produits à l’Institut Curie) ; et (3) améliorer notre compréhension des rôles des G4 stables dans la transcription, en associant l'expression génique à la fréquence de motifs G4 canoniques présents autour des TSS, par des analyses combinées de génomique/traitements avec des ligands dans des cellules de fibrosarcome<br>Nucleic acid G-quadruplex (G4) secondary structures play important biological roles in multiple cellular processes (telomere maintenance, cellular and viral replication, genome rearrangements, DNA damage response, epigenetic, transcriptional regulation). G4 potential motifs are scattered throughout the genome and, depending on the algorithms used to identify them in silico, their number varies and may reach several hundreds of thousands. Recently, the development of small molecules able to stabilise these structures opened the possibility of probing and/or interfering with their formation, allowing to examine the associated biological processes and developing anti-cancer agents. Work in our research unit, using natural and site-directed mutated human minisatellite sequences in yeast treated with different G4 ligands, showed that not all G4 sequences display the same potential to induce G4-dependent genome instability during replication. Namely, G4 structures carrying very short interconnecting loops between the G-runs are more stable in vitro and correlatively, are more prone to trigger genome instability in vivo. At the extreme, the G4s with the consensus G3N1G3N1G3N1G3 motif (where N is any nucleotide) – herein called G4-L1 – carry the higher potential to fold and trigger instability. This raises the unresolved questions of how these ‘at risk’ sequences are formed in vivo, maintained in genomes and how they evolve. To address these issues, we have used up–to-date bioinformatics, analytical and biological approaches to: (1) map, annotate and compare G4-L1 motifs in the human genome, using the hg38 reference and the 1000 Genomes project variation information to assess common polymorphism, as well as examine their maintenance across over 500 species; (2) characterize, using various human cell lines and Next Generation Sequencing (NGS) approaches, the potential of these sequences to mutate or induce perturbations upon treatments with G4 ligands; and (3) to improve our understanding of the roles of stable G4s in transcription, we have associated gene expression with the frequency of canonical G4 motifs near gene by combined G4 ligand/genomic analyses in fibrosarcoma cells

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures non-canoniques d’acides nucléiques (ADN et ARN) constituées d’au moins deux quartets de guanines. L’une des propriétés importantes des G4s est leur capacité à former des complexes avec de petites molécules exogènes (ligands) et d’influencer ainsi les processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués. Ainsi, l’interaction de petites molécules avec certaines structures G4s permettrait de diminuer l’expression de certains oncogènes, d’inhiber la télomérase ou encore d’induire des dommages à l’ADN. Ce travail vise à développer des méthodologies rapides et simples pour la synthèse et le criblage des molécules afin d’identifier des ligands sélectifs et affins de structures non-canoniques d’acides nucléiques, en particulier des G4s. Plus précisément, ce travail explore la synthèse réversible d’acylhydrazones, jusqu’ici peu appliquée pour le développement de ligands de l’ADN et de l’ARN. Dans un premier temps, une série de 20 bis(acylhydrazones), analogues des ligands PDC (360A) et PhenDC3, a été obtenue par la synthèse préparative. Les expériences de dénaturation thermique suivie par fluorescence ont démontré que certains de ces composés avaient une bonne affinité pour l’ADN G4. Ces expériences ont permis de valider le potentiel du motif acylhydrazone pour le développement de ligands des G4s. Ensuite, une méthode de chimie dynamique combinatoire (CDC) a été développée. Cette dernière consiste en génération de bibliothèques combinatoires comportant jusqu’à 20 composés, suivie par l’isolement des ligands les plus affins par la précipitation avec la cible, immobilisée sur des billes magnétiques. Ainsi, un bis(acylhydrazone) non-symétrique a été identifié comme un ligand prometteur du G4 parallèle Pu24T. Cependant, les expériences avec ses proches analogues n’ont pas confirmé son affinité aux G4 augmentée par rapport aux dérivés symétriques. Il a été supposé que les résultats d’expériences de CDC pouvaient être biaisés par des interactions non-spécifiques entre les ligands et les billes magnétiques. Pour améliorer l’analyse des bibliothèques combinatoires, une nouvelle méthode basée sur l’extraction en phase solide des ligands a été développée et appliquée à deux bibliothèques d’acylhydrazones non-symétriques. Huit hits ont été obtenus à partir de 70 composés générés in situ. Trois d’entre eux ont été sélectionnés pour la synthèse préparative et une étude de l’interaction avec l’ADN G4. En parallèle, une approche classique de chimie combinatoire a été élaborée, ce qui a conduit à la génération d’une bibliothèque combinatoire de 90 dérivés bis(acylhydrazone) sous forme de solutions 2 mM dans DMSO prêtes à l’emploi, avec une pureté moyenne de 87%. Ces échantillons ont été utilisés directement dans le criblage biophysique contre quatre G4s de l’ADN de trois topologies différentes. Les composés les plus actifs ont été synthétisés d’une manière préparative et leur interaction avec les G4s a été étudiée en détail par des méthodes biophysiques, y compris la spectrométrie de masse native. Ainsi, au moins un dérivé avec une affinité pour les G4s supérieure à celle de PhenDC3 et une sélectivité inédite pour le G4 antiparallèle a été identifié. Enfin, dans le cadre d’un projet collaboratif (M. Blondel, Université de Bretagne Occidentale), des ligands synthétisés au cours de ce travail ont été étudiés vis-à-vis de leur capacité à moduler d’évasion immune du virus d’Epstein–Barr (EBV). Il a été démontré que certains bis(acylhydrazones) interagissent in vitro avec la séquence riche en guanines de l’ARNm codante pour le domaine riche en glycine-alanine (GAr) de la protéine virale EBNA1. Deux de ces dérivés déplacent le facteur de la cellule hôte (nucléoline) de l’ARNm d’EBNA1, conduisant ainsi à la surexpression de la protéine et à la présence exacerbé de peptides antigéniques sur les cellules infectées. Cet effet représente une opportunité thérapeutique pour le traitement des cancers associés à l’EBV<br>G-quadruplexes (G4s) are four-stranded structures of nucleic acids (DNA or RNA) that consist of at least two coplanar guanine quartets. An important feature of G4s is their ability to form stable complexes with exogenous small molecules (ligands) and thus influence biological processes in which they are involved. G4 targeting is often associated with oncology, where G4 ligands may suppress the expression of oncogenes, inhibit telomerase, or induce DNA damage in cancer cells. This work aims to develop methodologies for rapid and simple synthesis and screening of compounds, in order to identify selective and highly affine ligands of given non-canonical structures of nucleic acids, in particular G4s. Specifically, this works exploits the chemistry of reversible synthesis of acylhydrazones, which has been barely applied for the development of DNA or RNA ligands before. First, a small library of 20 cationic bis(acylhydrazones), analogues of the previously reported G4-ligands PDC (360A) and PhenDC3, was obtained by preparative synthesis. Through fluorescence melting experiments it is demonstrated that some of compounds indeed have high affinity to G4-DNA, validating the suitability of the acylhydrazone motif as a scaffold for the development of G4 ligands. Next, a method of dynamic combinatorial chemistry (DCC), which consists in simultaneous one-pot generation of libraries of up to 20 compounds with consecutive pull-down of most affine ligands by bead-immobilized targets (i.e., G4-DNA), was developed. By using this method, a non-symmetrical bis(acylhydrazone) was identified as a promising ligand of a parallel G4-DNA Pu24T. However, biophysical experiments with its close structural analogues did not confirm their preferential binding in comparison with the symmetrically substituted compound. It is proposed that the outcome of DCC experiments may be biased by non-specific interactions of ligands with magnetic beads, leading to false-positive results. In order to improve the analysis of dynamic combinatorial libraries, a novel method based on solid-phase extraction of the G4-ligand complex was developed and applied to two libraries of non-symmetric acylhydrazones. In a few rounds of selection, 13 hits were obtained out of 70 in situ generated compounds. Three of them were selected for preparative synthesis and detailed study of interaction with G4-DNA. In parallel, a classical combinatorial chemistry approach was developed, resulting in generation of a combinatorial library of 90 individual bis(acylhydrazone) derivatives in the form of ready-to-use 2 mM solutions in DMSO, with an average purity of 87%. These samples were directly used for biophysical screening experiments towards four G4-DNA targets of three different topologies. Three most active compounds were obtained in preparative manner and their interaction with the mentioned biological targets was studied in detail by several biophysical methods, including native mass spectrometry experiments. This way, at least one derivative with a G4-DNA affinity superior to that of PhenDC3 and unprecedented selectivity towards anti-parallel G4-DNA could be identified. Finally, in the framework of a collaborative project (M. Blondel, University of Western Brittany) the ligands synthesized in this work were studied with respect to their capacity to act as modulators of the immune evasion of Epstein–Barr virus (EBV). Specifically, it was shown that several bis(acylhydrazones) bind in vitro to G4-RNA structures formed by the guanine-rich repeat sequence of mRNA encoding for the glycine-alanine rich (GAr) domain of viral genome maintenance protein EBNA1. Moreover, two derivatives were found to displace the host cell factor nucleolin from EBNA1 mRNA, leading to overexpression of EBNA1 protein and a concomitant increase of antigen presentation in EBV-infected cell cultures. This effect represents an interesting therapeutic opportunity for treatment of EBV-related cancers

Guanine-rich nucleic acids can fold into distinctive four-stranded G-quadruplex structures which are found in telomeric DNA repeats, as well as in sequences in promoter and other regulatory regions of genes, especially those involved in cellular proliferation. Small molecules that can selectively bind and stabilize the G-quadruplex structure have become of significant interest to researchers and are gaining momentum as a possible new class of anticancer agents [1]. Using a distamycin scaffold as a starting point, we introduced biaryl building blocks in place of pyrroles to switch preference from duplex to quadruplex DNA. This alteration in shape ensures that the molecules have low affinity for duplex DNA while increasing their interaction with a G-quadruplex structure, since the ligands have similar dimensions. The structures of the biaryl polyamides previously reported by the Thurston group were tailored to enhance affinity for specific G-quadruplexes (e.g., c-kit1 vs c-kit2 vs HT4) while retaining the quadruplex vs duplex selectivity. A 66 member focused second generation biaryl polyamide library was synthesized based on structural information obtained from the previously reported polyamide types. Assessment of the G-quadruplex interaction of the library members was initially carried out using a FRET-based melting assay. Compound KN-242 with hybrid benzofused and biaryl building blocks showed significant selective stabilization of human Telomeric G-quadruplex. At 1 μm concentration it stabilized human Telomeric G-quadruplex by 32 ºC, while showing insignificant affinity for duplex DNA. FRET competition assays with C-kit quadruplexes and CT DNA further confirmed selective stabilization of telomeric quadruplexes. A short-term growth inhibitory experiment against six different cancer cell lines, MiaPaCa2, A549 MCF7, HeLa, U87MG, A431 and WI38 gave low micromolar IC50 values and between 5-8 fold selectivity for cancer cell lines compared with the non-cancerous WI 38 cell line. Therefore, given their low molecular weight, good water solubility and excellent cellular penetration properties, molecules of this type have the potential to be developed into either potential therapeutic agents or reagents that can probe DNA structure, and/or down-regulate individual signalling pathways in cells.

Les G-quadruplexes (ou G4) sont des structures non canoniques des acides nucléiques formées à partir de séquences riches en guanines. Les G4 sont des structures stables, présentes sur l'ensemble du génome et qui peuvent adopter différentes conformations. La formation des G4 peut réguler, de façon positive ou négative, différents processus cellulaires tels que la transcription, la réplication, les transactions des ARN et les mécanismes mitochondriaux. L'ensemble de ces processus nécessite le recrutement de protéines capables de moduler la formation de ces structures. Certaines protéines, telles que les hélicases BLM, WRN ou DHX36, sont capables de dérouler les G4 alors que d'autres, comme la nucléoline (NCL), se lient aux G4 et les stabilisent. Enfin, des molécules capables de stabiliser les G4 appelées ligands de G4, peuvent impacter divers processus dans lesquels sont impliqués les G4 ; en particulier, ils peuvent entrainer la répression de l'expression d'oncogènes et mener à de l'instabilité génomique. Ainsi, les ligands de G4 sont considérés comme de potentiels agents anti-cancéreux. Mes travaux de thèses s'articulent autour de plusieurs problématiques concernant les G4 : 1/ l'amélioration des ligands de G4 et leur caractérisation ; 2/ le décryptage des mécanismes induisant de l'instabilité génomique suite à la stabilisation des G4 par des ligands ; 3/ l'identification des protéines capables de se lier aux G4 (ou GBP pour " G4 Binding Proteins "). Par des expériences biochimiques et biophysiques, j'ai participé à la caractérisation de ligands dérivés de porphyrine. Dans le cas du ligand AuMA, j'ai montré une augmentation à la fois de la capacité de stabilisation des G4 et de la spécificité envers les G4, par rapport à d'autres molécules dérivées de porphyrine. Cette molécule représente donc un meilleur potentiel thérapeutique que le TMPyP4, ligand largement étudié, dont elle est dérivée. J'ai également étudié l'instabilité génomique due à la stabilisation des G4 grâce à l'utilisation du ligand pyridostatine et du ligand CX5461, actuellement en phase II d'un essai clinique. Ces ligands induisent des cassures double brin de l'ADN (ou CDB) dépendantes de la transcription par l'ARN polymérase II et partiellement dues à la pause transcriptionnelle. Les CDB sont initiées par l'activité des Topoisomérases II, enzymes impliquées dans la résolution des stress topologiques de l'ADN dus à la transcription et à la réplication. Ces résultats montrent le rôle important de la transcription dans l'induction de l'instabilité génomique et ouvrent de nouvelles pistes thérapeutiques, dans le traitement de cancers dans lesquels ces protéines sont surexprimées ou par la combinaison avec d'autres chimiothérapies telles que l'étoposide afin d'en augmenter le potentiel cytotoxique. J'ai étudié les protéines se liant aux G4 grâce à des structures contraintes, bloquées dans une conformation particulière, en mettant au point un protocole de détection des GBP par des expériences de "Pull-Down" suivie d'une analyse par spectrométrie de masse. Ces résultats, validés par la liaison aux G4 de protéines déjà identifiées et caractérisées telles que WRN, DHX36 ou encore CNBP, ont permis l'identification de 425 GBP. Ainsi, j'ai mis en évidence de nouvelles GBP impliquées dans divers processus cellulaires tels que la réplication, la réparation de l'ADN, la transcription et le métabolisme des ARN. De façon annexe, l'étude de la protéine CNBP dans un modèle animal a permis de montrer que la régulation des G4 in vivo impacte la transcription et le développement embryonnaire, renforçant le rôle des G4 dans des organismes vivants. Mes travaux contribuent à étendre les connaissances sur les G4 et leurs ligands, particulièrement celles portant sur les mécanismes d'action des G4 pendant la transcription, et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques<br>G-quadruplexes (or G4) are non-canonical structures of nucleic acid formed from guanine-rich sequences. G4 are stable structures, present throughout the genome and could be folded into different conformations. G4 formation can regulate, positively or negatively, different cellular processes such as transcription, replication, RNA transactions and mitochondrial mechanisms. All these processes require the recruitment of proteins able to modulate the formation of these structures. Indeed, some proteins, such as BLM, WRN or DHX36 helicases, are able to unwind G4 while others, like nucleolin (NCL), bind to and stabilize G4. Finally, G4 ligands, small molecules stabilizing G4, can impact various processes in which G4 are involved; in particular, they can cause repression of oncogene expression and lead to genomic instability. Thus, G4 ligands are considered to be potential anti-cancer agents. My thesis work focuses on several issues concerning G4: 1/ the improvement of G4 ligands and their characterization; 2/ the deciphering of the mechanisms inducing genomic instability following G4 stabilization by ligands; 3/ the identification of proteins able to bind to G4 (or GBPs for "G4 Binding Proteins"). Through biochemical and biophysical experiments, I have participated in the characterization of porphyrin-derived ligands. In the case of the AuMA ligand, I showed an increase in both G4 stabilization capacity and G4 specificity, compared to other porphyrin-derived molecules. This molecule therefore represents a better therapeutic potential than TMPyP4, a widely characterized ligand from which it is derived. I have also studied the genomic instability due to G4 stabilization using the pyridostatin ligand and the CX5461 ligand, currently in Phase II of a clinical trial. These ligands induce DNA double-strand breaks (or DSBs) dependent on transcription by RNA polymerase II and partly due to the transcriptional pausing. DSBs are initiated by the activity of Topoisomerases II, enzymes involved in the resolution of DNA topological stresses due to transcription and replication. These results show the significant role of transcription in the induction of genomic instability and open up new therapeutic approaches in the treatment of cancers in which these proteins are overexpressed or by combining them with other chemotherapies such as etoposide to increase their cytotoxic potential. I have studied G4-binding proteins using constrained structures, blocked in a particular conformation, by developing a protocol for the detection of GBPs through Pull-Down experiments followed by mass spectrometry analysis. These results, validated by the binding to G4 of proteins already identified and characterized such as WRN, DHX36 or CNBP, allow the identification of 425 GBP. Thus, I have highlighted new GBPs involved in various cellular processes such as replication, DNA repair, transcription and RNA metabolism. Aside, the study of CNBP protein in a zebrafish model has shown that the regulation of G4 in vivo affects transcription and embryonic development, reinforcing the role of G4 in whole living organisms. My work contributes to extend the knowledge of G4 and their ligands, particularly the mechanisms of action of G4 during transcription, and is opening up new therapeutic perspectives

Guanine-rich nucleic acids can fold into distinctive four-stranded G-quadruplex structures which are found in telomeric DNA repeats as well as in sequences in the promoter and other regulatory regions of genes, especially those involved in cellular proliferation. Small molecules that can selectively bind and stabilize the G-quadruplex structure have become of significant interest to researchers, and are gaining momentum as a possible new class of anticancer agents. This project was based on a previously reported series of novel biaryl polyamides with significant selectively toward G-quadruplexes compared to duplex DNA, and with modest selectivity between different quadruplex types. Using a distamycin scaffold as a starting point, biaryl building blocks were introduced in place of pyrroles to switch preference from duplex to quadruplex DNA. This alteration in shape ensured that the molecules had low affinity for duplex DNA while increasing their interaction with a G-quadruplex structure since the ligands have similar 3D structures. The main aim of this project was to modify the structure of the previously reported biaryl polyamides (with the help of a molecular modelling based approach) through the incorporation of benzofused building blocks to improve their affinity for G-quadruplexes, while further reducing their affinity for duplex DNA, thereby enhancing their selectivity for quadruplex DNA. A small, focused benzofused-polyamide library (18 molecules) was initially synthesized and evaluated for the ability of members to stabilize G-quadruplex structures using a FRET-based DNA thermal denaturation assay and molecular dynamics (MD) simulations. However, these compounds failed to stabilize the F21T (human telomeric G-quadruplex), c-Kit quadruplexes and Bcl-2 quadruplexes, and MD simulations suggested that the shape of the molecules required further modification to facilitate quadruplex interaction. A second library of molecules (43 in total) was then designed and synthesized using a molecular modelling-based approach. In this series, the shape of the polyamide fragment was changed, while retaining the original scaffold, by introducing benzofused moieties with 3,5-substitutions. Evaluation of these molecules in the same FRET assay showed a notable increase in stabilization of the F21T quadruplex for many library members. For example, compounds 4.93 and 4.71 stabilized the quadruplex by 15°C and 17°C, respectively (at 1 μM concentration), while showing insignificant affinity for duplex DNA. Moreover a third set of benzofused polyamides (9 in total) has been synthesized by the addition of two consecutive benzofused moieties instead of three consecutive benzofused moieties for the ideal length of G-quadruplex DNA targeting ligand molecules. These molecules were also evaluated by the same FRET-based DNA thermal denaturation assay. The overall data showed that benzofused polyamides made of three consecutive benzofused moieties had a specific curvature which improved their G-quadruplex interacting capacities compared to those with two consecutive benzofused moieties. Cytotoxicity studies were undertaken on MDA-MB-231 and HeLa cell lines and some library members are active at the low micromolar level. Molecule 4.45 has emerged as a lead compound, possessing a cytotoxicity of 40nM in MDA-MB-231. Given their low molecular weight (between 422-646 Daltons), reasonable water solubility and good cellular penetration properties compared to other known G-quadruplex inhibitors which are mostly non-drug-like, molecules of this type have the potential to be developed into both reagents that can probe DNA structure and into novel quadruplex-targeting therapeutic agents.

Depuis plusieurs années, on observe un intérêt grandissant envers des structures particulières de l’ADN, les quadruplexes de guanine ou G4. Ces structures, largement étudiées in vitro, sont encore peu connues in cellulo mais semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression génétique. Elles ont rapidement été considérées comme des cibles thérapeutiques potentielles pour certaines maladies telles que le cancer. Le premier indice de leur existence dans les cellules n’a été obtenu qu’en 2013 par immunodétection sur des cellules fixées. Les recherches sont actuellement tournées vers le développement de nouveaux outils moléculaires qui permettraient la visualisation des G4 dans des cellules vivantes.C’est dans ce cadre que nous avons imaginé une série de complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII à base de ligands plans étendus (heptacycle dpqp et octacycle dppqp). La combinaison des propriétés photophysiques des complexes de RuII associées à la présence d’un large plan étendu supposé interagir avec les G4, fait de ces molécules des outils potentiels pour l’étude des G4 in cellulo.La première partie de ce projet porte sur la synthèse de ces nouveaux complexes de ruthénium. Une méthode originale de "chimie sur complexe" a permis d'obtenir, entre autres, un complexe possédant le ligand dpqp, fonctionnalisé par une triple liaison. Il a également été possible, par « chimie sur complexe », de construire un cycle supplémentaire sur le ligand heptacyclique (dpqp) chélaté pour obtenir les complexes [Ru(L)2dppqp]2+. Les propriétés photophysiques des différents complexes ont été étudiées. Seuls deux complexes, [Ru(phen)2dpqp-Cl]2+ et [Ru(TAP)2dpqp-Cl]2+, présentent un comportement s’approchant de celui des complexes de référence; c’est à dire des rendements quantiques comparables à [Ru(bpy)3]2+ et des durées de vie de l’état excité de l’ordre de la centaine de nanosecondes. Les autres complexes sont non luminescents et l’hypothèse d’un quenching par transfert de proton à l’état excité a été avancée pour expliquer ce comportement.Les complexes ont aussi été évalués vis à vis de différentes structures oligonucléotidiques G4 et duplexes. Tous les complexes possèdent une affinité correcte envers les G4. Comme nous l'espérions, le complexe porteur du ligand octacyclique semble être particulièrement sélectif envers les G4 par rapport à l'ADN double brin. Il a aussi été montré que deux des complexes testés ont le potentiel d'être utilisés comme sondes moléculaires "light-switch ON" pour les structures G4 en milieu cellulaire. Certains des complexes synthétisés possèdent donc le potentiel pour devenir de bons outils moléculaires pour l’étude des G4 in cellulo.<br>Doctorat en Sciences<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’objectif de ces travaux de thèse était l’étude des interactions de petites molécules avec les multiples structures de l’ADN quadruplex via i) le développement et l’utilisation d’un test haut-débit pour l’analyse des interactions ligand-ADN quadruplex et le criblage de chimiothèques/ciblothèques et ii) la préparation de composés aux modes d’interactions multiples (empilement/sillon, covalent/non-covalent, etc.), sélectifs (quadruplex vs. duplex et intra-quadruplex) et éventuellement fonctionnalisés (biotine, fluorophore, etc.). La première partie des travaux a été centrée sur le développement du test G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement) qui est une méthode semi-quantitative permettant l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de petites molécules pour l’ADN quadruplex par déplacement d’une sonde off/on, le Thiazole Orange (TO). Le test a notamment été transposé avec succès de la cuve vers la microplaque (HT-G4-FID). D’autre part, nous avons montré l’intérêt de fluorophores alternatifs, TO-PRO-3 et Hoechst 33258, aux caractéristiques spectrales complémentaires à TO. Cette méthode d’analyse a également été utilisée avec succès pour l’identification de nouveaux ligands sélectifs d’ADN quadruplex et la mise en évidence des relations structure-activité ainsi que des sélectivités structurales. La deuxième partie des travaux a été consacrée à la préparation et à l’étude de nouveaux ligands d’ADN quadruplex. Ces ligands possèdent des particularités, soit dans leur mode d’interaction (sillons, coordination) soit par leur bifonctionnalité (biotinylés, fluorescents). Nous avons ainsi préparé un ligand de quadruplex polyhétéroaryle acyclique (TOxaPy) possédant une sélectivité inattendue pour certaines structures de l’ADN quadruplex. D’autre part, nous avons montré que les complexes de dérivés de terpyridine peuvent être adaptés, en changeant le ligand organique et/ou la nature du métal, de façon à interagir avec l’ADN quadruplex par interaction covalentes et/ou non covalentes<br>The aim of this thesis work was to study the interactions of small molecules with multiple structures of quadruplex DNA via i) the development and use of a high-throughput test for the analysis of ligand-quadruplex DNA interactions and screening of chemical libraries and ii) the preparation of compounds with multiple binding modes (stacking/groove, covalent/non-covalent, etc..) selective (quadruplex vs. duplex and intra-quadruplex) and possibly functionalized (biotin, fluorophore, etc.). The first part of the work was focused on the development of the G4-FID (G-quadruplex Intercalator Fluorescent Displacement) assay, which is a semi-quantitative method for evaluating the affinity and selectivity of small molecules for quadruplex DNA by displacing an off/on probe, the Thiazole Orange (TO). The test has been implemented successfully with microplate (HT-G4-FID). On the other hand, we have shown the importance of alternative fluorophores, TO-PRO-3 and Hoechst 33258, with complementary spectral characteristics. This method of analysis has also been successfully used for the identification of new selective ligands of quadruplex DNA and the identification of structure-activity relationships and structural selectivities. The second part of the work was devoted to the preparation and study of new DNA quadruplex ligands. These ligands possess particular characteristics either in their mode of interaction (grooves, coordination) or by their bifunctionality (biotinylated, fluorescent). We have prepared an acyclic polyheteroaryle quadruplex ligand (TOxaPy) with an unexpected selectivity for certain structures of quadruplex DNA. Furthermore, we showed that complexes of terpyridine derivatives can be tailored by changing the organic ligand and / or the metal in order to interact with quadruplex DNA by covalent and / or non-covalent interaction

La compréhension des mécanismes biologiques et l’implication des protéines dans ces mécanismes ont toujours été un enjeu important pour les biologistes. Les zones à risques de l’ADN impliquées dans les cancers, comme les G-quadruplex, les zones riches en Adénine-Thymine et leurs environnements proches sont particulièrement étudiés depuis de nombreuses années. L’essor des techniques d’analyses par fluorescence a permis aux scientifiques de mettre au point des sondes marquant ces domaines avec toujours plus de précision et de sensibilité. Cependant, de nombreuses interrogations existent sur la nature des interactions entre ces zones de l’ADN et les protéines. Afin de répondre à cette problématique, la synthèse d’une sonde pro-fluorescente alliant un ligand de l’ADN (conçu d’après les travaux des équipes de l’Institut Curie, UMR 176) à un piège à protéines (basé sur le squelette de l’epicocconone) a été réalisée et son efficacité biologique a été évaluée. Ces deux parties ont été assemblées en utilisant une réaction de cycloaddition 1,3 dipolaire spontanée entre un azoture et un alcyne contraint (SPAAC). De plus, au cours de ces travaux, une nouvelle bibliothèque de ligands de l’ADN a été synthétisée en utilisant une méthodologie innovante basée sur une réaction de C-H activation « on water »<br>Understanding biological process and proteins involved in has challenged biologists’ mind for a while. Specific DNA sequences, such as G-quadruplex and Adenine-Thymine rich sequences, have been studied for many years, especially for their involvement in genetic diseases like cancer. Scientists have also been interested in fluorescence monitoring and imaging of these specific sequences for a long time. Indeed, the huge sensitivity of these fluorescent technics and the wide scope of synthetic dyes available allowed several improvements on targeting DNA sequences responsible for genetic disorders. Nonetheless, relation between proteins and these areas remains mostly unknown. In order to answer this question, a pro-fluorescent dye built of two main parts, which are a DNA ligand (designed by Curie Institute teams, UMR 176) and a protein trap (based on epicocconone core). These parts were synthesized, coupled thanks to a Spontaneous Azoture Alkyne Cycloaddition (SPAAC) and the biological properties of the probe were evaluated. Furthermore, new ligands were synthesized using a new and innovating method of “on water” C-H activation reaction

Dans la plupart des cellules somatiques, en absence de la télomérase, les extrémités des chromosomes appelées télomères, raccourcissent au cours des divisions cellulaires, jusqu'à atteindre une taille limite qui définit la capacité proliférative des cellules. La réactivation de la télomérase provoque une prolifération infinie des cellules : c'est l'immortalisation cellulaire, un processus clé de la cancérogenèse. La molécule ID3-010 présente in vitro pour les structures en G-quadruplex (se formant au niveau des télomères) une affinité 10000 fois supérieure par rapport aux duplex ADN. Malgré une bonne inhibition de la télomérase in vitro, cette molécule s'est révélée inapte à provoquer l'arrêt de prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les télomères sont peu réactifs vis à vis des mécanismes de religature de ces cassures. Le mécanisme C-NHEJ ("non-homologous end-joining" classique) est majoritairement responsable de la réparation des CDB dans les cellules humaines. Dans un 2ème projet, j'ai étudié les mécanismes d'inhibition de la C-NHEJ aux télomères. J'ai montré que l'inhibition de la C-NHEJ est basée sur une compétition entre les protéines télomériques TRF2/RAP1 et les protéines de la C-NHEJ, KU et DNA-PKcs. De façon paradoxale, ces protéines de la C-NHEJ sont nécessaires à la stabilité télomérique car leur absence conduit à des fusions dépendantes d'un mécanisme alternatif de ligation (B-NHEJ). Il est proposé un modèle de double protection des télomères contre leur ligature dans lequel les protéines TRF2/RAP1 inhibent la C-NHEJ via un contrôle négatif de KU et DNA-PKcs qui en retour inhibent la voie B- NHEJ<br>In absence of telomerase, telomere decrease during cells divisions, until a limitant length which define the proliferative capacity of cells. Reactivation of telomerase causes a infinite proliferation of cells : it's cell immortalization, a key process of cancerogenesis. ID3-010 molecule had in vitro an affinity 10000 fold high for G-quadruplex (structures formed in telomere) rather than DNA duplex. Despite of a good inhibition of telomerase in vitro, this molecule can't inhibit cancer cell proliferation. Contrary to DNA double strand break (DSB), natural extremities of telomere don't react with ligation or signalization mechanisms. C-NHEJ mechanism (classical non-homologous end-joining) repairs most of DSB in human cells. In the second project of my thesis, I study the inhibition mechanism of C-NHEJ in telomere. I show with ligation and pulldown experiment that inhibition of C-NHEJ is supported by a competition between telomeric proteins TRF2/RAP1 and C-NHEJ proteins KU and DNA-PKcs. Paradoxically, KU and DNA-PKcs are necessary to telomeric stability. Indeed, lack of this proteins causes fusions with a alternative ligation mechanism (B-NHEJ). We propose a model of double protection of telomere against ligation in which TRF2/RAP1 inhibit C-NHEJ via a negative control of KU and DNA-PKcs, themselves inhibit B-NHEJ

Annually, more than 500,000 new cervical cancer cases are diagnosed worldwide with a 60% mortality rate. In Portugal, about 750 new cases are annually diagnosed which in 2018 resulted in 340 deaths. Human papillomaviruses (HPVs) are the principal cause for the development of cervical cancer. High-risk HPV types 16 and 18 are responsible for 70% of all cases. Persistent HPV infection leads to the hyperproliferation of the infected cells by downregulating epithelial differentiation, epidermal development, and innate immune responses. The oncogenic potential of high-risk HPV types is attributed to the expression of oncoproteins, E6 and E7, which inactivate tumour suppressor p53 and members of retinoblastoma family, leading to carcinoma development. Despite recent progresses in screening and HPV vaccination that reduced cervical cancer incidence, treatment options for women with persistent HPV infection or in its latent form are still missing. Furthermore, the available therapeutic options for cervical cancer have limited effectiveness and specificity, causing great pain to patients, and do not benefit from the research addressing the host-HPV interaction patterns during malignant progression. The genome of HPV is divided into 3 regions: a long control region (LCR) that contains cis-elements necessary for the replication and transcription of viral DNA; the early region, composed of six open reading frames (ORFs) labelled E1−E7, and a late region with two ORFs coding for capsid structural proteins L1 and L2. Recently, several guanine-rich regions have been found in the genome of ten HPV types (both high- and low-risk), and the potential of the sequences to fold into stable G-quadruplex (G4) structures was demonstrated. These guanine-rich regions are present in LCR, E1, E4 regions and L2 protein coding sequence, which are involved in transcription, replication, and viral proteins production. Hence, targeting these G-rich regions of the HPV genome could serve as a potential antiviral strategy, using small ligands that can stabilize the viral G4 regions and regulate gene expression. Nucleolin is overexpressed in the surface of cervical cancer cells and was shown to be involved in the activation of HPV18 oncogene transcription in cervical cancer and to be related with HPV16 genome stability maintenance. Nucleolin is present in the nucleus, cytoplasm, and cell surface. The roles of cell-surface nucleolin in tumorigenesis, angiogenesis, and cancer signalling pathways have also been described. Therefore, nucleolin is an attractive target for the development of targeted therapies for both cervical cancer and HPV infection given its high abundance, its multifaceted influence on oncogenesis and virulence of HPV, and its selective presence on the plasma membrane of cancer cells, but not on untransformed, normal cells. AS1411 is a nucleolin-targeted G4 aptamer with antitumoral effect in many cancers that has also been extensively used for the tumour-specific delivery of both therapeutic and imaging agents. This thesis innovates by proposing the development of aptamer-based carriers of antiviral/anticancer G4 ligands as a new therapeutic strategy for HPV infection and cervical cancer. Firstly, several G4-specific ligands belonging to different aromatic scaffolds such as indole, phenanthroline and acridine, were synthesized and characterized for their ability to bind G4 structures, either found in the cancer cell genome (oncogene promoter and telomeric G4s) or the HPV genome. Their effect in inhibiting key G4-dependent processes was demonstrated by their potential to inhibit Pif1 helicase and Taq polymerase enzymes, and to downregulate c-MYC oncogene expression. The ligands demonstrated interesting antitumoral effects in cervical cancer cell lines, particularly ligand C8, which was also found to inhibit HPV18 replication and encapsidation in organotypic raft cultures, with resulting antiproliferative effects in infected tissue. Having established the ability of the ligands as anticancer/antiviral agents, the development of an aptamer-based delivery system was envisioned. AS1411 aptamer and its derivatives AT11, AT11-L0 and AT11-B0 were used to selectively convey the G4 ligands to HPV-positive cervical cancer cells, with a simple non-covalent conjugation strategy and mediated by cell-surface nucleolin recognition. This strategy proved to be efficient at accumulating the ligands in cervical cancer cells, improving their antitumoral effect while limiting their off-target toxicity towards normal cells. Interestingly, because the used aptamers are also G4-forming sequences, the presence of the G4 ligands improved the aptamers’ properties such as cellular penetration and serum nuclease resistance, without affecting nucleolin recognition. Finally, advanced and intricate drug delivery systems were developed aiming at enhancing the clinical applicability of the anticancer/antiviral agents. AS1411-decorated nanoaggregates were synthesized to encapsulate the G4 ligands, allowing their sustained and targeted release within HPV-positive cells in precancerous and cancerous stages. The nanoaggregates presented small sizes (nanoscale), negative surface charge, stability, and a suitable drug release profile. The presence of AS1411 on the nanoaggregates surface as a cancer-specific guiding agent promoted the specific accumulation of the G4 ligands in cervical cancer cells which inhibited their growth, with little effect on non-malignant normal cells. The nanoaggregates were also able to penetrate cervix tissue biopsies of patients with HPV infection in precancerous stages, demonstrating the potential of this system to treat HPV infection in its latent stage, preventing oncogenesis and cervical cancer progression. The administration route of the drug-loaded nanosystems was also addressed. The C8-loaded nanoaggregates were formulated as a gel for local application in the female genital tract, specifically tissue with precancerous lesions and/or HPV infection. Preliminary ex vivo permeation studies using porcine vaginal tissue demonstrated the efficacy of the formulation in penetrating and accumulating the nanosystems in the target cells. Overall, the research performed throughout this doctoral thesis defined improvements in the design of G4-specific compounds with dual anticancer/antiviral effects and led to the discovery of potential aptamer-based delivery systems for G4 ligands. The original results obtained during the past years provide important knowledge in the applicability of G4 nucleic acids for the development of specific and effective therapeutics against HPV virulence and oncogenesis. Furthermore, the encouraging pre-clinical evaluation performed on the newly developed nanomedicines demonstrated the need of continuing the research initiated by this project, particularly by pursuing the in vivo studies to verify the clinical applicability of these systems. In the future, a similar strategy could be extended to the treatment of other types of cancers (for instance HPV-induced oropharyngeal cancers) and other viral infections such as HIV, hepatitis virus and SARS-CoV-2.<br>Anualmente, mais de 500 mil novos casos de cancro do colo do útero são diagnosticados, com uma taxa de mortalidade a rondar os 60%. Em Portugal, cerca de 750 novos casos são diagnosticados anualmente, que em 2018 resultaram em 340 mortes. Os vírus do papiloma humano (VPHs) são a principal causa do desenvolvimento de cancro do colo do útero. Os VPHs de alto-risco do tipo 16 e 18 são responsáveis por 70% de todos os casos. A infeção persistente por VPH leva à hiperproliferação das células infetadas, através da inibição da diferenciação epitelial, do desenvolvimento epidérmico e da resposta imune. O potencial oncogénico dos VPHs de alto risco é atribuído à expressão das oncoproteínas E6 e E7, que inativam o gene supressor de tumores p53 e membros da família do retinoblastoma, levando ao desenvolvimento de carcinomas. Apesar dos recentes progressos no diagnóstico e vacinação contra o VPH, que reduziram a incidência de cancro do colo do útero, ainda não existe tratamento para mulheres infetadas com VPH. Além disso, as terapias existentes para o cancro do colo do útero tais como quimioterapia, radioterapia e cirurgia, têm eficácia e especificidade limitadas, causando sofrimento aos pacientes, e não beneficiam da investigação sobre os padrões de interação hospedeiro-vírus durante a oncogénese. O genoma do VPH está dividido em 3 regiões: uma região denominada RLC que contém elementos cis necessários à replicação e transcrição do ADN viral; uma região prematura composta por seis fases de leitura aberta que codificam as proteínas E1 - E7; e uma região tardia com duas fases de leitura aberta codificando as proteínas estruturais da cápside, L1 e L2. Recentemente, foram encontradas várias regiões ricas em guaninas no genoma de dez tipos de VPH e o potencial destas sequências formarem estrutura estáveis de G-quadruplex (G4) foi demonstrado. Essas sequências ricas em guanina estão presentes nas regiões RLC, E1, E4 e na sequência codificante da proteína L2, que estão envolvidas na transcrição, replicação e produção de proteínas virais. Assim, o desenvolvimento de moléculas capazes de reconhecer e ligar essas regiões ricas em guaninas do genoma do VPH pode servir como uma estratégia antiviral, dado o seu potencial de regular a expressão de genes virais. A nucleolina é uma proteína sobrexpressa na superfície das células cancerosas do colo do útero e que demonstrou estar envolvida na ativação da transcrição de oncogenes do VPH18 e também na manutenção da estabilidade do genoma do VPH16. A nucleolina está presente no núcleo, no citoplasma e na membrana plasmática e foi descrita por estar envolvida na carcinogénese, angiogénese e em vias de sinalização do cancro. Por isso, esta proteína é um alvo atraente para o desenvolvimento de terapias direcionadas para o cancro do colo do útero e a infeção por VPH, devido à sua elevada expressão, múltiplos efeitos na oncogénese e virulência e a sua presença seletiva na membrana plasmática das células cancerosas, mas não em células normais. O AS1411 é um aptamero G4 direcionado à nucleolina, que apresenta efeito antitumoral em vários cancros, cuja aplicação se estende também à entrega específica de agentes terapêuticos e de diagnóstico a tumores. Esta tese inova ao propor o desenvolvimento de transportadores de ligandos de G4 baseados em aptameros, como uma nova estratégia terapêutica para infeção por VPH e cancro do colo do útero. Inicialmente, vários ligandos específicos de G4 foram sintetizados, pertencentes a diferentes grupos funcionais aromáticos, como indol, fenantrolina e acridina. Depois avaliou-se a sua ligação a estruturas G4, encontradas no genoma das células cancerosas (promotor de oncogenes e G4s teloméricos) ou no genoma do VPH. O seu efeito inibitório de processos dependentes de G4 foi demonstrado pelo potencial para inibir as helicase Pif1 e a polimerase Taq, assim como para regular negativamente a expressão do oncogene c-MYC. Os ligandos demonstraram efeitos antitumorais promissores em linhas celulares do cancro do colo do útero, particularmente o ligando C8, que também inibiu a replicação e encapsidação do VPH18 em culturas organotípicas, inibindo a proliferação do tecido infetado. Tendo estabelecido a capacidade dos ligandos como agentes anticancerígenos/antivirais, iniciou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega de ligandos baseado em aptameros. O aptamero AS1411 e seus derivados AT11, AT11-L0 e AT11-B0 foram usados para entregar seletivamente os ligandos de G4 a células cancerosas do colo do útero, utilizando uma estratégia simples de conjugação não covalente, mediada pelo reconhecimento da nucleolina na superfície das células. Essa estratégia foi eficiente na acumulação dos ligandos nas células do cancro do colo do útero, melhorando o seu efeito antitumoral e limitando sua toxicidade para as células normais. Uma vez que os aptameros usados também são sequências formadoras de G4, a presença dos ligandos melhorou as propriedades dos aptameros, tais como a penetração celular e resistência às nucleases séricas, sem afetar o reconhecimento de nucleolina. Finalmente, foram desenvolvidos sistemas mais avançados, com o objetivo de melhorar a aplicabilidade clínica dos agentes anticancerígenos/antivirais. Nanoagregados funcionalizadas com AS1411 foram sintetizadas por forma a encapsular os ligandos G4, permitindo sua libertação gradual e direcionada nas células positivas para VPH em fases pré-cancerosas e cancerosas. Os nanoagregados apresentaram tamanhos pequenos (escala nano), carga superficial negativa, estabilidade e perfil adequado de libertação dos ligandos. A presença de AS1411 na superfície do nanoagregados como agente de direcionamento tumoral, promoveu a acumulação nas células cancerosas do colo do útero, inibindo o seu crescimento, com pouco efeito nas células normais. Notavelmente, os nanoagregados também foram capazes de penetrar biópsias do cérvix uterino de pacientes com infeção por VPH em estadios pré-cancerosos, demonstrando o potencial deste sistema para tratar o VPH numa fase inicial da infeção, travando a oncogénese e progressão do cancro do colo do útero. A via de administração dos nanossistemas foi também abordada. Os nanoagregados foram formuladas como um gel semissólido para aplicação local no trato genital feminino, especificamente tecido com lesões pré-cancerosas e/ou infeção por VPH. Estudos preliminares de permeação ex vivo usando tecido vaginal porcino demonstraram a eficácia da formulação em penetrar e acumular os nanossistemas nas células alvo. No geral, a investigação realizada ao longo desta tese de doutoramento definiu melhorias no desenho de compostos específicos para G4 com efeitos anticancerígenos/antivirais e levou à descoberta de possíveis sistemas de entrega baseados em aptameros para ligandos de G4. Os resultados obtidos forneceram um conjunto de conhecimentos sobre a aplicabilidade dos ácidos nucleicos G4 para o desenvolvimento de terapias específicas e eficazes contra a virulência e oncogénese do VPH. Além disso, a encorajadora avaliação pré-clínica realizada nas nanopartículas desenvolvidas demonstrou a necessidade de continuar a investigação, particularmente através da realização de estudos in vivo para verificar a aplicabilidade clínica desses sistemas. No futuro, uma estratégia semelhante pode ser alargada ao tratamento de outros tipos de cancro (por exemplo, cancros da orofaringe induzidos pelo HPV) e outras infeções virais, como HIV, vírus da hepatite e SARS-CoV-2.

A telomerase é a enzima responsável pela proliferação descontrolada de células tumorais. A estabilização, por ligandos, das estruturas de G-quadruplexes de ADN tem vindo a ser apontada como uma estratégia promissora na inibição da telomerase em terapias de cancro. Neste trabalho foram estudadas várias porfirinas e ftalocianinas catiónicas como potenciais ligandos estabilizadores de G-quadruplexes de ADN. Selecionou-se, como padrão, uma das porfirinas mais estudadas nesta área de investigação, a meso-tetraquis(Nmetilpiridínio- 4-il)porfirina (TMPyP), que apresenta como forte limitação a sua baixa seletividade para G-quadruplexes. Os estudos de afinidade e seletividade dos ligandos selecionados recorrendo a técnicas de espectroscopia de ultravioleta-visível mostraram que, quer a coordenação do núcleo da porfirina TMPyP com o ião metálico zinco(II) quer a presença de unidades de piridina cationizadas nas posições beta pirrólicas contribuem fortemente para o aumento da seletividade destes ligandos para G-quadruplexes. Relativamente à serie de ftalocianinas selecionadas foi possível concluir que a existência de um equilíbrio entre o número e posição das cargas positivas na estrutura destes ligandos é fundamental para a existência de seletividade para estruturas de G-quadruplexes. Os resultados dos estudos anteriores foram ainda corroborados recorrendo a técnicas espectroscópicas de fluorescência. Para os ligandos mais promissores foram também feitos estudos preliminares sobre as alterações conformacionais induzidas pela presença dos ligandos nas estruturas dos G-quadruplexes, usando o dicroísmo circular. Neste trabalho foi também desenvolvido um método de screening competitivo que permite avaliar a afinidade e seletividade para G-quadruplexes de novos ligandos de uma forma rápida e económica. O desenvolvimento deste método envolveu uma grande componente de otimização de condições experimentais, sendo a sua utilização possível em espetrofotómetros convencionais ou em espetrofotómetros com leitor de placas.<br>Telomerase is an enzyme responsible for the unlimited proliferation of cancer cells and the stabilization of DNA (deoxyribonucleic acid) G-Quadruplex structures has been pointed out as a promising strategy for telomerase inhibition in cancer therapies. In this work, several cationic porphyrins and phthalocyanines were studied as potential DNA GQuadruplexes stabilizing ligands. One of the most studied porphyrins in this field of research, the meso-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)porphyrin (TMPyP) presents, as a strong limitation, low selectivity for GQuadruplexes. In these studies, TMPyP was selected as the standard. The studies of affinity and selectivity of selected ligands, using ultraviolet-visible spectroscopy techniques, have shown that either the coordination of the porphyrin TMPyP core with the zinc(II) metal ion or the presence of pyridine units cationized in the beta pyrrolic positions strongly contribute to increase the selectivity of these ligands to Gquadruplexes. With respect to the series of the selected phthalocyanines, it was possible to conclude that the existence of a balance between the number and position of the positive charges in the structure of these ligands is crucial for the existence of selectivity for G-quadruplex structures. Two of the studied phthalocyanines showed high selectivity and affinity to Gquadruplex structures, thus being identified as promising ligands in telomerase inhibition. The results of previous studies were further corroborated using spectroscopic fluorescence techniques. For the most promising ligands, preliminary studies of conformational changes induced by the presence of ligands in GQuadruplexes structures were also performed, using circular dichroism. In this work, a competitive screenning method that allows the evaluation of the affinity and selectivity of new ligands for Gquadruplexes, in a fast and economic way, was developed. The development of this methodology involved a large component of experimental conditions optimization, its application being proposed for conventional spectrophotometers or plate reader spectrophotometers.<br>Mestrado em Bioquímica

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014<br>O cancro é uma doença somática que causa milhões de mortes por ano, estimando-se que venham a ser diagnosticados 20,3 milhões de novos casos até 2030. Os G-quadruplexos (G4) são formas de ADN de maior ordem, que são particularmente relevantes em áreas do genoma como os telómeros, regiões promotoras de oncogenes e promotores de chaperoninas de oncogenes. A estabilização de G4 torna-se, assim, importante no impedimento da progressão de alguns dos eventos que têm o potencial de desencadear o processo neoplásico, uma vez que o ADN deixa de estar na sua forma linear, dificultando o processo de maquinarias como a de transcrição. As indolo[3,2-b]quinolinas são uma de entre muitas classes de compostos que têm vindo a ser estudadas como potenciais estabilizadores de G-quadruplexos, devido à sua estrutura planar, que os torna bons candidatos ao estabelecimento de interacções π-π stacking com as bases de guanina. Neste trabalho, é proposta a síntese de um conjunto de derivados tri-substituídos de indolo[3,2-b]quinolinas, sua relação estrutura-actividade (SAR) para G4 e modelação in silico de modo a prever quais os melhores estabilizadores de G4 para esta classe de compostos. Os resultados mostraram que o composto 7 (11-oxo-5,10-bis[3-(1-piperidil)propil] indolo[3,2-b]quinolina-7-carboxilato de 3-(1-piperidil)propilo) foi o que obteve maiores valores de ΔTm para os vários tipos de estruturas de G4 testadas. No geral, verificou-se que a introdução de cadeias do tipo propilamina é mais favorável que a de cadeias etilamina. Anéis terminais de piperidina também mostraram ser mais favoráveis, enquanto os anéis de morfolina são desaconselháveis, devido aos diferentes pKa’s destes grupos terminais. Estudos de docking molecular, usando alguns dos ligandos sintetizados, permitiram a construção de um modelo que permite previsões razoáveis do potencial de estabilização de G4 por parte de derivados de indolo[3,2-b]quinolinas. Este método utiliza uma função de scoring baseada em ligações de hidrogénio e uma função-padrão London dG como refinamento. Este método permitiu a confirmação das SAR estabelecidas anteriormente.<br>Cancer is a somatic disease that causes millions of deaths a year. It is estimated that by 2030, 20.3 million new occurrences of this disease will have been diagnosed. G-quadruplexes (G4) are higher order forms of DNA particularly relevant in areas of the genome such as telomeres or oncogene promoter regions. G4 stabilisation is, therefore, important in the arrest of some events capable of leading to the development of a tumour, since DNA is no longer in its single strand .-conformation, which stalls some of the machinery needed for cell cycle progression. Indolo[3,2-b]quinolines are one of many types of compounds which have been studied as possible stabilisers of G-quadruplexes due to their planar structure, which makes them good candidates for π-π stacking interactions with guanine bases. It has also been shown that the substitution of some positions with protonable alkylamine side chains tends to enhance this stabilisation. In this work, we propose the synthesis of a series of tri-substituted indolo[3,2-b]quinoline derivatives, as well as the establishment of their structure-activity relationship for G4 sequences and in silico predictions of stabilisation strengths for this type of compounds. The results showed that compound 7 (3-(1-piperidyl)propyl-11-oxo-5,10-bis[3-(1-piperidyl)propyl]indolo[3,2-b]quinoline-7-carboxylate) was the one to attain higher values of ΔTm for various types of G4 sequences. In general, it was demonstrated that propylamine chains are preferable to ethylamine ones. Terminal piperidine rings also seem to be favoured for these compounds, as opposed to the not recommended morpholine ones. This is postulated to occur due to the pKa differences between these terminal groups. Docking studies using some of the synthesised molecules allowed for the development of a model which can make reasonable predictions for the G4 stabilisation potential of indolo[3,2-b]quinoline derivatives, using a scoring function which relies heavily on hydrogen bonding and a general London dG function for refinement. This model allowed for the confirmation of the relationships obtained through the previous SAR studies

In addition to the Watson and Crick B-form duplex DNA, G-quadruplexes are four-stranded DNA structures formed in vivo by the self-assembly of guanine-rich sequences. These can be formed by one, two or four separate strands of DNA and present a diversity of topologies, defined by the strand orientation, loop size and sequence. G-quadruplexes can be found in telomeres, immunoglobulin switch regions and gene promoter regions. The biological relevant location on the genome makes these high-order structures an attractive target for drug design and the development of highly specific ligands that bind and stabilize G-quadruplex with therapeutic activity. Herein, the biosynthesis of a novel G-rich quadruplex-forming DNA sequence 58Sγ3 is described by plasmid amplification. The recovery and purification of 58Sγ3 oligonucleotide using size-exclusion chromatography is presented. The G-quadruplex formation is promoted and its topology is determined by circular dichroism. The stabilization of the G-quadruplex structure with quinoline and naphthalene-based derivatives is studied using melting analysis, G4-FID and PCR-stop assays. The results suggest that 58Sγ3 folds into a parallel-stranded G-quadruplex structure in 500 mM KCl buffer and that naphthalene-based ligands bind and stabilize the G-quadruplex structure. The ligands are also found to be quadruplex-specific over duplex DNA and inhibit Taq DNA polymerase. This work provides evidence for G-quadruplex formation within the immunoglobulin switch regions. Furthermore, it is suggested that the novel ligands here reported act as potent specific G-quadruplex binders and may also potentially be used to inhibit genes transcription in tumor cells.<br>Além da forma B Watson e Crick do ADN duplex, os G-quadruplexes são estruturas de ADN de quatro cadeias, formadas in vivo pela auto-associação de sequências ricas em guaninas. Estas podem ser formadas por uma, duas ou quatro cadeias distintas de ADN e apresentar uma diversidade de topologias, definidas pela orientação da cadeia, tamanho dos loops e a sequência. G-quadruplexes podem ser encontrados nos telómeros, regiões de troca das imunoglobulinas e nas regiões dos promotores génicos. A localização biologicamente relevante no genoma faz com que estas estruturas altamente ordenadas sejam um alvo atrativo do desenho de fármacos e o desenvolvimento de ligandos altamente específicos que ligam e estabilizam o G-quadruplex com ação terapêutica. Neste trabalho, descreve-se a biossíntese da nova sequência de ADN rica em guaninas e formadora de G-quadruplex 58Sγ3, utilizando amplificação por plasmídeo. A recuperação e purificação do oligonucleótido 58Sγ3 é efetuada por cromatografia de exclusão molecular. A formação de G-quadruplex é promovida e a sua topologia é determinada por dicroísmo circular. A estabilização da estrutura do G-quadruplex com ligandos derivados de quinolina e naftaleno é estudada utilizando ensaios de estabilização térmica no dicroísmo circular, G4-FID e PCR-stop. Os resultados sugerem que 58Sγ3 adota uma estrutura G-quadruplex paralela em tampão 500 mM KCl e que os ligandos de naftaleno ligam e estabilizam a estrutura do G-quadruplex. Os ligandos demonstraram também ser específicos do G-quadruplex em relação ao ADN duplex além de inibir a Taq ADN polimerase. Este trabalho fornece evidência da formação de G-quadruplex nas regiões de troca das imunoglobulinas. Além disso, sugere que os derivados de naftaleno atuam como ligandos do G-quadruplex e que podem ser potencialmente utilizados para inibir a transcrição de genes em células tumorais.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016<br>Os ácidos nucleicos são as moléculas base dos seres vivos. Desde a mais simples bactéria até aos mamíferos mais desenvolvidos, todos os têm nas suas células, e é a partir deles que todas as proteínas são originadas. Mutações que provoquem erros na sua replicação, transcrição e tradução, se incapazes de serem corrigidos, podem dar origem à desregulação das células e consequentemente a doenças, ou até à morte dessas células. Mas há casos em que pode ser desejada a morte celular, como no caso de infeções virais, bacterianas e fúngicas, ou ainda no caso da proliferação indesejada de células, como o caso das neoplasias. Por isso, muitos fármacos que perturbam o normal funcionamento dos processos que envolvem os ácidos nucleicos, como a replicação, a transcrição e o processamento de ARN, têm sido desenvolvidos com sucesso. No entanto, a sua pouca seletividade e elevada toxicidade faz com que haja a necessidade de desenvolver novas moléculas com melhores propriedades. O desenvolvimento tecnológico dos métodos de estudo dos ácidos nucleicos é muito importante, pois faz com que se conheça melhor a sua estrutura e assim, permite que se sintetizem novos fármacos mais específicos para atuarem no ADN e ARN. Recentemente, têm sido investigadas estruturas secundárias, como o ADN triplex e os G-quadruplexes, que devido à sua localização e função no genoma pensa-se serem bons alvos terapêuticos. Nesta monografia serão abordadas as estruturas secundárias do ADN e ARN de um modo geral e posteriormente os fármacos utilizados na prática clínica. Por fim, descrever-se-ão algumas das novas moléculas que interagem com os alvos já referidos, sendo que algumas se encontram em ensaio clínico e poderão dar origem a medicamentos inovadores. No entanto, o problema da seletividade mantém-se de certo modo, já que, apesar de estas moléculas atuarem em estruturas específicas do genoma (e não em todo o genoma), essas estruturas existem tanto em células normais como em células tumorais. É, por isso, necessário que se desenvolvam moléculas específicas para uma sequência e não só para uma estrutura.<br>Nucleic acids are the basic molecules of all living beings. From the simplest bacteria to the most developed mammal, they all have them in their cells and it’s from them that all gels are generated. Mutations causing replication, transcription and translation errors, if not corrected may originate dysregulation of cells and consequent diseases or even death of those cells. However there are cases in which cell death might me desired such as viral, bacterial and fungi infections, but also when there is unwanted proliferation of cells such as what happens in tumors. Therefore, many drugs that disturb the normal functioning of processes involving nucleic acids such as replication, transcription and RNA processing have been developed successfully. However their low selectivity and high toxicity make it necessary for new molecules with better properties to be developed. It is also very important to develop new methodologies for the study of nucleic acids, since it enables a more comprehensive view of their structure making it possible for more specific drugs targeting DNA and RNA to be synthesized. Recently several secondary structures (like triplex DNA and G-quadruplexes) have been studied and will possibly make good targets in the future because of their locations and functions in the genome. In this review DNA and RNA secondary structures will be briefly discussed and also the drugs used in clinical practice. New molecules that target those nucleic acids and that may originate new drugs in the future will be approached later. Some of those molecules are currently in clinical trial although there are no approvals yet. The issue concerning selectivity still stands because even though these molecules target specific structures (contrary to the whole genome) the structures exist in normal and abnormal cells. Therefore it is necessary to develop novel compounds targeting (or also targeting) specific sequences instead of specific structures alone.